JP2015073468A - 細胞培養装置および細胞培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
このような細胞として、血管内皮細胞がある。血管内皮細胞は、血管生物学に関する学術研究や、血管をターゲットとした薬剤の開発のために培養される。
血管内皮細胞は、体内では血流の剪断力に応答してその機能を発現しているため、理想的には剪断力がかかる環境下で培養されるのが好ましいが、そのような培養環境を整えるのは容易ではなく、マイクロプレートを用いた静置培養が行われることが多い。
この問題に対応すべく、液体培地の送入により剪断力が加えられる環境下で血管内皮細胞を培養できるマイクロ流体デバイスが開発されている(非特許文献1、2を参照)。また、液体培地を低速で灌流しながら培養することができる、圧力駆動のマイクロ流体デバイスも報告されている(非特許文献3を参照)。
しかしながら、外部動力源を用いた培養は、多数のアッセイを並列的に行おうとすると、その数だけ外部動力源が必要となり、装置構成が複雑になるという問題がある。
また、剪断力を付与するには液体培地の流動が必要となる。例えばシリンジポンプを用いる場合は長期間にわたって多量の液体培地を流すために、大量の液体培地の用意、もしくは頻繁な液体培地の補充が必要となる。このため、現実的には多数のアッセイを並列的に行うことは困難である。この問題は圧力駆動のマイクロ流体デバイスを用いた場合も同様である。
ペリスタポンプを用いる場合も、外部装置に液体培地を循環させるために大量の液体培地を必要とする。また、無菌的に液体培地を循環する流路を構築する作業は煩雑である。
本発明は、前記事情に鑑みてなされたもので、構造が簡略であり、かつ細胞に剪断力を加えつつ培養を行うことができる細胞培養装置および細胞培養方法を提供することを目的とする。
(1)液体培地を貯留する密閉構造の第1および第2貯留槽と、前記2つの貯留槽を互いに連通する1または複数の連絡用流路、および、1または複数の培養用流路が形成された流路デバイスと、前記連絡用流路から前記第1貯留槽への前記液体培地の流れを許容し、かつ前記第1貯留槽から前記連絡用流路への前記液体培地の流れを阻止する第1逆止弁と、前記培養用流路から前記第2貯留槽への前記液体培地の流れを許容し、かつ前記第2貯留槽から前記培養用流路への前記液体培地の流れを阻止する第2逆止弁と、前記第1および第2貯留槽内を加圧可能な加圧手段と、を備え、前記培養用流路は、前記第1貯留槽から導入された液体培地によって細胞を培養するとともに、前記液体培地を前記第2貯留槽に向けて流通させる細胞培養装置。
(2)前記第1および第2貯留槽は、液体培地を貯留する容器状の槽本体と、前記槽本体の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有する(1)に記載の細胞培養装置。
(3)前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、前記蓋部押圧部は、前記槽本体を支持する基体部と、基体部に支持された前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材とを有する(1)または(2)に記載の細胞培養装置。
(4)前記複数の培養用流路は、共通の前記第1貯留槽に接続され、前記複数の連絡用流路は、共通の前記第1貯留槽および前記第2貯留槽に接続されている(1)〜(3)のうちいずれか1つに記載の細胞培養装置。
(5)(1)〜(4)のうちいずれか1つに記載の細胞培養装置を用いて細胞を培養する方法であって、前記加圧手段によって、前記第1貯留槽内を加圧することにより、前記第1貯留槽内の液体培地を前記培養用流路に導入して、前記培養用流路の内面に付着した細胞を培養するとともに、前記液体培地を前記第2貯留槽に向けて流通させる第1工程と、前記加圧手段によって、前記第2貯留槽内を加圧することにより、前記第2貯留槽内の液体培地を、前記連絡用流路を通して前記第1貯留槽に導入する第2工程と、を有する細胞培養方法。
また、液体培地を、第1貯留槽と培養用流路と第2貯留槽との間で循環使用するため、液体培地の使用量を削減でき、かつ無菌的操作も容易になる。このため、複数の試験を並列的に行うのが容易となり、創薬スクリーニング等において効率の高い試験が可能となる。
以下、本発明の一実施形態である細胞培養装置10について、図面を参照して説明する。
図1および図4に示すように、細胞培養装置10は、液体培地M1を貯留する貯留槽11と、マイクロチップ3(流路デバイス)と、第1貯留槽1と連絡用流路32との間の液体培地M1の流れを調整する第1逆止弁4と、第2貯留槽2と培養用流路31との間の液体培地M1の流れを調整する第2逆止弁5と、貯留槽1、2内を加圧可能な加圧ポンプ6(加圧手段)と、貯留槽1、2の蓋部13を押さえつけて保持するホルダ7(蓋部押圧部)と、を備えている。
図5および図6に示すように、槽本体12は、平面視矩形(詳しくは長方形)の底壁14と、底壁14の長辺である側縁部14a、14aに立設された側壁15、15と、底壁14の短辺である端縁部14b、14bに立設された端壁16、16と、側壁15、15の間に設けられた隔壁17とを備えている。
以下、一方の側壁15を第1側壁15Aといい、他方の側壁15を第2側壁15Bということがある。また、一方の端壁16を第1端壁16Aといい、他方の端壁16を第2端壁16Bということがある。
図1等において、X方向は底壁14の長手方向であり、側縁部14aの延在方向である。Y方向は底壁14に平行な面内でX方向に直交する方向であって、端縁部14bの延在方向である。Z方向はX方向およびY方向と直交する高さ方向である。
隔壁17は、底壁14、側壁15および端壁16で囲まれた内部空間18を2つの空間1a、2aに分割している。
図示例では、隔壁17は、端壁16A、16Bの幅方向(Y方向)の中央に設けられており、2つの空間1a、2aの形状および大きさは互いに等しい。
底壁14と、側壁15Bと、端壁16、16と、隔壁17とを有し、これらに囲まれた直方体状の内部空間2aを有する構造を第2貯留槽2という。第2貯留槽2の上部開口を第2開口19bという。
第1および第2貯留槽1、2は、それぞれ内部空間1a、2aに液体培地M1を貯留できる。
補強壁部20は、端壁16に平行に、端壁16から離れた位置に形成されている。
図示例では、側壁15Aと隔壁17との間、および側壁15Bと隔壁17との間に、それぞれX方向に間隔をおいて2つの補強壁部20が形成されている。
側壁15Aと隔壁17との間の補強壁部20(第1貯留槽1内の補強壁部20)を補強壁部20Aといい、側壁15Bと隔壁17との間の補強壁部20(第2貯留槽2内の補強壁部20)を補強壁部20Bという。
第1〜第3区画27a〜27c内の底壁14には、それぞれ、導入用流路33に通じる導出口36(36a〜36c)と、連絡用流路32(32a〜32c)に通じる導入口38(38a〜38c)とが形成されている。
第1〜第3区画28a〜28c内の底壁14には、それぞれ、導出用流路34(34a〜34c)に通じる導入口37(37a〜37c)と、連絡用流路32(32a〜32c)に通じる導出口39(39a〜39c)とが形成されている。
同様に、第2貯留槽2の上部において、第1〜第3区画28a〜28cは互いに連通しているため、これら第1〜第3区画28a〜28c内を均圧化できる。
蓋部13の下面13a(図7参照)は、側壁15、端壁16および隔壁17の上縁部15c、16c、17c(図4参照)に隙間なく当接して貯留槽1、2の開口19a、19bを気密に閉止することができる。
蓋部13が開口19a、19bを気密に閉止する構造としては、蓋部13の下面13aが直接、上縁部15c、16c、17cに当接する構造であってもよいし、パッキン(図示略)を介して上縁部15c、16c、17cに当接する構造であってもよい。
係止凸部24a、24bの形状は、これらの外周縁に係止するパッキン(図示略)が、それぞれ第1開口19aおよび第2開口19bを包囲可能となるように定められる。
係止凸部24a、24bの下面には、第1開口19aおよび第2開口19bに入り込むことができる嵌合凸部25a、25bを形成してもよい。嵌合凸部25a、25bを形成することによって、蓋部13を槽本体12に対して位置合わせするのが容易となる。
第1の気体供給孔26aは、一端26a1が蓋部13の一方の側面13dに開口し、他端26a2が係止凸部24aの下面に開口しているため、第1の気体供給孔26aを通して内部空間1aに気体を送入できる。
第2の気体供給孔26bは、一端26b1が蓋部13の側面13dに開口し、他端26b2が係止凸部24bの下面に開口しているため、第2の気体供給孔26bを通して内部空間2aに気体を送入できる。
樹脂としては、シリコーン系樹脂(例えばポリジメチルシロキサン(PDMS))、アクリル系樹脂(例えばポリメタクリル酸メチル(PMMA))、スチレン系樹脂(例えばポリスチレン)、ポリビニルピリジン系樹脂(ポリ(4−ビニルピリジン)、4−ビニルピリジン−スチレン共重合体等)、ポリオレフィン系樹脂(例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂)、ポリエステル樹脂(ポリエチレンテレフタレート樹脂(PET))、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等がある。
なかでも、シリコーン系樹脂(例えばポリジメチルシロキサン(PDMS))、アクリル系樹脂(例えばポリメタクリル酸メチル(PMMA))、スチレン系樹脂(例えばポリスチレン)は、高い透明性を有するため好ましい。
培養用流路31a〜31cは、それぞれ、Y方向に沿って直線的に延在する直線部31dと、折返し部31eとが繰り返される蛇行構造となっている。
培養用流路31a〜31cの他端部31gは、それぞれ導出用流路34a〜34cによって、第2貯留槽2の第1〜第3区画28a〜28cの導入口37(37a〜37c)に通じている。このため、培養用流路31a〜31cは、導出用流路34a〜34cを介して第2貯留槽2に接続されている。
なお、培養用流路31a〜31cの一端部31fは、直接、第1貯留槽1の導出口36に接続されていてもよい。他端部31gは、直接、第2貯留槽2の導入口37に接続されていてもよい。
培養用流路31の断面積は、例えば0.1mm2〜10mm2とすることができる。
培養用流路31は、ここに示したマイクロチップ3の構成に限られない。培養用流路の形状や大きさや数、流路の幅、深さ、経路、数等は、細胞培養装置の用途などに応じて適宜設計することができる。
連絡用流路32a〜32cの一端部は、それぞれ第1貯留槽1の第1〜第3区画27a〜27cの導入口38(38a〜38c)に通じている。
連絡用流路32a〜32cの他端部は、それぞれ第2貯留槽2の第1〜第3区画28a〜28cの導出口39(39a〜39c)に通じている。
このため、連絡用流路32a〜32cは、第1貯留槽1と第2貯留槽2とを連通する流路である。
基板および天板の材料は特に制限されず、例えば樹脂(プラスチック)、ガラス等が使用できる。培養細胞を光学的に観察することが容易であることから、前記材料は透明材料であることが好ましく、具体的には樹脂およびガラスが好ましい。
樹脂としては、シリコーン系樹脂(例えばポリジメチルシロキサン(PDMS))、アクリル系樹脂(例えばポリメタクリル酸メチル(PMMA))、スチレン系樹脂(例えばポリスチレン)、ポリビニルピリジン系樹脂(ポリ(4−ビニルピリジン)、4−ビニルピリジン−スチレン共重合体等)、ポリオレフィン系樹脂(例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂)、ポリエステル樹脂(ポリエチレンテレフタレート樹脂(PET))、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等がある。
なかでも、シリコーン系樹脂(例えばポリジメチルシロキサン(PDMS))、アクリル系樹脂(例えばポリメタクリル酸メチル(PMMA))、スチレン系樹脂(例えばポリスチレン)は、高い透明性を有するため好ましい。
具体的には、第1逆止弁4は、第1貯留槽1の第1〜第3区画27a〜27c内の底壁14上に、導入口38(38a〜38c)を開閉できるように設置される。
図1および図2に示すように、第1逆止弁4は、連絡用流路32(32a〜32c)から第1貯留槽1への液体培地M1の流れを許容し、かつ第1貯留槽1から連絡用流路32(32a〜32c)への液体培地M1の流れを阻止する。
具体的には、第2逆止弁5は、第2貯留槽2の第1〜第3区画28a〜28c内の底壁14上に、導入口37(37a〜37c)を開閉できるように設置される。
図1および図2に示すように、第2逆止弁5は、導出用流路34(34a〜34c)から第2貯留槽2への液体培地M1の流れを許容し、第2貯留槽2から導出用流路34(34a〜34c)への液体培地M1の流れを阻止する。
なお、第1および第2逆止弁4、5は、底壁14に設けてもよいが、マイクロチップ3に設けてもよい。
図4に示すように、基体部41は、略矩形(詳しくは略長方形)の薄板状の底板部43と、底板部43の上面に高さ方向に突出して形成された厚肉部44とを有する。
側縁凸部44aおよび端縁凸部44b、44bは、それぞれ底板部43の側縁部43aおよび端縁部43b、43bに沿って形成されている。
端縁凸部44b、44bの両端面には、それぞれ押圧バー42の端部が挿入される挿入穴44cが形成されている。
厚肉部44によって囲まれた内部空間は、槽本体12の下部およびマイクロチップ3の一部を収容する収容凹部45となっている。
基体部41は、金属や樹脂で構成することができる。
押圧バー42は、両端部を厚肉部44の挿入穴44cに挿入した状態で、この挿入部分を支点として、端縁凸部44bに沿う中心軸の軸周り方向に回動可能となっている。
図3に示すように、押圧バー42は、凸状曲げ部45を蓋部13の切欠き21内に配置し、段部23に係止させることができる。これによって、蓋部13を槽本体12に対して押圧し、貯留槽11を確実に密封状態とすることができる。
送気経路46a、46bは、例えば貯留槽11の蓋部13の気体供給孔26a、26bの一端26a1、26b1に接続することができる。
次に、細胞培養装置10を用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
本発明において培養する細胞は、特に限定されず、例えばヒトを含む動物由来の細胞、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を目的に応じて使用できるが、特に好適な細胞の例として、血管内皮細胞がある。
培養用流路31に細胞を接着させるために細胞間基質(ECM)が必要である場合は、この予備工程を実施することが好ましい。
図1に示すように、第1貯留槽1に、細胞間基質(ECM)を含有する液(ECM含有液)を充てんし、加圧ポンプ6からの気体供給により第1貯留槽1を加圧することによって、ECM含有液を導入用流路33から培養用流路31に導入し、所定時間放置する。
第1貯留槽1に気体を送り込み、この気体を培養用流路31に送入することによって、ECM含有液を培養用流路31から除去し、導出用流路34を通して第2貯留槽2に導入し、排出する。
次いで、同様の手法により、PBS(リン酸緩衝溶液)で貯留槽1、2および流路31〜34を洗浄する。
なお、細胞間基質(ECM)がなくても培養用流路31への十分な細胞の接着強度が得られる場合には、この予備工程はなくてもよい。
第1貯留槽1に細胞懸濁液を充てんし、加圧ポンプ6からの気体供給により第1貯留槽1に気体を送入することによって、細胞懸濁液を導入用流路33から培養用流路31に導入し、所定時間静置して細胞を培養用流路31の内面に接着させる。
(第1サブ工程)
図1に示すように、液体培地M1を第1貯留槽1に充てんする。
加圧ポンプ6を稼働させ、第1送気経路46aを通して第1貯留槽1に気体(例えば空気)を供給して第1貯留槽1内を加圧する。この際、第2貯留槽2は、気体供給孔26bを通して大気に開放しておくことが好ましい。
第1貯留槽1内の圧力上昇によって、第1貯留槽1内の液体培地M1は、導出口36、導入用流路33を通って培養用流路31に導入され、培養用流路31内を流通する。液体培地M1は、導出用流路34を通って第2貯留槽2に導入される。
導入口38には第1逆止弁4が設けられているため、液体培地M1が第1貯留槽1から連絡用流路32に流入することはない。
加圧ポンプ6による第1貯留槽1への気体供給を停止するとともに、加圧ポンプ6によって、第2送気経路46bを通して第2貯留槽2に気体を供給して第2貯留槽2内を加圧する。この際、第1貯留槽1は、気体供給孔26aを通して大気に開放しておくことが好ましい。
第2貯留槽2内の圧力上昇によって、第2貯留槽2内の液体培地M1は、導出口39、連絡用流路32を通って第1貯留槽1に導入される。
導入口37には第2逆止弁5が設けられているため、液体培地M1が第2貯留槽2から導出用流路34に流入することはない。
第2サブ工程では、液体培地M1が第1貯留槽1に導入されるため、十分量の液体培地M1が第1貯留槽1内に確保される。
細胞に与えられる剪断応力(ずり応力)は、例えば1〜100dyn/cm2となる。
また、液体培地M1を第1貯留槽1と培養用流路31と第2貯留槽2との間で循環使用するため、液体培地M1の使用量を削減でき、かつ無菌的操作も容易になる。このため、複数の試験を並列的に行うのが容易となり、創薬スクリーニング等において効率の高い試験が可能である。
例えば、図8等に示す細胞培養装置10のマイクロチップ3では、培養用流路31、連絡用流路32、導入用流路33、および導出用流路34は、それぞれ3つ形成されているが、各流路の数は3に限らず、1または2でもよいし、4以上であってもよい。
Claims (5)
- 液体培地を貯留する密閉構造の第1および第2貯留槽と、
前記2つの貯留槽を互いに連通する1または複数の連絡用流路、および、1または複数の培養用流路が形成された流路デバイスと、
前記連絡用流路から前記第1貯留槽への前記液体培地の流れを許容し、かつ前記第1貯留槽から前記連絡用流路への前記液体培地の流れを阻止する第1逆止弁と、
前記培養用流路から前記第2貯留槽への前記液体培地の流れを許容し、かつ前記第2貯留槽から前記培養用流路への前記液体培地の流れを阻止する第2逆止弁と、
前記第1および第2貯留槽内を加圧可能な加圧手段と、を備え、
前記培養用流路は、前記第1貯留槽から導入された液体培地によって細胞を培養するとともに、前記液体培地を前記第2貯留槽に向けて流通させることを特徴とする細胞培養装置。 - 前記第1および第2貯留槽は、液体培地を貯留する容器状の槽本体と、前記槽本体の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有することを特徴とする請求項1に記載の細胞培養装置。
- 前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、
前記蓋部押圧部は、前記槽本体を支持する基体部と、基体部に支持された前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材とを有することを特徴とする請求項1または2に記載の細胞培養装置。 - 前記複数の培養用流路は、共通の前記第1貯留槽に接続され、
前記複数の連絡用流路は、共通の前記第1貯留槽および前記第2貯留槽に接続されていることを特徴とする請求項1〜3のうちいずれか1項に記載の細胞培養装置。 - 請求項1〜4のうちいずれか1項に記載の細胞培養装置を用いて細胞を培養する方法であって、
前記加圧手段によって前記第1貯留槽内を加圧することにより、前記第1貯留槽内の液体培地を前記培養用流路に導入して、前記培養用流路の内面に付着した細胞を培養するとともに、前記液体培地を前記第2貯留槽に向けて流通させる第1工程と、
前記加圧手段によって、前記第2貯留槽内を加圧することにより、前記第2貯留槽内の液体培地を、前記連絡用流路を通して前記第1貯留槽に導入する第2工程と、を有することを特徴とする細胞培養方法。
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