JP2015096549A - リスペリドンイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

【課題】体液中のリスペリドン及びパリペリドンを定量及びモニタリングする。
【解決手段】新規なコンジュゲート並びにリスペリドンに由来する免疫原及びこれらの免疫原によって産生される抗体は、体液中のリスペリドン及びパリペリドンを定量及びモニタリングするためのイムノアッセイにおいて有用である。
【選択図】なし

Description

本発明は、治療期間中の最適薬物濃度を迅速に決定するためにヒト体液においてリスペリドン及び薬理学的に活性なその代謝産物であるパリペリドンの存在の決定及び／又は量の定量をするためのイムノアッセイの分野に関する。

統合失調症は、世界の人口の約１％に影響を及ぼしている重症の精神医学的障害である。統合失調症の臨床症状としては、妄想、幻聴、支離滅裂な思考及び発言、社会的離脱、意欲の欠如、及び、例えば支離滅裂な思考及び記憶障害のような認知機能障害等が挙げられる。この障害は、ドーパミン及びセロトニンのレベルを含む神経学的欠損と、抑制性介在ニューロン欠損との組合せによって惹起されると考えられている（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，２００３，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４９（１８）：１７３８−１７４９）。統合失調症は、一般に抗精神病薬又は神経遮断薬と呼ばれる、神経伝達物質及び受容体を標的とする薬剤で治療することができる。

「非定型抗精神病薬」又は「第二世代抗精神病薬」と呼ばれる一クラスの抗精神病薬には、ベンゾイソオキサゾール誘導体である、リスペリドン（Ｉ）が含まれる。リスペリドンは、米国にあるＪａｎｓｓｅｎ−ＣｉｌａｇによってＲｉｓｐｅｒｄａｌ^{（登録商標）}の下で販売されており、セロトニン（５−ＨＴ_２Ａ）及びドーパミン（Ｄ_２）の受容体を標的として、そのそれぞれの神経伝達物質の取り込みを阻害する（Ｐａｃｋａｇｅ−Ｉｎｓｅｒｔ−Ｒｉｓｐｅｒｄａｌ，２００９，Ｊａｎｓｓｅｎ Ｃｉｌａｇ）。リスペリドンは、ヒトにおいてチトクロームＰ４５０アイソフォームＣＹＰ２Ｄ６によって生物学的に活性な９−ヒドロキシ代謝産物であるパリペリドン（ＩＩ）に代謝される。双方が同様のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を有することが示されているので、共にこれらは「活性部分」を構成し、ひとまとめにしてモニタリングしなければならない（Ｍａｎｎｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔ．＆ Ｄｉｓｐ．，２１（６）：１１３４−１１４１）。パリペリドン自体は、近年、ＦＤＡによって統合失調症の治療薬として承認されており、Ｊａｎｓｓｅｎ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａによってＩｎｖｅｇａ^{（登録商標）}のもとで販売されている（Ｐａｃｋａｇｅ−Ｉｎｓｅｒｔ−Ｉｎｖｅｇａ，２００９，Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ）。

リスペリドンは、以下の式を有する：

パリペリドンは、以下の式を有する：

リスペリドン及びパリペリドンの「活性部分」は定常状態血漿中濃度において最高で１３倍の患者間変動性を有すること並びにこの変動性が効力及び安全性に影響を与え得ることが示されている（Ｓｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５３（２）：２３８−２４３；Ａｒａｖａｇｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒ．，２５（６）：６５７−６６４；Ｒｉｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｅｕｒ．Ａｒｃｈ．Ｐｓｙｃｈ．ａｎｄ Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２５５（４）：２６１−２６８）。

リスペリドン及びパリペリドンの効力はより高いトラフ値レベルで増大し、この薬剤は広範囲にわたる患者内薬物動態学的変動を示すので、血液中のこの薬剤の濃度をモニタリングして目標レベルに調整することは、効力を増大させて毒性を最小限に抑えるのに重要なはずである（Ｒａｇｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１：２９９−３１６；Ｍｕｓｅｎｇａ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．．Ｃｈｅｍ．，１６（１２）：１４６３−１４８１）。リスペリドン及びその誘導体の、個体内及び個体間の薬物動態学的変動の程度は、１３倍になることが報告されており、以下を含む、多くの因子によって影響される：
○年齢
○体重
○臓器機能
○薬剤−薬剤相互作用
○遺伝的調節
○コンプライアンス

この変動の結果として、異なる個体における等用量の同一薬剤によって臨床転帰が劇的に異なる結果となり得る。同一投与量のリスペリドン及びパリペリドンの有効性は、患者における個々の薬物クリアランス及び最終的な血清中薬物濃度に基づいて著しく変化する。治療薬管理により、臨床医が薬剤投与の際の患者の変化を洞察できるようになるはずである。治療薬管理を行えば、薬剤投与量を患者に合わせて個別化することができ、望ましくない副作用なく該障害を有効に治療する可能性がかなり高くなるであろう。

さらに、リスペリドン及びパリペリドンの治療薬管理は、実際の所定投与量のある抗精神病薬を投与する際のコンプライアンス（Ｖａｌｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈ．，６７（１０）：１５４２−１５５０；Ｔｒｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，ＢＭＣ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖ．Ｒｅｓ．，９：９）及び有効な血清中濃度レベルの達成を確実にする優れた手段として役立つはずである。リスペリドン及びパリペリドンの日常的な治療薬管理には、一般実験機器に適合可能な簡単な自動化された試験を利用できることが必要とされるであろう。ヒトの血液中及び血漿中のリスペリドン及びパリペリドンの濃度を決定するための、ＵＶ検出又はマススペクトロスコメトリー検出を用いた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の使用は、記載されている（Ｂａｌａｎｔ−Ｇｏｒｇｉａ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒ．，２１（１）：１０５−１１５；Ｓｃｈａｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６０（１）：５１−５６；Ｆｒａｈｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ，７９４（１）：３５−４７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍ．，２２（７）：６７１−６８７）。これらの方法は、労働集約的であり、液液抽出又は固相抽出を必要とするので、高価な装置を使用し、日常的な臨床検査での使用に受け入れられるものではない。現在までのところ、リスペリドン及び／又はパリペリドンを、これらの抗精神病薬で治療した患者のヒト体液中で測定するためのイムノアッセイはない。

上記からわかるように、ヒト体液においてリスペリドン及び／又はパリペリドンの存在の決定及び／又は量の定量をするためのイムノアッセイはない。イムノアッセイによるリスペリドン及びパリペリドンの日常的な治療薬管理により、標準実験機器に適合した簡単な自動化された試験が可能となるはずである。しかし、こうしたイムノアッセイを可能にするためには、リスペリドン及びパリペリドンに選択的な抗体を作製する必要がある。このアッセイにおいて使用される誘導体及び免疫原は、作製された対応するそれらの抗体を通して、治療的に活性若しくは不活性な、又は薬理学的に活性若しくは不活性な、リスペリドン及びパリペリドンの他の代謝産物に対するいかなる実質的な交差反応性もなく、リスペリドン及びパリペリドンに対する選択的反応性を付与しなければならない。薬剤レベルのモニタリングにおいて有効であるためには、該抗体は、リスペリドン及びパリペリドンに選択的でなければならず、薬学的又は薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの代謝産物と交差反応性であってはならない。主要な薬学的又は薬理学的に不活性な代謝産物は、７−ヒドロキシリスペリドン（Ｖ）又はＮ−デアルキルリスペリドン（ＶＩ）であり（Ｍａｎｎｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔ．＆ Ｄｉｓｐ．，２１（６）：１１３４−１１４１；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０（１）：１９−３０）、これらの代謝産物は以下の式を有する：

イムノアッセイにおいて有効であるためには、これらの抗体は、薬学的又は薬理学的に不活性な代謝産物である、７−ヒドロキシリスペリドンＶに対して実質的に低い反応性を有すると同時に、薬学的又は薬理学的に不活性な他の代謝産物、特に、Ｎ−デアルキルリスペリドンＶＩに対しては反応性を実質的に全く又は少しも有していない必要がある。これは、該代謝産物、７−ヒドロキシリスペリドンＶが、リスペリドン及びパリペリドンからきわめて少ない量で生成されるのみであるためである。

本発明によれば、リスペリドン及びパリペリドンに対して選択的に反応性であり、薬理学的又は薬学的に不活性なこれらの代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドンに対してはほとんど実質的に反応性でなく、Ｎ−デアルキルリスペリドン等の薬理学的又は薬学的に不活性なこれらの他の代謝産物に対してはいかなる実質的な交差反応性もないように、リスペリドン及びパリペリドンに対して実質的に選択的に反応性である、新しい一クラスの抗体が作製されている。選択的に反応性とは、この抗体がリスペリドン及びパリペリドンと反応し、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドンとの実質的な反応性をほとんど有しておらず、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの他の代謝産物、特に、Ｎ−デアルキルリスペリドンとの実質的な交差反応性を有していないことを意味する。該代謝産物、７−ヒドロキシリスペリドンＶは、リスペリドン及びパリペリドンから、この代謝産物を形成するのに使用されるリスペリドン及びパリペリドンの重量を基準として、５重量％未満の、きわめて少ない量で生成されるのみであるので、これらの特性は、本発明のイムノアッセイを可能にするために重要である（Ｍａｎｎｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔ．＆ Ｄｉｓｐ．，２１（６）：１１３４−１１４１）。したがって、ヒト体液試料において、これらのイムノアッセイを行う際に、リスペリドン及びパリペリドンで治療した患者のヒト試料中の７−ヒドロキシリスペリドンは、たとえあるとしても、ほとんどないことになる。これらの抗体には薬学的又は薬理学的に活性でないリスペリドン及びパリペリドンのこれらの代謝産物に対するこうした反応性及び交差反応性があるので、これらの代謝産物が、ヒトの体液中のリスペリドン及びパリペリドンの存在及び量の、イムノアッセイによる、正確な決定を妨げることはない。

次式の化合物：

［式中、Ｂは、

であり、
Ｙは、有機スペーサー基であり、
Ｘは、担体に結合することができる末端官能基であり、
ｐは、０から１までの整数である］
との免疫原性ポリアミンポリマーのコンジュゲートである免疫原を使用することによって、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドンとの反応性を実質的にほとんど有しておらず、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの他の代謝産物、特に、Ｎ−デアルキルリスペリドンと実質的に交差反応しないという点でリスペリドン及びパリペリドンに選択的な抗体が産生されることが見出されている。

上記のような、リスペリドン及びパリペリドンと実質的に選択的に反応し、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの代謝産物とはほとんど又は全く交差反応性を有していない、これらの抗体の提供により、リスペリドン及びパリペリドンで治療している患者の体液試料中のリスペリドン及びパリペリドンをモニタリングするために特異的に検出及び定量することができるイムノアッセイを行うことが可能となる。本発明にさらに含まれるのは、前記イムノアッセイ用の試薬及びキットである。

本発明によれば、リスペリドン及びパリペリドンと実質的に選択的に反応し、本明細書中で上述したような代謝産物との実質的な反応性又は交差反応性を有していない又はほとんど有していない、新しい一クラスの抗体が得られる。式ＩＩＩのリスペリドンのこれらの誘導体を免疫原として使用することによって本発明の新しい一クラスの抗体が得られることが発見された。これらの抗体を使用することにより、血液、血漿又は他の体液の試料中のリスペリドン及びパリペリドンを検出及び／又は定量するためのこうしたイムノアッセイ用の試薬及びキットを含めて、イムノアッセイが開発された。このイムノアッセイを使用することにより、リスペリドン及びパリペリドンの、これらの治療薬で治療した患者の体液試料中での存在及び量を検出及び／又は定量することができる。この方法では、リスペリドン又はパリペリドンで治療している患者を療法期間中にモニタリングすることができ、前記モニタリングに従ってその患者の治療を調整する。本発明により、治療用抗精神病薬としてリスペリドン又はパリペリドンで治療している精神病患者、特に、統合失調症患者におけるリスペリドン及び／又はパリペリドンの治療薬管理が実現する。検出される治療用抗精神病薬は、式Ｉのリスペリドン及び／又は薬理学的に活性なその代謝産物である式ＩＩのパリペリドンである。

本発明の抗体は、薬学的に活性な抗精神病薬であるリスペリドン及びパリペリドンを検出する方法を可能にする。本発明の抗体は、リスペリドン及びパリペリドンの双方と反応性であるので、リスペリドン及びパリペリドンの双方の検出に利用され得る。したがって、リスペリドンで治療する患者のイムノアッセイ並びにパリペリドンで治療する患者のイムノアッセイのいずれにおいても、これらの抗精神病薬のうちいずれか１種の投与をモニタリングするためにこれらを使用することができる。パリペリドンはリスペリドンの薬学的に活性な代謝産物であるので、これは本当である。このような方法で、リスペリドンで治療する患者をモニタリングして、その患者の試料中のリスペリドン若しくはパリペリドン又は双方の存在を決定することができる。患者をリスペリドンで治療する場合に患者の試料中のこれらの薬剤の双方の量を定量することにより、どのくらいのリスペリドンを患者に投与するべきか、及びどのようにリスペリドン療法を調節するかを決定することになる。パリペリドンについては、リスペリドンの代謝産物であるので、リスペリドンは、パリペリドンで治療した患者のヒト試料中に、たとえあるとしても、ほとんどないであろう。したがって、このイムノアッセイにより、パリペリドンで治療した患者をモニタリングして患者の試料中のパリペリドンの存在を決定することもできる。同様の方法で、患者をパリペリドンで治療する場合に患者の試料中のパリペリドンの量を定量することにより、どのくらいのパリペリドンを患者に投与するべきか、及びどのようにパリペリドン療法を調節するかを決定することになる。

本発明のイムノアッセイは、これらの抗精神病薬の一方又は双方で治療した患者の試料を含有する混合物を用意し、この試料を本発明の抗体及び式ＩＩＩのリガンドと担体のコンジュゲートと共に含有する混合物を用意することによって行われる。この方法において、薬学的に活性な抗精神病薬及び前記試料中の該コンジュゲートは抗体と結合することになり、この結合から、コンジュゲートの量を決定することから、患者の試料中の抗精神病薬の量を算出することができる。

あらゆる患者の試料を使用することができる。一般に、患者の試料は、これらの薬剤の一方又は双方で治療した患者から採取された血液試料であり得ることが好ましい。これにより、これらの抗精神病薬を用いた患者の治療を継続的にモニタリングする簡単な方法が可能となるであろう。

本発明のアッセイにおいて利用される試薬は、ポリマー担体と式ＩＩＩの化合物とのコンジュゲートである。これらのコンジュゲートは、本発明の抗体との結合について、試料中に存在するリスペリドン及びパリペリドンと競合的な結合パートナーである。したがって、該抗体に結合するコンジュゲート試薬の量は、試料中のリスペリドン及びパリペリドンの量に反比例することになる。本発明によれば、該アッセイは、該抗体に結合している又は結合していない前記コンジュゲートの量を検出及び測定するための従来の任意の測定方法を利用する。前記方法の使用により、結合している又は結合していないコンジュゲートの量を測定することができる。一般に、試料中のリスペリドン及びパリペリドンの量は、試料中のリスペリドン及びパリペリドンによって得られる、結合している又は結合していないコンジュゲートの測定量を、既知量のリスペリドン及び／又はパリペリドンを含有する試料で得られた標準曲線又は較正曲線から決定された、結合している又は結合していないコンジュゲートの値と関連付けることによって決定され、この既知量は、試験する試料について予想される範囲内にある。較正曲線を作成するためのこれらの試験は、試料に使用したのと同様のイムノアッセイ法を使用して決定される。

定義
本明細書の全体にわたり、以下の定義を理解しておくべきである：

本出願の全体にわたり、「Ｐｈ」という用語は、フェニル基を意味する。「アルキレン」という用語は、１から１０個までの炭素原子を含む２価の飽和した直鎖又は分岐鎖の炭化水素置換基を意味する。

「免疫原」及び「免疫原性」という用語は、生物において免疫応答を誘発、生成、又は発生させることができる物質を指す。

「コンジュゲート」という用語は、別々の部分を結合させて一緒にすることから形成されるあらゆる物質を指す。本発明による代表的なコンジュゲートとしては、式ＩＩＩの化合物のような小分子と、担体又はポリアミンポリマー、特に、タンパク質のような大分子とを結合させて一緒にすることによって形成されるものが挙げられる。該コンジュゲートにおいて、小分子は、大分子上の１つ又は複数の活性部位で結合され得る。コンジュゲートという用語には、免疫原という用語も含まれる。

「ハプテン」は、部分的又は不完全な抗原である。これらは、タンパク質を含んでいない物質、大抵は低分子量の物質であり、抗体形成を刺激することはできないが、抗体と反応する。後者は、ハプテンを高分子量の免疫原性担体にカップリングさせることと、次いで、このカップリングされた生成物、すなわち、免疫原をヒト又は動物の対象に注射することとによって形成される。本発明のハプテンは、リスペリドンである。

本明細書において、「スペーサー基」又は「スペーサー」とは、ハプテン、担体、免疫原、標識、又はトレーサーのような２つ以上の部分構造を官能リンカー基を通して連結する化学構造の一部を指す。これらのスペーサー基については、本出願において以下に列挙することになる。スペーサー基の原子及びスペーサー基中の鎖の原子は、それら自体が化学結合によって連結されている。中でも好ましいスペーサーは、直鎖又は分岐状の、飽和又は不飽和の炭素鎖である。これらの炭素鎖は、鎖中又は鎖の末端に１つ又は複数のへテロ原子も含み得る。「ヘテロ原子」とは、酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される炭素以外の原子を意味する。スペーサー基は、鎖の一部として又は鎖中の原子のうちの１個の上にある置換基として環状又は芳香族の基も含み得る。

該スペーサー基中の原子の数は、水素以外の原子を計数することによって決定される。スペーサー基中の鎖中の原子の数は、連結されている部分構造間の最短経路に沿った水素以外の原子の数を計数することによって決定される。官能リンカー基は、ハプテンと標識又は担体若しくはポリアミンポリマーとのコンジュゲートを合成するためのハプテン又はスペーサー基を活性化するために、例えば、その上に利用可能な官能部位を提供するために、使用され得る。

本明細書において、「免疫原性担体」という用語は、この場合にはリスペリドンである、ハプテンと１つ又は複数の部位で結合することができ、それによってこれらのハプテン誘導体が免疫応答を誘導してこれらのハプテンと特異的に結合できる抗体の産生を誘発するのを可能にする、一般的にはタンパク質である、免疫原性物質である。免疫原性担体及びリンカー基については、本出願において以下に列挙することになる。免疫原性担体物質には、異物として認識され、それによって宿主からの免疫応答を誘発する、タンパク質、糖タンパク質、複合ポリアミノ−多糖、粒子、及び核酸が含まれる。ポリアミノ−多糖は、その調製で知られている従来の方法のうちの任意のものを使用して多糖から調製することができる。

多様なタンパク質の型も、ポリ（アミノ酸）免疫原性担体として用いられ得る。こうした型としては、アルブミン、血清タンパク質、リポタンパク質等が挙げられる。例示的なタンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵オボアルブミン、ウシサイログロブリン（ＢＴＧ）等が挙げられる。代替的に、合成ポリ（アミノ酸）が利用され得る。

免疫原性担体には、単糖の繰り返し縮合によって構築された高分子量ポリマーである、ポリアミノ−多糖も含まれ得る。多糖の例は、デンプン、グリコーゲン、セルロース、アラビアガムのような炭水化物ガム、及び寒天等である。多糖には、ポリ（アミノ酸）残基及び／又は脂質残基も含まれる。

免疫原性担体は、単独のポリ（核酸）、又は上述のポリ（アミノ酸）若しくは多糖のうちの一方とコンジュゲートしたポリ（核酸）のいずれかであってもよい。

免疫原性担体は、固体粒子も含み得る。該粒子は、一般に、直径が、少なくとも約０．０２ミクロン（μｍ）であり、約１００μｍを超えず、通常は、約０．０５μｍから１０μｍまでである。該粒子は、有機又は無機、膨潤性又は非膨潤性、多孔性又は非多孔性であってもよく、最適には、水に近い、一般に約０．７から１．５ｇ／ｍＬまでの密度を有し、透明、部分的に透明、又は不透明であり得る物質を含んでいてもよい。該粒子は、赤血球、白血球、リンパ球、ハイブリドーマ、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及びウィルス等の非限定的な例を含む、細胞及び微生物のような生体物質であってもよい。該粒子は、有機及び無機のポリマー、リポソーム、ラテックス、リン脂質小胞、又はリポタンパク質も含み得る。

「ポリ（アミノ酸）」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸から形成されたポリアミドである。ポリ（アミノ酸）は、分子量の上限を有さず、一般に約２，０００の分子量からの範囲に及ぶことになり、普通は１０，０００，０００未満、通常は約６００，０００ダルトン未満である。免疫原性担体又は酵素が含まれているかどうかによって、通常は異なる範囲もあろう。

「ペプチド」は、アミド（ペプチド）結合による２個以上のアミノ酸の結合によって形成されたあらゆる化合物であり、通常は、（ＮＨ_２末端以外の）各アミノ酸残基のα−アミノ基が隣の残基のα−カルボキシル基に直鎖状に結合しているα−アミノ酸のポリマーである。ペプチド、ポリペプチド及びポリ（アミノ酸）という用語は、本明細書において、大きさについて限定することなくこのクラスの化合物を言及するのに同義的に使用される。このクラスの中で最も大きなものはタンパク質と呼ばれる。

「標識」、「ディテクター分子」、又は「トレーサー」は、検出可能なシグナルを生成するか、又はその生成を誘導することができるあらゆる分子である。標識は、検体、免疫原、抗体に、又は別の分子、例えば受容体若しくは受容体に結合可能な分子、例えばリガンド、特にハプテン等にコンジュゲートさせることができる。標識の非限定的な例としては、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、触媒、フルオロフォア、色素、化学発光体、発光体、又は増感剤；非磁性粒子若しくは磁性粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、又は受容体等が挙げられる。

「抗体」という用語は、抗原の特異的タンパク質結合パートナーを指し、他の物質を排除して抗原に対して特異的な結合親和性を有する、あらゆる物質、又は物質群である。抗体という総称には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗体フラグメントが含まれる。

「誘導体」という用語は、１つ又は複数の化学反応によって親化合物から生成された化学的な化合物又は分子を指す。

「担体」という用語は、固体粒子及び／又は、例えば、上述のもののような免疫原性ポリマー等の、高分子ポリマーを指す。担体が固体粒子の場合には、式ＩＩＩの化合物中の末端官能基Ｘに結合するための１つ又は複数の反応部位を提供するために、ポリアミンポリマーが、固体粒子に結合、コーティング、又はそれ以外では付加されていてもよい。

「試薬キット」、又は「試験キット」という用語は、アッセイを行う際に使用される材料の集合体を指す。試薬は、それらの交差反応性及び安定性に依存して、同一又は別々の容器中に、液体又は凍結乾燥された形態でパッケージングされた組合せで提供されてもよい。キットで提供する試薬の量及び比率は、特定の用途で最適の結果が得られるように選択することができる。本発明の特徴を実現する試薬キットは、リスペリドン及びパリペリドンに特異的な抗体を含む。キットは、検体のリガンド並びに較正物質及び対照物質を更に含んでいてもよい。試薬は、液体の形態のままであってもよく、又は凍結乾燥されていてもよい。

「較正物質及び対照物質」という語句は、既知量の測定する薬剤を含有するあらゆる標準物質又は参照物質を指す。薬剤の濃度は、未知の試料で得られた結果を標準物質で得られた結果と比較することによって算出される。これは、一般的には、較正曲線を作成することによって行われる。

「生体試料」という用語は、生物又は元生物からの任意の量の物質を含むが、これらに限定されない。こうした生物としては、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、ウマ、及び他の動物等が挙げられるが、これらに限定されない。こうした物質としては、血液、血清、血漿、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ液、リンパ節、滑膜組織、軟骨細胞、軟骨細胞、滑膜マクロファージ、内皮細胞、及び皮膚等が挙げられるが、これらに限定されない。

試薬及び免疫原
抗体に基づいたイムノアッセイにおいて、リスペリドンのコンジュゲートは、試料中でその抗体上の結合部位についてリスペリドン及びパリペリドンと競合するように構築される。本発明のイムノアッセイにおいて、式ＩＩＩの試薬は、式ＩＩのパリペリドンの９−ヒドロキシル基上に形成された、酸素置換されたリスペリドン誘導体である。式ＩＩＩの化合物において、リンカースペーサーは、この分子の「Ｙ−Ｘ」部分を構成する。これらのリンカーＸ及びスペーサーＹは、イムノアッセイ用のコンジュゲート及び抗体産生用の免疫原を調製する際の従来型である。イムノアッセイ用のコンジュゲート及び抗体産生用の免疫原を調製するのに利用される従来のスペーサー−リンカー基のうちの任意のものを、式ＩＩＩの化合物において利用することができる。こうした従来のリンカー及びスペーサーは、米国特許５，５０１，９８７及び米国特許５，１０１，０１５に開示されている。

該コンジュゲート並びに該免疫原は、式ＩＩの化合物から調製される。ハプテンを有する担体のコンジュゲート又は免疫原において、該担体は、該担体のポリアミンポリマー部分が含む１個又は複数の反応性アミノ基に対して、１つに又は複数の位置で、次式を有するハプテン：

［式中、Ｘ’は、−ＣＨ_２又は官能リンカー基であり、Ｂ、ｐ及びＹは、上記の通りである］
に結合される。

好ましいスペーサー基の中には、本明細書中で前述したスペーサー基が含まれる。特に好ましいスペーサー基は、１から１０までの炭素原子を含むアルキレン、

［式中、ｎ及びｏは、０から６までの整数であり、ｍは、１から１０までの整数であり、アルキレンがあれば特に好ましいスペーサー基となる］
等の基である。

式ＩＶの化合物において、式中、Ｘ’は、好ましくは高分子担体上の反応性アミン基を通して、スペーサーを結合している官能基である。基Ｘ’は、式ＩＩＩの化合物中の末端官能基Ｘが、担体又は免疫原のポリアミンポリマー中の反応性アミノ基に結合した結果である。アミノ基と反応することができるいずれの末端官能基も、式ＩＩＩの化合物中の官能基Ｘとして利用することができる。Ｘ中に含まれていることが好ましいこれらの末端官能基は、以下のものである：

［式中、Ｒ_３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシルであるか、又は結合した酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ_４は、酸素又は硫黄である］。基−Ｎ＝Ｃ＝Ｒ_４は、イソシアネート又はイソチオシアネートであってもよい。Ｒ_３によって形成される活性エステルとしては、例えばＮ−ヒドロキシスクシンアミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びｐ−ニトロフェニルエステルのような、イミドエステル等が挙げられる。しかし、アミン基と反応可能なあらゆる活性エステルを使用することができる。

カルボン酸基及び活性エステルは、従来の方法によって担体又は免疫原性ポリマーに結合される。タンパク質等の、ポリアミンポリマー上のアミン基は、本発明のポリマー、免疫原又は担体及び／又はコンジュゲートにスペーサーを連結するアミド基を生成する。

本発明の免疫原及びコンジュゲートにおいて、カルボキシル基を含む式ＩＩＩのハプテンと、担体又は免疫原が含むポリアミンポリマー上の反応性アミノ基との間の化学結合は、当業者に知られている多様な方法を使用して形成され得る。アミド結合の形成が好ましいことが多い。アミド結合は、まず、式ＩＩＩの化合物中のＸを形成するカルボン酸部分を活性化し、次いで、このカルボキシ基を脱離基試薬（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノール等）と反応させることによって形成される。ジシクロヘキシルカルボジイミド、及びジイソプロピルカルボジイミド等の任意の活性化試薬を使用することができる。式ＩＩＩの化合物中のＸを形成するカルボン酸部分は、塩化チオニル、及び臭化チオニル等を使用してそれぞれの酸ハロゲン化物に変換することによっても活性化することができる。次いで、式ＩＩＩのリスペリドンハプテン中の活性化型のカルボキシル基を、反応性アミノ基を有する担体を含有する緩衝溶液と反応させる。

式ＩＩＩの化合物中の、Ｘがアルデヒド基を含む場合、これらの化合物を、還元的アミノ化によるアミン結合を通して担体上のポリアミンポリペプチドの遊離アミノ基に連結することもできる。アルデヒドをアミンと縮合させるあらゆる従来法、例えば還元的アミノ化を通したものなどを、この結合を形成するのに使用することができる。この場合には、式ＩＶのリガンド部分中のＸ’は、−ＣＨ_２−である。

一方、Ｘが、式ＩＩＩの化合物中の、末端のイソシアネート基又はチオイソシアネート基−Ｎ＝Ｃ＝Ｒ_４である場合、これらの基は、ポリアミンポリマーの遊離アミンと反応して、Ｘ’がポリアミン担体又は免疫原性ポリペプチド上にアミノ基を有する式ＩＶのコンジュゲート又は免疫原を生成する。

式ＩＩＩの化合物は、これらの化合物を、ポリアミン又はポリペプチドを含む担体と反応させることによって本発明の免疫原及び／又はコンジュゲート試薬に変換することができる。ポリアミン又はポリペプチドが免疫学的に活性であるならば、同一のポリペプチドを、本発明の免疫原において担体として、また免疫原性ポリマーとして利用することができる。しかし、コンジュゲートを形成するために、これらのポリマーは、免疫原に必要とされるような免疫学的応答を生成する必要はない。本発明によれば、式ＩＩＩの化合物中でＸによって表される多様な官能基は、ポリマー中に含まれるアミノ基に官能基を付加する従来の方法によって、反応性アミノ基を有するポリマーを含む担体にコンジュゲートさせることができる。好ましい一実施形態によれば、式ＩＩＩの化合物において、Ｘは、カルボン酸基又はその活性エステルである。

式ＩＩＩの化合物は、次式の化合物：

から形成され得る。

式ＩＩＩの化合物は、次式の化合物

から形成される。
式中、Ｂ、Ｙ及びＸは、上記の通りである。

式ＩＸ−Ａの化合物を、式中のＢが−Ｏ−ＣＨ_２−である式Ｘの化合物の誘導体に変換する際には、式ＩＸ−Ａの化合物を、次式の化合物

［式中、ｐ、Ｙ及びＸは、上記の通りである］
と反応させる。

これらの誘導体を形成する際に、アルコールを反応させてエーテルを形成するあらゆる従来の方法を、式ＸＩ−Ａのハロ化合物を式ＩＸ−Ａの化合物上のヒドロキシ基と縮合させるのに利用することができる。式ＸＩ−Ａの化合物中のハロゲン化物を使用することにより、アルコールと縮合させることによってエーテルを形成する効率的な方法が可能になる。一方、式ＸＩ−Ａの化合物が、これらの誘導体を形成するためのこの反応を妨げる可能性のある官能基を含む場合には、これらの官能基を、本明細書中で上記したような反応の後に除去することができる好適な保護基によって保護することもできる。

式中のＢが

である式Ｘの化合物では、任意の従来のエステル化の方法を利用して、式ＩＸ−Ａの化合物中の遊離ヒドロキシ基を、次式の化合物

［式中、Ｙ、Ｘ及びｐは、上記の通りである］
と反応させる。エステル化の前に、式ＩＸ−Ａの化合物上のアミノ基を、任意の従来のアミノ保護基を利用して保護することもできる。

式中のＢが

である式Ｘの化合物の誘導体は、本明細書中で上述したカルボキシレート活性化の任意の従来の方法を使用して式ＩＸ−Ｃの化合物上のカルボキシル基を最初に活性化した後に、式ＩＸ−Ｂの化合物上のカルボキシル基を、次式のアミノ化合物：
ＮＨ_２−ＣＨ_２−（Ｙ）_ｐ−Ｘ ＸＩ−Ｃ
［式中、Ｘ、Ｙ及びｐは、上記の通りである］
と反応させることによって生成される。この反応の前に、式ＸＩ−Ｃの化合物上の反応基を、本明細書中で上記したように従来の保護基で保護することもできる。これらの保護基は、本明細書中で前記したような従来の方法によってこのアミド化の後に除去することができる。アミノ基を保護するあらゆる方法を、式Ｘの化合物について使用することができる。このアミノ保護基は、従来の方法によって除去することができる。

式中のＢが

である式Ｘの化合物の誘導体は、本明細書中で上述したカルボキシレート活性化の任意の従来の方法を使用して式ＩＸ−Ｂの化合物上のカルボキシル基を最初に活性化した後に、式ＩＸ−Ｂの化合物上のカルボキシル基を、次式のヒドロキシ化合物：
ＨＯ−ＣＨ_２−（Ｙ）_ｐ−Ｘ ＸＩ−Ｄ
［式中、Ｘ、Ｙ及びｐは、上記の通りである］
と反応させることによって生成される。この反応の前に、式ＸＩ−Ｄの化合物上の反応基を、本明細書中で上記したように従来の保護基で保護することもできる。これらの保護基は、本明細書中で前記したような従来の方法によってこのエステル化の後に除去することができる。アミノ基を保護するあらゆる方法を、式Ｘの化合物について使用することができる。このアミノ保護基は、従来の方法によって除去することができる。

式中のＢが

である式Ｘの化合物の誘導体は、式ＩＸ−Ｃの化合物上のアミン基を、カルボキシレートを含む次式の化合物：
ＨＯＯＣ−ＣＨ_２−（Ｙ）_ｐ−Ｘ ＸＩ−Ｅ
［式中、Ｘ、Ｙ及びｐは、上記の通りである］
と反応させることによって生成される。

式ＩＸ−Ｃの化合物上のオルト位のアミンは、反応の前に従来の保護基で本明細書中で上記したように選択的に保護されなければならない。このアミド化反応は、本明細書中で上述したカルボキシレート活性化の任意の従来の方法を使用した式ＸＩ−Ｅのカルボキシレートの活性化の後に行われる。この反応の前に、式ＸＩ−Ｅの化合物上の反応基を、本明細書中で上記したように従来の保護基で保護することもできる。これらの保護基は、本明細書中で前記したような従来の方法によってこのアミド化の後に除去することができる。

式中のＢが

である式Ｘの化合物の誘導体は、式ＩＸ−Ｃの化合物上のアミン基を、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎｔｅ）又はイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｔｅ）を含む次式の化合物：

［式中、Ｘ、Ｙ及びｐは、上記の通りであり、Ｒ_４は、Ｏ又はＳである］
と反応させることによって生成される。

式ＩＸ−Ｃの化合物上のオルト位のアミンは、反応の前に従来の保護基で本明細書中で上記したように選択的に保護されなければならない。この縮合反応は、式ＸＩ−Ｆを化合物ＩＸ−Ｃの緩衝溶液に添加した後に行われる。この反応の前に、式ＸＩ−Ｆの化合物上の反応基を、本明細書中で上記したように従来の保護基で保護することもできる。これらの保護基は、本明細書中で前記したような従来の方法によってこの濃縮の後に除去することができる。

式Ｘの化合物は、式ＩＸの化合物からパリペリドンを合成する方法のうちの任意のものを利用して式ＩＩＩの化合物に変換することができる。この方法において、式Ｘの化合物中の官能基Ｘは、好適な保護基によって保護され、式ＩＩＩの化合物の形成の後に、この保護基を従来の方法によって除去することができる。

抗体
本発明は、上述の免疫原を利用することによって産生される、リスペリドン及びパリペリドンに対するモノクローナル抗体を含む新規な抗体にも関する。本発明によれば、本発明に従って作製されたこれらの抗体は、リスペリドン及びパリペリドンと選択的に反応することが見出されている。選択的に反応性であることとは、その抗体が、リスペリドン及びパリペリドンと反応し、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドンとの実質的な反応性をほとんど有しておらず、その反応性は、リスペリドン及びパリペリドンの双方との反応性に基づき、４０％未満、好ましくは２５％未満であり、その抗体が、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの他の代謝産物、特に、Ｎ−デアルキルリスペリドンと実質的に交差反応せず、他の代謝産物に対するその実質的な非交差反応性は、リスペリドン及びパリペリドンの双方との反応性に基づき５％未満であることを意味する。患者の体液試料中のリスペリドン及びパリペリドンの存在の検出及び／又は量の定量を正確に行うためのイムノアッセイを行うための抗体が得られるのは、これらの選択的な反応特性による。

本発明は、リスペリドン及びパリペリドンに対する新規抗体及びモノクローナル抗体に関する。本発明の抗血清は、本発明の免疫原で宿主動物を免疫化することによって都合よく作製することができる。好適な宿主動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯動物、又はヤギ、ヒツジ、ウマ等の高等哺乳動物等が挙げられる。初回投与、採血及び追加抗原注射は、動物において免疫応答を誘発するための受け入れられているプロトコルに従って行うことができ、例えば、好ましい一実施形態において、マウスに１００μｇ免疫原／マウス、腹腔内の初回投与及び６ヶ月間にわたり２回以上の５０〜１００μｇ免疫原／マウスの間のその後の追加抗原注射を行った。定期的な採血を通して、免疫化したマウスの血液試料で、従来のイムノアッセイを利用してリスペリドン及びパリペリドン結合に対する免疫応答の獲得が認められた。これらの方法により、所望の活性を有する抗血清を産生する宿主をスクリーニングする便利な方法が可能となる。該抗体は、リスペリドンの主な代謝産物であるパリペリドンに対してもスクリーニングされ、この化合物に対して実質的に結合することが示された。

リスペリドン及びパリペリドンと選択的に反応し、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドンとの実質的な反応性をほとんど有しておらず、リスペリドン及びパリペリドンの双方との反応性に基づき、４０％未満、好ましくは２５％未満の反応性を有し、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの他の代謝産物、特に、Ｎ−デアルキルリスペリドンと実質的に交差反応せず、他の代謝産物に対する実質的な非交差反応性は、リスペリドン及びパリペリドンの双方との反応性に基づき、５％未満である、該抗体は、式ＩＩＩの免疫原を利用して、以下に開示しているスクリーニング法によって作製することができる。このスクリーニング法を使用して、リスペリドン及びパリペリドンの化学療法剤の双方と反応性がある抗体を得ることができ、これは、これらの化学療法剤について任意の望ましい相対反応性を有するこれらの化学療法剤に対して特異的且つ選択的である。

これらの抗体の調製において、免疫原性担体を、式ＩＩＩの免疫原とコンジュゲートさせることができ、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯動物、又はヤギ、ヒツジ、ウマ等の高等哺乳動物等宿主動物の免疫化に使用することができる。式ＩＩＩの化合物に対する免疫応答の獲得は、ＢＳＡと式ＩＩＩの化合物とのコンジュゲートをコーティングしたマイクロタイタープレートを利用してＥＬＩＳＡによってモニタリングすることができる。一度免疫応答が十分に獲得されれば、宿主動物の脾細胞を単離して、不死化された細胞系と融合させることができる。モノクローナル抗体の作製に関して、この融合細胞を、９６ウェルプレート上に播種して、ハイブリドーマ細胞を選択するための選択培地の存在下で培養することができる。ハイブリドーマ上清及び抗血清を、ＥＬＩＳＡによって抗リスペリドン抗体の存在について試験することができる。陽性のＥＬＩＳＡ結果が得られたウェルからの抗体を、間接的競合マイクロタイタープレートアッセイによってリスペリドン及びパリペリドンの結合について試験することができる。リスペリドン、パリペリドン及びこれらの代謝産物等の検体のＩＣ_５０値を、このアッセイから算出することができる。アッセイにおける検体のＩＣ_５０（５０％での阻害濃度）は、阻害アッセイにおいてアッセイでのシグナルが検体の存在しないアッセイでの総シグナルの５０％であるときの試料中のその検体の濃度である。検体の選択的反応性は、％としてＩＣ_５０の表される以下の比率から算出される：１００％−（［ＩＣ_５０−検体／（ＩＣ_５０−リスペリドン＋ＩＣ_５０−パリペリドン）］×１００）。ＩＣ_５０の計算は、Ｄ．Ｗｉｌｄによって編集され、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍによって２００５に出版された、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｐｐ１０８−１１０，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ中で見出される方法に従って行われる。該式からわかるように、検体のＩＣ_５０は、検体の反応性に反比例する。１００％又は１００％付近を示したウェルからの細胞を限界希釈によってサブクローン化して、モノクローナル抗リスペリドン抗体を産生している個々のクローンを単離することができる。リスペリドン及びパリペリドンについて望ましい相対反応性を有するウェルからの細胞を限界希釈によってサブクローン化して、パリペリドンと十分に交差反応性であってこの薬剤にも選択的となるモノクローナル抗リスペリドン抗体を産生している個々のクローンを単離することもできる。

モノクローナル抗体は、上記のスケジュールに従ってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、その後、このマウスに１００μｇの免疫原を、細胞融合の３日前又は４日前から始めて連続して３日間、腹腔内又は静脈内に注射することによって作製するのが好都合である。抗体の技術分野においてよく知られている他のプロトコルも、当然同様に利用することができる。本明細書中で詳述している完全な免疫化プロトコルは、リスペリドン又は薬理学的に活性なその代謝産物であるパリペリドンに対する抗体の血清抗体応答に最適なプロトコルを実現した。

宿主の脾臓、末梢血、リンパ節又は他の組織から得られるＢリンパ球を、モノクローナル抗体産生細胞として使用することもできる。最も好ましいのは、脾臓から得られるＢリンパ球である。本発明の所望のモノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマは、こうしたＢリンパ球を、ハイブリッド細胞に長期間の組織培養安定性を付与する細胞系である不死細胞系と融合することによって得られる。本発明の好ましい実施形態において、不死細胞は、それ自体抗体産生細胞であるが悪性でもある、リンパ芽球腫細胞又は形質細胞腫細胞、例えば、骨髄腫細胞等であってもよい。リスペリドン又は薬理学的に活性なその代謝産物であるパリペリドンに対するモノクローナル抗体を産生する、ネズミ科動物のハイブリドーマは、マウスの骨髄腫細胞と、リスペリドン−タンパク質コンジュゲートに対して免疫化されたマウスからの脾細胞との融合によって形成される。キメラなヒト化モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞からの遺伝子を発現する抗体をクローン化し、当技術分野で現在よく知られている組換えＤＮＡ法を用いて、マウスの可変領域の部分配列をヒトの定常領域に結合するか、又はヒトのフレームワーク領域をドナーのマウス又はラットの免疫グロブリンからの相補性決定領域（ＣＤＲ）と結合するかのいずれかによって作製することができる。親和性が高められた抗体を提供する、ネズミ科動物のモノクローナル抗体をヒト化するための改良された方法は、国際特許出願ＷＯ９２／１１０１８に記載されている。

一次抗体構造の一部のみを含むポリペプチド断片を作製することもでき、この断片は１種又は複数の免疫グロブリン活性を有する。これらのポリペプチド断片は、当技術分野においてよく知られている方法により、完全な抗体をタンパク分解で切断することによって、又はＦａｂフラグメント又は（Ｆａｂ’）_２フラグメントを作製するための部位特異的変異生成を使用して、抗体遺伝子を含む発現ベクター内の所望の位置に終止コドンを挿入することによって作製することができる。単鎖抗体は、ＶＬ領域及びＶＨ領域をＤＮＡリンカーと結合することによって作製することができる（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３及びＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６を参照されたい）。

本発明の抗体は、リスペリドン及びパリペリドンに対して実質的に選択的に反応性であり、薬理学的又は薬学的に不活性なこれらの代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドンとの実質的な反応性をほとんど有しておらず、Ｎ−デアルキルリスペリドン等の薬理学的又は薬学的に不活性なこれらの他の代謝産物に対してはいかなる実質的な交差反応性もない。薬理学的又は薬学的に不活性なこれらの代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドンとの実質的な反応性をほとんど有していないこととは、本発明の抗体が、リスペリドン及びパリペリドンの双方に対するその合計の反応性に相対して、４０％未満、好ましくは２５％未満の、７−ヒドロキシリスペリドンに対する反応性を有することを意味する。７−ヒドロキシリスペリドン以外の薬理学的又は薬学的に不活性な代謝産物に対して実質的な交差反応性を全く有さないこと又はいかなる実質的な交差反応性もないこととは、本発明の抗体が、リスペリドン及びパリペリドンの双方に対するその合計の反応性に相対して、５％未満、好ましくは２％未満の、Ｎ−デアルキルリスペリドン等の薬理学的又は薬学的に不活性なこれらの他の代謝産物に対する交差反応性を有することを意味する。

イムノアッセイ
本発明によれば、該コンジュゲート及び式ＩＩＩの化合物の免疫原から産生される該抗体は、患者の試料中のリスペリドン及びパリペリドンの決定のための試薬として利用することができる。この決定は、イムノアッセイによって行われる。患者の試料中のリスペリドン及びパリペリドンの存在を決定するために、式ＩＩＩの化合物から形成される試薬コンジュゲートが、本発明に従って作製された抗体上の結合部位について、試料中のリスペリドン及びパリペリドンと競合するあらゆるイムノアッセイを利用することができる。リスペリドン及びパリペリドンを含有すると考えられる試料においてリスペリドン及びパリペリドンについてのこうしたアッセイを行う方法には、（ａ）水性媒体試料、（ｂ）本発明に従って作製された、リスペリドン及びパリペリドンに対する抗体、（ｃ）式ＩＩＩの化合物から形成される該コンジュゲート、又はこれらの混合物を組み合わせることが含まれる。試料中のリスペリドン及びパリペリドンの量は、該試料と抗体との混合物に添加された既知量のコンジュゲートの特異的抗体に対する結合の阻害を測定することによって決定することができる。既知量のコンジュゲートのこうした結合の、未知の試料による阻害の結果を、同様のアッセイにおいてリスペリドンの既知の標準溶液を利用することによって得られる結果と比較する。未知の試料中のリスペリドン及びパリペリドンの量を決定する際には、該試料、式ＩＩＩの化合物から形成される該コンジュゲート、及び該抗体を、任意の順序で添加することができる。

抗体に結合した、式ＩＩＩの化合物から形成されたコンジュゲートの量を測定するために、多様な方法を利用することができる。１つの方法は、コンジュゲートが抗体に結合することにより、フルオロフォアコンジュゲートの回転速度の低下が引き起こされるものである。液体混合物中のフルオロフォアコンジュゲートの回転速度の低下量は、米国特許４，２６９，５１１及び米国特許４，４２０，５６８に開示されているような蛍光偏光技術によって検出することができる。

一方、該抗体は、ナノ粒子上にコーティング又は吸収されていてもよく、その結果、これらの粒子が式Ｖの化合物から形成されるリスペリドンコンジュゲートと反応するときにこれらのナノ粒子が集合体を形成するようになる。しかし、抗体をコーティング又は吸収したナノ粒子が試料中のリスペリドン及びパリペリドンと反応するときには、これらのナノ粒子に結合した試料からのリスペリドン及びパリペリドンは抗体ナノ粒子の集合を引き起こさない。この集合または凝集の量は、アッセイ混合物において吸光度によって測定することができる。

一方、これらのアッセイは、抗体又はリスペリドンコンジュゲートのいずれかを、固体支持体、例えばマイクロタイタープレート、又は固体粒子等の他の従来の固体支持体に結合させることによって行うことができる。抗体及びタンパク質をこうした固体粒子に結合させることは、当技術分野においてよく知られている。こうした結合の実施には、任意の従来の方法を使用することができる。多くの場合、測定を補助するために、該抗体と結合している又は結合していない、式ＩＩＩの化合物から形成されるコンジュゲートの量を検出する際の補助として、抗体、コンジュゲート又は固体粒子上に、放射性標識又は酵素標識のような標識をつけることもできる。他の好適な標識としては、発色団、フルオロフォア等が挙げられる。

便宜上、本発明のアッセイ構成材料は、リスペリドン及びパリペリドンについてのアッセイに使用される所定量の新規試薬を含むパッケージングされた組合せである、キットで提供される。これらの試薬には、本発明の抗体、並びに、式Ｖの化合物から形成されたコンジュゲートが含まれる。

これらの必要な試薬に加えて、補助的な試薬のような添加物、例えば、安定剤、緩衝液等が含まれていてもよい。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適にする試薬の溶液中濃度を得るために幅広く変えることもできる。試薬は、溶液で又は、溶解時に、アッセイを行うのに適切な濃度を有する試薬溶液を提供することになる添加剤を含む、通常は凍結乾燥した、乾燥粉末として提供され得る。

実施例において、以下のものを指すのに以下の略語を使用する：
ＭｓＣｌ メタンスルホニルクロリド
ＤＩＰＥＡ Ｎ−Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ｐＴＳＡ ｐ−トルエンスルホン酸
ＨＡＴＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ｓ−ＮＨＳ スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＥＤＣ １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド
ＫＬＨ キーホールリンペットヘモシアニン
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＮａＣｌ 塩化ナトリウム
ＨＲＰ ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＡＮＳ ８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸
ＴＭＢ ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
ＴＲＩＳ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンヒドロクロリド
ｄｉＨ_２Ｏ 脱イオン水
リン酸緩衝液の組成には、
１５．４ｍＭ 二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）
４．６ｍＭ 一塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）
ｐＨ＝７．２±０．１０
を含有する水溶液がある。

実施例において、以下のスキーム１〜２は、実施例における番号によって参照される、調製した特定の化合物を示している。これらのスキームは、以下の通りである：

（例１）
リスペリドン（９−イルオキシ）ペンタン酸誘導体［９］の調製（スキーム１）
化合物［１］（１０．０ｇ、９０．８ｍｍｏｌ）を、Ｎ_２雰囲気下０℃で無水ＤＭＦ（２００ｍＬ）中に溶解した。撹拌しながら、ＮａＨ（６０％、３．６２ｇ、９０．８ｍｍｏｌ）を添加して、この混合物を１時間で周囲温度まで温度上昇させた。次いで、この反応混合物にメチル５−ブロモペンタノエート（１７．７２ｇ、９０．８０ｍｍｏｌ）を添加して、撹拌を一晩継続した。この反応混合物を水で希釈して、ＥｔＯＡｃで抽出した。この抽出物を、水、次いで、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、溶媒を蒸発させて粗生成物［２］を単離した。２０〜９０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用してフラッシュクロマトグラフィーによって不純物を除去して、純化合物［２］（１２．８０ｇ、６３％）を単離した。

化合物［２］（１２．８０ｇ、５７．１４ｍｍｏｌ）、化合物［３］（８．８０ｇ、６８．５７ｍｍｏｌ）、及びｐＴＳＡ・Ｈ_２Ｏ（２．０ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）をキシレン（３００ｍＬ）中に溶解して、得られた混合物をディーン−スターク条件下で１２時間加熱還流した。１２時間後、キシレンを減圧下で除去し、残留物に飽和ＮａＨＣＯ_３を添加して、スラリーをＥｔＯＡｃで抽出した。この有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、蒸発させて粗生成物［４］を単離した。この物質を、エーテル／ヘキサンの１：１混合物で粉末にして純化合物［４］（１０．４０ｇ、５５％）を単離した。

化合物［４］（９．９０ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ）及びＡｌＣｌ_３（１．９８ｇ、１４．８５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロエタン中の混合物をＮ_２下９５℃で６時間加熱し、その後、この混合物に別のＡｌＣｌ_３（１．０ｇ、７．４０ｍｍｏｌ）を添加して、撹拌をさらに５時間継続した。フラスコの内容物を周囲温度まで冷却して、氷冷した水で注意深くクエンチした。飽和ＮａＨＣＯ_３を添加して、その水相を５％のＭｅＯＨ／クロロホルムで抽出した。得られた有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、蒸発させて粗生成物［５］を単離した。この粗物質を、エーテル／ヘキサンの１：１混合物で粉末にして純化合物［５］（５．８０ｇ、５８％）を単離した。

化合物［５］（２．０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（７０ｍＬ）及び６ＮのＨＣｌ（１０ｍＬ）の混合物中に溶解して、Ｐｄ−Ｃ（１０重量％、０．５７ｇ）を添加した。（ＭＳによってモニタリングされるように）この反応が完了するまで、撹拌している混合物を通して水素ガスを吹き出させた。次いで、この反応混合物を、セライトのパッドに通して濾過して、パラジウム触媒を除去した。この濾液を蒸発させてメタノールを除去して、この酸性水性混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３に添加してクエンチし、次いで、１０％のＭｅＯＨ／クロロホルムで抽出した。この有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、蒸発させて所望の生成物［６］（１．８０ｇ、８９％）を単離した。

化合物［６］（１．８０ｇ、５．３２ｍｍｏｌ）を、Ｎ_２下０℃で無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍＬ）中に溶解した。この撹拌中の溶液にＤＩＰＥＡ（１．３８ｇ、１０．６４ｍｍｏｌ）を添加し、その後、メタンスルホニルクロリド（０．６７ｇ、５．８５ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。この反応混合物を、０℃で４０分間撹拌し、その後、溶媒を除去して粗メシレート中間体を得た。このメシレート中間体を無水ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中に溶解し、この溶液に化合物［７］（１．７６ｇ、７．９５ｍｍｏｌ）を、その後、ＤＩＰＥＡ（１．８０ｇ、５．３２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を１．５時間加熱還流し、次いで、メタノール溶媒を減圧下で除去し、その残留物をクロロホルム中に溶解した。このクロロホルム有機相を、水、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、蒸発させて粗生成物［８］を単離し、これを、２〜５％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３を溶離液として使用してフラッシュクロマトグラフィーによって精製して純生成物［８］（２．０２ｇ、７０％）を単離した。

エステル［８］（２．０ｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ／ＴＨＦの混合物（１：３、２４ｍＬ）中に０℃で溶解して、ＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏ（０．４６ｇ、１１．１０ｍｍｏｌ）の水（６ｍＬ）中の溶液を添加した。この混合物を、周囲温度まで温度上昇させて２時間撹拌した。この反応溶液を、ＥｔＯＡｃで希釈し、０．１ＮのＨＣｌで洗浄した。この有機相を除去して置いておき、残りの水相を１０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３で抽出した。この抽出物を、置いておいた有機相と合わせて、合わせた有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、蒸発させて化合物［９］（１．９１ｇ、９９％）を白色泡沫として得た。

（例２）
リスペリドン（９−イルオキシペタンカルバモイル）−メチル−安息香酸誘導体［１４］の調製（スキーム２）
化合物［９］（７００ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）、化合物［１２］（４４０ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（０．８６ｇ、１．２ｍＬ、６．６５ｍｍｏｌ）を、０℃でＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解した。ＨＡＴＵ（１．２１ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）を添加し、その後、この反応混合物を、周囲温度まで温度上昇させ、一晩撹拌した。その翌日、この反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈して、得られた有機相を、１ＭのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ_３、水で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ_２ＳＯ_４）。溶媒の除去によって粗生成物［１３］が得られ、これを２〜８％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３を用いたフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、純生成物［１３］（０．５２ｇ、５５％）を白色固体として得た。

化合物［１３］（０．５０ｇ、０．７ｍｍｏｌ）を、Ｎ_２下０℃で無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）中に溶解し、その撹拌中の溶液にＴＦＡ（１０ｍＬ）を添加した。撹拌を、０℃で３時間、次いで、周囲温度でさらに２０時間継続した。この時間の後に、溶媒を減圧下で除去して、得られた残留物を水中に懸濁し、乾燥状態まで凍結乾燥させて粗酸［１４］を得た。この乾燥物質を、２％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３（５ｍＬ）で溶解し、２００ｍＬのエーテルに添加して、酸［１４］を溶液から沈澱させた。沈澱した固体を、濾過して、エーテルで洗浄し、４０℃で乾燥させて所望の化合物［１４］（０．３８ｇ、７２％）をオフホワイトの粉末として得た。

（例３）
ｓ−ＮＨＳで活性化された薬剤誘導体を、対応する酸［９］及び［１４］から調製する一般的な方法
リスペリドン酸誘導体［９］及び［１４］をＥＤＣ及びｓ−ＮＨＳで活性化して、タンパク質に対する最終的な結合（例４及び５）のための、ｓ−ＮＨＳで活性化されたリスペリドンのエステル［１０］及び［１５］を作製した。

（例３ａ）
ｓ−ＮＨＳで活性化されたエステルリスペリドン（９−イルオキシ）ペンタン酸誘導体［１０］の調製
リスペリドン誘導体［９］、例１、スキーム１、（５６．８ｍｇ）を、５．６８ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解し、これに、ｓ−ＮＨＳ（６６．５６ｍｇ）及びＥＤＣ（５８．５８ｍｇ）を添加した。この反応混合物を、窒素雰囲気下、周囲温度で２０時間撹拌して、ｓ−ＮＨＳで活性化されたリスペリドンのエステル［１０］を作製した。この反応混合物を、例４及び５ａにおいて直接使用した。

（例３ｂ）
ｓ−ＮＨＳで活性化されたエステルリスペリドン（９−イルオキシペタンカルバモイル）−メチル−安息香酸誘導体［１５］の調製
リスペリドン誘導体［１４］、例２、スキーム２（２５．０ｍｇ）を、２．５ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解し、これに、ｓ−ＮＨＳ（１９．９ｍｇ）及びＥＤＣ（１７．６ｍｇ）を添加した。この反応混合物を、窒素雰囲気下、周囲温度で２０時間撹拌して、ｓ−ＮＨＳで活性化されたリスペリドンのエステル［１５］を作製した。この反応混合物を、例５ｂにおいて直接使用した。

（例４）
活性化ハプテン［１０］を有するＫＬＨ免疫原の調製
３００ｍｇのＫＬＨを２０ｍＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中に溶解することによってＫＬＨのタンパク質溶液を調製し、その後、例３ａにおいて調製した、ｓ−ＮＨＳで活性化されたリスペリドン誘導体［１０］を４．８５ｍＬ添加した。ＫＬＨと、活性化されたリスペリドン誘導体［１０］とのこの反応混合物を、室温で２０時間撹拌させてリスペリドン［９］−ＫＬＨコンジュゲートを作製した。次いで、このリスペリドン［９］−ＫＬＨコンジュゲートを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中の３０％ＤＭＳＯに対する透析によって室温で精製した。その後、ＤＭＳＯの割合を、２０％、１０％及び０％と段階的に低下させた。最後の透析は、４℃でリン酸緩衝液に対して行った。このリスペリドン［９］−ＫＬＨコンジュゲートを、紫外−可視分光法によって特徴付けした。このコンジュゲートを希釈して、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中２ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。

（例５ａ）
活性化ハプテン［１０］を有するＢＳＡコンジュゲートの調製
１ｇのＢＳＡをリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中に溶解して５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にすることによってＢＳＡのタンパク質溶液を調製した。このタンパク質溶液に、例３ａにおいて調製した、ｓ−ＮＨＳで活性化されたリスペリドン誘導体［１０］を０．８３ｍＬ添加した。ＢＳＡのタンパク質溶液に添加する、ｓ−ＮＨＳで活性化されたリスペリドン誘導体［１０］の量は、リスペリドン［１０］の誘導体とＢＳＡとの間で１：１のモル比で算出した。ＢＳＡと、活性化されたリスペリドン誘導体［１０］とのこの混合物を、室温で１８時間撹拌させて、活性化されたリスペリドンエステル［１０］とＢＳＡとのコンジュゲートを作製した。次いで、このコンジュゲートを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中の２０％ＤＭＳＯに対する透析によって室温で精製した。その後、ＤＭＳＯの割合を、１０％及び０％と段階的に低下させた。最後の透析は、４℃でリン酸緩衝液に対して行った。精製したリスペリドン［９］−ＢＳＡコンジュゲートを、ＵＶ／ＶＩＳ分光法によって特徴付けした。

（例５ｂ）
活性化されたハプテン［１５］を有するＢＳＡコンジュゲートの調製
１ｇのＢＳＡをリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中に溶解して５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にすることによってＢＳＡのタンパク質溶液を調製した。このＢＳＡのタンパク質溶液１０．０ｍＬに、氷上で撹拌しながら、例３ｂにおいて調製した、ｓ−ＮＨＳで活性化されたリスペリドン誘導体［１５］を０．６２０ｍＬ添加した。ＢＳＡのタンパク質溶液に添加する、ｓ−ＮＨＳで活性化されたリスペリドン誘導体［１５］の量は、リスペリドン［１５］の誘導体とＢＳＡとの間で１：１のモル比で算出した。ＢＳＡと、活性化されたリスペリドン誘導体［１５］とのこの混合物を、室温で１８時間撹拌させて、活性化されたリスペリドンエステル［１５］とＢＳＡとのコンジュゲートを作製した。次いで、このコンジュゲートを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中の１５％ＤＭＳＯに対する透析によって室温で精製した。その後、ＤＭＳＯの割合を、１０％、５％、及び０％と段階的に低下させた。最後の透析は、４℃でリン酸緩衝液に対して行った。精製したリスペリドン［１４］−ＢＳＡコンジュゲートを、ＵＶ／ＶＩＳ分光法によって特徴付けした。

（例６ａ）
リスペリドン［９］に対するポリクローナル抗体の調製
１０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全フロイントアジュバント中に乳化させた、例４において調製したような、１００μｇ／マウスのリスペリドン［９］−ＫＬＨ免疫原で腹腔内に免疫化した。これらのマウスに、初回注射の４週間後に、不完全フロイントアジュバント中に乳化させた１００μｇ／マウスの同一の免疫原で追加免疫を１回行った。追加免疫の２０日後に、ポリクローナル抗体を含有する、各マウスからの試験採血を眼窩出血によって得た。この試験採血を、遠心分離によって分画して抗血清を得た。リスペリドン［９］−ＫＬＨ免疫原に対するポリクローナル抗体を含有する、これらの試験採血からの抗血清を、例８ａ及び９において評価した。

（例６ｂ）
リスペリドン［９］に対するモノクローナル抗体の調製
４において調製したリスペリドン［９］−ＫＬＨで免疫化した例６ａからのマウスを、モノクローナル抗体の産生に使用した。モノクローナル抗体の場合は、融合の３日前から始めて、例４において調製した、ＰＢＳ／ＤＭＳＯ中の４００μｇ（融合の３日前）、２００μｇ（融合の２日前）、及び２００μｇ（融合の１日前）のリスペリドン［９］−ＫＬＨを該マウスに腹腔内注射した。脾細胞を、選択したマウスから単離して、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２．５．１−２．５．８，（１９９２），Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹの方法に従って、５０％のポリエチレングリコール１５００を用いて２×１０^７のＳＰ２／０細胞で融合させた。この融合細胞を、１０枚の９６ウェルプレート上の、２０％のＦｅｔａｌＣｌｏｎｅ Ｉ、２％のＬ−グルタミン（１００ｍＭ）及び２％の５０ＸＨＡＴを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２中に播種した。２週間から３週間後に、このハイブリドーマ上清を、（例８ｂにおけるような）ＥＬＩＳＡによって抗リスペリドン抗体の存在について試験した。陽性のＥＬＩＳＡ結果（例８ｂ）が得られたウェルからの細胞を、２４ウェルプレートに展開した。ＥＬＩＳＡによって陽性のクローンを、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２．５．８−２．５．１７，１９９２，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ中に開示されている方法に従って、限界希釈によって２回サブクローン化した。選択したサブクローンからのモノクローナル抗体を含有するハイブリドーマ培養液上清を、競合ＥＬＩＳＡ（例９）によってリスペリドンの結合について確認した。これらのモノクローナル抗体を、例９に記載のような間接的競合マイクロタイタープレートアッセイによって、リスペリドン結合及び主なリスペリドン代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドンに対する交差反応性について試験した。

（例７ａ）
リスペリドン［９］−ＢＳＡコンジュゲートでのマイクロタイタープレート感作方法
リスペリドン濃度を測定するためのＥＬＩＳＡ法を、タンパク質結合用に最適化されており、プレートあたり９６個のウェルを含む、ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｆ８ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌｅｓ）中で行った。各ウェルを、０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６中に１０μｇ／ｍＬのリスペリドン［９］−ＢＳＡコンジュゲートを３００μＬ添加して、室温で３時間インキュベートすることによって、（例５ａにおけるように調製した）リスペリドン［９］−ＢＳＡコンジュゲートでコーティングした。これらのウェルを０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６で洗浄し、次いで、３７５μＬの５％ショ糖、０．２％カゼインナトリウム溶液で室温で３０分間ブロッキングした。後からコーティングした溶液を除去した後に、このプレートを３７℃で一晩乾燥させた。

（例７ｂ）
リスペリドン［１４］−ＢＳＡコンジュゲートでのマイクロタイタープレート感作方法
リスペリドン濃度を測定するためのＥＬＩＳＡ法を、タンパク質結合用に最適化されており、プレートあたり９６個のウェルを含む、ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｆ８ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌｅｓ）中で行った。各ウェルを、０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６中に１０μｇ／ｍＬのリスペリドン［１４］−ＢＳＡコンジュゲートを３００μＬ添加して、室温で３時間インキュベートすることによって、（例５ｂにおけるように調製した）リスペリドン［１４］−ＢＳＡコンジュゲートでコーティングした。これらのウェルを０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６で洗浄し、次いで、３７５μＬの５％ショ糖、０．２％カゼインナトリウム溶液で室温で３０分間ブロッキングした。後からコーティングした溶液を除去した後に、このプレートを３７℃で一晩乾燥させた。

（例８ａ）
抗体スクリーニング法−力価（タイター）
この方法は、例９におけるような置換について試験する抗体又は抗血清の希釈率を見出すためのものである。（例６において作製した）リスペリドン抗体をスクリーニングするためのＥＬＩＳＡ法を、例７ａ及び７ｂにおいて調製したリスペリドン−ＢＳＡコンジュゲートで感作したマイクロタイタープレートを用いて行った。抗体スクリーニングアッセイは、ポリクローナルリスペリドン抗体を含有する、（例６におけるような）試験採血からのネズミ科動物の血清を、０．１％のＢＳＡ及び０．０１％のチメロサールを含有するリン酸緩衝生理食塩水中で１：２，０００、１：６，０００、１：１５，０００及び１：５４，０００（容積／容積）に希釈することによって行った。モノクローナル抗体の評価では、例８ｂの方法によって抗体の存在について陽性であることが見出された、例６ｂのハイブリドーマ上清を、０．１％のＢＳＡ及び０．０１％のチメロサールを含有するリン酸緩衝生理食塩水中で１：２、１：４、１：１６等（容積／容積）に希釈した。（例７ａ及び７ｂにおいて調製した）リスペリドン−ＢＳＡで感作したウェルの各ウェルに、０．１％のＢＳＡ及び０．０１％のチメロサールを含有する５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水及び５０μＬの希釈した抗体を添加し、振盪しながら室温で１０分間インキュベートした。このインキュベート中に、抗体が、ウェル中に受動的に吸収されたリスペリドン−ＢＳＡコンジュゲート（例７ａ及び７ｂ）に結合する。プレートのウェルを、０．０２ＭのＴＲＩＳ、０．９％のＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ−８０及び０．００１％のチメロサール、ｐＨ７．８で３回洗浄し、結合していない抗体をすべて除去した。ウェル中でリスペリドン−ＢＳＡコンジュゲートに結合したリスペリドン抗体の量を検出するために、ネズミ科動物の免疫グロブリンと特異的に結合することができ、基質（本例ではＴＭＢ）と共に培養したときに着色生成物を生成することができる、ヤギの抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＡＮＳ、０．０１％のチメロサールを含むＰＢＳ中で特定の活性（約１／３０００）まで希釈して、これを各ウェルに１００μＬ添加した。振盪しながら室温で１０分間インキュベートし、この間にヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲートがウェル中でリスペリドン抗体に結合し、その後、これらのプレートを再び３回洗浄して、結合していないヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲートを除去した。ウェル中で測定可能な発色をさせるために、洗浄後に、ＨＲＰの基質であるＴＭＢ（ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ＢｉｏＦｘ）を１００μＬ添加して、振盪しながら室温で１０分間インキュベートしている間に発色させた。発色のためのインキュベート後に、５０μＬの停止液（ｄｉＨ_２Ｏ中１．５％のフッ化ナトリウム）を各ウェルに添加して発色を停止させ、２０秒間振盪した後に、６５０ｎｍにおいて吸光度を決定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）。１ウェル中の抗体の量は、測定された吸光度に比例し、希釈率（力価）として表され、１．５の吸光度という結果になった。力価は、測定された抗体の抗体希釈率（ｘ軸）対吸光度６５０ｎｍ（ｙ軸）をグラフ化して、１．５の吸光度における力価を補間することによって決定した。１．５の吸光度が得られたこの力価により、例９に記載の間接的競合マイクロタイタープレートアッセイにおいて使用する抗体の濃度（希釈率）を決定した。

（例８ｂ）
抗体スクリーニング法−モノクローナルスクリーニング
（例６ｂにおいて作製した）リスペリドンモノクローナル抗体をスクリーニングするためのＥＬＩＳＡ法を、例７ａに記載のリスペリドン−ＢＳＡで感作したマイクロタイタープレートを用いて行った。（例７において調製した）リスペリドン−ＢＳＡで感作したウェルの各ウェルに、０．１％のＢＳＡ及び０．０１％のチメロサールを含有する５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水及び次いで５０μＬのモノクローナル培養液上清を添加し、振盪しながら室温で１０分間インキュベートした。このインキュベート中に、抗体が、ウェル中でリスペリドン−コンジュゲートに結合する。プレートのウェルを、０．０２ＭのＴＲＩＳ、０．９％のＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ−８０及び０．００１％のチメロサール、ｐＨ７．８で３回洗浄し、結合していない抗体をすべて除去した。ウェル中のリスペリドン−ＢＳＡコンジュゲートに結合したリスペリドン抗体の量を検出するために、ネズミ科動物の免疫グロブリンと特異的に結合することができ、基質（本例ではＴＭＢ）と共に培養したときに着色生成物を生成することができる、ヤギの抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＡＮＳ、０．０１％のチメロサールを含むＰＢＳ中で１／３０００に希釈して、これを各ウェルに１００μＬ添加した。振盪しながら室温で１０分間インキュベートし、この間にヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲートがウェル中でリスペリドン抗体に結合し、その後、これらのプレートを再び３回洗浄して、結合していないヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲートを除去した。ウェル中で測定可能な発色をさせるために、洗浄後に、ＨＲＰの基質であるＴＭＢ（ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ＢｉｏＦｘ）を１００μＬ添加して、振盪しながら室温で１０分間インキュベートしている間に発色させた。発色のためのインキュベート後に、５０μＬの停止液（ｄｉＨ_２Ｏ中１．５％のフッ化ナトリウム）を各ウェルに添加して発色を停止させ、１０秒間振盪した後に、６５０ｎｍにおいて吸光度を決定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）。１ウェル中の抗体の量は、測定された吸光度に比例した。バックグラウンドの３倍より大きい吸光度を有する試料が陽性であるとされた。例６ｂに記載のように、最大吸光度を有する５０試料を２４ウェルプレートに展開した。

（例９）
間接的競合マイクロタイタープレートイムノアッセイ法
リスペリドンに対する抗体のＩＣ_５０及び交差反応性の決定
ＩＣ_５０値及び交差反応性を決定するためのＥＬＩＳＡ法を、例７ａ及び７ｂに記載のリスペリドン−ＢＳＡコンジュゲートで感作したマイクロタイタープレートを用いて行った。検体、すなわちリスペリドン及びパリペリドン、並びにこれらの不活性な代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドン及びＮ−デアルキルリスペリドンを、（例７ａにおけるように）リスペリドン［９］−ＢＳＡマイクロタイタープレートを使用するときには１から１０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にわたって、又は（例７ｂにおけるように）リスペリドン［１４］−ＢＳＡマイクロタイタープレートを使用するときには０．５から１，０００ｎｇ／ｍＬにわたって、ｄｉＨ_２Ｏ中に希釈した。それぞれのアッセイは、５０μＬの検体溶液を、例４の免疫原で例６ａにおいて産生されたポリクローナル抗体から選択される抗血清のうちの１種の５０μＬ又は例６ｂにおいて産生されたモノクローナル抗体から選択されるうちの１種の５０μＬと共にインキュベートすることによって行った。これらのアッセイは全て、ウェルのそれぞれにおいて、抗血清又はモノクローナル抗体の濃度を、例８ａにおいて決定されたタイターに希釈することによって行った。（振盪しながら室温で）１０分間のインキュベート中に、（例７ａ及び７ｂにおいて作製した）ウェル中のリスペリドン−ＢＳＡコンジュゲートと、溶液中の検体とに対する抗体結合の競合が生じる。このインキュベート後に、プレートのウェルを、０．０２ＭのＴＲＩＳ、０．９％のＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ−８０及び０．００１％のチメロサール、ｐＨ７．８で３回洗浄し、結合しなかった物質をすべて除去した。（例７ａ及び７ｂにおいて作製した）ウェル中のリスペリドン−ＢＳＡコンジュゲートに結合したリスペリドン抗体の量を検出するために、ネズミ科動物の免疫グロブリンと特異的に結合することができ、基質（本例ではＴＭＢ）と共に培養したときに着色生成物を生成することができる、ヤギの抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＡＮＳ、０．０１％のチメロサールを含むＰＢＳ中で予め決定された特定の活性（約１／３０００）まで希釈して、これを各ウェルに１００μＬ添加した。振盪しながら室温で１０分間インキュベートし、この間にヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素コンジュゲートがウェル中でリスペリドン抗体に結合し、その後、これらのプレートを再び３回洗浄して、結合していない二次コンジュゲートを除去した。ウェル中で測定可能な発色をさせるために、洗浄後に、ＨＲＰの基質であるＴＭＢ（ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ＢｉｏＦｘ）を１００μＬ添加して、振盪しながら室温で１０分間のインキュベートにおいて発色させた。発色のためのインキュベート後に、５０μＬの停止液（ｄｉＨ_２Ｏ中１．５％のフッ化ナトリウム）を各ウェルに添加して発色を停止させ、２０秒間振盪した後に、６５０ｎｍにおいて吸光度を決定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）。１ウェル中の抗体の量は、測定された吸光度に比例し、試料中のリスペリドンの量に反比例した。リスペリドン及びパリペリドンのＩＣ_５０値は、ウェル中の吸光度をウェル中の検体濃度に対してプロットした、用量反応曲線を構築することによって決定した。検体を含有するウェルにおける色の吸光度を検体を含まないものと比較して、標準曲線を作成した。所与の検体のＩＣ_５０値は、検体を含有しないウェルの吸光度の５０％を有するのに必要な検体の濃度として定義された。交差反応性は、パリペリドンのＩＣ_５０に対するリスペリドンのＩＣ_５０の比として算出しており、百分率として表した。このプールの抗体で測定したときには、リスペリドンと相対したパリペリドンについての百分率での交差反応性は、１００±２０％であった。下記の表Ｉに、リスペリドンに対するポリクローナル抗体についての結果がある。表ＩＩに、リスペリドンに対するモノクローナル抗体についての結果がある。

これらの表からわかるように、本発明の抗体は、活性型のリスペリドンと実質的に選択的に反応性であり、同様に、活性な代謝産物であるパリペリドンと実質的に交差反応性であり、不活性な代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドン及びＮ−デアルキルリスペリドンとの低い交差反応性を有する。

式ＩＶの化合物において、式中、Ｘ’は、好ましくは高分子担体上の反応性アミン基を通して、スペーサーを結合している官能基である。基Ｘ’は、式ＩＩＩの化合物中の末端官能基Ｘが、担体又は免疫原のポリアミンポリマー中の反応性アミノ基に結合した結果である。アミノ基と反応することができるいずれの末端官能基も、式ＩＩＩの化合物中の官能基Ｘとして利用することができる。Ｘ中に含まれていることが好ましいこれらの末端官能基は、以下のものである：

［式中、Ｒ_３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシルであるか、又は結合した酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ_４は、酸素又は硫黄である］。基−Ｎ＝Ｃ＝Ｒ_４は、イソシアネート又はイソチオシアネートであってもよい。Ｒ_３によって形成される活性エステルとしては、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びｐ−ニトロフェニルエステルのような、イミドエステル等が挙げられる。しかし、アミン基と反応可能なあらゆる活性エステルを使用することができる。

Claims (54)

1. リスペリドン、パリペリドン及びこれらの混合物からなる群から選択される薬学的に活性な抗精神病薬を検出するためのイムノアッセイであって、試料と、前記薬学的に活性な抗精神病薬と選択的に反応性である抗体と、次式を有するリガンド：
   

   

   
   ［式中、Ｂは、
   

   

   
   であり、
   Ｙは、有機スペーサー基であり、
   Ｘは、担体に結合することができる末端官能基であり、
   ｐは、０から１までの整数である］
   との担体のコンジュゲートとを含有する混合物を用意するステップと、前記試料中の薬学的に活性な抗精神病薬及び前記コンジュゲートを前記抗体と結合させるステップと、その後、前記試料中の、前記抗体に結合している又は結合していない前記コンジュゲートの量を測定し、それによって前記試料中の抗精神病薬の存在が検出可能となるステップとを含む上記イムノアッセイ。
2. 前記抗体が、リスペリドン及びパリペリドンと反応し、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドンとの実質的な反応性をほとんど有しておらず、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの他の代謝産物と実質的に交差反応しない、請求項１に記載のイムノアッセイ。
3. 前記抗体の７−ヒドロキシリスペリドンとの反応性が４０％未満であり、前記抗体の薬学的に不活性な他の代謝産物との前記交差反応性が５％未満であり、前記反応性及び交差反応性が前記抗体のリスペリドン及びパリペリドンの双方との合計の反応性に基づいている、請求項２に記載のイムノアッセイ。
4. 前記試料がヒト試料である、請求項３に記載のイムノアッセイ。
5. 前記薬学的に活性な抗精神病薬の存在が、前記抗体に結合している又は結合していないコンジュゲートの量を測定することによって定量される、請求項４に記載のイムノアッセイ。
6. 薬学的に活性な抗精神病薬が、リスペリドン及びパリペリドンからなる群から選択される、請求項５に記載のイムノアッセイ。
7. 前記ヒト試料が、リスペリドンで治療した患者から採取された試料であり、前記イムノアッセイが、前記試料中のリスペリドン及びパリペリドンの量を測定する、請求項６に記載のイムノアッセイ。
8. 前記ヒト試料が、パリペリドンで治療した患者から採取された試料であり、イムノアッセイが、前記試料中のパリペリドンの量を測定する、請求項６に記載のイムノアッセイ。
9. 前記抗体が、次式のリガンド：
   

   

   
   ［式中、Ｙ、Ｘ及びＢは、上記の通りである］
   とコンジュゲートしたポリアミンポリマーを含む免疫原性担体を含む免疫原から作製される、請求項３に記載のイムノアッセイ。
10. 前記抗体が固体支持体に結合されている、請求項５に記載のイムノアッセイ。
11. 前記固体支持体がマイクロタイタープレートである、請求項１０に記載のイムノアッセイ。
12. 前記固体支持体がナノ粒子である、請求項１０に記載のイムノアッセイ。
13. 前記抗体が、マウス、ウサギ、ヒツジ又はラットに由来する、請求項９に記載のイムノアッセイ。
14. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３に記載のイムノアッセイ。
15. リスペリドン、パリペリドン及びこれらの混合物からなる群から選択される薬学的に活性な抗精神病薬と選択的に反応性である抗体であって、リスペリドン及びパリペリドンと反応し、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドンとの実質的な反応性をほとんど有しておらず、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの他の代謝産物との実質的な交差反応性を有していない、上記抗体。
16. 前記抗体の前記７−ヒドロキシリスペリドンとの反応性が４０％未満であり、薬学的に不活性な他の前記代謝産物との前記交差反応性が５％未満であり、前記反応性及び交差反応性が前記抗体のリスペリドン及びパリペリドンの双方との合計の反応性に基づいている、請求項１５に記載の抗体。
17. 前記抗体が、次式のリガンド：
    

    

    
    ［式中、Ｂは、
    

    

    
    であり、
    Ｙは、有機スペーサー基であり、
    Ｘは、ポリアミンポリマーを含む免疫原性担体に結合することができる末端官能基であり、
    ｐは、０から１までの整数である］
    とコンジュゲートしたポリアミンポリマーを含む免疫原性担体を含む免疫原から作製される、請求項１６に記載の抗体。
18. 前記抗体が、マウス、ヒツジ、ウサギ又はラットに由来する、請求項１７に記載の抗体。
19. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の抗体。
20. 次式の化合物：
    

    

    
    ［式中、Ｙ、Ｂ、Ｘ及びｐは、上記の通りであり、
    Ｂは、
    

    

    
    であり、
    Ｙは、有機スペーサー基であり、
    Ｘは、担体に結合することができる末端官能基であり、
    ｐは、０から１までの整数である］。
21. ｐが０である、請求項２０に記載の化合物。
22. Ｘが
    

    

    
    ［式中、Ｒ_３は、水素、ハロゲン化物、ヒドロキシルであるか、又はそれに結合した酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ_４は、酸素又は硫黄である］
    である、請求項２１に記載の化合物。
23. Ｘが
    

    

    
    である、請求項２２に記載の化合物。
24. Ｘが
    

    

    
    である、請求項２２に記載の化合物。
25. Ｘが
    

    

    
    であり、Ｒ_３がヒドロキシルである、請求項２２に記載の化合物。
26. Ｘが
    

    

    
    であり、Ｒ_３が反応性エステルを形成している、請求項２２に記載の化合物。
27. 形成されているエステルが、低級アルキルエステル、イミドエステル又はアミドエステルである、請求項２６に記載の化合物。
28. ｐが１である、請求項２０に記載の化合物。
29. Ｘが
    

    

    
    ［式中、Ｒ_３は、水素、ハロゲン化物、ヒドロキシルであるか、又はそれに結合した酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ_４は、酸素又は硫黄である］
    である、請求項２８に記載の化合物。
30. Ｙが、１個から１０個までの炭素原子を含むアルキレン、
    

    

    
    ［式中、ｎ及びｏは、０から６までの整数であり、ｍは、１から６までの整数である］
    である、請求項２９に記載の化合物。
31. Ｙが、１個から６個までの炭素原子を含む低級アルキレンである、請求項３０に記載の化合物。
32. Ｘが
    

    

    
    であり、Ｒ_３が上記の通りである、請求項３１に記載の化合物。
33. Ｙが
    

    

    
    ［式中、ｍ及びｏは、上記の通りである］
    である、請求項３０に記載の化合物。
34. Ｘが
    

    

    
    であり、Ｒ_３が上記の通りである、請求項３３に記載の化合物。
35. 次式のリガンド：
    

    

    
    ［式中、Ｂは、
    

    

    
    Ｙは、有機スペーサー基であり、
    Ｘは、担体に連結することができる官能リンカー基であり、
    ｐは、０から１までの整数である］
    とコンジュゲートした担体を含むコンジュゲート。
36. 前記担体がポリアミンポリマーを含む、請求項３５に記載のコンジュゲート。
37. ｐが０である、請求項３６に記載のコンジュゲート。
38. Ｘが
    

    

    
    ［式中、Ｒ_３は、水素、ハロゲン化物、ヒドロキシルであるか、又はそれに結合した酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ_４は、酸素又は硫黄である］
    である、請求項３７に記載のコンジュゲート。
39. ｐが１である、請求項３６に記載のコンジュゲート。
40. Ｙが、１個から１０個までの炭素原子を含むアルキレン、
    

    

    
    ［式中、ｎ及びｏは、０から６までの整数であり、ｍは、１から６までの整数である］
    である、請求項３９に記載のコンジュゲート。
41. Ｘが
    

    

    
    ［式中、Ｒ_３は、水素、ハロゲン化物、ヒドロキシルであるか、又はそれに付加された酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ_４は、酸素又は硫黄である］
    である、請求項４０に記載のコンジュゲート。
42. 前記ポリアミンポリマーが免疫原性ポリマーである、請求項３６に記載のコンジュゲート。
43. Ｙが、１個から６個までの炭素原子を含むアルキレンである、請求項４２に記載のコンジュゲート。
44. Ｘが
    

    

    
    であり、Ｒ_３が上記の通りである、請求項４３に記載のコンジュゲート。
45. Ｙが
    

    

    
    ［式中、ｍ及びｏは、上記の通りである］
    である、請求項３９に記載のコンジュゲート。
46. Ｘが
    

    

    
    であり、Ｒ_３が上記の通りである、請求項４５に記載のコンジュゲート。
47. 患者の試料中のリスペリドン及びパリペリドンからなる群から選択される薬学的に活性な抗精神病薬の存在を決定するためのキットであって、別々の容器中にパッケージングされた別々の試薬を含み、前記試薬のうちの一方が、次式のリガンド：
    

    

    
    ［式中、Ｂは、
    

    

    
    であり、
    Ｙは、有機スペーサー基であり、
    Ｘは、担体に結合することができる末端官能基であり、
    ｐは、０から１までの整数である］
    との担体のコンジュゲートであり、他方の試薬が、リスペリドン及びパリペリドンからなる群から選択される薬学的に活性な抗精神病薬と選択的に反応性である抗体であり、前記抗体が、リスペリドン及びパリペリドンと反応し、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの代謝産物である７−ヒドロキシリスペリドンとの実質的な反応性をほとんど有しておらず、薬理学的に不活性なリスペリドン及びパリペリドンの他の代謝産物との実質的な交差反応性を有していない、上記キット。
48. ｐが１である、請求項４７に記載のキット。
49. Ｂが−Ｏ−ＣＨ_２−である、請求項４８に記載のキット。
50. Ｙが低級アルキレンである、請求項４９に記載のキット。
51. Ｘが
    

    

    
    ［式中、Ｒ_３は、水素、ハロゲン化物、ヒドロキシルであるか、又はそれに付加された酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、Ｒ_４は、酸素又は硫黄である］
    である、請求項５０に記載のキット。
52. Ｘが
    

    

    
    であり、Ｒ_３が上記の通りである、請求項４８に記載のキット。
53. Ｙが
    

    

    
    である、請求項４７に記載のキット。
54. Ｙが
    

    

    
    ［式中、ｍ及びｏは、上記の通りである］
    である、請求項４９に記載のキット。