JP2015181356A

JP2015181356A - 精製ウイルス液の製造方法及びウイルス検出方法

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Publication number: JP2015181356A
Application number: JP2014058140A
Authority: JP
Inventors: 大英中熊; Daiei Nakakuma
Original assignee: DIC Corp; Dainippon Ink and Chemicals Co Ltd
Current assignee: DIC Corp
Priority date: 2014-03-20
Filing date: 2014-03-20
Publication date: 2015-10-22

Abstract

【課題】ウイルス液から夾雑物であるフミン酸のみを特異的に回収し精製することを有する精製ウイルス液の製造方法。【解決手段】ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が１〜３０００μｍである粒子（Ａ）に接触させて精製ウイルス液を得る工程１を有し、前記粒子（Ａ）の総表面積に対するフミン酸量が、０．５〜１００μｇ／ｃｍ２であることを特徴とする、精製ウイルス液の製造方法。前記粒子（Ａ）が、アガロースゲル、セルロースゲル、またはデキストランゲルである方法。【選択図】なし

Description

本発明は、精製ウイルス液の製造方法、及びウイルス検出方法に関する。

安全志向が高まる近年、河川水や海水といった環境水、水道水や井戸水等の生活用水、土壌や食品等、我々を取り巻く環境に対する安全性の担保が非常に重要視されている。特に環境水や生活水が各種ウイルスによって汚染されると、近隣住民へと爆発的に感染し、甚大な健康被害を生じる虞があり、とくに開発途上地域における生活用水のウイルス汚染は大きな問題となっている。

これらを鑑み、環境中のウイルス汚染を恒常的に監視することは、人々の安全安心を維持していく上で非常に重要であり、そのためには簡便で正確にウイルス量を評価する方法を確立することが急務である。

しかし、様々な環境、特に環境水中のウイルス量はごく少量であるため、検出することが非常に難しいということが課題となっている。そこで、ウイルスを濃縮回収したうえで、ウイルスを検出する方法が試みられてきた。

例えば、ウイルス検出に用いる試料を、超遠心やポリエチレングリコール法などによって濃縮する方法などが知られている。

また、特許文献１においては、表面処理された中空糸にウイルスを含む液を通じてウイルスを捕捉し、ウイルスの濃度を評価する方法が報告されており、その際には、必要に応じて限外ろ過膜で２次濃縮を行う場合もある。

上記のような方法でウイルスを濃縮回収し、得られたウイルス液を、各種方法で検出、同定を行う。一般的によく行われるのが、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）等に代表される核酸増幅検査（ＮＡＴ）法である。ＮＡＴ法は、ウイルスに含まれる核酸を人工的に増幅して高感度に検出する方法であり、ウイルスに特異なプライマーによって検出を行う場合や、遺伝子を増幅させた後にハイブリダイゼーション等で同定を行う。

しかし、上記のようなウイルス濃縮方法では、環境中に存在するＮＡＴ法を阻害する物質であるフミン酸も同時に回収してしまうという問題があった。

フミン酸とは、環境中に存在する腐植物質の一種であり、植物残渣や微生物、プランクトンの遺骸が微生物による分解を受け、その分解生成物から化学的、生物的に合成された高分子有機酸の混合物である。腐植物質はフミン質とも呼ばれ、アルカリ溶液に可溶だが、酸性溶液では沈殿を形成するフミン酸、どのｐＨでも可溶なフルボ酸、及びアルカリに不溶なヒューミン（またはフムス質）とが存在する。フミン質は、動植物由来物質であることから、土壌・海水・河川湖沼水や排水・廃棄物等、環境中のあらゆる場所に存在する。フミン質は、動植物由来であることから不定形の高分子物質であるが、芳香環族を多数有する三次元網目状構造をもつものが多い。その中でもフミン酸は、水酸基やカルボキシル基といった酸性基を一つ以上有するポリフェノール型カルボン酸であることが多く、その構造から金属類のキレート性を有し、工業的にはキレート剤として用いられる。

上記問題を解決する為に、特許文献２においては、特定の細孔を持つシリカゲルにフミン酸等の夾雑物を吸着させることによる、ウイルス検出率の向上方法が報告されている。しかし、細孔の大きさに依存した非特異的な吸着であるため、定量的測定には不十分であるといった問題があった。

国際公開第２０１２／１４４５５４号特開２０１１−１５５９１９号公報

本発明は、ウイルス液から夾雑物であるフミン酸のみを特異的に回収し精製することを有する精製ウイルス液の製造方法を提供することを課題とする。また、得られた精製ウイルス液を用いたウイルス検出方法を提供することを課題とする。

本発明者は鋭意検討の結果、ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が１〜３０００μｍである粒子（Ａ）に接触させて精製ウイルス液を得る工程１を有し、前記粒子（Ａ）の総表面積に対するフミン酸量が、０．５〜１００μｇ／ｃｍ^２であることを特徴とする、精製ウイルス液の製造方法を提供することで、上記課題を解決できることを見出した。

また、前記カチオン性基が、アミノ基または４級アンモニウム基である、精製ウイルス液の製造方法を見出した。

また、前記粒子（Ａ）が、アガロースゲル、セルロースゲル、またはデキストランゲルである、上記精製ウイルス液の製造方法を見出した。

さらに、前記サンプル液中の塩濃度が、５０ｍＭ以下である、上記精製ウイルス液の製造方法を見出した。

また、前記サンプル液中におけるフミン酸濃度が３μｇ／ｍＬ以上である、上記精製ウイルス液の製造方法を見出した。

また、上記何れかに記載の製造方法で得られた精製ウイルス液を、ウイルス検出工程にかけることを特徴とするウイルス検出方法を見出した。

本発明の精製ウイルス液の製造方法は、サンプル液から夾雑物であるフミン酸のみを特異的に分離し精製することができることから、ウイルス検出方法に対し感度よく定量的なウイルス含有試験液を提供することが可能である。

本発明は、ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が１〜３０００μｍである粒子（Ａ）に接触させて精製ウイルス液を得る工程１を有し、上記粒子（Ａ）の総表面積に対するフミン酸量が、０．５〜１００μｇ／ｃｍ^２であることを特徴とする、精製ウイルス液の製造方法、及び上記精製ウイルス液をウイルス検出工程に供することを特徴とするウイルス検出方法を提供するものである。

カチオン性基を有し平均粒径が１〜３０００μｍである粒子（Ａ）は、カチオン性基を有するため、水中で表面が正に帯電している。フミン酸及びウイルスは、弱酸〜アルカリ性条件下では負に帯電する為、フミン酸及びウイルスは粒子（Ａ）が有するカチオン性基にトラップされる。この際、本発明者は、粒子（Ａ）の総表面積に対するフミン酸濃度が０．５〜１００μｇ／ｃｍ^２であるとき、カチオン性基に対してフミン酸が優先的に結合するため、サンプル液からフミン酸が分離可能となり、精製されたウイルス液が得られることを見出した。なお、粒子（Ａ）の総表面積に対するフミン酸濃度が０．５μｇ／ｃｍ^２よりも低い場合は、カチオン性基が余剰となるためにウイルスまでもトラップされる虞があり、１００μｇ／ｃｍ^２よりも高い場合には、フミン酸が余剰となりウイルス液が精製されない虞がある。

本発明における平均粒径とは、体積分布における累積５０％の径のことを示す。

〔工程１〕
工程１は、ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が１〜３０００μｍである粒子（Ａ）に接触させて精製ウイルス液を得る工程である。

（サンプル液）
本発明におけるサンプル液とは、ウイルスが含まれる水媒体の液体である。ウイルスを含有するサンプル液は、ウイルスを含有すると思われるサンプルを水に混濁すればよく、ウイルスを含有するサンプルとは、河川水・湖沼水・海水・雨水といった環境水、井戸水・水道水・ボトルドウォーターといった飲料水や下水・排水・プール水・農業用水・工業用水・冷媒水といった産業用水のような生活用水；食品、土壌、動植物、血液等の体液など、様々なものをサンプルとして用いることができる。

サンプル液は、ウイルスを含有するサンプルを水に混濁することによって得られ、例えば環境水や生活用水のような液体サンプルであれば滅菌水で希釈すればよく、固形サンプルであれば滅菌水で混濁した上清や、固形サンプル表面を滅菌水で洗浄した洗浄液等もサンプル液として用いることができる。このように、サンプルは環境水等から採取したものを使用できることから、本形態で使用するサンプル液には通常フミン酸が含まれうる。

本形態に適用可能なウイルスとしては、特に制限されず、２本鎖ＤＮＡウイルス、１本鎖ＤＮＡウイルス、２本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、２本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルス等が挙げられる。

前記２本鎖ＤＮＡウイルスとしては、アデノウイルス、ポドウイルス等が挙げられる。

前記１本鎖ＤＮＡウイルスとしては、パルボウイルス等が挙げられる。

前記２本鎖ＲＮＡウイルスとしては、ロタウイルス、レオウイルス等が挙げられる。

前記１本鎖ＲＮＡウイルスとしては、エンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ノロウイルス、ネコカリシウイルス等のｍＲＮＡとして作用する１本鎖ＲＮＡウイルス；麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス等のｍＲＮＡの相補鎖として作用する１本鎖ＲＮＡウイルスが挙げられる。

前記１本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス、泡沫状ウイルス等が挙げられる。

前記２本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルスとしては、Ｂ型肝炎ウイルス等が挙げられる。

これらのうち、本形態に適用されうるウイルスは、水中に存在し、ヒトに感染しうるアデノウイルス、ポリオーマウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ノロウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、ロタウイルス、アイチウイルス、パレコウイルス、レオウイルスであることが好ましく、ノロウイルス、ＨＡＶ、ＨＥＶ、エンテロウイルス、ロタウイルスであることがより好ましい。

上述のウイルスは単独で適用しても、２種以上が混合されて適用されてもよい。

また、本形態のサンプル液に含有されうるフミン酸としては、特に制限されず、公知のもの、例えば、自然界に存在しうるフミン酸、自然界のフミン酸と化学構造の少なくとも一部が異なるフミン酸誘導体等が挙げられる。これらのフミン酸はサンプル液中に単独で含まれていても、２種以上が混合して含まれていてもよい。

フミン酸は、上述のように複雑な構造を有しているが、吸光度の測定によりフミン酸の検出、評価を行うことができる。

サンプル液中のフミン酸濃度は、３μｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、１０〜１００００μｇ／ｍＬであることがより好ましい。サンプル液中のフミン酸濃度が３μｇ／ｍＬ以上であると、ウイルスの回収率が高まることから好ましい。

採取したサンプルを本形態に係るサンプル液としては使用する前には、適宜精製することができる。

例えば、採取したサンプルは、分級、溶媒抽出、活性炭等による吸着、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等により不純物を除去して精製することができる。

また、サンプル液には、添加剤等を添加してもよい。使用されうる添加剤としては、特に制限されないが、有機溶媒、塩、ｐＨ調整剤が挙げられる。

用いられうる有機溶媒としては、特に制限されないが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、１−ブタノール等のアルコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；ジエチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類；ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類などが挙げられる。これらの溶媒は、単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。ただし、環境面、操作の簡便性等の観点から、有機溶媒については添加しないことが好ましい。

用いられうる塩としては、特に制限されないが、酢酸、クエン酸、リン酸、ホウ酸、酒石酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、または２−４−［（２−ヒドロキシエチル）−１−ピエラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）と、アルカリ金属、ベリリウム、またはアルカリ土類金属と、の塩等が挙げられる。これらのうち、前記塩は、酢酸、クエン酸、リン酸と、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムと、の塩であることが好ましく、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムであることがより好ましく、リン酸ナトリウムであることがさらに好ましい。
上述の塩は単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

サンプル液の塩濃度は、５００ｍＭ以下であることが好ましく、１００ｍＭ以下であることがより好ましく、５０ｍＭ以下であることがさらに好ましく、１〜５０ｍＭであることが特に好ましい。塩濃度が５００ｍＭ以下であると、ウイルスとフミン酸との疎水性相互作用による凝集を防止しやすくなり、フミン酸をより選択的に分離できることから好ましい。

用いられうるｐＨ調整剤としては、特に制限されないが、上述の塩、塩酸等の酸、水酸化ナトリウム等の塩基が挙げられる。

サンプル液のｐＨは、３．０〜１０．０であることが好ましく、６．０〜１０．０であることがさらに好ましい。サンプル液のｐＨが上記範囲にあると、酸または塩基によるウイルスの損傷を防止することができる、ウイルスおよびフミン酸の凝集を防止しうる、フミン酸をより特異的に分離することができる等の観点から好ましい。

本形態に係るサンプル液において、後述する粒子（Ａ）の総表面積に対するフミン酸濃度（フミン酸濃度／粒子（Ａ）の総表面積）は０．５〜１００μｇ／ｃｍ^２であり、好ましくは１〜５０μｇ／ｃｍ^２であり、より好ましくは２．５〜３０μｇ／ｃｍ^２である。

なお、サンプル液中のフミン酸濃度は、測定対象となるフミン酸に適した波長の光を照射した場合の吸光度を測定することにより求めることができる。

また、本発明における粒子（Ａ）の総表面積とは、以下３点の条件を満たしたと仮定した場合の粒子（Ａ）の表面積の和のことである。

１．粒子（Ａ）が孔のない完全な球形である
２．粒子（Ａ）の粒子径が全て平均粒子径である
３．粒子（Ａ）がスピンダウン後に最密充填構造となっている。

この条件から、粒子（Ａ）の総表面積は以下の式（１）から計算できる。
（総表面積）＝４×π×ｒ^２×（ｖ／（（４／３×π×ｒ^３）／０．７４））（１）
ｒ：粒子（Ａ）の平均粒子径（ｃｍ）
ｖ：粒子（Ａ）のスピンダウン後の体積（ｃｍ^３）

（粒子（Ａ））
粒子（Ａ）は、カチオン性基を有する粒子状材料を含む構成を有する。この際、前記粒子は、１〜３０００μｍであり、好ましくは３０〜１０００μｍであり、より好ましくは３０〜２００μｍである。粒子（Ａ）の平均粒径が１μｍ未満であると、サンプル液から分離することができない。一方、粒子（Ａ）の平均粒径が３０００μｍ超であると、所望の表面積を得るための粒子量が多くなるため、ウイルスを高収率で回収することができない。

前記カチオン性基としては、特に制限されず、公知のものが用いられうる。この際、カチオン性基には、それ自体がカチオン性を有しているものだけでなく、プロトン化等によりカチオン性を有するようになる基も含まれうる。

カチオン性基の具体例としては、アミノ基、４級アンモニウム基、スルホニウム基、ホスホニウム基等が挙げられる。これらのうち、合成の容易さからアミノ基または４級アンモニウム基であることが好ましく、ジエチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基であることがより好ましい。

前記粒子状材料としては、特に制限されないが、アガロースゲル、セルロースゲル、デキストランゲルといった多糖類ゲルを用いることが好ましい。これらの多糖類ゲルは、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。

粒子状材料として、カチオン性基を有する粒子状材料を用いる場合には、そのまま粒子（Ａ）として使用することができる。

一方、上述の多糖類ゲルのようなカチオン性基を有しないものを使用する場合には、公知の方法でカチオン性基を導入する。カチオン性基を導入する方法としては、カチオン性基を有する化合物や樹脂を被覆または結合させることによって導入する方法；カチオン性基を、中間基を介して結合させる方法、例えば、特開２００２−３６９８８１号公報に記載されているように、水酸基を含有するゲル粒子表面にエピクロロヒドリンを反応させた後にアミンを反応させる方法や、特開２００６−３２８２９０号公報に記載されているように、芳香環を有する多孔粒子表面にクロロエチルメチルエーテルを反応させた後にトリメチルアミンを反応させる方法等が挙げられる。

粒子（Ａ）中のカチオン性基の量としては、１〜３０００μｍｏｌ／ｍＬであることが好ましく、５〜１５００μｍｏｌ／ｍＬであることがより好ましく、５０〜３００μｍｏｌ／ｍＬであることがさらに好ましい。カチオン性基の量が１μｍｏｌ／ｍＬ以上であると、フミン酸の捕集効率が高まることから好ましい。一方、カチオン性基の量が３０００μｍｏｌ／ｍＬ以下であると、ウイルスの回収率が高まることから好ましい。

上記粒子（Ａ）を構成する粒子状材料が多糖類ゲルである場合、デキストランやポリエチレングリコールといった鎖状水溶性樹脂の排除限界分子量は、１００〜１０００００ｋＤａであることが好ましく、５００〜２００００ｋＤａであることがより好ましく、１０００〜５０００ｋＤａであることがさらに好ましい。これは、１００ｋＤａ以上であると孔径が比較的大きいため、フミン酸をビーズ表面の孔内で捕捉しやすいため好ましく、１０００００ｋＤａ以下であると、試験液とビーズとの接触効率が向上するため好ましいからである。

（接触）
工程１では、サンプル液を粒子（Ａ）に接触させることを含む。

粒子（Ａ）とサンプル液を接触させる場合、様々な方法を用いることができる。バッチ式の場合、粒子（Ａ）とサンプル液をビーカーや試験管、マイクロチューブやチップ等に入れ、撹拌することで接触させることができる。撹拌する場合、撹拌翼や撹拌子を使用してもよいし、振動式ミキサー等で撹拌してもよい。

フロー式の場合、粒子（Ａ）をカラムやチューブに詰めた上、サンプル液を通液してもよいし、担体に粒子（Ａ）を固定したうえで通液してもよい。

〔工程２〕
本発明の工程２では、工程１において接触させた粒子（Ａ）とウイルス液とを分離することで、フミン酸を除去した精製ウイルス液を得ることができる。分離の方法は公知慣用の方法を用いればよく、濾過、デカンテーション、遠心分離等の方法を用いることができるし、注射器等を用いて液のみを採取してもよい。

〔工程３〕
工程２で得られた精製ウイルス液は、工程３にてウイルス検出工程に供することが好ましい。

ウイルス検出工程とは、ウイルスを検出、及び同定する工程である。ウイルス検出方法としては、古くは単離培養からの形態的同定法が用いられていたが、現在はポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）等に代表される核酸増幅検査（ＮＡＴ）法が好適に用いられる。ＮＡＴ法は、培養方法が確立していないウイルスを検出できるうえ、培養日数が不要なため短期間での検出が可能という利点がある。

工程２で得られる精製ウイルス液中で、ウイルス濃度が低い場合、公知慣用の方法でウイルスを濃縮してもよく、具体的には陽電荷膜法や陰電荷膜法、ポリエチレングリコール沈殿法、限外ろ過法などがある。本発明で得られる精製ウイルス液は、ＮＡＴ法を阻害するフミン酸が除去、またはほとんど分離されているため、感度よく検出することが可能である。また、ウイルスの濃縮が必要な場合、工程１の前に実施してもかまわない。

精製ウイルス液をＮＡＴ法に供する場合、ウイルスから核酸を抽出する前処理を行うことが好ましい。ウイルス核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）の抽出は、特に限定されるものではなく、フェノール・クロロホルム抽出法、界面活性剤やプロテアーゼを併用した抽出法等が用いられる。また、ウイルス核酸精製に関しても、液相抽出法、エタノール沈殿法やスピンカラム法等により行うことができる。

抽出された核酸は、ＮＡＴ法により検査を行うことが好ましい。ＮＡＴ法はウイルス等の微量の遺伝子を人工的に増幅して高感度に検出する方法の総称であり、ＰＣＲ法の他、転写媒介増幅（ＴＭＡ）法、鎖置換反応（ＬＡＭＰ）法、等温遺伝子増幅（ＩＣＡＮ）法、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法等が挙げられる。

例えばＰＣＲ法の場合、ウイルスに特異的なプライマーを用いて核酸増幅を行い、増幅が認められればウイルスが存在することが判明する。

以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明は実施例の記載に制限されるものではない。また、実施例において特段の記載がない場合、部及び％は質量基準である。

［試験用のサンプル液］
試験用のサンプル液を調製した。

＜調製例１＞
精製水にフミン酸（ナカライテスク株式会社）を１００００μｇ／ｍＬとなるように添加し、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．３に調整することで、フミン酸溶液を調製した。

また、精製水にＱβファージ（ＮＢＲＣ２００１２）を終濃度１０^１２ＰＦＵ／ｍＬとなるように調整してファージ溶液を調製した。

そして、フミン酸濃度、ファージ濃度、およびｐＨが、それぞれ１００μｇ／ｍＬ、１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、およびｐＨ５．０となるように、上記で調製したフミン酸溶液およびファージ溶液、並びにクエン酸緩衝液を混合してサンプル液を調製した。この際、クエン酸緩衝液の塩濃度は適宜調整した。

＜調製例２＞
調製例１と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。

フミン酸濃度、ファージ濃度、およびｐＨが、それぞれ１００μｇ／ｍＬ、１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、およびｐＨ４．０となるように、フミン酸溶液、ファージ溶液、およびクエン酸緩衝液を混合してサンプル液を調製した。この際、クエン酸緩衝液の塩濃度は適宜調整した。

＜調製例３＞
調製例１と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。

フミン酸濃度、ファージ濃度、およびｐＨが、それぞれ１００μｇ／ｍＬ、１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、およびｐＨ７．０となるように、フミン酸溶液、ファージ溶液、およびリン酸緩衝液を混合してサンプル液を調製した。この際、リン酸緩衝液の塩濃度は適宜調整した。

＜調製例４＞
調製例１と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。

フミン酸濃度、ファージ濃度、およびｐＨが、それぞれ１００μｇ／ｍＬ、１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、およびｐＨ４．０となるように、フミン酸溶液、ファージ溶液、および酢酸緩衝液を混合してサンプル液を調製した。この際、酢酸緩衝液の塩濃度は適宜調整した。

＜調製例５＞
調製例１と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。

フミン酸濃度およびファージ濃度が、それぞれ１００μｇ／ｍＬおよび１０^１０ＰＦＵ／ｍＬとなるように、フミン酸溶液、ファージ溶液、およびイオン交換水を混合してサンプル液を調製した。なお、調製したサンプル液のｐＨは７．３である。

＜調製例６＞
調製例１と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。

フミン酸濃度、ファージ濃度、およびｐＨが、それぞれ１０００μｇ／ｍＬ、１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、およびｐＨ５．０となるように、フミン酸溶液、ファージ溶液、およびクエン酸緩衝液を混合してサンプル液を調製した。この際、クエン酸緩衝液の塩濃度は適宜調整した。

＜調製例７＞
調製例１と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。

フミン酸濃度、ファージ濃度、およびｐＨが、それぞれ１０μｇ／ｍＬ、１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、およびｐＨ５．０となるように、フミン酸溶液、ファージ溶液、およびクエン酸緩衝液を混合してサンプル液を調製した。この際、クエン酸緩衝液の塩濃度は適宜調整した。

調製例１〜７で調製したサンプル液を下記表１に示す。

［粒子（Ａ）等］
・ＤＥＡＥ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＢＦＦＤＥＡＥ（以下、単に「ＤＥＡＥ」と称する）（ＧＥｈｅｌｔｈｃａｒｅ社製）を粒子（Ａ）として準備した。ＤＥＡＥの材料は、アガロースゲルであり、カチオン性基である−ＮＨ（Ｃ_２Ｈ_５）_２を有する。なお、ＤＥＡＥは、平均粒径が９０μｍであり、アミノ基量が１３５μｍｏｌ／ｍＬであり、排除限界分子量が１０００ｋＤａであり、総表面積が２４６．７ｃｍ^２／ｍＬである。

・ｃｅｌｆｉｎｅ−Ａｍｉｎｏ
ｃｅｌｆｉｎｅ−Ａｍｉｎｏ（ＪＮＣ株式会社製）を粒子（Ａ）として準備した。ｃｅｌｆｉｎｅ−Ａｍｉｎｏの材料はセルロースゲルであり、当該セルロースゲルは−ＯＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２基を介してカチオン性基であるアミノ基（−ＮＨ_２）を有している。なお、ｃｅｌｆｉｎｅ−Ａｍｉｎｏは、平均粒径が１６５μｍであり、アミノ基量が１７．５μｍｏｌ／ｍＬであり、表面積が１３３ｃｍ^２／ｍＬである。

・ＳＡ−１０Ａ
ＳＡ−１０Ａ（三菱化学株式会社製）を粒子（Ａ）として準備した。ＳＡ−１０Ａの材料はスチレン系陰イオン交換樹脂であり、スチレンの芳香族基に−ＣＨ_２基を介してカチオン性基であるトリメチルアンモニウム基（−Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３）基が結合した構造を有する。なお、ＳＡ−１０Ａは、平均粒径が７００μｍであり、アミノ基量が１３００μｍｏｌ／ｍＬであり、表面積が３１．７ｃｍ^２／ｍＬである。

・シリカゲル
シリカゲルビーズであるシリカゲル６０Ｎ（６３−２１０μｍ）（関東化学株式会社製）を準備した。なお、シリカゲル６０Ｎの平均粒径は、１２０μｍである。

今回使用した粒子（Ａ）等を下記表２に示す。

＜実施例１＞
（工程１）
調製例１で調製したサンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：５００ｍＭ）に、粒子（Ａ）として洗浄処理を行ったＤＥＡＥをスピンダウン後の容積として３０μＬになるように投入し、１０分間転倒混和した後、静置した。

なお、この場合において、粒子（Ａ）の総表面積を上記式（１）で計算したところ、７．４ｃｍ^２となり、フミン酸量は１００μｇである。よって、粒子（Ａ）に対するフミン酸量は、１３．５μｇ／ｃｍ^２である。

（工程２）
粒子（Ａ）をスピンダウンして上澄み、すなわち精製ウイルス液を回収した。

（工程３）
精製ウイルス液中のフミン酸量およびファージ量を定量し、下記式（２）および（３）により、フミン酸除去率およびウイルス除去率を算出した。

精製ウイルス液中のフミン酸量を、２６０ｎｍの吸光度測定にて定量したところ、２７μｇ／ｃｍ^２であった。

よって、フミン酸回収率は２７％（すなわち、フミン酸除去率は７３％）であった。

また、ファージ量については以下のように定量した。

すなわち、ＱＩＡＧＥＮＭｉｎＥｌｕｔｅＶｉｒｕｓＳｐｉｎキット（株式会社キアゲン）を用いてファージＲＮＡを抽出した。フミン酸による阻害の影響を排除してファージの回収率を算出するため、抽出したファージＲＮＡ液を１００倍に希釈してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にてＲＮＡ量を定量した。測定に用いたプライマー及びプローブの配列は文献（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ１４９（２００８），ｐ１２３−１２８）に従って作製し、測定はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（ライフテクノロジースジャパン株式会社）を使用した。

定量されたファージ量は、５．７×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬであった。

よって、ウイルス回収率は５７％（すなわち、ウイルス除去率は４３％）であった。

また、フミン酸除去率／ウイルス除去率を算出したところ、１．７であった。

＜実施例２＞
サンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：５００ｍＭ）に代えて、サンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：１００ｍＭ）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ１６．８％（すなわち、フミン酸除去率は８３．２％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ６７．８％（すなわち、ウイルス除去率は３２．２％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、２．６である。

＜実施例３＞
サンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：５００ｍＭ）に代えて、サンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：５０ｍＭ）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ２４．７％（すなわち、フミン酸除去率は７５．３％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ９９．０％（すなわち、ウイルス除去率は１．０％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、７５．３である。

＜実施例４＞
サンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：５００ｍＭ）に代えて、サンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：１０ｍＭ）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ１７．８％（すなわち、フミン酸除去率は８２．２％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ９９．０％（すなわち、ウイルス除去率は１．０％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、８２．２である。

＜実施例５＞
工程１において、ＤＥＡＥのスピンダウン後の容積としての投入量３０μＬを１５０μＬに変更し、サンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：５００ｍＭ）に代えて、サンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：１ｍＭ）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

なお、この場合において、粒子（Ａ）の総表面積を上記式（１）で計算したところ、３７ｃｍ^２であり、フミン酸量は１００μｇである。よって、粒子（Ａ）に対するフミン酸量は、２．７μｇ／ｃｍ^２である。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ７．３％（すなわち、フミン酸除去率は９２．７％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ８６．３％（すなわち、ウイルス除去率は１３．７％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、６．７である。

＜実施例６＞
サンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：１ｍＭ）を調製例２で調製したサンプル液１ｍＬ（ｐＨ４クエン酸緩衝液、塩濃度：１ｍＭ）に変更したことを除いては、実施例５と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ１０．６％（すなわち、フミン酸除去率は８９．４％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ７８．４％（すなわち、ウイルス除去率は２１．６％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、４．１である。

＜実施例７＞
工程１において、調製例１で調製したサンプル液（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：１ｍＭ）に代えて、調製例３で調製したサンプル液（リン酸緩衝液、塩濃度：１ｍＭ）を用いたことを除いては、実施例５と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ７．５％（すなわち、フミン酸除去率は９２．５％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ９９．０％（すなわち、ウイルス除去率は１．０％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、９４．６である。

＜実施例８＞
工程１において、ＤＥＡＥのスピンダウン後の容積としての投入量３０μＬを３００μＬに変更し、サンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：５００ｍＭ）に代えて、サンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：１ｍＭ）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

なお、この場合において、粒子（Ａ）の総表面積を上記式（１）で計算したところ、７４ｃｍ^２であり、フミン酸量は１００μｇである。よって、粒子（Ａ）に対するフミン酸量は、１．４μｇ／ｃｍ^２である。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ２．８％（すなわち、フミン酸除去率は９７．２％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ６５．７％（すなわち、ウイルス除去率は３４．３％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、２．８である。

＜実施例９＞
工程１において、調製例１で調製したサンプル液（ｐＨ５クエン酸緩衝液、塩濃度：５００ｍＭ）に代えて、調製例４で調製したサンプル液（酢酸緩衝液、塩濃度：１ｍＭ）を用いたことを除いては、実施例８と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ３．５％（すなわち、フミン酸除去率は９６．５％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ６４．１％（すなわち、ウイルス除去率は３５．９％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、２．７である。

＜実施例１０＞
工程１において、ＤＥＡＥに代えて、ｃｅｌｆｉｎｅ−Ａｍｉｎｏを用いたことを除いては、実施例３と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

なお、この場合において、粒子（Ａ）の総表面積を上記式（１）で計算したところ、４．０ｃｍ^２であり、フミン酸量は１００μｇである。よって、粒子（Ａ）に対するフミン酸量は、２５．０μｇ／ｃｍ^２である。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ２４．９％（すなわち、フミン酸除去率は７５．１％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ９３．５％（すなわち、ウイルス除去率は６．５％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、１１．５である。

＜実施例１１＞
工程１において、ＤＥＡＥ３０μＬに代えて、ＳＡ−１０Ａを３００μＬ投入したことを除いては、実施例４と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

なお、この場合において、粒子（Ａ）の総表面積を上記式（１）で計算したところ、９．５ｃｍ^２であり、フミン酸量は１００μｇである。よって、粒子（Ａ）に対するフミン酸量は、１０．５μｇ／ｃｍ^２である。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ２８．３（すなわち、フミン酸除去率は７１．７％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ５５．５％（すなわち、ウイルス除去率は４４．５％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、１．６である。

＜実施例１２＞
工程１において、調製例１で調製したサンプル液に代えて、調製例６で調製したサンプル液（クエン酸緩衝液濃度：１０ｍＭ）を用いたことを除いては、実施例８と同様の方法で精製サンプル液を調製した。

なお、この場合において、粒子（Ａ）の総表面積は７４ｃｍ^２であり、フミン酸量は１０００μｇである。よって、粒子（Ａ）に対するフミン酸量は、１３．５μｇ／ｃｍ^２である。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ１１．０％（すなわち、フミン酸除去率は８９．０％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ７７．４％（すなわち、ウイルス除去率は２２．６％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、３．９である。

＜実施例１３＞
（工程１および２）
ＤＥＡＥを、直径２ｍｍのカラムにスピンダウン後の容積として２００μＬ充填した。次いで、ＤＥＡＥを充填したカラムに、調製例１で調製したサンプル液１ｍＬ（ｐＨ５クエン酸緩衝液濃度：１ｍＭ）を通し、その後精製水１ｍｌでカラムを洗浄して、精製ウイルス液を調製した。

なお、この場合において、粒子（Ａ）の総表面積を上記式（１）で計算したところ、４９．３ｃｍ^２であり、フミン酸量は１００μｇである。よって、粒子（Ａ）に対するフミン酸量は、２．０μｇ／ｃｍ^２である。

得られた精製ウイルス液について、実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ１１．６％（すなわち、フミン酸除去率は８８．４％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ５２．９％（すなわち、ウイルス除去率は４７．１％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、１．９である。

＜実施例１４＞
調製例１で調製したサンプル液に代えて、調製例５で調製したサンプル液を用いたことを除いては、実施例１３と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ１１．６％（すなわち、フミン酸除去率は８８．４％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ５０．０％（すなわち、ウイルス除去率は５０．０％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、１．８である。

＜比較例１＞
工程１において、調製例２で調製したサンプル液１ｍＬ（リン酸緩衝液、塩濃度：１ｍＭ）に、シリカゲルビーズ１０００μＬを投入したことを除いては、実施例１と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ９９．０％（すなわち、フミン酸除去率は１．０％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ９９．０％（すなわち、ウイルス除去率は１．０％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、１．０である。

＜比較例２＞
工程１において、調製例１で調製したサンプル液に代えて、調製例７で調製したサンプル液（クエン酸緩衝液濃度：１ｍＭ）を用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。

なお、この場合において、粒子（Ａ）の総表面積は３７ｃｍ^２であり、フミン酸量は１０μｇである。よって、粒子（Ａ）に対するフミン酸量は、０．２７μｇ／ｃｍ^２である。

実施例１と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ３．０％（すなわち、フミン酸除去率は９７．０％）であった。また、実施例１と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ１．０％（すなわち、ウイルス除去率は９９．０％）であった。

よって、フミン酸除去率／ウイルス除去率は、０．９８である。

実施例１〜１４および比較例１〜２をまとめた結果を下記表３〜５に示す。

フミン酸除去率／ウイルス除去率の値が大きいほど、フミン酸を選択的に除去することができたといえる。

ここで、表５の結果を見ると、実施例１〜１４では、比較例１および２に対して優位に高い値となっており、特異的にフミン酸を除去できたことが分かる。

本発明のウイルス精製方法及びウイルス検出方法は、ウイルス検査方法に対し好適に使用可能である。

Claims

ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が１〜３０００μｍである粒子（Ａ）に接触させて精製ウイルス液を得る工程１を有し、
前記粒子（Ａ）の総表面積に対するフミン酸量が、０．５〜１００μｇ／ｃｍ^２であることを特徴とする、精製ウイルス液の製造方法。
前記カチオン性基が、アミノ基または４級アンモニウム基である、請求項１に記載の製造方法。
前記粒子（Ａ）が、アガロースゲル、セルロースゲル、またはデキストランゲルである、請求項１または２に記載の製造方法。
前記サンプル液が、さらに塩を含み、
前記サンプル液の前記塩濃度が、５０ｍＭ以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
前記サンプル液中におけるフミン酸濃度が３μｇ／ｍＬ以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が１〜３０００μｍである粒子（Ａ）に接触させて精製ウイルス液を得る工程１を有し、
前記粒子（Ａ）の総表面積に対するフミン酸量が、０．５〜１００μｇ／ｃｍ^２であって、
前記粒子（Ａ）と前記精製ウイルス液とを分離する工程２を有し、
さらに、前記精製ウイルス液をウイルス検出工程に供する工程３とを有することを特徴とする、ウイルスの検出法。