JP2022131809A - 測定方法及び測定システム - Google Patents
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Abstract
Description
まず、本実施形態に係る測定方法に対する比較例が説明される。検体試料中の微生物量を複数種同時に定量測定する方法の比較例として、以下、マルチプレックスqPCR(quantitative Polymerase Chain Reaction)法、及び、マイクロアレイ法が説明される。
図1に、qPCR法による定量測定の手順例が示される。検体試料から核酸が抽出されて精製される(ステップS901)。精製された試料に反応液が添加される(ステップS902)。検体試料と別に、既知の濃度の標準核酸に反応液を添加することによって検量用試料が調製される(ステップS903)。検体試料からの核酸及び標準核酸のリアルタイムPCR測定が行われる(ステップS904)。既知の濃度の標準核酸のリアルタイムPCR測定のCt値と、検体試料からの核酸のCt値とを比較するデータ解析が行われる(ステップS905)。データ解析によって推定された検体試料の核酸量に基づいて、微生物量が算出される(ステップS906)。
図3に、マイクロアレイ法による定量測定の手順例が示される。検体試料から核酸が抽出されて精製される(ステップS921)。精製された試料にPCR反応液が添加される(ステップS922)。試料がPCR増幅反応に供され、ラベル化される(ステップS923)。PCR増幅された試料にハイブリダイズ反応液が添加される(ステップS924)。マイクロアレイ上のプローブにおいて、検体試料からの核酸がハイブリダイズ反応に供される(ステップS925)。反応液が洗浄によって除去される(ステップS926)。ハイブリダイズ反応に供されたプローブの画像を取得するために、マイクロアレイ上のプローブがスキャンされる(ステップS927)。プローブにハイブリダイズ固定されたラベルの光量を数値化し、あらかじめ取得した既知濃度の標準核酸におけるラベルの光量と比較するデータ解析が実行される(ステップS928)。データ解析によって推定された核酸量に基づいて、微生物量が算出される(ステップS929)。
本開示の一実施形態に係る測定方法は、PCR工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、同時に多種類の微生物を定量的かつ高感度に測定できる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、検体試料の濃縮精製工程を含むPCR工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、標的微生物を高感度に測定できる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、PCR工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、PCR反応効率の影響を排除し標的微生物を定量的に測定できる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、ラベル化を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、ラベル化効率の影響を排除し標的微生物を定量的に測定できる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、マイクロアレイ検出を実行することによって、標的微生物種が増えた場合においても、qPCRに比して検査コストが増大しないように測定できる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、PCR工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、プライマの開発コストと時間を減少させる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、PCR工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、PCR反応の試薬等の消耗品コスト及び手間を減少させる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、PCR工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、プローブ開発にかかるプライマとの交差反応をなくし開発を容易にする結果、開発コストを低減できる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、洗浄工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、洗浄による擬陽性リスク又は定量性低下リスクを低減できる。
本開示の一実施形態に係る測定方法は、図5及び図6に例示されるフローチャートの手順として実行される。まず、図5を参照して、マイクロアレイ検出の実施例の工程が説明される。
文献:H.Katayama他 2002. Development of a Virus concentration Method and Its Application to Detection of Enterovirus and Norwalk Virus from Coastal Seawater. Applied and Environmental Microbiology 2002 Vol. 68. p.1033-1039
本実施形態に係る測定方法は、以下のように応用され得る。例えば、本実施形態に係る測定方法は、蛍光量計測におけるドライ画像測定、バイオチップの蛍光量液中観察、又は、連続反応におけるリアルタイム観察等で使用されてよい。本実施形態に係る測定方法は、具体的な実施例として、核酸分析による菌種判別、がん遺伝子、動植物判別、又は、腸内細菌の検査等に用いられてよい。
Claims (5)
- 検体試料に含まれる微生物の存在量を測定する測定方法であって、
前記検体試料に含まれる微生物を濃縮精製するステップと、
濃縮精製した微生物から核酸を抽出するステップと、
抽出した核酸に、前記抽出した核酸のハイブリダイズ反応に必要な塩類及び界面活性剤を含むハイブリダイズ反応液を添加して前記ハイブリダイズ反応に供するステップと、
ハイブリダイズした核酸の発光量を測定するステップと、
前記核酸の発光量の測定値に基づいて前記抽出した核酸の量を推定するステップと、
前記抽出した核酸の量の推定値に基づいて、前記検体試料に含まれる微生物の存在量を算出するステップと
を含む測定方法。 - 前記ハイブリダイズ反応に供するステップで、マイクロアレイが有する複数のスポットそれぞれにおいて前記抽出した核酸をハイブリダイズ反応に供し、
前記ハイブリダイズした核酸の発光量を測定するステップで、前記マイクロアレイが有する各スポットにおける発光量を測定する、請求項1に記載の測定方法。 - 前記ハイブリダイズ反応に供するステップで、前記マイクロアレイが有する各スポットの固相面に固定化され、かつ、蛍光分子で修飾されているプローブに前記核酸を捕捉させる、請求項2に記載の測定方法。
- 検体試料に含まれる微生物の存在量を測定する測定システムであって、
検体試料に含まれる微生物を濃縮精製する微生物濃縮装置と、
前記微生物濃縮装置で濃縮精製した微生物から核酸を抽出する核酸抽出装置と、
前記核酸抽出装置で抽出した核酸に、前記抽出した核酸のハイブリダイズ反応に必要な塩類及び界面活性剤を含むハイブリダイズ反応液を添加して前記ハイブリダイズ反応に供するハイブリダイズ反応装置と、
前記ハイブリダイズ反応装置でプローブにハイブリダイズした核酸の発光量を測定し、前記核酸の発光量の測定値に基づいて前記抽出した核酸の量を推定する核酸検出装置と
を備え、
前記核酸検出装置は、演算装置に前記抽出した核酸の量の推定値に基づいて、前記検体試料に含まれる微生物の存在量を算出させ、前記演算装置の算出結果を前記微生物の存在量の測定結果として取得する、測定システム。 - 前記微生物濃縮装置が陰電荷膜法によって前記検体試料に含まれる微生物を濃縮精製する、請求項4に記載の測定システム。
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