JP2015091226A - 細胞内の酸化還元状態をモニターするための蛍光タンパク質、dna、ベクター、形質転換体、及び方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】蛍光タンパク質であるSirius、mTurquoise、EBFP2及びVenusからなる群から選択されるアミノ酸配列、又は、上記群から選択されるアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間に、グリシン(G)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、ロイシン(L)およびアルギニン(R)からなる群から選択されるいずれか1つのアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質。
【選択図】図1A
Description
したがって、本発明の目的は、細胞内における酸化還元状態の変化を、励起スペクトルの解析等に依らず、より簡便に評価することが可能な分子ツールを提供することである。
[1]配列番号1、59、60及び61からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は、配列番号1、59、60及び61からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間に、グリシン(G)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、ロイシン(L)およびアルギニン(R)からなる群から選択されるいずれか1つのアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質。
[2]前記アミノ酸配列において、146番目のアミノ酸残基がロイシン(L)、トリプトファン(W)、アスパラギン(N)、フェニルアラニン(F)、セリン(S)およびグリシン(G)からなる群から選択されるいずれか1つのアミノ酸でさらに置換された、上記[1]に記載の蛍光タンパク質。
[3]配列番号1のアミノ酸配列、又は、配列番号1に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、146番目のアミノ酸残基がアスパラギン(N)で置換され、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間にアスパラギン酸(D)が挿入されたアミノ酸配列からなる、上記[2]に記載の蛍光タンパク質。
[4]配列番号1のアミノ酸配列、又は、配列番号1に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、65番目のアミノ酸残基がセリン(S)で置換され、66番目のアミノ酸残基がトリプトファン(W)で置換され、146番目のアミノ酸残基がグリシン(G)で置換され、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、148番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸(D)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間にグルタミン酸(E)が挿入されたアミノ酸配列からなる、上記[2]に記載の蛍光タンパク質。
[5]配列番号59のアミノ酸配列、又は、配列番号59に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、146番目のアミノ酸残基がグリシン(G)で置換され、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間にグルタミン酸(E)が挿入されたアミノ酸配列からなる、上記[2]に記載の蛍光タンパク質。
[6]配列番号60のアミノ酸配列、又は、配列番号60に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、146番目のアミノ酸残基がロイシン(L)で置換され、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間にアスパラギン酸(D)が挿入されたアミノ酸配列からなる、上記[2]に記載の蛍光タンパク質。
[7]配列番号59のアミノ酸配列、又は、配列番号59に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、146番目のアミノ酸残基がトリプトファン(W)で置換され、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間にグリシン(G)が挿入されたアミノ酸配列からなる、上記[2]に記載の蛍光タンパク質。
[8]配列番号61のアミノ酸配列、又は、配列番号61に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、146番目のアミノ酸残基がトリプトファン(W)で置換され、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間にアルギニン(R)が挿入されたアミノ酸配列からなる、上記[2]に記載の蛍光タンパク質。
[9]上記[1]〜[8]のいずれか1項に記載の蛍光タンパク質と、第2のタンパク質とが融合されてなる、融合タンパク質。
[10]上記[1]〜[8]のいずれか1項に記載の蛍光タンパク質又は上記[5]に記載の融合タンパク質をコードするDNA。
[11]上記[9]に記載のDNAを有する組み換えベクター。
[12]上記[11]に記載の組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
[13]細胞内の酸化還元状態をモニターする方法であって、上記[1]〜[8]のいずれか1項に記載の蛍光タンパク質、又は上記[9]に記載の融合タンパク質を細胞内に存在させ、前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、検出された蛍光の蛍光強度に基づいて細胞内の酸化還元状態をモニターすることを含む方法。
国際公開第2009/020197号に記載の方法で作製されたSiriusをコードするDNA(配列番号44)を、pet23a(Novagen社製)に組み込んだベクター(pet23a/Sirius)を鋳型として、PrimStar(登録商標)Mutagenesis Basal Kit(タカラバイオ社製)を使用した部位特異的突然変異誘発法により、Sirius(配列番号1)のS147C及びQ204Cのアミノ酸変異に対応する塩基配列の変異を配列番号44に導入した。
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号14及び15の組み合わせ、配列番号16及び17、並びに配列番号18及び19の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。なお、得られたタンパク質をコードするDNAを配列番号46とする。
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号14及び15の組み合わせ、配列番号16及び17、並びに配列番号20及び21の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。なお、得られたタンパク質をコードするDNAを配列番号47とする。
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号14及び15の組み合わせ、配列番号16及び17、配列番号20及び21、並びに配列番号22及び23の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。ただし、配列番号20及び21を用いてC147_S148insDに対応する変異を導入した後に、配列番号22及び23の組み合わせを使用してI146Nに対応する変異を導入した。なお、得られたタンパク質をコードするDNAを配列番号48とする。
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号14及び15の組み合わせ、配列番号16及び17、並びに配列番号24及び25の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。なお、得られたタンパク質をコードするDNAを配列番号49とする。
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号14及び15の組み合わせ、配列番号16及び17、配列番号24及び25、並びに配列番号26及び27の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。ただし、配列番号24及び25を用いてC147_S148insEに対応する変異を導入した後に、配列番号26及び27の組み合わせを使用してI146Nに対応する変異を導入した。なお、得られたタンパク質をコードするDNAを配列番号50とする。
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号14及び15の組み合わせ、配列番号16及び17、並びに配列番号28及び29の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。なお、得られたタンパク質をコードするDNAを配列番号51とする。
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号14及び15の組み合わせ、配列番号16及び17、並びに配列番号30及び31の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。なお、得られたタンパク質をコードするDNAを配列番号52とする。
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号14及び15の組み合わせ、配列番号16及び17、配列番号30及び31、並びに配列番号32及び33の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。ただし、配列番号30及び31を用いてC147_S148insRに対応する変異を導入した後に、配列番号32及び33の組み合わせを使用してI146Fに対応する変異を導入した。なお、得られたタンパク質をコードするDNAを配列番号53とする。
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号14及び15の組み合わせ、配列番号16及び17、配列番号30及び31、並びに配列番号34及び35の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。ただし、配列番号30及び31を用いてC147_S148insRに対応する変異を導入した後に、配列番号34及び35の組み合わせを使用してI146Nに対応する変異を導入した。なお、得られたタンパク質をコードするDNAを配列番号54とする。
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号14及び15の組み合わせ、配列番号16及び17、配列番号30及び31、並びに配列番号36及び37の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。ただし、配列番号30及び31を用いてC147_S148insRに対応する変異を導入した後に、配列番号36及び37の組み合わせを使用してI146Sに対応する変異を導入した。なお、得られたタンパク質をコードするDNAを配列番号55とする。
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号14及び15の組み合わせ、配列番号16及び17、配列番号24及び25、配列番号38及び39、配列番号40及び41、並びに配列番号42及び43の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。ただし、配列番号24及び25の組み合わせを用いてC147_S148insEに対応する変異を導入し、そして、配列番号40及び41の組み合わせを用いてS148D対応する変異を導入した後に、配列番号42及び43の組み合わせを用いてI146G対応する変異を導入した。なお、得られたタンパク質をコードするDNAを配列番号56とする。
mTurquoiseをコードするDNA(配列番号80)を、pet23a(Novagen社製)に組み込んだベクター(pet23a/mTurquoise)を鋳型として、変異を導入するためのプライマーとして、配列番号73及び74の組み合わせ、並びに配列番号78及び79の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。
EBFP2をコードするDNA(配列番号81)を、pet23a(Novagen社製)に組み込んだベクター(pet23a/EBFP2)を鋳型として、変異を導入するためのプライマーとして、配列番号66及び67の組み合わせ、並びに配列番号68及び69の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。得られたOba−Qbを、C末端にpet23a由来のヒスチジンタグを含む配列(LEHHHHHH)を含む状態で実施例15に使用した。なお、GFP及びその変異体のC末端側の11アミノ酸は、一般的に蛍光特性に関与しない部分であり、その先に他のタンパク質を連結しても蛍光特性は変化しないことが知られている。
mTurquoiseをコードするDNA(配列番号80)を、pet23a(Novagen社製)に組み込んだベクター(pet23a/mTurquoise)を鋳型として、変異を導入するためのプライマーとして、配列番号70及び71の組み合わせ、並びに配列番号72及び73の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。得られたRe−Qcを、C末端にpet23a由来のヒスチジンタグを含む配列(LEHHHHHH)を含む状態で実施例15に使用した。
VenusをコードするDNA(配列番号82)を、pet23a(Novagen社製)に組み込んだベクター(pet23a/Venus)を鋳型として、変異を導入するためのプライマーとして、配列番号74及び75の組み合わせ、並びに配列番号76及び77の組み合わせを使用した他は、比較例1と同様にして作製した。得られたRe−Qyを、C末端にpet23a由来のヒスチジンタグを含む配列(LEHHHHHH)を含む状態で実施例15に使用した。
実施例1〜14並びに比較例1及び2で作製した蛍光タンパク質の1μM溶液を調製し、分光蛍光光度計FP−8500(日本分光株式会社)を使用して各蛍光タンパク質の蛍光強度を測定した。蛍光タンパク質の還元型の蛍光強度を測定する場合は、蛍光強度測定前に1 mM ジチオスレイトール(DTT)存在下で15分間室温で蛍光タンパク質を保温し、あらかじめ還元型とした。蛍光タンパク質の酸化型の蛍光強度を測定する場合は、蛍光強度測定前に、50μM塩化銅存在下にて15分間室温で蛍光タンパク質を保温し、あらかじめ酸化型とした。
比較例1及び2、並びに実施例1〜9で作製した蛍光タンパク質においては、分光蛍光光度計の感度をmediumに設定し、蛍光波長425nmとし、励起・蛍光バンド幅を共に5nmに設定して、250nm〜400nmの範囲で励起スペクトルを測定した。極大蛍光波長(375nm付近)における各蛍光タンパク質の蛍光強度を記録した。
実施例10、11及び13で作製した蛍光タンパク質の蛍光強度は、蛍光波長480nmで250〜460nmの範囲で励起スペクトルを測定し、極大励起波長(430nm付近)における蛍光タンパク質の蛍光強度を記録した。
実施例12で作製した蛍光タンパク質の蛍光強度は、蛍光波長440nmで250〜500nmの範囲で励起スペクトルを測定し、極大励起波長(380nm付近)における蛍光タンパク質の蛍光強度を記録した。
実施例14で作製した蛍光タンパク質の蛍光強度は、蛍光波長525nmで250〜518nmの範囲で励起スペクトルを測定し、極大励起波長(515nm付近)における蛍光タンパク質の蛍光強度を記録した。
各蛍光タンパク質の酸化型及び還元型の蛍光強度を図1A及びBに示す。
また、各蛍光タンパク質の還元型及び酸化型の蛍光強度の内、いずれか高い方に対する他方の蛍光強度との比を図2A及びBに示す。
実施例2で作製された、pet23aにOba−Qsに対応する塩基配列が挿入されたベクター(oba−Qs/pet23aと称する)に対して、シロイナズナのグルタチオンペルオキイダーゼ1(AtGpx1)に対応する塩基配列を挿入した。さらに、Oba−Qに対応する塩基配列とAtGpx1に対応する塩基配列との間に、可動性リンカーである(GGSGG)6に対応する塩基配列を挿入した。得られたベクターを、Oba−Qs−AtGpx1/pet23aと称する。
あらかじめ500μMのDTTで還元した10μMのOba−Qs溶液、及びOba−Qs−AtGpx1溶液(いずれも脱気済み)を、50mMのトリシンバッファーで100倍に希釈したもの(タンパク質の終濃度100nM)をそれぞれサンプルとして使用した。分光蛍光光度計FP−8500(日本分光株式会社)を使用して各サンプルの蛍光強度を測定した。分光蛍光光度計の感度をmediumに設定し、励起波長375nmとし、励起・蛍光バンド幅を共に5nmに設定して、蛍光波長425nmにおける蛍光強度を10秒ごとに測定した。測定開始1分後に所定の濃度のH2O2を加え、蛍光強度の経時変化を観察した(図4、5)。
Claims (13)
- 配列番号1、59、60及び61からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は、配列番号1、59、60及び61からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間に、グリシン(G)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、ロイシン(L)及びアルギニン(R)からなる群から選択されるいずれか1つのアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質。
- 前記アミノ酸配列において、146番目のアミノ酸残基がロイシン(L)、トリプトファン(W)、アスパラギン(N)、フェニルアラニン(F)、セリン(S)及びグリシン(G)からなる群から選択されるいずれか1つのアミノ酸でさらに置換された、請求項1に記載の蛍光タンパク質。
- 配列番号1のアミノ酸配列、又は、配列番号1に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、146番目のアミノ酸残基がアスパラギン(N)で置換され、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間にアスパラギン酸(D)が挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項2に記載の蛍光タンパク質。
- 配列番号1のアミノ酸配列、又は、配列番号1に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、65番目のアミノ酸残基がセリン(S)で置換され、66番目のアミノ酸残基がトリプトファン(W)で置換され、146番目のアミノ酸残基がグリシン(G)で置換され、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、148番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸(D)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間にグルタミン酸(E)が挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項2に記載の蛍光タンパク質。
- 配列番号59のアミノ酸配列、又は、配列番号59に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、146番目のアミノ酸残基がグリシン(G)で置換され、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間にグルタミン酸(E)が挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項2に記載の蛍光タンパク質。
- 配列番号60のアミノ酸配列、又は、配列番号60に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、146番目のアミノ酸残基がロイシン(L)で置換され、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間にアスパラギン酸(D)が挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項2に記載の蛍光タンパク質。
- 配列番号59のアミノ酸配列、又は、配列番号59に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、146番目のアミノ酸残基がトリプトファン(W)で置換され、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間にグリシン(G)が挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項2に記載の蛍光タンパク質。
- 配列番号61のアミノ酸配列、又は、配列番号61に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、146番目のアミノ酸残基がトリプトファン(W)で置換され、147番目及び204番目のアミノ酸残基がシステイン(C)で置換され、かつ147番目と148番目のアミノ酸残基との間にアルギニン(R)が挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項2に記載の蛍光タンパク質。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の蛍光タンパク質と、第2のタンパク質とが融合されてなる、融合タンパク質。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の蛍光タンパク質又は請求項5に記載の融合タンパク質をコードするDNA。
- 請求項10に記載のDNAを有する組み換えベクター。
- 請求項11に記載の組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 細胞内の酸化還元状態をモニターする方法であって、
請求項1〜8のいずれか1項に記載の蛍光タンパク質、又は請求項9に記載の融合タンパク質を細胞内に存在させ、前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、検出された蛍光の蛍光強度に基づいて細胞内の酸化還元状態をモニターすることを含む方法。
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JP2018023308A (ja) * | 2016-08-09 | 2018-02-15 | 国立大学法人東京工業大学 | 細胞内の酸化還元状態をモニターするための蛍光タンパク質、dna、ベクター、形質転換体、及び方法、並びに抗癌剤のスクリーニング方法 |
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JP6425483B2 (ja) | 2018-11-21 |
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