JP2015044826A - カーゴ分子の送達ビヒクルおよび炎症反応を免疫調節するための生物学的治療剤としてのYopM - Google Patents
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Abstract
Description
び反作用に最も重要なYopであることが示されている。
ることができ、したがって、免疫調節剤または免疫抑制剤として効率的に使用できることも見い出した。
片または単離したYopM変異体が、それにより、補助因子なしに、本明細書中で定義したカーゴ分子、たとえば、天然または非天然起源のペプチドもしくはタンパク質、DNA、RNA、炭水化物、脂質または化学的に考案された分子を、高等細胞内に輸送および送達することができることを意味する。
分間、より好ましくは25〜35分間、最も好ましくは30分間の期間インキュベーションすることを含む。YopM、YopM断片またはYopM変異体は、当業者に知られている任意の適切な培地中に存在し得る。たとえば、タンパク質は、たとえば、DMEM、FCS、L−グルタミン、HEPESおよびメチル−α−D−マンノースを含む感染培地中で提供する。好ましくは、感染培地は、500mlのDMEM、10%(v/v)のFCS、1mMのL−グルタミン、10mMのHEPESおよび1%(w/v)のメチル−α−D−マンノースを含む。アッセイには、たとえばコンフルエントに成長させた表面層として試験する細胞を含む細胞培養皿を、本明細書中で上述した感染培地中に任意の適切な濃度、たとえば、1〜100μg/ml、好ましくは5〜50μg/ml、より好ましくは10〜30μg/ml、最も好ましくは15〜25μg/mlの濃度で存在する本発明の化合物と共に、インキュベーションし得る。続いて、細胞を、当業者に知られている任意の適切な緩衝液、たとえばD−PBS/Mg2+で洗浄し得る。好ましくは、洗浄は氷冷緩衝液中で実施し、2回繰り返す。任意選択で、これに続いて0.2Mのグリシン、pH2.0を用いた酸洗浄を行う。続いて、当業者に知られている任意の適切な手段によって細胞を透過処理する。好ましくは、細胞を適切な超音波処理緩衝液に懸濁させ、その後、懸濁液を超音波処理によって透過処理し得る。続いて、生じた懸濁液を、たとえば、遠心分離、たとえば108,000×gで15分間、4℃によって、細胞画分に分離し得る。分画ステップの後、懸濁した細胞質タンパク質を含む上清を回収し得る。生じるペレットを、当業者に知られている任意の適切な緩衝液、たとえば超音波処理緩衝液で、任意選択で洗浄し得る。超音波処理緩衝液は、例示的に、トリスHCl、NaCl、EDTA、EGTA、グリセロール、NaVO4およびNaFを含む。好ましくは、超音波処理緩衝液は、50mMのトリスHCl、pH7.6、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、30%のグリセロール、0.4mMのNaVO4および1mMのNaFを含む。続いて、ペレットを、当業者に知られている任意の適切な緩衝液、たとえばTriton緩衝液、好ましくは、本明細書中で上述した超音波処理緩衝液中に1%(v/v)のTritonを含む1mlのTriton緩衝液に再懸濁させ得る。その後、懸濁液を、振盪器内で、当業者に知られている適切な期間、たとえば、30分間、4℃、15U/分でインキュベーションし得る。続いて、懸濁液を、たとえば108,000×gで15分間、4℃で、再度遠心分離し得る。生じる上清を「膜画分」として回収し得る。続いて、生じた画分は、当業者に知られている適切な手段、たとえばトリクロロ酢酸(TCA)を用いて沈殿させ得る。YopM、YopM断片またはYopM変異体の自己浸透および組込みの検出には、本明細書中で上述した方法によって得られた細胞質および膜の画分を、当業者に知られている任意の方法で、たとえば免疫染色によって分析し得る。例示的には、画分は、当業者に知られており、たとえば、LottspeichおよびZorbas(Bioanalytik、1998)から得られる、ウエスタンブロットによって分画し得る。検出は、たとえば、ポリクローナルネズミYopM抗血清、たとえば、完全長のエンテロコリチカ菌のYopMに対するポリクローナルネズミ抗血清を用いて行い得る。
イトゾル内に放出されて(後者が好ましい)、細胞質画分中に検出されることが想定される。
Press、フロリダ州Boca Raton、2007)およびLangel,U.(編)(細胞浸透性ペプチド:プロセスおよび応用(Cell−penetrating
peptides:Processes and Applications)、CRC Press、フロリダ州Boca Raton、2002)に記載されているものなどの、放射活性計数、ビオチン化/細胞−ELISA、蛍光標識/分光光度計/FACS、共鳴エネルギー移動、HPLC検出、免疫検出、蛍光相関顕微鏡観察(FCM)、キャピラリー電気泳動による細胞活性(CACE)、もしくはMALDI−TOF MSを含めた、当業者に知られているさらなる対応する方法を使用し得る。
B.他(1999)(Anal.Biol.、267:390)に記載されている核移行アッセイによって試験することができる。
体は、このNLS配列、すなわちYopMのロイシンリッチリピート1〜3を含み、より好ましくは配列番号4のアミノ酸74〜133を含む。
まれる(たとえば、ビオチン/ストレプトアビジン等の化学結合によってなど)。2つの部分、特に2つのタンパク質を「付着」させる方法は、当業者に周知である。
、手動の補正を適用し得る。多くの場合、網羅的なポリペプチドアラインメントに基づく%同一性の計算が、局所的にのみ一致するポリペプチドとは対照的に、全体(すなわち、重複する領域だけでなくすべてのオーバーハングが含まれる)としてのポリペプチド分子間の%同一性を反映しているため、好ましい。CLUSTALWプログラムは、%同一性を計算する際に対象配列のN末端またはC末端の切断を考慮しないため、網羅的な%同一性の決定のための手動の補正が必要である。クエリー配列と比較してN末端またはC末端が切断された対象配列では、%同一性は、対象配列のN末端またはC末端であり、一致/アラインメントしていないクエリー配列のアミノ酸の数を、クエリー配列の全アミノ酸の割合として計算することによって、補正する。アミノ酸が一致/アラインメントしているかどうかは、CLUSTALW配列アラインメントの結果によって決定される。その後、このパーセンテージを、指定したパラメータを用いて上記CLUSTALWプログラムによって計算した%同一性から減算して、最終的な%同一性スコアが得られる。この補正したスコアを本発明の目的のために使用し得る。
タンパク質の機能に重要な領域を同定するために、遺伝子操作を使用する。たとえば、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発(分子中のすべての残基に単一のアラニン突然変異を導入)を使用することができる(CunninghamおよびWells、Science、244:1081〜1085(1989))。その後、生じた突然変異体分子を、生物活性について試験することができる。著者らが述べているように、これら2つの戦略により、タンパク質が驚くべきことにアミノ酸置換に対して許容性があることが明らかとなった。著者らは、タンパク質中の特定のアミノ酸位置においてアミノ酸変化が許される可能性が高いことを、さらに示している。たとえば、ほとんどの埋まっている(タンパク質の三次構造の内部にある)アミノ酸残基は非極性の側鎖を必要とする一方で、表面側鎖の特長は一般にわずかしか保存的でない。
Drug Carrier Systems、10:307〜377(1993))。さらに、本発明には、本明細書中で上述したYopMに分子進化(「DNAシャフリング」)方法を適用することで作製されたポリペプチド変異体も含まれる。そのようなDNA
シャフリング技術は当業者に知られており、たとえば、Stemmer、(PNAS、91:10747、(1994)またはLeong他、(PNAS、100:1163〜1168(2003))から得られる。
つまたは複数のヒドロキシ基を含むポリマー(ポリヒドロキシポリマー)が含まれるもの[たとえばポリ(ビニルアルコール)が含まれる];反復単位が1つまたは複数のアミノ基を含むポリマー(ポリアミンポリマー)が含まれるもの[たとえば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ならびにアルブミンおよび天然リポタンパク質などのリポタンパク質が含まれる];反復単位が1つまたは複数のカルボキシ基を含むポリマー(ポリカルボキシポリマー)が含まれるもの[たとえば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ならびにアルギン酸ナトリウムおよびカルシウムなどのその塩、グリコサミノグリカンならびにヒアルロン酸の塩を含めたその塩、炭水化物のリン酸化およびスルホン酸誘導体、インターロイキン−2およびインターフェロンなどの遺伝物質、ホスホロチオエートオリゴマーが含まれる];反復単位が1つまたは複数の糖部分を含むポリマー(多糖ポリマー)が含まれるもの[たとえば炭水化物が含まれる]であり得る。
ン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸、ならびにその天然に存在する誘導体。したがって、適切なポリマーには、たとえば、タンパク質、たとえばアルブミン、ポリアルギネート、およびポリ乳酸−コグリコリドポリマーが含まれる。例示的な半合成ポリマーには、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチル−セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、およびメトキシセルロースが含まれる。例示的な合成ポリマーには、ポリホスファゼン、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイトポリマー、ポリエチレン(たとえば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン、およびポリエチレンテレフタレートなど)、ポリプロピレン(たとえばポリプロピレングリコールなど)、ポリウレタン(たとえば、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリ塩化ビニルおよびポリビニルピロリドンなど)、ナイロンを含めたポリアミド、ポリスチレン、ポリ乳酸、フッ素化炭化水素ポリマー、フッ素化炭素ポリマー(たとえばポリテトラフルオロエチレンなど)、アクリレート、メタクリレート、およびポリメチル−メタクリレート、ならびにその誘導体が含まれる。ポリマーを安定化化合物として用いる本発明の誘導体化したポリペプチドを調製する方法は、米国特許第5,205,290号に記載されているものおよびその中で引用されているものなどの、当分野で知られている情報と合わせた際に、本開示に鑑みて当業者に容易に明らかであろう。さらに、用語「YopM変異体」は、本発明のYopMポリペプチドのさらなる改変にも関する。そのようなさらなる改変は当分野で知られており、誘導体化方法などに加えて米国特許第6,028,066号に具体的に提供されている。
ける1つのαヘリックス構造の複製および2つの異なるαヘリックス構造の存在を含めて、ポリペプチド中の他の構造要素に関して任意の配向または順序であり得る。αヘリックス構造は、N末端もしくはC末端に位置していてもよいか、またはポリペプチドもしくは分子内の任意の他の適切な位置に局在していてもよい。
ド中、好ましくは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8のうちの任意の1つ中に存在する最初の3個のN末端ロイシンリッチリピートに関する。YopMのロイシンリッチリピート1〜3はEvdokimov他(J.Mol.Biol.、312:807〜821(2001))にも記載されている。ロイシンリッチリピート1〜3は、さらなるロイシンリッチリピートに関して、および/または本明細書中で上述した1つもしくは2つのαヘリックス構造に関して、および/またはポリペプチド中の他の構造要素に関して、任意の配向または順序であり得る。ロイシンリッチリピート1〜3は、N末端もしくはC末端に位置していてもよいか、またはポリペプチドもしくは分子内の任意の他の適切な位置に局在していてもよい。
を含まない、および/または免疫調節ドメインが失活している(たとえば、欠失、挿入などの突然変異による、または他の様式による)。「免疫調節能力を本質的に有さない」とは、本発明の化合物が、たとえば培地自体および/またはYopM87−Cなどの陰性対照と比較した場合に、たとえばTNFαなどの1つまたは複数のサイトカイン(好ましくはそのmRNA)を、約5%以下、10%、15%、20%、25%、30%、40%、または50%しかダウンレギュレーションしないことを意味する。用語「サイトカイン」および「ダウンレギュレーションする」は、本明細書中以下にさらに記載する。サイトカインのmRNAのダウンレギュレーションを決定するためのアッセイも、同様に本明細書中以下に詳述する。
接単離したか培養したかにかかわらず、体液、組織および細胞を含めた天然源から精製した生成物;化学合成手順の生成物;ならびに組換え技術によって、たとえば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物の細胞を含めた、原核または真核の宿主から産生した生成物からも回収することができる。
せたインキュベーションの間にこれらの小胞様構造中に同時局在化する(図6:d、e、f、g)。これらの結果があいまって、YopMのN末端αヘリックスがカーゴタンパク質を標的細胞の細胞質内に送達することができ、したがって、他のCPPについて既に記載されているように、カーゴを真核細胞内に送達するための新しいツールとして使用し得るCPPモチーフを表すことを実証している。
診断的な細胞内送達に適用可能である。しかし、本発明の代替実施形態は臨床応用に限定されないことを理解されたい。本発明は、医学的および生物学的研究に有利に応用し得る。本発明の研究応用では、カーゴは、たとえば薬物またはレポーター分子であり得る。
vivoで遮断し得る、囮オリゴヌクレオチドと合わせる。
れる第2のタンパク質、好ましくは、たとえば複数の機能を有するキメラタンパク質をもたらし得る異種タンパク質との間の融合タンパク質に関する。さらなる好ましい実施形態では、タンパク質−タンパク質融合体は、転写融合体の形態であり得る。適切な転写融合体、および対応する構築体を作製する適切な方法は、当業者に知られている。
00nm未満、100nm未満、50nm未満、30nm未満、20nm未満、10nm未満、最も好ましくは5nm未満または3nm未満を有する、そのような粒子に関する。好ましい実施形態では、用語「ナノ粒子」とは、たとえば最小の大きさが2.8nmの金粒子、たとえば最小の大きさが20nmの量子ドットをロードしたポリマーミセル、または最小の大きさが65〜200nmの立体的に安定なリポソームをいう。
らびに改変されており、親の薬剤と比較して減少もしくは増大したレベルの活性および/または減少もしくは増大した結合反応速度薬剤、たとえばプロドラッグが含まれる。
プログラム細胞死をもたらす任意のタンパク質に関する。好ましくは、この用語は、当業者に知られている任意のそのようなタンパク質に関する。より好ましくは、この用語は、アポトーシス促進タンパク質BAX、BID、BAK、またはBADに関する。
合物に関する。好ましくは、この用語は、当業者に知られている任意のそのような化合物に関する。より好ましくは、この用語は、プロスタグランジン、セロトニン、ヒスタミン、ブラジキニン、カリクレイン、ならびに胃腸管系ホルモン、放出ホルモン、下垂体ホルモン、インスリン、バソプレシン(ADH)、グルカゴン、エンケファリン、カルシトニン、およびコルチコステロイドに関する。
様々な細胞種または組織種の認識を容易にする分子を意味する。そのような(細胞に)特異的な相互作用を可能にする分子は、たとえば、細胞(たとえば腫瘍細胞)の表面上に位置する受容体または受容体断片と特異的に相互作用し、特定の細胞種または組織種中で示差的に発現されるリガンドであり得る。この用語には、当業者に知られている任意の適切なCD抗原、たとえば(http://www.pathologyoutlines.com/cdmarkers.html)からのもの、より好ましくは、たとえば、樹状細胞、腸管上皮細胞、B細胞の部分集合、NK T細胞の部分集合の標的化に使用し得るCD1d;CD11a、b、c、d;たとえばマクロファージの標的化に使用し得るCD14およびCD16/18;たとえば、IgMもしくはIgDを発現する活性成熟B細胞(特にマントル細胞)、活性単球/マクロファージ、T細胞の部分集合、血小板、好酸球、ランゲルハンス細胞、濾胞性樹状細胞、または腸管上皮の標的化に使用し得るCD23;たとえば、BおよびT細胞やB細胞前駆体、単球、破骨細胞、内皮細胞、ならびに様々な上皮細胞の標的化に使用し得るCD54(ICAM−1としても知られる);たとえば、NKの部分集合の細胞、T細胞の部分集合、神経外肺葉組織、網膜、脳、前立腺、腎近位尿細管の標的化に使用し得るCD57;マクロファージ/単球、活性顆粒球、樹状細胞または初期骨髄性細胞を含めた抗原提示細胞の標的化に使用し得るCD64(FcγRIとも呼ばれる);線維芽細胞、樹状細胞、マクロファージ、肝臓、脳または肺組織の標的化に使用し得るCD91(低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1(LRP1)としても知られ、α−2−マクログロブリン受容体とも呼ばれる)、CD−20、CD−45が含まれる。さらに、この用語は、抗CD抗体、分子危険シグナル、TLR、細菌毒素、たとえば、WO2006/114308号に記載されている神経細胞の「トラポ(trapo)」、または典型的には樹状細胞上に存在するDEC−205に関する。さらに、この用語は、たとえば脳、腎臓、肺、皮膚、または心臓などの特定の臓器または組織に特異的であり得る血管ホーミングペプチドに関する。より好ましくは、この用語は、Arap,W.他、Proc.Natl Acad Sci.U.S.A.、99:1527〜1531(2002);Rajotte,D.他、J.Clin Invest.、102:430〜437(1998);Pasqualini,R.、およびRuoslahti,E.(2002)Nat.Rev.Cancer、2:83;Rajotte,D.およびRuoshlati,E.、J.Biol.Chem.274:11593〜11598(1999);Essler,M.、およびRuoshlati,E.、Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.、99:2252〜2257(2002)に言及されているものなどのペプチドに関する。腫瘍ホーミングペプチドも想定される。用語「腫瘍ホーミングペプチド」とは、RGDおよび/またはNGRモチーフを含むタンパク質を意味する。典型的には、RGDモチーフを有するタンパク質はαvβ3およびαvβ5インテグリンと結合し、立ち代って、これらは血管形成性血管の特異的マーカーであるとみなされる(Eliceiri,B.P.およびCheresh,D.A.、Cancer J.、6:S245〜S249(2000))。さらに、NGRモチーフを有するタンパク質はアミノペプチダーゼNと結合する場合があり、立ち代って、これらは血管形成性の内皮細胞に特異的である(Pasqualini,R.他、Cancer Res.、60:722〜727(2000))。好ましい実施形態では、RGDおよび/またはNGRモチーフを含む腫瘍ホーミングペプチドは、当業者にはたとえばArap,W.他、Science、279:377〜380(1998);Pasqualini,R.他、Nat.Biotech.、15:542〜546(1997))から知られるように、関与する腫瘍の種類に依存しない血管形成細胞の全体的標的化に使用し得る。
N、Philp R、Helfrich M、およびHorton M、1989、J.Cell Biol.、109:1817〜1826;Clove J、Dodds R A、およびGowen M、1992、J.Cell Sci.、103:267〜271)。この細胞マーカーと結合し得る薬剤は本明細書中に記載されており、たとえば抗体などが含まれる。
Press、米国Cold Spring Harbor、1988を参照)、またはその結合特異性を保持もしくは本質的に保持している前記抗体の誘導体をいう。そのような抗体の好ましい誘導体は、マウスまたはラットの可変領域およびヒトの定常領域を含むキメラ抗体である。本明細書中で使用する用語「機能的断片」とは、分離した軽鎖および重鎖、Fab、Fab/c、Fv、Fab’、F(ab’)2などの、抗体の結合特異性を保持または本質的に保持している、本明細書中で指定した抗体の断片をいう。また、用語「抗体」は、二官能性(二重特異性)抗体および単鎖Fv(scFv)または抗体融合タンパク質などの抗体構築体を含む。用語「scFv断片」(単鎖Fv断片)は当分野で十分に理解されており、その大きさが小さく、そのような断片は組換えによって産生される可能性があるため、好ましい。前記抗体または抗体結合部分は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。本発明によれば、用語「ヒト化抗体」とは、CDR3、好ましくは6個すべてのCDRなどの、可変領域中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)が、所望の特異性を有するヒト源の抗体のCDRによって置き換えられている、非ヒト源の抗体を意味する。任意選択で、抗体の非ヒト定常領域が、ヒト抗体の定常領域によって置き換えられている。ヒト化抗体を産生する方法は、たとえば、EP−A1 0239400号およびWO90/07861号に記載されている。
28A、IL28B、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35(p35−EBI3)、LT−α、LT−β、LIGHT、TWEAK、APRIL、BAFF、TL1A、GITRL、OX40L、CD40L、FASL、CD27L、CD30L、4−1BBL、TRAIL、RANK、GM−CSF、M−CSF、SCF、IL1−α、IL1−β、aFGF、bFGF、int−2、KGF、EGF、TGF−α、TGF−β、TNF−α、TNF−β、ベータセルリン、SCDGF、アンフィレギュリンまたはHB−EGFが包含され、当業者に知られており、たとえば、Tato,C.M.およびCua,D.J.(Cell、132:900;Cell、132:500、Cell、132:324、(2008))またはサイトカインおよび細胞のオンラインパスファインダー百科事典(Cytokines&Cells Online Pathfinder Encyclopaedia)(http://www.copewith−cytokines.de)から得られる。「炎症誘発性サイトカイン」も企図される。用語「炎症誘発性サイトカイン」とは、炎症を支持する免疫調節サイトカインを意味する。典型的には、炎症誘発性サイトカインは、IL−1−α、IL−1−β、IL−6、およびTNF−αを含む。これらの炎症誘発性サイトカインは、初期応答において大きな役割を司っている。他の炎症促進伝達物質には、LIF、IFN−γ、IFN−α、OSM、CNTF、TGF−β、GM−CSF、TWEAK、IL−11、IL−12、IL−15、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−8、IL−16、IL−22、IL−23、IL−31、およびIL−32が含まれる(Tato,C.M.およびCua,D.J.Cell、132:900;Cell、132:500、Cell、132、324(2008))。これらの炎症誘発性サイトカインは、内在性発熱物質として作用するか(IL−1、IL−6、TNF−α)、マクロファージおよび間葉細胞(線維芽細胞、上皮および内皮細胞が含まれる)の両方による二次メディエーターおよび炎症誘発性サイトカインの合成をアップレギュレーションするか、急性期タンパク質の産生を刺激するか、または炎症細胞を誘引する場合がある。好ましくは、用語「炎症誘発性サイトカイン」とは、TNF−α、IL−15、IFN−γ、IFN−α、IL−1−β、IL−8、IL−16およびIL−22に関する。
胞は、発現パターンの比較を可能にするために、3時間、6時間および18時間インキュベーションする。YopM、YopM断片またはYopM変異体は、当業者に知られている任意の適切な培地中に存在し得る。好ましくは、タンパク質は、たとえば、DMEM、FCS、L−グルタミン、HEPESおよびメチル−α−D−マンノースを含む感染培地中で提供する。より好ましくは、感染培地は、500mlのDMEM(HeLa細胞用)またはRPMI(HL60細胞用)、10%(v/v)のFCS、1mMのL−グルタミン、10mMのHEPESおよび1%(w/v)のメチル−α−D−マンノースを含む。アッセイには、試験する細胞を含む細胞培養皿は、たとえば5×106個の細胞を接種してコンフルエントな表面層まで成長させた後、本明細書中で上述した感染培地中に1〜100μg/ml、好ましくは5〜50μg/ml、より好ましくは10〜30μg/ml、さらにより好ましくは15〜25μg/ml、最も好ましくは5μg/mlの濃度で存在するYopMタンパク質、YopM断片またはYopM変異体と共にインキュベーションし得る。HL60細胞は、たとえば当業者に知られている任意の適切な化合物を加えることによって、たとえばFontana他(Proc.Natl Acad Sci.U.S.A、78:3863〜3866(1981))から得られるPMA(ホルボール12−ミリステート13アセテート)を加えることによって、マクロファージに分化させることができる。続いて、細胞を当業者に知られている任意の適切な緩衝液、たとえばD−PBS/Mg2+で洗浄し得る。好ましくは、洗浄は氷冷緩衝液中で実施し、2回繰り返す。続いて、当業者に知られている任意の適切な手段によって細胞を透過処理する。好ましくは、細胞を適切な溶解緩衝液に懸濁させ、その後、懸濁液を、たとえばRNA単離キットを用いて、好ましくはRoche高純度RNA単離キットを用いて溶解し得る。続いて、RNAを当業者に知られている任意の適切な手段によって抽出する。さらなるステップでは、RNAを測定し、AmbionのT7オリゴ(dT)プライマーを用いて逆転写し、当業者に知られている任意の適切な手段、好ましくは当業者に知られている定量的RT−PCR、たとえば、Myers,T.W.およびGelfand,D.H.、Biochem.、30:7661〜7667(1991);Krug,M.S.およびBerger,S.L.、Methods Enzymol.、152:316〜325(1987),;Bustin,S.A.、J.Mol.Endocrinol.、29:169〜193(2000);Bustin,S.A.、J.Mol.Endocrinol.、25:23〜39(2002);Stahlberg,A.他、Clin.Chem.、50:509〜515(2004))から得られるものによって分析する。より好ましくは、RocheのTranscriptorキット、RocheのSybr Greenキット、および/またはRocheのLightCyclerを定量的リアルタイムRT−PCRに使用する。RNA分析は、任意の目的のタンパク質または因子、たとえば当業者に知られている任意の適切なサイトカイン、好ましくは本明細書中で上述したサイトカインについて実施する。より好ましくは、分析は、TNF−α、IL−15およびIFN−γについて実施する。最も好ましくは、リアルタイムRT−PCRプライマーは、Rocheから入手可能なユニバーサルプローブセットライブラリから導き得る。
でき、好ましくは炎症誘発性サイトカインをダウンレギュレーションすることができる。より好ましくは、これは、炎症誘発性サイトカインTNF−α、IL−15、IFN−α、IL−1−β、IL−8、IL−16およびIL−22のうちの任意の1つをダウンレギュレーションすることができ、さらにより好ましくは、これは、TNF−α、IL−15またはIFN−γのうちの少なくとも任意のものをダウンレギュレーションすることができる。最も好ましくは、これは、IFN−γをダウンレギュレーションすることができる。用語「ダウンレギュレーションすること」とは、本明細書中に上述されている。ダウンレギュレーションは、RNA定量アッセイまたは当業者に知られている試験、たとえば実施例に記載した試験において試験し得る。
スでは、RASFは、炎症性サイトカインおよびマトリックス分解分子を産生することによって関節の炎症および退化を能動的に引き起こす(Muller−Ladner,U.、Ospelt,C.、Gay,S.、Distler,O.、Pap,T.、Arthritis Res.Ther.、9:223〜233(2007))。RAの発生におけるRASFの能動的な関与から起因して、本発明者らは、組換えYopMとこの細胞種との相互作用を調査した。この目的のために、YopMを単離し、Ni−NTAアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、PBSに対して透析し、製造者の指示書に記載されているように反応性蛍光Cy3−色素とコンジュゲートさせた(Cy3−DyeLight Ab標識キット;GE Healthcare)。RASFをYopM−Cy3とそれぞれ30分間および1時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を蛍光顕微鏡観察用に調製した。DNAをDraq5で染色し、細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡観察によって分析した。YopM−Cy3と30分間インキュベーションした後、タンパク質がRASFの細胞質内部の小胞様構造中に現れ(図14;a〜c)、これは、YopMもこの細胞種に自己浸透することを示している。1時間延長してインキュベーションした後、インキュベーションしたRASFの細胞質内部のYopMの量が増加し、細胞の核周囲領域における特徴的なYopMの蓄積が観察された(図14;d〜f)。RASFに浸透するYopMの能力を確認した後、本発明者らは、YopMが炎症および軟骨破壊に対して効果を有するかどうかに興味を持った。この状況では、RASFによるIL−6の分泌は、滑膜における急性期反応および炎症を誘導する。RAにおいて観察される軟骨破壊は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の分泌および活性化によって引き起こされる。MMP−1およびMMP−3はRASFによって産生される主要な酵素である。MMP−1は線維状コラーゲン(コラーゲンI、II、VIIおよびX)を分解する一方で、MMP−3は広範囲の細胞外基質を分解する(Noh,E.M.、Kim,J.S.、Hur,H.、Park,B.H.、Song,E.K.、Han,M.K.、Kwon,K.B.、Yoo,W.H.、Shim,I.K.、Lee,S.J.、Youn,H.J.、Lee,Y.R.、Rheumatology、48:5〜48(2009))。IL−6、MMP−1およびMMP−3の分泌に対するYopMの影響を分析するために、RASFをTNFα(10ng/ml)および組換えYopMと、様々な時点の間同時インキュベーションした。続いて、RASFの培養上清におけるIL−6、MMP−1およびMMP−3の産生をELISAによって決定した(図15A〜C;培地、TNFαおよびYopM)。RASFをTNFαとインキュベーションした後、IL−6の産生が誘導される一方で(少なくとも3倍)、YopMとのインキュベーションでは、対照細胞と比較してIL−6産生の減少がもたらされた(x倍;培地、図15A)。RASFとTNFαおよびYopMとの同時インキュベーションにより、TNFαに誘導されたIL−6産生の劇的な阻害が明らかとなった。この効果は、組換えYopMとの8時間のインキュベーション後にも持続する(図15A;6時間および8時間)。MMP−1およびMMP−3の産生も劇的に減少させる。6時間および8時間の、RASFとYopM単独とのインキュベーション、ならびにTNFαおよびYopMとの同時インキュベーションにより、これらの軟骨破壊分子の量の強力な減少がもたらされた。合わせると、これらの結果は、組換えYopMがRAの発生に関与している細胞に浸透することができ、炎症性分子および軟骨破壊分子の産生に対して阻害効果を有することを実証している。このことは、組換えYopMをRAなどの自己免疫疾患の治療に有益に適用できるという本発明者らの主張を強調している。
なわち、1、2、3、4、5、6、7または8個のLRRを含む。さらなるLRRの付加も想定される。同様に、本発明のこれらの化合物がカーゴ分子と連結/付着していることが想定される。
図16A)。対照的に、破骨細胞形成の2つのメディエーターを用いた刺激に加えてYopMと同時インキュベーションすることは、骨髄細胞の破骨細胞形成の強力な阻害をもたらす(図16、A)。YopMと同時インキュベーションした細胞のうち、少数のみが小さな中間体細胞に発達し(2〜10個の核)、これはM−CSFで刺激した対照細胞でも観察された(図16、A)。さらに、光学顕微鏡観察によるTRAP+多核破骨細胞の定量により、M−CSFおよびRANKLでの刺激がTRAP+(前駆)破骨細胞(2〜10個の核)発生およびより大きな多核破骨細胞へのこれらの細胞の融合を誘導する(>10個の核;図16B)ことが明らかとなった。光学顕微鏡観察によって既に示されているように、この効果はYopMの同時インキュベーションによって完全に阻害された(図16B)。合わせると、本発明者らの結果は、YopMはRAに関連する炎症伝達物質の産生を減少させることができ(たとえば実施例9を参照)、また、破骨細胞形成の阻害による構造損傷を予防できることを示している。これらのYopM効果はどちらも、炎症および構造損傷に対する抗リウマチ治療において有益であり得る。
片、変異体および/または免疫調節ドメインなしでインキュベーションを実施した対照と比較して、少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または99%減少していることを意味する。骨髄細胞のM−CSFおよびRANKLでの刺激は、TRAP+(前駆)破骨細胞(2〜10個の核)発生およびより大きな多核破骨細胞へのこれらの細胞の融合も誘導する。この減少を評価する方法を本明細書中に例示する。
節を意味する。用語「炎症反応の免疫調節」とは、免疫系の炎症反応の調節をいう。そのような炎症反応は当業者に知られており、たとえば、Schmidt−Schonbein(Annu.Rev.Biomed.Eng.、8:93〜151(2006))から得られる。
部としての核酸の構築または他のベクターなどの援助により投与し得る。導入方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口の経路が含まれる。組成物は、任意の好都合な経路、たとえば、インフュージョンまたはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚の裏打ち(たとえば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など)を介した吸収によって投与してもよく、他の生物活性のある薬剤と共に投与してもよい。投与は全身性または局所的であることができる。さらに、本発明の薬剤化合物または医薬組成物を脳室内およびくも膜下腔内注射を含めた任意の適切な経路によって中枢神経系内に導入することが望ましい場合がある。脳室内注射は、脳室内カテーテルによって、たとえば、オマヤリザーバなどのリザーバに取り付けて容易に行い得る。また、たとえば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤を用いた配合によって、肺投与も用いることができる。
Therapy of Infectious Disease and Cancer)、Lopez−BeresteinおよびFidler(編)、Liss、New York、353〜365ページ(1989);Lopez−Berestein、同書、317〜327ページ)。
Raton(1974);制御された薬物の成体利用可能能、薬物製品の設計および性能(Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance)、SmolenおよびBall(編)、Wiley、New York(1984);RangerおよびPe
ppas,J.、Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.、23:61(1983)を参照;Levy他、Science、228:190(1985);During他、Ann.Neurol.、25:351(1989);Howard他、J.Neurosurg.、71:105(1989)も参照)。さらに別の実施形態では、徐放系を治療標的、すなわち脳に近接して配置することができ、したがって、全身用量の一部分のみが必要となる(たとえば、Goodson、徐放性の医学的用途(Medical Applications of Controlled Release)、上記、第2巻、115〜138ページ(1984)を参照)。
本明細書中で言及した疾患および病状のうちの任意のものを治療する方法に関する。好ましくは、本発明は、本明細書中で他の箇所に例示した疾患を予防、寛解および/または治療する方法に関する。好ましくは、治療する対象は動物であり、より好ましくは、治療する対象は人間である。
(a)本発明の化合物を、細胞内への送達の後にex vivoおよび/またはin vivoで治療活性を示すカーゴ分子と付着させることと;任意選択で
(b)前記化合物を製薬上許容される担体と接触させることと
を含む、医薬組成物を製造する方法にも関する。
シンリッチリピート、またはYopMのαヘリックスのうちの2つおよび1〜3個のYopMロイシンリッチリピートを本質的に含み、追加の要素を必要とせずに細胞膜に自己浸透して細胞サイトゾル内に組み込まれることができるYopM断片またはYopM変異体に関する。
び1〜3個のYopMロイシンリッチリピート、またはYopMのαヘリックスのうちの2つおよび1〜3個のYopMロイシンリッチリピートを本質的に含むYopM断片またはYopM変異体の、細胞核に入る能力は、核移行配列(NLS)の存在に関連している。より好ましくは、YopM断片またはYopM変異体は、本発明の状況では、当業者に知られているYopM NLS、たとえば、YopMのロイシンリッチリピート1〜3、好ましくは配列番号4のロイシンリッチリピート1〜3中に存在するNLSを含む。好ましい実施形態では、YopM断片またはYopM変異体はYopMのロイシンリッチリピート1〜3を含み、より好ましくは配列番号4のアミノ酸74〜133を含む。
また、本発明は、細胞膜を横切って少なくとも1つのカーゴ分子を真核細胞のサイトゾルに送達するための、追加の要素を必要とせずに真核細胞の細胞膜に自己浸透して細胞サイトゾル内に組み込まれることができるエルシニア外側タンパク質M(YopM)、YopM断片またはYopM変異体の使用にも関する。また、前記YopM断片またはYopM変異体はYopMのαヘリックスのうちの少なくとも1つを含むことも想定される。また、前記YopM断片またはYopM変異体はさらに少なくとも1つのYopMロイシンリッチリピートを含むことも企図される。好ましい実施形態では、前記YopM断片またはYopM変異体は、YopMのロイシンリッチリピート1〜3(LRR1〜3)を含む。また、上記使用では、YopMは、YopMをコードしている病原性プラスミドを天然に含むエルシニア属菌株のYopM、好ましくは、エンテロコリチカ菌、偽結核菌またはペスト菌の種、より好ましくはエンテロコリチカ菌8081v、血清型O:8のものから選択されることも企図される。YopMは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8からなる群から選択される任意の配列のアミノ酸配列を含むことが企図される。また、前記断片または変異体は、
配列番号4のアミノ酸1〜239;
配列番号4のアミノ酸55〜367;
配列番号4のアミノ酸1〜73;
配列番号4のアミノ酸52〜73;
配列番号4のアミノ酸1〜133;
配列番号4のアミノ酸52〜133;ならびに
配列番号4のアミノ酸1〜51およびアミノ酸74〜133
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことも企図される。
ックスのうちの2つ、YopMのαヘリックスのうちの1つおよび1〜3個のYopMロイシンリッチリピート、またはYopMのαヘリックスのうちの2つおよび1〜3個のYopMロイシンリッチリピートを本質的に含み、追加の要素を必要とせずに細胞膜に自己浸透して細胞サイトゾル内に組み込まれることができるYopM断片またはYopM変異体にも関する。YopM、YopM断片またはYopM変異体であって、前記YopM断片またはYopM変異体は、追加の要素を必要とせずに細胞膜に自己浸透して細胞サイトゾル内に組み込まれることができ、前記YopM、前記YopM断片または前記YopM変異体は、少なくとも1つのカーゴ分子と連結しており、ただし、前記連結は、以下のカーゴのうちの1つ、すなわち、β−ラクタマーゼ、EGFPおよび百日咳菌シクロリシンのアデニル酸シクラーゼドメイン(Cya)とのペプチド結合による連結ではないものも想定される。前記連結は、切断可能なリンカーによって形成されているか、またはジスルフィド結合、ペプチド結合もしくはストレプトアビジン−ビオチン複合体が含まれいてよい。前記連結は、前記YopM、前記YopM断片または前記YopM変異体のC末端またはN末端での連結であり得る。前記カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、有機分子、有機小分子、金属、ナノ粒子、ウイルス、改変ウイルス、ウイルスベクターおよびプラスミドから選択される少なくとも1つの化合物を含み得る。前記カーゴ分子は、治療的タンパク質、自殺タンパク質、腫瘍抑制タンパク質、転写因子、キナーゼ阻害剤、キナーゼ、調節タンパク質、アポトーシスタンパク質、抗アポトーシスタンパク質、微生物抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生生物抗原、細胞抗原、分化因子、不死化因子、毒素、酵素、アンチセンス構築体、診断的イメージング剤または造影剤、同位体、色素、抗細菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗増殖剤、細胞増殖抑制剤、免疫抑制剤、ヒスタミン受容体拮抗剤、ビタミン、鎮痛剤、抗新生物剤、ホルモン、抗炎症剤、接着分子、受容体分子、治療的有機分子、有機阻害剤、ペプチド阻害剤および抗老化剤からなる群から選択される少なくとも1つの化合物を含み得る。前記YopM断片または前記YopM変異体は、細胞特異的な標的薬剤とさらに連結していてよい。前記細胞特異的な標的薬剤は、CD抗原、抗CD抗体、分子危険シグナル、TLR、細菌毒素、血管ホーミングペプチド、腫瘍ホーミングペプチドおよびDEC−205からなる群から選択され得る。
YopMの推定上の細胞外機能によれば、最近、無極性に分泌されたYopMおよび組換えYopMがエルシニア属菌のT3SSに依存せずに宿主の細胞膜に浸透できる可能性があることが示唆された。宿主細胞の細胞質内へのYopMの細菌接触非依存性の送達をさらに分析するために、HeLa細胞を組換えYopMと共にインキュベーションし、続いてサイトゾル(CF)および膜タンパク質画分(MF)に分離し、TCAで沈殿させ、SDS−PAGEによって分離し、ウエスタンブロッティングによって分析した。
にHL60およびXS52細胞を用いて、YopMのこのプロセス(「自己浸透」)を確認することができ、これが特定の真核細胞種に限定されないYopMの内因性の能力であることが示された。
宿主細胞の細胞質内へのYopMのT3SS非依存性の自己浸透を媒介するYopM内のドメインをさらに分析および位置決定するために、NまたはC末端が切断された、組換えHisタグ付けしたYopMの様々な型を構築した(図4A)。YopM、YopMN−239、YopM172−CおよびYopM87−Cのクローニングならびに組換えタンパク質の発現および精製は以前に記載されている(Heusipp他、2006)。ア
ミノ酸(aa)残基1〜55を欠失させるために、プライマー対を用いてYopM55−Cを同様に構築した(図4A)。YopMの第2のαヘリックスの欠失は、pET−yopMを鋳型として用いた逆PCRによって達成した(図4A;YopMΔ2αH)。
宿主の細胞膜に自己浸透するYopMの能力を、実施例1および2に記載した実験で同定した。そのメンバーが「細胞浸透性ペプチド」(CPP)と呼ばれるタンパク質群について同様の機能が記載されている。CPPは、オリゴヌクレオチドおよびペプチドなどの小さなカーゴを生細胞内に非侵襲的に輸送するために使用されている。最近、全タンパク質のペプチド媒介性の細胞送達が実証された。HI−ウイルスのTatタンパク質に由来するトランスポータンおよびキイロショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質がタンパク質を生細胞内に送達することができる(DietzおよびBahr、2003を参照)。
自然免疫系は、非特異的な様式で宿主を病原体による感染から防御する細胞および機構を含む。自然免疫系の細胞および構成要素は、養子免疫系とは異なり、持続的または誘導性の免疫を宿主に与えない、一般的な様式で病原体を認識してそれに応答する。脊椎動物の自然免疫系の主要な機能には、サイトカインを介して免疫細胞を感染および炎症の部位に動員することが含まれる。サイトカインおよびケモカインは、成長の刺激、分化、および活性化に関与し、また、免疫応答の性質を制御および決定し、免疫細胞の輸送および免疫器官の細胞配置を制御する、冗長な分泌タンパク質である(BorishおよびSteinke、2003)。さらに、自然免疫系には、補体カスケードの活性化および抗原提示を介した養子免疫系の活性化が含まれる。
αの転写はわずかにのみ低下していた。しかし、mRNA量はインキュベーション中に大きく低下した(18時間まで;図7A)。同様のパターンがHL60細胞におけるIL−15のmRNAでも見られた。このサイトカインの転写も経時変化中に大きく減少し、培地とインキュベーションした細胞を比較して、YopM処理した後の18時間後に約80%の減少のプラトーがもたらされた(対照;図7B)。
激する、T細胞成長因子である。さらに、これは循環NK細胞の維持および活性化、ならびに骨髄におけるNK細胞の発生に重要である(Kennedy他、2000;Prlic他、2003;Ranson他、2003;WaldmannおよびTagaya、1999)。単核食細胞、上皮、線維芽細胞および胎盤がIL−15の主な供給源である。
自己浸透したYopMはTNFα、IL−15またはIFNγなどの炎症誘発性サイトカインをダウンレギュレーションする能力を有するが、遺伝子転写に対するYopMの全体的な影響は、TNFα、IL−15またはIFNγに基づいた実験単独では決定することができない。さらなるサイトカインに対するYopMの転写への影響および他のこれまでは知られていない遺伝子に対するその影響に関する知識を増やすために、遺伝子アレイ分析を行った。この技術により、40,000個の遺伝子の転写の変化の調査が単一の実験で可能となる。
翻訳の変化、さらに、YopMによるサイトカインの分泌の変化を評価するために、R
ayBio(登録商標)ヒト炎症抗体アレイを用いた。この目的のために、分化したHL60細胞を組換えYopM、YopM87−C、または培地と共に6時間インキュベーションした。続いて、インキュベーションした細胞の上清を特定の炎症誘発性サイトカインの量について分析した。
免疫調節を媒介するYopM内のドメインを分析および位置決定するために、以前に記載したYopMの切断された型(実施例2を参照)を用いて分化したHL60細胞を処理した。本発明者らは自己浸透能力が免疫調節に必要であると推定したため、対照タンパク質YopM87−C以外では、すべて依然として宿主の細胞膜に浸透することができる、YopMのこの型のみを使用した(実施例2を参照)。
炎症性腸疾患(IBD)は、消化管の様々な組織を攻撃する過剰反応性免疫系によって特長づけられる。主要なIBDの種類は、クローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC)である。CDは胃腸管のどの部分にも影響を与えることができる一方で、UCは結腸および直腸に限定される。上昇したレベルの炎症誘発性サイトカイン、特にIL−12関連分子が、細胞媒介性の免疫応答およびIBDに関与している(Larousserie,F.、Pflanz,S.、Coulomb−L’Hermine,A.、Brousse,N.、Kastelein,R.、Devergne,O.、J.Pathol.、
202:164〜171(2004))。最近の研究により、ヒト腸管微小血管内皮細胞(HIMEC)がIBDの病因に積極的に関与していることが示唆されている(Hatoum,O.A.およびBinion,D.G.、Inflamm.Bowel Dis.、11:304〜313(2005))。HIMECにおける炎症誘発性サイトカインおよびIL−12関連分子の発現は、TLR3作用剤ポリ(I:C)によって誘導することができる(Heidemann,J.、Ruther,C.、Kebschull,M.、Domschke,W.、Bruwer,M.、Koch,S.、Kucharzik,T.、Maaser,C.、Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.、293:G1315〜1324(2007))。したがって、ポリ(I:C)で刺激したHIMECは、ヒトIBDのメディエーターに対するYopMの影響を調査することができるIBDのin vitroモデルを表す。
胞種に加えてヒト腸管微小血管内皮細胞にも入る能力を有し、ヒトIBDのこのin vitroモデルにおいて炎症のメディエーターの誘導を防止できることを示している。
関節リウマチ(RA)とは、最も一般的には関節の炎症および組織損傷(関節炎)を引き起こす、慢性の全身性自己免疫障害である。RAの関節炎は、関節および腱鞘を裏打ちする滑膜の炎症である滑膜炎が原因である。RA滑膜線維芽細胞(RASF)は、滑膜マクロファージと共に、RAにおける関節破壊の能動的駆動因子である。この破壊的プロセスでは、RASFは、炎症性サイトカインおよびマトリックス分解分子を産生することによって関節の炎症および退化を能動的に引き起こす(Muller−Ladner,U.、Ospelt,C.、Gay,S.、Distler,O.、Pap,T.、Arthritis Res Ther、9:223〜233(2007))。
および8時間)。MMP−1およびMMP−3の産生も劇的に減少させる。6時間および8時間の、RASFとYopM単独とのインキュベーション、ならびにTNFαおよびYopMとの同時インキュベーションにより、これらの軟骨破壊分子の量の強力な減少がもたらされた。合わせると、これらの結果は、組換えYopMがRAの発生に関与している細胞に浸透することができ、炎症性分子および軟骨破壊分子の産生に対して阻害効果を有することを実証している。このことは、組換えYopMをRAなどの自己免疫疾患の治療に有益に適用できるという本発明者らの主張を強調している。
炎症の制御に加えて、構造損傷の予防が抗リウマチ治療の主な目的である。RAの1つの特徴は、関節近接骨の破壊を含む局所的な骨侵食である。この構造損傷は、ミネラル化した軟骨および肋軟骨下骨を再吸収する関節中およびその周囲の破骨細胞の形成に基づいている。破骨細胞は炎症性関節炎の混合細胞浸潤の不可欠な部分であり、構造損傷部位でのこれらの細胞の蓄積は、破骨細胞の形成に関与している分子が疾患の破壊的プロセスにおいて重要な役割を果たしていることを示唆している(Schett,G.、Arthritis Res.Ther.、9、補遺1:S2(2007))。この状況では、核因子κBリガンドの受容体活性化剤(RANKL)およびマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)が、その前駆細胞からの破骨細胞の分化に必須であり、どちらの分子が欠けても、破骨細胞の形成を完全に遮断するために十分となる(Yoshida,H.、Hayashi,S.、Kunisada,T.、Ogawa,M.、Nishikawa,S.、Okamura,H.、Sudo,T.、Shultz,L.D.、Nishikawa,S.、Nature、345:442〜444(1990))。
Tissue Res.、330:111〜121(2007))。RANKLおよびM−CSFによって誘導したマウス骨髄細胞はYopM(10ng/ml)と共に5日間インキュベーションした一方で、対照細胞はRANKL/M−CSFのみと共にインキュベーションした。続いて、細胞を顕微鏡観察用に調製した。TRAP+細胞を、Fast
Garnett(白血球酸ホスファターゼキット、Sigma Diagnostics)を含有する200μlの溶液を用いて、酒石酸の存在下、30分間37℃で染色した。
顕微鏡観察によって既に示されているように、この効果はYopMの同時インキュベーションによって完全に阻害された(図16B)。
YopMの2つのN末端ヘリックス(2αH)によるカーゴの潜在的なin vivo送達に関して、自己免疫疾患、特に関節リウマチ(RA)などのTNF関連疾患を治療するYopMの免疫調節能力を用いて、本発明者らは、麻酔したヘアレスマウスの後肢の関節内に関節内(i.a.)注射した後のCy5とコンジュゲートさせたYopMの分布を、蛍光反射イメージング(FRI)によって調査した。組換えYopMを単離し、Ni−NTAクロマトグラフィーによって精製し、PBSに対して透析し、製造者の指示に記載されているように反応性蛍光Cy5色素とコンジュゲートさせた(Cy5−DyeLight Ab標識キット;GE Healthcare)。マウスの後肢の関節内に関節内注射した後、YopM−Cy5は注射部位に留まり、72時間の期間中に全身に散在しなかった。YopM−Cy5シグナルは経時的に消失し、これはおそらく色素および/または化合物全体の分解によるものである。この初期結果は、YopMを骨格関節内に集中施用することの実現可能性を示しており、RAおよび他の炎症性疾患の治療における新規治療剤としてYopMの潜在性をさらに強化している。
YopMの細胞内局在化を決定するために、金で標識したYopMを備えた電子顕微鏡観察(EM)を行った(図18)。HeLa細胞をインキュベーションした後の早期に(37℃で5〜15分間)、YopM−Auが細胞表面と結合して検出され(図18;a)、また、サイトゾル中の小胞と会合しているようにも見えた(図18;b)。インキュベーション後の後期に(15〜60分間)、YopM−Auは多小胞体中に見つけることができ(MVB;図18;c)、これは、後期エンドソーム(LE)の典型的な形態である。興味深いことに、本発明者らは、明確な膜を全く有さないYopM関連構造をしばしば観察した(図18;d)。さらに、小胞膜は溶解しているように見え、YopMがエンドソーム区画から漏れることを許容していた。最後に、YopM−Auは、サイトゾル中に遊離して、および核質内で検出された(3時間)(図18;f、黒色矢印によって示した)。これは、YopMが最初に小胞関連機構を介して宿主細胞に入った後、後の時点で細胞質に入ることを示し、本発明者らはこのプロセスを自己浸透と呼んだ。自己浸透後、YopMはサイトゾル中に遊離して表れ、核周囲領域中に蓄積され、核に入ることができる。
Claims (15)
- 細胞膜を横切って少なくとも1つのカーゴ分子を真核細胞のサイトゾルに送達するための、追加の要素を必要とせずに真核細胞の細胞膜に自己浸透して細胞サイトゾル内に組み込まれることができるエルシニア外側タンパク質M(YopM)、YopM断片またはYopM変異体の使用。
- 前記YopM断片またはYopM変異体がYopMのαヘリックスのうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の使用。
- YopM、その断片または変異体が、YopMをコードしている病原性プラスミドを天然に含むエルシニア属菌株のYopMから選択される、請求項1または2に記載の使用。
- YopM、その断片または変異体が、エンテロコリチカ菌(Y.enterocolitica)、偽結核菌(Y.pseudotuberculosis)またはペスト菌(Y.pestis)の種のYopMから選択される、請求項3に記載の使用。
- YopMまたはその変異体が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8からなる群から選択されるいずれかの配列のアミノ酸配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
- 前記カーゴ分子が、核酸、ポリペプチド、有機分子、有機小分子、金属、ナノ粒子、ウイルス、改変ウイルス、ウイルスベクター、抗体および/またはプラスミドからなる群から選択される少なくとも1つの化合物を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用。
- 前記カーゴが治療的および/または診断的活性を示す、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用。
- 前記YopM、前記YopM断片または前記YopM変異体が細胞特異的な標的薬剤とさらに連結している、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用。
- 前記YopM、前記YopM断片または前記YopM変異体が免疫調節能力を本質的に有さない、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用。
- YopM、YopM断片またはYopM変異体を含む医薬組成物であって、前記YopM断片またはYopM変異体が追加の要素を必要とせずに細胞膜に自己浸透して細胞サイトゾル内に組み込まれることができる、医薬組成物。
- サイトカインおよび/もしくはサイトカイン受容体および/もしくはサイトカインに応答する遺伝子および/もしくは軟骨破壊分子のダウンレギュレーション、ならびに/または破骨細胞形成の阻害に使用するための、追加の要素を必要とせずに細胞膜に自己浸透して細胞サイトゾル内に組み込まれることができるYopM、YopM断片またはYopM変異体を含む医薬組成物。
- サイトカインおよび/もしくはサイトカイン受容体および/もしくはサイトカインに応答する遺伝子および/もしくは軟骨破壊分子のダウンレギュレーション、ならびに/または破骨細胞形成の阻害に使用するための、細胞膜に自己浸透して細胞サイトゾル内に組み込まれる能力を本質的に有さないYopMの免疫調節ドメインを含む医薬組成物。
- 前記YopM、YopM断片、YopM変異体および/またはYopMの免疫調節ドメインがカーゴと連結している、請求項10から12のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 免疫系の炎症反応の調節、宿主の自己免疫によって引き起こされる疾患の治療、炎症、慢性炎症、胃腸炎、慢性胃炎、炎症性腸疾患(IBD)、潰瘍性大腸炎、乾癬、アレルギー反応、クローン病、関節リウマチの治療、骨吸収の変化によって特徴づけられた骨疾患の治療および/または免疫系の抑制に使用するための、請求項10から13のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- YopMのαヘリックスのうちの1つ、YopMのαヘリックスのうちの2つ、YopMのαヘリックスのうちの1つおよび1〜3個のYopMロイシンリッチリピート、またはYopMのαヘリックスのうちの2つおよび1〜3個のYopMロイシンリッチリピートを本質的に含み、追加の要素を必要とせずに細胞膜に自己浸透して細胞サイトゾル内に組み込まれることができるYopM断片またはYopM変異体であって、前記YopM、前記YopM断片または前記YopM変異体が少なくとも1つのカーゴ分子と連結している、YopM断片またはYopM変異体。
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