JP2015164952A - 細菌多様性を増大させるためのラクトバチルス・プランタルムの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、消化管の多様性を増大させるための組成物を製造するためのラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)の1つの菌株の使用、および予防的治療のための組成物を製造するためのラクトバチルス・プランタルムの1つの菌株の使用に関する。
高多様性(様々な種類の生物体の変化)が地球生態系および局部的なより限定された生態系にとって有益であり、そして個々の人間にとっても有益であることは、生物学において一般的に一致した意見である。高多様性は、生態系が健康的な均衡状態にあることを示す。対照的に、不均衡または撹乱した生態系、もしくは病的な生態系は少数の生物体の「過剰増殖」を開始し、これは、系を支配してさらなる撹乱および新しい病的状態を生じる。これは、ヒトの腸の生態系にも当てはまる。
上記の問題は本発明によって解決される。
本発明によると、ラクトバチルス・プランタルムの単一の菌株の投与が消化管の多様性を増大させる、すなわちただ1つの菌株を与えることによって消化管内の様々な種類の細菌の総数が増大することは全く予想外である。従って、投与した菌株の量の増大だけでなく、他の細菌の種類の増大も観察される。さらに、前記単一のラクトバチルス・プランタルム菌株の投与およびコロニー形成は、これまでは個体の消化管内で増殖することができなかった新しい細菌群の増殖を開始させる。これは、当技術分野において提言されていること(様々な細菌株の混合物だけが消化管内の細菌株の混合物、すなわち増大した多様性を提供することができると提言されている)とは対照的である。従って、当技術分野では多くの場合、生物学的多様性がそれにより低下されるという推定を考慮して、単一の菌株だけを与えることは反対される。別の形で表現すると、様々な種類の細菌の混合物を与えるための主な論拠は、これらの混合物が多様性の要件を満たすことである。
Didiff_total=Σ(Diafter_product−Dibefore_product)/(nproduct)−Σ(Diafter_placebo−Dibefore_placebo)/(nplacebo)
1)L.プランタルムは比較的大きいゲノムを有し、これは、多くの異なる条件を採用する能力を示す。
2)L.プランタルムは多くの異なる炭水化物を発酵させる著しい能力を有する。
3)L.プランタルムはマンガンに対して高い増殖要求性を有し、高い細胞間レベルのマンガンを蓄積することができる。マンガンは、酸素ラジカルのH2O2への還元によって酸素毒性に対するL.プランタルムの防御を提供する。生成したH2O2は、次に、マンガン補因子偽カタラーゼ(manganese cofactored pseudocatalase)によってO2および水へ転換され得る。
4)L.プランタルムは低pHに対して高い耐性を有する。pHが通常4.0よりも低い乳酸発酵食品中でL.プランタルムは自然に優位を占めることが多く、ヒトの胃の酸性条件を通過しても生き残るという事実は、酸性条件に対するその高い耐性を示す。
5)L.プランタルムはタンナーゼ活性を有することができ、フェノール酸を代謝することもできる。
多様性の測定
末端制限断片長多型(terminal restriction fragment length polymorphism、T−RFLP)解析は、蛍光で末端標識化されたPCR産物の制限エンドヌクレアーゼ消化に基づいた群集フィンガープリント法であり、既知および未知の細菌群の両方についての情報が明らかになる。T−RFLPパターンは一連のステップで作られる。簡単には、群集のDNAがサンプルから直接抽出される。関心のある遺伝子は、1つが蛍光標識化されたプライマーを用いてPCR増幅される。精製の後、PCR産物は、制限エンドヌクレアーゼ(通常は4−塩基カッター)により消化される。消化産物は蛍光標識化DNAサイズ標準物と混合され、次に、蛍光標識化された末端の断片のみが可視化されるように、断片は、レーザー検出器を備えたゲルまたは毛細に基づいた系のいずれかを用いて電気泳動法によって分離される。このような解析からの出力は、2つの形態である:1)細菌群集のプロファイルを様々な高さの一連のピークとして示す電気泳動図、2)最も重要なことに、各ピークのサイズ(塩基対における)および高さ(または面積)を含む、自動断片解析プログラムから作成される表。サンプル間のT−RFLPプロファイルは、統計的方法を用いて数値的に比較することができる。微生物群集を比較するためにいくつかの統計的方法が適用されている。
被験者およびサンプル採取
被験者は全て良好な身体状態であるが、十分に管理され明確な心血管疾患を有する男性であった。彼らに、4週間の試験溶液の摂取の前後に軟性S状結腸鏡検査を受けさせた。さらなる解析のために、下部S状結腸の粘膜から標準的なやり方でバイオプシーをとった。
粘膜のバイオプシーを超音波浴内で5分間処置し、次に2分間ボルテックスした。サンプルをUV処理1.5mlチューブに移し、9000rpmで7分間遠心分離した。380μlの緩衝液G2および30μlのProteinas K(Qiagen(Hilden, Germany))をペレットに添加した。サンプルを完全に溶解するまで56℃の水浴中で処置した。Eppendorf Mixer(モデル5432、Eppendorf(Hamburg, Germany))において、4℃で45分間12〜15個のガラスビーズ(直径2mm)と一緒に振とうさせることによって、懸濁液をさらに崩壊させた。5000rpmで1分間の遠心分離の後、上澄みを2つの異なる2mlのサンプルチューブ(各チューブ200μl)に移した。さらに、EZ1 DNA Tissue CardおよびEZ1 DNA Tissue Kitを有するBioRobot(登録商標)EZ1(Qiagen(Hilden, Germany))において、製造業者の使用説明書に従って精製を行った。DNAを200μlで溶出した。
5’末端がCy5で蛍光標識された普遍的な順方向プライマーCy5−ENV1(5’−AGA GTT TGA TII TGG CTC AG−3’)および逆方向プライマーENV2(5’−CGG ITA CCT TGT TAC GAC TT−3’)(それぞれ、8〜27bpおよび1511−1492bpでアニールする)によって、16S rRNA遺伝子を増幅した。PCR反応混合物は、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各デオキシリボヌクレオチドトリホスファート(Roche Diagnostics(Indianapolis, IN))、5μlの10×PCR反応緩衝液(100mMのTris−HCl、500mMのKCl、pH8.3)、2.5U/μlのTaqポリメラーゼ(Roche Diagnostics(Mannheim, Germany))および0.2〜10μlのテンプレートを、50μlの最終体積中に含有した。以下のプログラム:94℃で3分間の1サイクルの後、94℃で1分間、50℃で45秒間および72℃で2分間を32サイクル、そして72℃で7分間のさらなる延長を用いて、Eppendorf Mastercycler(Hamburg, Germany)において増幅を行った。
10μlの総体積で、15Uの制限エンドヌクレアーゼHaeIII(Sigma-Aldrich(St Louis, USA))とは別に、200ngの一定分量の精製PCR産物を37℃において16時間消化した。消化の後、65℃で15分間加熱することによって酵素を不活性化した。消化物を、1μlの内部サイズ標準物および4μlのホルムアミド負荷染料(3.3μlの脱イオンホルムアミド、5%w/vのDextran Blueを有する0.7μlの25mMのEDTA)と混合し、ポリアクリルアミドゲルに負荷する前に、混合物を94℃で3分間変性させ、そして即座に氷の上に置いた。
ALFwin TM断片アナライザー1.03プログラム(Amersham Biosciences(Uppsala, Sweden))を用いることによって、蛍光標識化T−RFのピーク面積を評価した。所与のT−RFLPパターン内の各T−RFの相対存在量は、20〜697bpの間の断片長内で検出される全てのT−RFの合計ピーク面積で除したそれぞれのT−RFのピーク面積として計算した。シンプソン(D)およびシャノン−ウィーナー(H’)指数は、式:
Claims (28)
- プラセボと比較して増大した多様性指数差を生じることを目的としてラクトバチルス・プランタルムの1つの菌株を個体に投与することによって消化管の多様性を増大させるための組成物を製造するための前記菌株の使用。
- 前記増大した多様性指数差が、酵素としてHaeIIIを用い、そしてシャノン−ウィーナーの指数およびシンプソンの多様性指数を用いてT−RFLP法によって測定される請求項1に記載の使用。
- 前記ラクトバチルス・プランタルムが、ラクトバチルス・プランタルム299、DSM6595、ラクトバチルス・プランタルム299v、DSM9843、ラクトバチルス・プランタルムHEAL−9、DSM15312、ラクトバチルス・プランタルムHEAL−19、DSM15313、およびラクトバチルス・プランタルムHEAL−99、DSM15316からなる群から選択される請求項1または2に記載の使用。
- シャノン−ウィーナーの指数が使用される場合に、前記増大した多様性指数差が少なくとも0.15、好ましくは0.30、より好ましくは0.45、そしてさらにより好ましくは0.60である請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
- シンプソンの多様性指数が使用される場合に、前記増大した多様性指数差が少なくとも0.02、好ましくは0.04、より好ましくは0.06、そしてさらにより好ましくは0.08である請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
- 前記組成物が、液体製剤または固体製剤である請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用。
- 前記固体製剤が、錠剤、吸引錠剤、スウィート、咀嚼錠剤、チューインガム、カプセル、サシェ、粉末、顆粒、被覆粒子および被覆錠剤、腸溶性の錠剤およびカプセル、ならびに溶融ストリップおよびフィルムからなる群から選択される請求項6に記載の使用。
- 前記液体製剤が、経口溶液、懸濁液、乳濁液およびシロップからなる群から選択される請求項6に記載の使用。
- 前記組成物が、キャリア材料を含む請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用。
- 前記組成物が、医療用食品、機能性食品、栄養補助食品、栄養製品または食品調製物である請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用。
- 前記キャリア材料が、オートミール粥、乳酸発酵食品、難消化性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質、および糖化タンパク質からなる群から独立して選択される請求項9または10に記載の使用。
- 前記食品調製物が、飲料、ヨーグルト、ジュース、アイスクリーム、パン、ビスケット、シリアル、健康バー、およびスプレッドからなる群から選択される請求項10に記載の使用。
- 前記菌株が、約1×106〜約1×1014CFU、好ましくは約1×108〜約1×1012、そしてより好ましくは約1×109〜約1×1011の量で組成物中に存在する請求項1〜12のいずれか一項に記載の使用。
- 低細菌多様性(LBD)を発生することに対して健康な個体を予防的に治療するため、1つまたは複数の生理的撹乱状態、大腸細菌過剰増殖(LIBO)または小腸細菌過剰増殖(SIBO)を発生することに対してLBDを有する個体を予防的に治療するため、そして1つまたは複数の生理的撹乱状態を発生することに対してLIBOまたはSIBOを有する個体を予防的に治療するための組成物を製造するためのラクトバチルス・プランタルムの1つの菌株の使用。
- トランスロケーションが前記生理的撹乱状態の1つである請求項14に記載の使用。
- 細菌多様性を改善および/または増大させ、そして腸における小腸細菌過剰増殖(SIBO)および大腸細菌過剰増殖(LIBO)を根絶することによって、場合により小腸細菌過剰増殖(SIBO)および/または大腸細菌過剰増殖(LIBO)によって誘発される、個体の消化(GI)管内の低細菌多様性(LBD)に基づいたあるいは関連した前記生理的撹乱状態の1つまたは多数を治療するための組成物を製造するための請求項14に記載の使用。
- 前記ラクトバチルス・プランタルムが、ラクトバチルス・プランタルム299、DSM6595、ラクトバチルス・プランタルム299v、DSM9843、ラクトバチルス・プランタルムHEAL−9、DSM15312、ラクトバチルス・プランタルムHEAL−19、DSM15313、およびラクトバチルス・プランタルムHEAL−99、DSM15316からなる群から選択される請求項14に記載の使用。
- 前記組成物が、液体製剤または固体製剤である請求項15〜17のいずれか一項に記載の使用。
- 前記固体製剤が、錠剤、吸引錠剤、スウィート、咀嚼錠剤、チューインガム、カプセル、サシェ、粉末、顆粒、被覆粒子および被覆錠剤、腸溶性の錠剤およびカプセル、ならびに溶融ストリップおよびフィルムからなる群から選択される請求項18に記載の使用。
- 前記液体製剤が、経口溶液、懸濁液、乳濁液およびシロップからなる群から選択される請求項18に記載の使用。
- 前記組成物が、キャリア材料を含む請求項14〜20のいずれか一項に記載の使用。
- 前記医薬組成物が、医療用食品、機能性食品、栄養補助食品、栄養製品または食品調製物である請求項14〜21のいずれか一項に記載の使用。
- 前記キャリア材料が、オートミール粥、乳酸発酵食品、難消化性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質、および糖化タンパク質からなる群から独立して選択される請求項21または22に記載の使用。
- 前記食品調製物が、飲料、ヨーグルト、ジュース、アイスクリーム、パン、ビスケット、シリアル、健康バー、およびスプレッドからなる群から選択される請求項22に記載の使用。
- 前記菌株が、約1×106〜約1×1014CFU、好ましくは約1×108〜約1×1012、そしてより好ましくは約1×109〜約1×1011の量で組成物中に存在する請求項14〜24のいずれか一項に記載の使用。
- プラセボと比較して増大した多様性指数差を生じることを目的として個体にラクトバチルス・プランタルムの1つの菌株を投与することによって消化管の多様性を増大させるための方法。
- 前記増大した多様性指数が、酵素としてHaeIIIを用い、そしてシャノン−ウィーナーの指数およびシンプソンの多様性指数を用いてT−RFLP法によって測定される請求項26に記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の増大した多様性指数差を生じる際に使用するため、および/または請求項14〜25のいずれか一項に記載の予防的治療において使用するためのラクトバチルス・プランタルム菌株。
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