BR112016027196B1 - Vetor e cepa bacteriana gram-negativa recombinante - Google Patents

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Abstract

CEPA BACTERIANA GRAM-NEGATIVA RECOMBINANTE, VETOR, MÉTODO PARA LIBERAR UMA PROTEÍNA HETERÓLOGA EM UMA CÉLULA EUCARIÓTICA, MÉTODO PARA PURIFICAR UMA PROTEÍNA HETERÓLOGA E USO DE UMA CEPA BACTERIANA GRAM- NEGATIVA RECOMBINANTE. A presente invenção refere-se as cepas bacterianas gram-negativas recombinantes e ao uso das mesmas para liberação de proteínas heterólogas dentro de células eucarióticas.

Description

Campo da invenção
[0001] A presente invenção refere-se às cepas bacterianas gram-negativas recombinantes e ao uso das mesmas para liberação de proteínas heterólogas dentro de células eucarióticas.
Antecedentes da invenção
[0002] As técnicas de transfecção transitórias têm sido aplicadas em pesquisas de biologia celular durante muitos anos, para abordar as funções das proteínas. Estes métodos resultam geralmente em uma super-representação massiva da proteína sob estudo, o que pode conduzir a modelos super- simplificados de sinalização [1]. Para as proteínas controlando os processos de sinalização de vida-curta, a proteína de interesse está presente na medida em que o evento de sinalização é controlado [2]. Ainda mais, a transfecção do DNA com base na super-expressão transitória conduz a uma população celular heteróloga e não-sincronizada, o que complica os estudos funcionais e impede a abordagem ômica. Além disso, os estudos mais elevados das referidas análises para uma escala maior são muito onerosos. Alguns dos pontos acima mencionados são cobertos pela existência de técnicas como a micro-injeção ou proteo-fecção das proteínas purificadas, a estratégia de transporte induzível para buscar rapidamente AS GTPases pequenas nascidas do plasmídeo para a membrana celular [2] ou a adição de proteínas purificadas fundidas às toxinas bacterianas permeáveis na célula [3]. Mas estas técnicas consomem todas elas muito tempo e são complexas e devido ao nosso conhecimento nenhuma preenche todos os critérios mencionados.
[0003] A bactéria tem evoluído diferentes mecanismos para injetar diretamente as proteínas dentro de células alvos [4]. Os sistemas de secreção do tipo III (T3SS) utilizados pelas bactérias, tais como Yersinia, Shigella e Salmonella [5] funcionam como uma nano-seringa que injeta as assim chamadas proteínas efetoras bacterianas dentro das células hospedeiras. As proteínas bacterianas a serem secretadas via T3SS, chamadas efetoras, abrigam um sinal de secreção N- terminal curto [6]. Dentro da bactéria, algumas efetoras são ligadas por chaperonas. As chaperonas podem mascarar os domínios tóxicos [7], elas contribuem para exposição do sinal de secreção [8, 9] e mantem os substratos em uma conformação de secreção competente [10], facilitando, portanto, a secreção. Durante a indução da secreção, uma ATPase adjacente ao T3SS remove as chaperonas [11] e as efetoras viajam desdobradas ou apenas parcialmente dobradas através da agulha [10], e a redobra uma vez no citoplasma do hospedeiro.
[0004] T3S tem sido explorado por liberar peptídeos híbridos e proteínas dentro de células alvos. As efetoras T3SS bacterianas heterólogas tem sido liberadas no caso de bactérias sob estudo serem dificilmente acessíveis pela genética (tipo Chlamydia trachomatis; [12]). Frequentemente, as proteínas repórter foram fundidas em sinais de secreção T3SS possíveis, e como para estudo dos requerimentos para liberação da proteína dependente T3SS, tal como a ciclase adenilato de Bordetella pertussis [13], DHFR de murino [10] ou um tag fosforilado [14]. A liberação do peptídeo foi principalmente conduzida com o auxílio de vacinação. Isto inclui epítopos virais [15, 16], epítopos bacterianos (listeriolisina o, [17]) bem como peptídeos representantes do epítopo de células de câncer humano [18]. Em poucos casos, as proteínas eucarióticas funcionais têm sido liberadas para modular a célula hospedeira, como feito com os nanocorpos [19], proteínas nucleares (cre-recombinase, MyoD) [20,21] ou Il10 e Il1ra [22]. Nenhum dos sistemas acima-mencionados permite liberação de proteínas únicas como em cada caso um ou múltiplas proteínas efetoras endógenas são ainda codificadas. Adicionalmente, os vetores utilizados não têm sido construídos em uma rota que permita a simples clonagem de outros fragmentos de DNA codificantes das proteínas de escolha, obstruindo a aplicação ampla do sistema.
[0005] Portanto, um método simples e barato permitindo uma liberação dimensionável, rápida, sincronizada, homogênea e sintonizável de uma proteína de interesse, em concentrações fisiológicas, seria de grande benefício para muitos biologistas celulares.
Sumário da invenção
[0006] A presente invenção refere-se genericamente as cepas bacterinas gram-negativas recombinantes e ao uso das mesmas para liberação de proteínas heterólogas dentro de células eucarióticas. A presente invenção provê cepas bacterianas gram-negativas e o uso dessas, o que permite o transporte de vários efetoras do tipo III, mas também as efetoras do tipo IV, de proteínas virais e mais importante, de proteínas eucarióticas funcionais. Os meios para rastreio fosforescente de liberação, para relocalização dos núcleos e notavelmente para remoção dos apêndices bacterianos após a liberação à célula hospedeira são providos. Isto permite em um primeiro momento a liberação de quase todas as proteínas nativas dentro de células eucarióticas usando apenas uma T3SS. O sistema baseado em T3SS apresentado resulta em uma liberação dimensionável, rápido, sincronizado, homogêneo e sintonizável de uma proteína de interesse. O sistema de liberação da presente invenção é apropriado para injetar proteínas eucarióticas em animais vivos e pode ser utilizada para o propósito terapêutico.
[0007] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere- se a uma cepa bacteriana gram-negativa recombinante selecionada a partir do grupo consistindo do gênero Yersinia, Escherichia, Salmonella e Pseudomonas, sendo que a referida cepa bacteriana gram-negativa é transformada com um vetor que compreende a direção 5’ para 3’: um promotor, uma primeira sequencia de DNA codificante de um sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS, operavelmente ligada ao referido promotor; e uma segunda sequencia de DNA codificante de uma proteína heteróloga fundida em uma estrutura da extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA, onde a proteína heteróloga é selecionada a partir do grupo consistindo de proteínas envolvidas na apoptose ou na regulação da apoptose.
[0008] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere- se a uma cepa bacterina gram-negativa recombinante transformada com um vetor, que compreende na direção 5’ para 3’: um promotor; uma primeira sequência de DNA codificante de um sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS, operavelmente ligada ao referido promotor; uma segunda sequência de DNA codificante de uma proteína heteróloga fundida na estrutura da extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA; uma terceira sequência de DNA codificante de um sítio de clivagem da protease, sendo que a terceira sequência de DNA está localizada entre a extremidade 3’ do referida primeira sequência de DNA e a extremidade 5’ da segunda sequência de DNA.
[0009] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere- se a uma cepa bacteriana gram-negativa recombinante, onde a cepa bacteriana gram-negativa recombinante é uma cepa de Yersinia e sendo que a referida cepa de Yersinia é alelo- selvagem ou deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora T3SS e é transformada com um vetor que compreende na direção 5’ para 3’: um promotor; uma primeira sequência de DNA codificante de um sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS onde o sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana compreende os 138 aminoácidos do N-terminal da proteína efetora YopE de Y. enterocolitica, operavelmente ligada ao referido promotor; e uma segunda sequência de DNA codificante de uma proteína heteróloga fundida na estrutura da extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA.
[0010] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere- se a uma cepa bacteriana gram-negativa, sendo que a cepa bacteriana gram-negativa recombinante é uma cepa de Salmonella e sendo que a referida cepa de Salmonella é alelo- selvagem ou deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora T3SS e é transformada com um vetor que compreende na direção 5’ para 3’: um promotor; uma primeira sequência de DNA codificante de um sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS bacteriana onde o sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana compreende a proteína efetora SteA de S. enterica ou os 81 ou 105 aminoácidos N-terminal da proteína efetora SopE de S. entérica, operavelmente ligados ao referido promotor; e uma segunda sequência de DNA codificante de uma proteína heteróloga fundida na estrutura para a extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA.
[0011] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere- se a um vetor que compreende na direção 5’ para 3’: um promotor; uma primeira sequência de DNA codificante de um sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS bacteriana, operavelmente ligada ao referido promotor; uma segunda sequência de DNA codificante de uma proteína heteróloga fundida na estrutura para a extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA; e uma terceira sequência de DNA codificante de um sítio de clivagem de protease, sendo que a terceira sequência de DNA está localizada entre a extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA e a extremidade 5’ da referida segunda sequência de DNA.
[0012] A presente invenção refere-se, adicionalmente, a um método para liberar uma proteína heteróloga dentro de uma célula eucariótica compreendendo as etapas a seguir: (i) cultivar a cepa bacteriana gram-negativa; e (11) contatar a célula eucariótica com a cepa bacteriana gram-negativa de (i), sendo que uma proteína de fusão que compreender um sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana e a proteína heteróloga ser expressa através da cepa bacteriana gram-negativa e ser transportada para dentro de uma célula eucariótica.
[0013] A presente invenção refere-se, adicionalmente, a um método para liberar uma proteína heteróloga dentro de uma célula eucariótica compreendendo as etapas a seguir: (i) cultivar a cepa bacteriana gram-negativa; (ii) contatar a célula eucariótica com a cepa bacteriana gram-negativa de (i), sendo que uma proteína de fusão que compreender um sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana e a proteína heteróloga ser expressa através da cepa bacteriana gram-negativa e ser transportada para dentro de uma célula eucariótica; e (iii) clivar a proteína de fusão de modo que a proteína heteróloga seja clivada a partir do sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana.
[0014] A presente invenção refere-se adicionalmente a um método para purificar uma proteína heteróloga compreendendo o cultivo de uma cepa bacteriana gram-negativa de modo que uma proteína de fusão que compreende um sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS bacteriana e a proteína heteróloga seja expressa e secretada dentro do sobrenadante da cultura.
[0015] Em um aspecto adicional da presente invenção refere- se a uma cepa bacteriana gram-negativa, sendo que a proteína heteróloga codificada pela segunda sequência de DNA do vetor de expressão das cepas bacterianas gram-negativas ser uma proteína humana ou de murino e, sendo que cada uma das proteínas, humana ou de murino, expressas por uma cepa bacteriana gram-negativa seja diferente na sequência de aminoácidos.
Breve descrição dos desenhos
[0016] A figura 1 ilustra a caracterização da liberação da proteína T3SS. (A) ilustra uma representação esquemática da secreção da proteína dependente de T3SS dentro do meio em torno (secreção in vitro)(lado esquerdo) ou dentro das células eucarióticas (lado direito). (I) mostra o sistema de secreção tipo 3; (II) indica as proteínas secretadas ao redor do meio; (III) indica as proteínas transportadas através da membrana dentro do citossol das células eucarióticas (VII).(VI) mostra uma extensão de duas membranas bacterianas nas quais a T3SS é inserida e o citossol bacteriano por baixo. (IV) mostra uma proteína de fusão ligada ao YopE1-138 do fragmento N-terminal (V),(B) é a secreção in vitro de (I): Y. enterocolitica E40 alelo-selvagem, II: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd ou III: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + pBadSi_2, como revelado por Western blotting sobre o lisado bacteriano total (IV) e os sobrenadantes da cultura precipitada (V), usando um anticorpo anti-YopE;
[0017] A figura 2 ilustra a caracterização da liberação da proteína T3SS dentro das células epiteliais. (A) coloração imunofluorescente do anti-myc em células HeLa infectadas em um MOI de 100 durante 1 hora com I: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd ou II: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + pBad_Si2. (B) quantificação da intensidade de coloração imunofluorescente anti-myc a partir de (A) dentro das células HeLa. Os dados foram combinados a partir de n=20 sítios, as barras de rro indicam o padrão de erro da média. I: não- infectadas; II: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd ou III: Y. enterocolitica DHOPEMT asd + pBad_Si2. O eixo Y indica a intensidade de coloração anti-myc [unidade arbitrária], o eixo x indica o tempo de infecção em minutos. (C) quantificação da intensidade de coloração imunofluorescente anti-myc dentro das células. As células HeLa foram infectadas pro 1 hora com Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + pBad_Si2 em um MOI, indicado sobre o eixo X. os dados foram combinados a partir de n=20 sítios, as barras de erro indicaram o erro padrão da média. O eixo Y indica a intensidade de coloração anti-myc [a.u.];
[0018] A figura 3 ilustra as modificações da liberação da proteína a base de T3SS permitindo a localização nuclear de uma proteína de fusão YopE1-138 (EGFP). Os sinais EGFP nas células HeLa infectadas com I: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd ou II: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd ΔyopB carregando os plasmídeos, III: + YopE1-138-EGFP ou IV: + YopE1-138-EGFP-NLS em um MOI de 100. O sinal EGFP é mostrado em “a”, para comparação da localização no núcleo foram corados em “b”;
[0019] A figura 4 ilustra as modificações da liberação da proteína a base de T3SS permitindo a remoção do apêndice YopE1-138. As células HeLa foram infectadas com duas cepas diferentes de Y. enterocolitica ao mesmo tempo, que é alcançada pela simples mistura de duas suspensões bacterianas. Uma cepa é liberada na protease TEV fundida ao YopE1-138, enquanto a outra cepa libera uma proteína de interesse fundida ao YopE1-138 com um ligante contendo um sítio de clivagem da protease TEV dupla. Após a liberação da proteína dentro da célula eucariótica, a protease TEV irá clivar o apêndice YopE1-138 a partir da proteína de interesse (A) células HeLa lisadas com Digitonina não-infectadas (II) ou após a infecção (MOI de 100) por 2 horas com I:; Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd e III: + pBadSi_2, IV: + YopE1-138- 2x sítio de clivagem TEV-Flag-INK4C, V: + YopE1-138-2x sítio de clivagem TEV-Flag-INK4C e, tratamento durante a noite adicional com a protease TEV purificada e VI: + YopE1-138-ex o sítio de clivagem TEV-Flag-INK4C e uma segunda cepa + YopE1-138- TEV foram analisadas por Western blotting anti-INK4C (mostrado em “a”) quanto à presença de YopE1-138-2x sítio de clivagem TEV-Flag-INK4C ou sua forma clivada Flag-INK4C. Como um controle de carga, o Western blotting anti-actina foi realizado (mostrado em “b”). Em um caso (V) as células lisadas foram incubadas durante a noite com a protease TEV purificada. (B) quantificação normalizada por actina da intensidade de coloração anti-INK4C (mostrado como [a.u.], no eixo Y) a partir de (A) no tamanho da extensão completa YopE1-138-2x do sítio de clivagem TEV-Flag-INK4C, onde a amostra IV é representada em 100%. I: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd e IV: + YopE1-138-2x do sítio de clivagem TEV- Fagl-INK4C, V: + YopE1-138-2x do sítio de clivagem TEV-Flag- INK4C e adicionalmente, o tratamento durante a noite com a protease purificada TEV e VI: + YopE1-138-ex do sítio de clivagem TEV-Flag-INK4C e uma segunda cepa + YopE1-138-TEV. Os dados foram combinados a partir de n=2 experimentos independentes, as barras de erro indicadas são o padrão de erro da média (C), as células HeLa lisada com Digitonina não- infectadas (II) ou após a infecção (MOI de 100) por 2 horas com I: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd e III: + pBadSi_2, IV: + YopE1-138-2x do sítio de clivagem TEV-ET1-Myc, V: + YopE1-138- 2x do sítio de clivagem TEV-ET1-Myc e o tratamento adicional durante a noite, com a protease TEV purificada e VI: + YopE1- 138-2x do sítio de clivagem TEV-ET1-Myc e uma segunda cepa + YopE1-138-TEV foram analisadas por Western blotting anti-Myc (mostrado em “a”) para a presença de YopE1-138-2x do sítio de clivagem TEV - ET1-Myc ou sua forma clivada ET1-Myc. Como um controle de carga, o Western blotting anti-actina foi realizado (mostrado em “b”). Em um caso (V) as células lisadas foram incubadas durante a noite com protease TEV purificada;
[0020] A figura 5 representa a liberação das proteínas efetoras bacterianas dentro das células eucarióticas (A), as células HeLa foram infectadas com I: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd carregando II: pBad_Si2 ou III: YopE1-138-SopE em um MOI de 100 pelo tempo indicado acima, as imagens (2, 10 ou 60 minutos). Após a fixação das células foram coradas para o citoesqueleto de actina (B), as células HeLa não-infectadas esquerda (II) ou infectada com I: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd carregando III: YopE1-138-SopE-Myc e em alguns casos co- infectada com IV: YopE1-138-SpttP no MOI indicado abaixo da cepa (MOI 50; MOI50:MOI50 ou MOI50:MOI100) para 1 hora. Após a fixação das células ser corada ao citoesqueleto de actina (mostrado em “a”) e a presença da proteína de fusão YopE1- 138-SopE-Myc foi seguido via coração anti-Myc (mostrado em “b);
[0021] A figura 6 ilustra a liberação das proteínas efetoras bacterianas dentro das células eucarióticas (A) fosfo-p38 (“a”), total p38 (“b”) e actina (“c”) pela análise de Western blot sobre as células HeLa, esquerda não-tratada (II) ou infectadas por 75 minutos com I: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd carregando III: pBad_Si2 ou IV: YopE1-138-OspF em um MOI de 100. As células foram estimuladas com TNFα para os últimos 30 minutos da infecção como indicada (+ permanência na adição de TNFα, - representa sem tratamento com TNFα) (B) fosfo-Akt T308 (“a”) e S473 (“b”) e actina (“c”) na análise de Western blot sobre as células HeLa, esquerda não tratadas (II) ou infectada para 22,5 ou 45 minutos (indicado abaixo nas manchas) com I: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd e carregando III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-SopE ou V: YopE1-138- SopB em um MOI de 100 (C) níveis cAMP (em fmol/poço mostrado sobre o eixo Y) em células HeLa, esquerda não-tratada (I) ou infectada por 2,5 horas com V: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YopEi-i38-BepPA, VI: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YOPEI-I38- BepAE305-extremidade, VII: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YopE1-138- BepGBid ou VIII: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + pBad_Siw em um MOI de 100. A toxina cólera (CT) foi adicionada por 1 hora como controle positivo às amostras II (1 μg/ml), III (25 μg/ml) ou IV (50 μg/ml). Os dados foram combinados a partir de n=3 experimentos independentes, barras de erros indicadas são erros padrão da média. A análise estatística foi realizada usando um Teste-T de duas-caudas não-pareado (números indicam uma mudança não significativa, ** indicam um valor p < 0,01, *** indica um valor p < 0,001);
[0022] A figura 7 ilustra a liberação da tBid humana dentro de células eucarióticas induzem a apoptose massiva. (A) a análise Werstern blot da Caspase clivada 3 p17 (“a”) e actina (“b”) sobre as células HeLa, esquerda não-tratada (II), ou infectadas por 60 minutos com I: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd carregando III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-Bid ou V: YopE1-138- t-Bid em um MOI de 100. Em alguns casos, as células foram tratadas com VI: 0,5 μM de Staurosporina ou VII: 1 μM Staurosporina (B) células HeLa lisadas por digitonina, esquerda não-tratada (II) ou após infecção por 1 hora com I: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd carregando III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-Bid ou V: YopeE1-138-t-Bid em um MOI de 100 foram analisados por Western Blotting anti-Bid (“a”) permitindo a comparação de níveis Bid endógenos (marcado com Z) para transportar os níveis YopE1-138-Bid (marcado com X) ou YopE1- 138-tBid (marco Y). Como um controle de carga, o Western blotting anti-actina foi realizada (mostrado em “b”). Em alguns casos, as células foram tratadas com VI: 0,5 μM Staurosporina ou VII: 1 μM Staurosporina (C), as células HeLa foram não-tratadas, esquerda, (I) ou infectadas em um MOI de 100 por 1 hora com II: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + pBad_Si2, III: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YopE1-138-Bid, IV: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YopE1-138-tBid. Em alguns casos, as células foram tratadas com V: 0,5 μM de Staurosporina ou VI: 1 μM Staurosporina. Após a fixação, as células foram coradas para o citoesqueleto de actina (cinza);
[0023] A figura 8 ilustra a liberação dependente de T3SS do peixe-zebra Bim (“zebrafish”) que induz a apoptose nos embriões do peixe zebra. (A) 2 dpf de embriões do peixe-zebra foram infectadas com EGFP expressando Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd +pBad_Si1 cepa controle (I) ou cepa de transporte zBIM (II: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YopE1-138- zBIM) por injeção de cerca de 400 bactérias dentro da região do rombencéfalo (“hindbrain”). Após 5,5 horas de embriões foram fixados, coradas pela Caspase ativada 3 (Caspase 3 clivada, p17; mostrado em “c”) e analisada quanto à presença de bactéria ( sinal EGFP, mostrado em “b”). A intensidade máxima de projeções z é mostrada para as imagens fluorescentes. A projeção z em campo brilhante é mostrada em “a” (B) análise da imagem automatizada sobre a intensidade máxima das projeções z das imagens em pilhas-z registradas de (A). Resumidamente, as bactérias foram detectadas via canal GFP. Em torno de cada área de um ponto bacteriano um círculo com um rádio de 10 pixels foi criada. As regiões de sobreposição foram igualmente separadas entre os membros de conexão. Naquelas áreas mais próximas da bactéria, a intensidade da coloração da caspase 3 p17 foi medida e é plotada sobre o eixo Y (como [a.u.]). A análise estatística foi realizada usando um teste Mann-Whitney (*** indica um valor p < 0,001) Os dados foram combinados de n =14 para Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + pBad_Si1 cepa controle (I) ou n=19 para II: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YopE1-138-zBIM animais infectados, as barras de erro indicadas são erro padrão da média;
[0024] A figura 9 ilustra fosfoproteoma dependente de tBID. As células HeLA foram infectadas por 30 minutos com Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YopE1-138-t-Bid em um MOI de 100 e como um controle com Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + pBad_Si2. (A) representação gráfica do fosfoproteoma tBID. As proteínas contendo os fosfopeptídeos que foram significativamente regulados de uma maneira dependente de tBid (cinza) (valor-q < 0,01) bem como, apoptose conhecida relacionada às proteínas (cinza escuro) são representados em uma rede STRING conhecida e previsível das interações proteína-proteína (alta confidência, pontuação 0,7). Apenas as proteínas com pelo menos uma conexão na rede STRING são representadas. (B) imagens cofocais das células HeLa infectadas tanto com Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + pBad_Si2 (I) ou Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YopE1-138-t- Bid (II) revelaram a indução de um fenótipo apoptótico durante a liberação tBid. As células foram coradas para o núcleo com Hoechst (“a”), para F-actina com faloidina (“b”), para tubulina com um anticorpo anti-tubulina (“c”) e para a mitocôndria com mito-rastreador (“d”). A barra de escala representa 40 μm;
[0025] A figura 10 mostra a descrição das ferramentas de liberação à base de secreção do tipo III. (A) Mapas dos vetores dos plasmídeos de clonagem pBad_Si1 e pBad_Si2 utilizados para gerar os constructos de fusão com YopE1-138. A chaperona SycE e a YopE1-138-fusão estão sob o promotor de Y. enterocolitica nativa. Os dois plasmídeos diferem apenas na presença de um EGFP induzível por arabinose presente no pBad_Si1 (B) dos sítios de múltiplas clonagem seguindo o fragmento YopE1-138 sobre os plasmídeos pBad_Si1 e pBad_Si2;
[0026] A figura 11 mostra a caracterização da liberação da proteína T3SS dentro de várias linhas de cédulas. A coloração imunofluorescente anti-myc sobre o fibroblastos 3T3 suíço (“a”), células Jurkat (“b”) e células HUVEC (“c”) esquerda não-tratada (II) ou infectado com Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + pBad_Si2 (I) no MOI indicou acima as imagens (MOI 25, 50, 100, 200 e 400 para HUVECs) por 1 hora;
[0027] A figura 12 ilustra a dependência T3Ss da liberação das proteínas efetoras bacterianas dentro da célula eucariótica. As células HeLa lisada por Digitonina após a infecção em um MOI de 100 por umt empo indicado acima das manchas (0, 5, 15, 10, 60 e 120 minutos) com Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd ΔyopB + YopE1-138-SopE-Myc (I) ou Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YopE1-138-SopE-Myc (II) foram analisadas por Western blotting anti-Myc. O tamanho correspondente para o YopE1-138-SopE-Myc é marcado com “a”, enquanto o tamanho da proteína c-Myc endógeno é marcada com “b”;
[0028] As figuras 13 e 14 mostram a secreção dependente de T3SS de várias outras proteínas dentro do sobrenadante da cultura. O experimento de secreção in vitro de I: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YopE1-138 fundido à proteína como indicado. O conteúdo de proteína do lisado bacteriano total (“A”) e os sobrenadantes precipitados na cultura (“B”) foi analisado por Western blotting usando um anticorpo anti-YopE. Os números escritos indicam o peso molecular em kDa na altura correspondente;
[0029] As figuras 15A à 15M ilustram as cepas Y. enterocolitica e S. entérica utilizadas neste estudo. A lista de cepas Y. enterocolitica e S. entérica utilizadas neste estudo provendo informação sobre as cepas antecedentes, plasmídeos e proteínas para a liberação dependente de T3SS codificada nos plasmídeos correspondentes. Adicionalmente, a informação sobre os oligonucleotídeos utilizados para construção do plasmídeo correspondente, a cadeia principal do plasmídeo e a resistência ao antibiótico é provida;
[0030] A figura 16 mostra a liberação do tBid murino, Bid BH3 murino e Bax BH3 murino dentro das células B16F10 induz apoptose massiva. As células B16F10 não-infectada (I) ou após a infecção (MOI de 50) por 2,5 horas com Y. enterocolitica e S. entérica e II: + pBadSi_2, III: + YopE1-138 de tBid de murino otimizado com o códon da Y. enterocolitica, IV: + YopE1-138 do Bid BH3 de murino otimizado do códon de Y. enterocolitica ou V: + YopE1-138 do Bax BH3 do murino otimizado pelo códon de Y. enterocolitica. Após a fixação das células foram coradas pelo citoesqueleto de actina e núcleo (ambos em cinza);
[0031] A figura 18 mostra a liberação de tBid murina, Bid BH3 murino, e Bax BH3 murino dentro das células HeLa induz apoptose massiva. As células HeLa não infectada (I) ou após infecção (MOI de 50) por 2,5 horas com Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd e II: + pBadSi_2, III: + YopE1-138 de tBid de murino otimizado pelo códon de Y. enterocolitica, IV: + YopE1-138 de Bid BH3 de murino otimizado pelo códon de Y. enterocolitica ou V: + YopE1-138 de Bax BH3 de murino otimizado do códon de Y. enterocolitica. Após a fixação das células foram coradas para o citoesqueleto de actina e núcleo (ambos em cinza);
[0032] A figura 19 mostra a liberação de tBid de murino, Bid BH3 de murino e Bax BH3 de murino dentro das células 4T1 induz a apoptose massiva. As células 4T1 não infectada (I) ou após a infecção (MOI de 50) por 2,5 horas com Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd e II: + pBadSi_2, III: YopE1-138 de tBId de murino otimizado pelo códon Y. enterocolitica, IV: + YopE1-138 do Bid BH3 de murino otimizado do códon de Y. enterocolitica ou V: + YopE1-138 de Bax BH3 de murino otimizado com códon Y. enterocolitica. Após a fixação, as células foram coradas para o citoesqueleto de actina e o núcleo (ambos em cinza);
[0033] A figura 20 mostra a liberação do tBid murino pelo crescimento de S. entérica sob SPI-1 T3SS induzindo as condições dentro das células eucarióticas que induz a apoptose. A análise Western blot Caspase 3 p17 clivada sobre as células HeLa, esquerda não tratada (I) ou infectada por 4 horas com III: S. enterica aroA carregando IV: SteA1-20-t- Bid, V: SteAFL-Bid, VI: SoPE1-81-t-Bid ou VII SopE1-105-t-Bid em um MOI de 100. Para este experimento, todas as cepas S. entérica aroA foram crescidas sob condições indutoras de SPI- 1 T3SS. Em alguns casos, as células foram tratadas com II: 1 μM de Staurosporina. Os números escritos indicam o peso molecular na kDa na altura correspondente;
[0034] A figura 21 mostra a liberação de tBid murino pelo crescimento de S. entérica sob SPI-2 T3SS as condições de indução dentro das células eucarióticas que induzem apoptose. A análise por Western blot da Caspase 3 p17 de clivagem sobre as células HeLa, esquerda não tratada (I) ou infectada por 4 horas com III: S. entérica aroA carregando IV: SteA1-20-t- Bid, V: SteAFL-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid ou VII: SopE1-105-t-Bid em um MOI de 100. Para este experimento, todas as cepas de S. enterica aroA foram crescidas sob as condições de indução SPI-2 T3SS. Em alguns casos, as células foram tratadas com II: 1 μM de Staurosporina. Os números escritos indicam o peso molecular em kDa na altura correspondente;
[0035] A figura 22 mostra a secreção dependente de T3Ss de S. entérica de várias proteínas do ciclo celular dentro do sobrenadante da cultura. O experimento de secreção in vitro de S. entérica aroA + tanto SteAFL (I, III, V, VII) ou SopE1- 105 (II, IV, VI, VIII) fundido às proteínas como listadas a seguir. I e II: Ink4a-MycHis; III e IV: Ink4c-MycHis; V e VI: Mad2-MycHis; VII e VIII: Cdk1-MycHis. O conteúdo de proteína dos sobrenadantes da cultura precipitados (“A”) e o lisado bacteriano total (“B”) foram analisados por Western blotting usando um anticorpo anti-myc. Os números escritos indicam o peso molecular em kDa na altura correspondente;
[0036] A figura 23 mostra a secreção dependente de T3SS de vários ciclos celulares conhecidos interferindo nos peptídeos dentro do sobrenadante da cultura. O experimento de secreção in vitro de I: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + pBad_Si2. II-VII: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YopE1-138 fundidas aos peptídeos como listadas como a seguir: II Ink4 A84-103; III: p107/RBL1657-662; IV: p21141-160D149A; V: p21145-160D149A; VI: p2117-33; VII: ciclina D2139-147. O conteúdo da proteína do sobrenadante da cultura precipitada (“A”) e lisado bacteriano total (“B”) foram analisados por Western blotting usando um anticorpo anti-YopE. Os números escritos indicam peso molecular no kDa na altura correspondente; e
[0037] A figura 24 mostra a fusão da proteína liberada T3SS para a ubiquina permite a remoção do apêndice YopE1-138. As células HeLa são infectadas com uma cepa de liberação da proteína de interesse fundida ao YopE1-138 com uma ubiquina fundida diretamente (YopE1-138-Ubi). Após a liberação da proteína dentro da célula eucariótica, as proteases específicas de ubiquina endógeno irá clivar o apêndice YopE1- 138-Ubi a partir da proteína de interesse. As células HeLa lisadas com Digitonina não infectada (I) ou após a infecção (MOI de 100) por 1 hora com II: Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd + YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis ou III: + YopE1-138-Flag- Ubiqueina-INK4C-MycHis foram analisadas por Western blotting anti-INK4C para a presença de IV: YopE1-138-Flag-Ubiquitina- INK4C-MycHis ou V: YopE1-138-Falg-INK4C-MycHis, a forma clivada VI: INK4C-MycHis e VII: o INK4C endógeno.
Descrição detalhada da invenção
[0038] A presente invenção provê cepas bacterianas gram- negativas recombinantes e o uso das mesmas para liberação das proteínas endógenas dentro de células eucarióticas.
[0039] Para o propósito de interpretação deste relatório, as definições a seguir serão aplicadas e quando apropriados, os termos no singular também incluirão o plural e vice-versa. Deve ser entendido que a terminologia utilizada aqui é para o propósito de descrição das concretizações particulares apenas e não pretendem ser limitativas.
[0040] O termo “cepa bacteriana gram-negativa”, como utilizado aqui, inclui as bactérias a seguir: Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Anaeromyxobacter dehalogenans, Bordetella bronchiseptica, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachmoatis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila pneumoniae, Chromobacterium violaceum, Citrobacter rodentium, Desulfovibrio vulgaris, Edwardsiella tarda, Endozoicomonas elysicola, Erwinia amylovora, Escherichia albertii, Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Mesorhizobium loti, Myxococcus xanthus, Pantoea agglomerans, Photobacterium damselae, Photorhabdus luminescens, Photorabdus temperate, Pseudoalteromonas spongiae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhizobium sp, Salmonella enterica and other Salmonella sp, Shigella flexneri and other Shigella sp, Sodalis glossinidius, Vibrio alginolyticus, Vibrio azureus, Vibrio campellii, Vibrio caribbenthicus, Vibrio harvey, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio tasmaniensis, Vibrio tubiashii, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis. As cepas bacterianas gram- negativas preferidas da presente invenção são as cepas bacterianas gram-negativas compreendidas pela família das Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae. A cepa bacteriana gram-negativa da presente invenção é normalmente utilizada para liberação de proteínas heterólogas pelas T3SS bacterianas dentro de células eucarióticas in vitro e in vivo.
[0041] O termo “cepa bacteriana gram-negativa recombinante” utilizado aqui, refere-se a uma cepa bacteriana gram-negativa geneticamente transformada com um vetor. Um vetor útil da presente invenção é, por exemplo, um vetor de expressão, um vetor para inserção cromossomal ou inserção de plasmídeo de virulência ou um fragmento de DNA para inserção cromossomal ou de plasmídeo virulento.
[0042] Os termo “cepa bacteriana gram-negativa deficiente para produzir um aminoácido essencial para crescimento” e “mutante auxotrófico” são utilizados aqui intercaladamente e referem-se as cepas bacterianas gram-negativas que não podem crescer na ausência de pelo menos um aminoácido essencial exogenamente produzido ou um precursor dos mesmos. o aminoácido que a cepa é deficiente em produzir é, por exemplo, aspartato, ácido meso-2,6-diaminopimélico, aminoácidos aromáticos, ou leucina-arginina [23]. A referida cepa pode ser gerada, por exemplo, por deleção do gene desidrogenase aspartato-beta-semialdeído (Δasd). Tal mutante auxotrófico não pode crescer na ausência do ácido meso-2,6- diaminopimélico [24]. A mutação, por exemplo, deleção do gene desidrogenase aspartato-beta-semialdeído é preferida aqui para uma cepa bacteriana gram-negativa, da presente invenção, deficiente em produzir um aminoácido essencial para crescimento.
[0043] O termo “cepa bacteriana gram-negativa deficiente em produzir proteínas de adesão para ligação à superfície da célula eucariótica ou à matriz extracelular” refere-se a cepas mutantes de bactérias gram-negativas que não expressam pelo menos uma proteína de adesão comparada às proteínas de adesão expressas pela correspondente cepa alelo-selvagem. As proteínas de adesão podem incluir, por exemplo, moléculas de adesão poliméricas estendidas do tipo adesinas pili/fimbriae ou adesinas não-finbriais. As adesinas fimbriais incluem a pili tipo 1 (tal como Fim-pili E. coli, com a adesina FimH), P-pili (tal omo a Pap-ili com a adesina PapG de E. coli), pili tipo 4 (como a proteína pilina de, por exemplo, P. aeruginosa) ou curli (proteínas Csg com a adesina CsgA de S. entérica). As adesões não-fimbriais incluem adesinas auto- transportadoras trimérica tais como YadA de Y. enterocolitica, BpaA (Bpseudomalleí), Hia (H. influenzae), BadA (B. henselae), NadA (N. meningitidis) or UspAl (M. catarrhalis) bem como outras adesinas transportadoras tais como AINDA-1 (E. coli) bem como outras adesinas/invasinas tais como InvA de Y. enterocolitica ou Intimina (E. coli) ou membros da família-Dr ou da família-Afa (E. coli). Os termos YadA e InvA como utilizados aqui, referem-se às proteínas de Y.enterocolitica. O auto-transportador YadA [25, 26] se liga a diferentes formas de colágeno, bem como à fibronectina, enquanto a invasina InvA [27, 29] se liga a β-integrina na membrana de células eucarióticas. Se a cepa bacteriana gram- negativa for uma cepa Y. enterocolitica, a cepa é, preferivelmente, deficiente na InvA e/ou YadA.
[0044] Como utilizado aqui, o termo “família das Enterobacteriaceae” compreende uma família de gram-negativas, formato de haste, bactérias anaeróbicas facultativas encontradas no solo, água, plantas, e animais, as quais frequentemente ocorrem como patógenos em vertebrados. A bactéria desta família divide uma fisiologia similar e demonstra uma conservação dentro de elementos funcionais e genes dos respectivos genomas. Bem como sendo uma oxidase negativa, todos os membros desta família são fermentadores de glicose e muitos são redutores de nitrato.
[0045] A bactéria Enterobacteriaceae da presente invenção pode ser qualquer bactéria a partir daquela família e inclui especificamente, mas não limitado as, bactérias do gênero a seguir: Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Erwinia, Morganella, Providencia, or Yersinia. In more specific embodiments, the bacterium is of the Escherichia coli, Escherichia blattae, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vuneris, Salmonella enterica, Salmonella bongori, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Enterobacter aerogenes, Enterobacter gergoviae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Erwinia amylovora, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus hauseri, Providencia alcalifaciens, or Morganella morganii species. Preferably the Gram-negative bacterial strain is selected from the group consisting of the genera Yersinia, Escherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Chlamydia, Erwinia, Pantoea, Vibrio, Burkholderia, Ralstonia, Xanthomonas, Chromobacterium, Sodalis, Citrobacter, Edwardsiella, Rhizobiae, Aeromonas, Photorhabdus, Bordetella e Desulfovibrio, mais preferivelmente, a partir do grupo consistindo do gênero Yersinia, Escherichia, Salmonella, e Pseudomonas, ainda mais preferivelmente, a partir do grupo consistindo do gênero Yersinia e Salmonella.
[0046] O termo “Yersinia” como utilizado aqui inclui todas as espécies de Yersinia, incluindo Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis e Yersinia pestis. A preferida é Yersinia enterocolitica.
[0047] O termo “Salmonella” como utilizado aqui inclui todas as espécies de Salmonella, incluindo Salmonella enterica e S. bongori. A preferida é Salmonella enterica.
[0048] O termo “promotor” como utilizado aqui refere-se a uma sequência de ácido nucléico que regula a expressão de uma unidade de transcrição. Uma “região promotora” é uma região regulatória capaz de se ligar a RNA polimerase em uma célula e iniciar a transcrição de uma sequência codificante (direção 3’) a jusante. Dentro da região promotora será encontrado um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definido pelo mapeamento com SI nuclease), bem como os domínios de ligação da proteína (sequências consenso) responsável pela ligação da RNA polimerase, tal como a região putativa-35 e a caixa de Pribnow. O termo “operativamente ligado” quando descrevendo a relação entre duas regiões do DNA significa simplesmente que eles são funcionalmente relacionados um ao outro e que eles estão localizados sobre o mesmo fragmento de ácido nucléico. Um promotor é operativamente ligado a um gene estrutural se controlar a transcrição do gene e estiver localizado sobre o mesmo fragmento de ácido nucléico que o gene. Usualmente, o promotor é funcional na referida cepa bacteriana gram-negativa, ou seja, o promotor é capaz de expressão a proteína de fusão da presente invenção, isto é, o promotor é capaz de expressar a proteína de fusão da presente invenção sem engenharia genética adicional ou expressar proteínas adicionais. Além disso, um promotor funcional não deve ser naturalmente contra-regulado à T3SS bacteriana.
[0049] O termo “liberação”, como utilizado aqui se refere ao transporte de uma proteína de uma cepa bacteriana gram- negativa recombinante para uma célula eucariótica, incluindo as etapas de expressar a proteína heteróloga na cepa bacteriana gram-negativa recombinante, secretar a proteína expressa a partir da referida cepa bacteriana gram-negativa e transportar a proteína secretada através da referida cepa bacteriana gram-negativa para dentro do citossol da célula eucariótica. Consequentemente, os termos “sinal de liberação” ou “sinal de secreção” que são utilizados intercaladamente na presente solução referem-se a uma sequência de polipeptídeo que pode ser reconhecida pela secreção e sistema de transporte da cepa bacteriana gram-negativa e direciona a liberação de uma proteína a partir da cepa bacteriana gram- negativa para as células eucarióticas.
[0050] Como utilizado aqui, a “secreção” de uma proteína refere-se ao transporte de uma proteína heteróloga externa através da membrana celular de uma cepa bacteriana gram- negativa recombinante. O “transporte” de uma proteína refere- se ao transporte de uma proteína heteróloga a partir de uma cepa bacterina gram-negativa recombinante através da membrana plasmática de uma célula eucariótica para dentro do citossol da referida célula eucariótica.
[0051] O termo “célula eucariótica” como utilizado aqui inclui, por exemplo, as células eucarióticas a seguir: Hi-5, HeLa, Hek, HUVECs, 3T3, CHO, Jurkat, Sf-9, HepG2, Vera, MDCK, Mefs, THP-1, J774, RAW, Caco2, NCI60, DU145, Lncap, MCF-7, MDA-MB-438, PC3, T47D, A549, U87, SHSY5Y, Ea.Hy926, Saos-2, 4T1, D2A1, B16F10, e hepatócitos humanos primários. “As células eucarióticas” como utilizado aqui são também referidas como “células alvo” ou “células eucarióticas alvo”.
[0052] O termo “proteína efetora T3SS” como aqui utilizado refere-se às proteínas que são naturalmente injetadas pelo sistema T3S dentro do citossol das células eucarióticas e às proteínas que são naturalmente secretadas pelos sistemas T3S que podem, por exemplo, formar o poro de transporte dentro da membrana eucariótica (incluindo os transportadores de formação do poro (como Yersinia YopB e YopD) e trip-proteínas (tal como Yersinia LcrV). Preferivelmente, as proteínas que são naturalmente injetadas pelos sistemas T3S para dentro do citossol de células eucarióticas, são utilizadas. Estes fatores de virulência irão paralisar ou reprogramar a célula eucariótica para benefício do patógeno. O sistema efetor T3S manifesta um grande repertório de atividades bioquímicas e modula a função de moléculas regulatórias hospedeiras cruciais [5,30] e incluem:
[0053] AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrDl, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpml, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, GALA family of proteins, HopAB2, HopAOl, Hopll, HopMl, HopNl, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopUl , HsvB, IcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgBl, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspCl, OspE2, OspF, OspG, Ospl, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXol, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, SrfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, Ssel/SrfH, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SspHl , SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopD YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.
[0054] Os genes T3SS efetores de Yersinia têm sido clonados a partir de, por exemplo, Y. enterocolitica que são YopE, YopH, YopM, YopO, YopP/YopJ, e YopT [31]. Os respectivos genes efetores podem ser clonados a partir de: Shigella flexneri (e.g. OspF, IpgD, IpgBl), Salmonella enterica (por exemplo, SopE, SopB, SptP), P. aeruginosa (por exemplo, ExoS, ExoT, ExoU, ExoY) ou E. coli (por exemplo, Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ). As sequências de ácido nucléico destes genes estão disponíveis, para os técnicos no assunto, por exemplo, no Banco de Dados Genebank (
[0055] (yopH, yopO, yopE, yopP, yopM, yopT de NC 002120 GL 10955536; proteína efetora de S. flexneri AF386526.1 GL 18462515; proteína efetora de S. enterica NC O16810.1 GL378697983 ou FQ312003.1 GL301156631; efetoras de P. aeruginosa AE004091.2 GI:110227054 ou CP000438.1 GI: 115583796 e proteínas efetoras de E. coli NC_011601.1 GL215485161).
[0056] Para o propósito da presente invenção, os genes são denotados por letras minúsculas e itálicos para serem distintos das proteínas. No caso dos genes (descritos por letras minúsculas e itálicas) o nome das espécies bacterianas é como a seguir (E. coli), eles referem-se a uma mutação do gene correspondente na espécie bacteriana correspondente. Por exemplo, YopE refere-se a proteína efetora codificada pelo gene yopE de Y. enterocolitica, yopE representa um Y. enterecolitica tendo uma mutação no gene yopE.
[0057] Como utilizado aqui, os termos “polipeptídeo”, “peptídeo”, “proteína”, “polipeptídico” e “peptídico” são utilizados intercaladamente para designar uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros pelas ligações de peptídeos entre os grupos alfa-amino e carboxi dos resíduos adjacentes. As proteínas preferidas são as que têm uma sequência de aminoácido compreendendo pelo menos 10 aminoácidos, mais preferivelmente, pelo menos 20 aminoácidos.
[0058] De acordo com a presente invenção, “uma proteína heteróloga” inclui proteínas de ocorrência natural ou parte das mesmas e também inclui proteínas artificialmente construídas ou parte das mesmas. Como utilizado aqui, o termo “proteína heteróloga” refere-se a uma proteína ou parte da mesma diferente da proteína efetora T3SS ou do fragmento N- terminal da mesma, ao qual ela pode ser fundida. Em particular, a proteína heteróloga como utilizado aqui refere- se a uma proteína ou parte da mesma, que não pertence ao proteoma, ou seja, o complemento da proteína natural total da cepa bacterina gram-negativa recombinante específica, provido e utilizado pela invenção, por exemplo, que não pertence ao proteoma, ou seja, o complemento total da proteína natural de uma cepa bacteriana específica do gênero: Yersinia, Escherichia, Salmonella ou Pseudomonas. Usualmente, as proteínas heterólogas são de origem animal, incluindo de origem humana. Preferivelmente, a proteína heteróloga é uma proteína humana. Mais preferivelmente, a proteína heteróloga é selecionada a partir do grupo consistindo de proteínas envolvidas na apoptose ou na regulação da apoptose, reguladoras do ciclo celular, proteínas de repetição anquirina, proteínas de sinalização celular, proteínas repórter, fatores de transcrição, proteases, GTPases pequenas, proteínas relacionadas ao GPCR, constructos de fusão de nanocorpos, e nanocorpos, efetores T3SS bacterianas, efetores T4Ss bacterianas, e proteínas virais. Particularmente preferidas, são as proteínas heterólogas selecionadas a partir do grupo consistindo das proteínas envolvidas na apoptose ou na regulação da apoptose, reguladoras do ciclo celular, proteínas de repetição da anquirina, proteínas repórter, GTPase pequenas, proteínas relacionadas ao GPCR, constructos de fusão de nanocorpos, efetoras T3SS bacterianas, efetoras T4SS bacterianas e proteínas virais. Ainda mais particularmente preferidas são as proteínas heterólogas selecionadas a partir do grupo consistindo de proteínas envolvidas na apoptose ou na regulação da apoptose, reguladoras do ciclo celular, e proteínas de repetição da anquirina. Mais preferidas ainda, são as proteínas envolvidas na apoptose ou regulação da apoptose, do tipo animal, preferivelmente, proteínas heterólogas humanas envolvidas na apoptose ou na regulação da apoptose.
[0059] Em algumas concretizações, o vetor da cepa bacteriana gram-negativa da presente invenção compreende duas sequências de DNA codificantes de proteínas idênticas ou de duas proteínas heterólogas diferentes fundidas independentemente uma da outra na estrutura da extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA. Em algumas concretizações, o vetor da cepa bacteriana gram-negativa da presente invenção compreende três da segunda sequência de DNA codificante de proteínas idênticas ou de três proteínas heterólogas diferentes independentemente fundidas uma nas outras na estrutura da extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA.
[0060] A proteína heteróloga expressa pela cepa bacteriana gram-negativa recombinante tem usualmente um peso molecular entre 1 e 150kD, preferivelmente, entre 1 e 120 kD, mais preferivelmente, entre 1 e 100kDa, mais preferivelmente, entre 15 e 100 kDa.
[0061] De acordo com a presente invenção as “proteínas envolvidas na apoptose ou na regulação da apoptose” incluem, mas não estão limitadas a, Bad, Bcl2, Bak, Bmt, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Apafl, Caspase 9, Caspase 3, Caspase 6, Caspase 7, Caspase 10, DFFA, DFFB, ROCKl, APP, CAD, ICAD, CAD, EndoG, AIF, HtrA2, Smac/Diablo, Arts, ATM, ATR, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-l(S), IAP family, LC8, PP2B, 14-3-3 proteins, PKA, PKC, PI3K, Erkl/2, p90RSK, TRAF2, TRADD, FADD, Daxx, Caspase8, Caspase2, RIP, RAIDD, MKK7, JNK, FLIPs, FKHR, GSK3, CDKs e seus inibidores do tipo da família INK4- (pl6(Ink4a), pl5(Ink4b), pl8(Ink4c), pl9(Ink4d)), e a família Cipl/Wafl/Kipl-2- (p21(Cipl/Wafl), p27(Kipl), p57(Kip2). Preferivelmente, Bad, Bmt, Bcl2, Bak, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Caspase9, Caspase3, Caspase6, Caspase7, Smac/Diablo, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-l(S), LC8, PP2B, TRADD, Daxx, Caspase8, Caspase2, RIP, RAIDD, FKHR, CDKs e seus inibidores do tipo da família INK4- (pl6(Ink4a), pl5(Ink4b), pl8(Ink4c), pl9(Ink4d)), mais preferivelmente, BIM, Bid, Bid truncado, FADD, Caspase 3 (e subunidades dos mesmos), Bax, Bad, Akt, CDKs e seus inibidores do tipo família INK4- (pl6(Ink4a), pl5(Ink4b), pl8(Ink4c), pl9(Ink4d)) são utilizadas [32-34]. Adicionalmente as proteínas envolvidas na apoptose ou na regulação da apoptose incluem DIVA, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bid and tBid, Egl-1, Bcl-Gs, Cytochrome C, Beclin, CED-13, BNIP1, BNIP3, Bcl-B, Bcl-W, Ced-9, Al, NR13, Bfl-1, Caspase 1, Caspase 2, Caspase 4, Caspase 5, Caspase 8. As proteínas envolvidas na apoptose ou na regulação da apoptose são selecionadas a partir do grupo consistindo de proteínas pro- apoptóticas, proteínas anti-apoptóticas, inibidores da rota de prevenção da apoptose e inibidores da sinalização ou da rota de pró-sobrevic~encia. As proteínas pró-apoptóticas compreendem as proteínas selecionadas a partir do grupo consistindo de Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid and tBid, Bok, Apafl, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 and CED-13, Citocromo C, FADD, a família Caspase, CDKs e seus inibidores do tipo da família INK4- (p 16(Ink4a), p 15(Ink4b), p 18(Ink4c), pl9(Ink4d)). Igualmente preferidos são Bax, Bak, Diva, Bcl- Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid e tBid, Bok, Apafl, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 e CED-13, Smac/Diablo, FADD, a família Caspase.
[0062] As proteínas anti-apoptóticas compreendem proteínas selecionadas a partir do grupo consistindo de Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, Al, NR13, família IAP e Bfi-1. Os preferidos são Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, Al, NR13 e Bfl-1.
[0063] Os inibidores da rota de prevenção da apoptose compreendem as proteínas selecionadas a partir do grupo consistindo de Bad, Noxa, e Cdc25A. As preferidas são Bad e Noxa.
[0064] Os inibidores da sinalização ou da rota de pró- sobrevivência compreendem as proteínas selecionadas a partir do grupo consistindo de PTEN, ROCK, PP2A, PHLPP, JNK, p38. As preferidas são PTEN, ROCK, PP2A e PHLPP.
[0065] Em algumas concretizações, as proteínas heterólogas envolvidas na apoptose ou na regulação da apoptose são selecionadas a partir do grupo consistindo de proteínas apenas BH3, caspases e proteínas de sinalização intracelular de controle da receptor da morte da apoptose.
[0066] As proteínas apenas BH3 compreendem as proteínas selecionadas a partir do grupo consistindo de Bad, BIM, Bid and tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 e CED-13. As preferidas são Bad, BIM, Bid and tBid.
[0067] As caspases compreendem as proteínas selecionadas a partir do grupo consistindo de Caspase 1, Caspase 2, Caspase 3, Caspase 4, Caspase 5, Caspase 6, Caspase 7, Caspase 8, Caspase 9, Caspase 10. As preferidas são Caspase 3, Caspase 8 e Caspase 9.
[0068] As proteínas de sinalização intracelular do controle do receptor da morte da apoptose compreende as proteínas selecionadas a partir do grupo consistindo de
[0069] FADD, TRADD, ASC, BAP31, GULPl/CED-6, CIDEA, MFG-E8, CIDEC, RIPK1/RIP1, CRADD, RIPK3/RIP3, Crk, SHB, CrkL, DAXX, a família 14-3-3, FLIP, DFF40 e 45, PEA-15, SODD. As preferidas são as FADD e TRADD.
[0070] Em algumas concretizações, duas proteínas heterólogas envolvidas na apoptose ou na regulação da apoptose estão compreendidas pelo vetor da cepa bacteriana gram-negativa da presente invenção, onde uma proteína é uma proteína pró-apoptótica e a outra proteína é um inibidor da rota de prevenção da apoptose ou uma proteína é uma proteína pró-apoptótica e a outra proteína é um inibidor da sinalização ou rota de pró-sobrevivência.
[0071] As proteínas pró-apoptóticas abrangidas pela presente invenção tem usualmente uma estrutura alfa- helicoidal, preferivelmente, uma hélice hidrofóbica contornada por uma hélice anfipática, e usualmente compreende pelo menos um dos domínios BH1, BH2, BH3 ou BH3, preferivelmente compreende pelo menos um domínio BH3. Usualmente, as proteínas pró-apoptóticas abrangidas pela presente invenção não tem atividade enzimática.
[0072] O termo “sítio de clivagem da protease”, como utilizado aqui, refere-se a uma parcela de aminoácidos especifica dentro de uma sequência de aminoácidos, por exemplo, dentro de uma sequência de aminoácidos de uma proteína ou uma proteína de fusão, que é clivada por uma protease específica, que reconhece a parcela de aminoácidos. Para revisão ver [35]. Exemplos de sítios de clivagem de protease são parcelas de aminoácidos, que são clivadas pela protease selecionada a partir do grupo consistindo de enteroquinase (cadeia leve), enteropeptidade, protease de precisão, protease do rinovírus humano (HRV 3C), protease TEV, protease TVMV, protease do fator Xa e trombina.
[0073] As parcelas de aminoácidos a seguir são reconhecidas pelas respectivas proteases: - Asp-Asp-Asp-Asp-Lys: Enteroquinase (cadeia leve chain)/Enteropeptidase; - Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro: protease de precisão /protease do rinovírus humano (HRV 3C); - Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser e parcelas modificadas a base de Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly/Ser (onde X é qualquer aminoácido) reconhecido pela protease TEV (tobacco etch virus) -Glu-Thr- Val-Arg-Phe-Gln-Ser: protease TVMV; - Ile-(Glu or Asp)-Gly-Arg: protease do Fator Xa; - Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser: Trombina.
[0074] Abrangido pelos sítios de clivagem da protease como utilizado aqui é ubiquitina. Assim, em algumas concretizações preferidas, a ubiquitina é utilizada como sítio de clivagem da protease, ou seja, a terceira sequencia de DN codifica a ubiquitina como sítio de clivagem da protease, o qual pode ser clivado por uma protease de processamento de ubiquitina específica no sítio N-terminal, por exemplo, pode ser clivada por uma protease de processamento de ubiquitina específica, chamada enzima de deubiquitinação, no sítio N-terminal endógeno na célula, onde a proteína de fusão tenha sido liberada. A ubiquitina é processada em seu C-terminal. Através de um grupo de proteases C-terminal ubiquitina especifica endógena (enzimas de deubiquintinação, DUBs). A clivagem da ubiquitina através de DUBs é suposta por acontecer próximo ao C-terminal da ubiquitina (após G76).
[0075] Um “indivíduo”, “sujeito” ou “paciente! É um vertebrado. Em determinadas concretizações, o vertebrado é um mamífero. O mamífero inclui, mas não está limitado a, primatas (incluindo humanos e primatas não-humanos) e roedores (por exemplo, camundongo e ratos). Em certas concretizações, um mamífero é um humano.
[0076] O termo “mutação” é utilizado aqui como um termo geral e inclui mudanças de ambos, um par de base única, quanto de múltiplos pares de base. Tais mutações podem incluir substituições, mutações de deslocamento da estrutura (“frameshift”), deleções, inserções e truncagem.
[0077] O termo “molécula marcada ou um sítio aceptor para uma molécula marcada” como utilizado aqui refere-se a um composto químico pequeno ligado a uma sequência de aminoácido específica resultando na fluorescência da ligação do composto químico, preferivelmente, coumarina-ligase/sítio aceptor da coumarina (e derivados dos mesmos), ligase resorufina/sítio aceptor da resorufina (e derivados dos mesmos) e a porção tetra-cisteína (como Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys e derivados dos mesmos) em uso com o corante FIAsH/ReAsH (Life Technologies) ou uma proteína fluorescente como a Proteína Fluorescente Verde Melhorada (EGFP).
[0078] O termo “sinal de localização nuclear” como utilizado aqui se refere a uma sequência de aminoácido que marca uma proteína para importar dentro do núcleo de uma célula eucariótica e inclui, preferivelmente, um sinal de localização nuclear viral tal como o T-antígeno grande SV40 derivado de NLS (PPKKKRKV).
[0079] O termo “sítio de clonagem múltiplo” como utilizado aqui se refere a uma sequência de DNA curta, contendo vários sítios de restrição para clivagem através das endonucleases de restrição, tais como, Acll, Hindlll, Sspl, MluCI, Tsp509I, Pcil, Agel, BspMI, BfuAI, SexAI, Mlul, BceAI, HpyCH4IV, HpyCH4III, Bael, BsaXI, Aflffl, Spel, Bsrl, Bmrl, Bglll, Afel, Alul, Stul, Seal, Clal, BspDI, PI-SceI, Nsil, Asel, Swal, CspCI, Mfel, BssSI, BmgBI, Pmll, Dralll, Alel, EcoP15I,PvuII, AlwNI, BtsIMutI, TspRI, Ndel, Nlalll, CviAII, Fatl, MslI, FspEI, Xcml, BstXI, PflMI, Bed, Ncol, BseYI, Faul,Smal, Xmal, TspMI, Nt.CviPII, LpnPI, Acil, SacII, BsrBI, Mspl, Hpall, ScrFI, BssKI, StyD4I, BsaJI, BslI, Btgl, Neil,Avrll, Mnll, BbvCI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Sbfl, BpulOI, Bsu36I, EcoNI, HpyAV, BstNI, PspGI, Styl, Bcgl, Pvul, BstUI, Eagl, RsrII, BsiEI, BsiWI, BsmBI, Hpy99I, MspAll, MspJI, SgrAI, Bfal, BspCNl, Xhol, Earl, Acul, Pstl, Bpml, Ddel, Sfcl, Aflll, BpuEI, Smll, Aval, BsoBI, MboII, Bbsl, Xmnl, Bsml, Nb.BsmI, EcoRI, Hgal, Aatll, Zral, Tthl 1 II Pf FI, PshAI, Ahdl, Drdl, Eco53kI, Sad, BseRI, Plel, Nt.BstNBI, Mlyl, Hinfl, EcoRV, Mbol, Sau3AI, Dpnll BfuCI, Dpnl, BsaBI, Tfil, BsrDI, Nb.BsrDl, Bbvl, Btsl, Nb.BtsI, BstAPI, SfaNI, Sphl, NmeAIII, Nael, NgoMIV, Bgll, AsiSI, BtgZI, HinPlI, Hhal, BssHII, Notl, Fnu4HI, Cac8I, Mwol, Nhel, Bmtl, Sapl, BspQI, Nt.BspQI, Blpl, Tsel, ApeKI, Bsp 12861, Alwl, Nt.AlwI, BamHI, Fokl, BtsCI, Haelll, Phol, Fsel, Sffl, Narl, Kasl, Sfol, PluTI, Ascl, Ecil, BsmFI, Apal, PspOMI, Sau96I, NlalV, Kpnl, Acc65I, Bsal, Hphl, BstEII, Avail, Banl, BaeGI, BsaHI, Banll, Rsal, CviQI, BstZ17I, BciVI, Sail, Nt.BsmAI, BsmAI, BcoDI, ApaLI, Bsgl, Accl, Hpyl66II, Tsp45I, Hpal, Pmel, Hindi, BsiHKAI, Apol, Nspl, BsrFI, BstYI, Haell, CviKI-1, EcoO109I, PpuMI, I-Ceul, SnaBI, I-Scel, BspHI, BspEI, Mmel, Taqal, Nrul, Hpyl 881, Hpyl88III, Xbal, Bell, HpyCH4V, Fspl, PI- PspI, Mscl, BsrGI, Msel, Pad, Psil, BstBI, Dral, PspXI, BsaWI, BsaAI, Eael, preferably Xhol, Xbal, Hindlll, Ncol, Notl, EcoRI, EcoRV, BamHI, Nhel, Sad, Sail, BstBI. O termo “sítio de clonagem múltiplo”, como utilizado aqui, refere-se adicionalmente a uma sequência curta de DNA utilizada para eventos de recombinação como, por exemplo, na estratégia de clonagem Gateway ou para métodos tais como arranjo Gibbson ou clonagem de Topo.
[0080] O termo “cepa de Yersínia alelo-selvagem” como utilizado aqui para uma variante de ocorrência natural (como Y. enterocolitica E40) ou uma variante de ocorrência natural contendo modificações genéticas permitindo o uso de vetores, tais como mutações por deleção, nas endonucleases de restrição ou genes de resistência aos antibióticos (como Y. enterocolitica MRS40, o derivado sensíveis à ampicilina de Y. enterocolitica E40). Estas cepas contém DNA cromossomal, bem como um plasmídeo de virulência não modificado (chamado pYV).
[0081] O termo “compreende” é geralmente utilizado no sentido de incluir, ou seja, permitir a presença de um ou mais características ou componentes.
[0082] Em uma concretização, a presente invenção provê uma cepa bacteriana gram-negativa recombinante, onde a cepa bacteriana gram-negativa é selecionada a partir do grupo consistindo do gênero de: Yersinia, Escherichia, Salmonella e Pseudomonas. Em uma concretização, a presente invenção provê uma cepa bacteriana gram-negativa recombinante, onde a cepa bacteriana gram-negativa é selecionada a partir do grupo consistindo do gênero Yersinia, e Salmonella. Preferivelmente, a cepa bacteriana gram-negativa é uma cepa de Yersinia, mais preferivelmente uma cepa de Y. enterocolitica. Mais preferivelmente, é a cepa de Yersinia enterocolitica E40 [13] ou derivados da mesma, que são sensíveis à ampicilina, como Y. enterocolitica MRS40, como descrito em [36]. Adicionalmente preferida, é a cepa bacteriana gram-negativa de Salmonella, mais preferivelmente, uma cepa de Salmonella enterica. Ainda mais preferida é a cepa de Salmonella enterica Serovar Tiphimurium SL1344, como descrita pela Coleção de Culturas da Saúde Pública da Inglaterra (NCTC 13347).
[0083] Em uma concretização da presente solução, o sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS bacteriana compreende uma proteína efetora T3SS bacteriana ou um fragmento N-terminal da mesma, onde a proteína efetora T3SS ou um fragmento N-terminal da mesma podem compreender um sítio de ligação da chaperona. Uma proteína efetora T3SS ou um fragmento N-terminal da mesma que compreende um sítio de ligação da chaperona é particularmente útil como sinal de liberação na presente invenção. As proteínas efetoras T3SS ou os fragmentos N-terminal das mesmas são selecionados a partir do grupo consistindo de: SopE, SopE2, SptP, YopE, ExoS, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgBl, IpgD, SipC, SifA, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, Ospl, IpaH, SspHl,VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, XopD, AvrRpt2, HopAOl, HopPtoD2, HopUl, GALA family of proteins, AvrBs2, AvrDl, AvrBS3, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspCl, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto,AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpml, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD, E AvrXv3. As proteínas efetoras T3SS mais preferidas ou os fragmentos N-terminal das mesmas são selecionados a partir do grupo consistindo de: SopE, SptP, YopE, ExoS, SopB, IpgBl, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, onde as proteínas efetoras T3SS mais preferidas ou fragmentos N-terminal das mesmas são selecionados a partir do grupo consistindo de IpgBl, SopE, SopB, SptP, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, in particular YopE ou um fragmento N-terminal do mesmo.
[0084] Igualmente preferidos são as proteínas efetoras T3SS ou os fragmentos N-terminal das mesmas são selecionados a partir do grupo consistindo de SopE, SopE2, SptP, SteA, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgBl, IpgD, SipC, SifA, SifB, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, Ospl, IpaH, VopF, ExoS, ExoT,HopAB2, AvrRpt2, HopAOl, HopUl, família GALA family das proteínas, AvrBs2, AvrDl, YopO, YopP, YopE, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspCl, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpml, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD, e AvrXv3. Igualmente, mais preferidas são as proteínas efetoras T3SS ou os fragmentos N-terminal das mesmas que são selecionados a partir do grupo consistindo de SopE, SptP, SteA, SifB, SopB, IpgBl, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopT, sendo as proteínas efetoras T3SS mais preferidas ou os fragmentos N-terminal das mesmas selecionados a partir do grupo consistindo de IpgBl, SopE, SopB, SptP, SteA, SifB, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE, and YopT, em particular SopE, SteA, ou YopE ou um fragmento N-terminal das mesmas, mais particularmente SteA ou YopE ou um fragmento N-terminal das mesmas, ainda mais particular YopE ou um fragmento N-terminal das mesmas.
[0085] Em algumas concretizações, o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana codificada pela primeira sequência de DNA compreende a proteína efetora T3SS bacteriana ou um fragmento do mesmo N-terminal, sendo que o fragmento N-terminal do mesmo inclui pelo menos os primeiros 10, preferivelmente, pelo menos os primeiros 20, mais preferivelmente, pelo menos os primeiros 100 aminoácidos da proteína efetora T3SS bacteriana.
[0086] Em algumas concretizações, o sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana codificada pela primeira sequência de DNA compreende a proteína efetora T3SS bacteriana ou um fragmento N-terminal da mesma, sendo que a proteína efetora T3SS bacteriana ou o fragmento N-terminal da mesma compreende um sítio de ligação da chaperona.
[0087] As proteínas efetoras T3SS preferidas ou um fragmento N-terminal da mesma, que compreende um sítio de ligação chaperona compreende as combinações a seguir do sítio de ligação da chaperona e a proteína efetora T3SS ou o fragmento N-terminal da mesma: SycE-YopE, InvB-SopE, SicP- SptP, SycT-YopT, SycO-YopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS- ExoS, CesF-EspF, SycD-YopB, SycD-YopD. More preferred are SycE-YopE, InvB-SopE, SycT-YopT, SycO-YopO, SycN/Y scB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF. Mais preferida é a YopE ou um fragmento N-terminal da mesma, compreendendo o sítio de ligação da chaperona SycE, tal como um fragmento N-terminal de uma proteína efetora YopE contendo os 138 aminoácidos do N-terminal da proteína efetora YopE designada aqui como YopE1- 138 e como mostrado na SEQ ID NO:2 ou uma SopE ou um fragmento N-terminal da mesma, compreendendo o sítio de ligação da chaperona InvB, tal como um fragmento N-terminal de uma proteína efetora SopE contendo os 81 ou 105 aminoácidos do N- terminal da proteína efetora SopE designada aqui como SopE1-81 ou SopE1-105 respectivamente, e como mostrado nas SEQ ID NOs: 142 ou 143.
[0088] Em uma concretização preferida da presente invenção, a cepa bacteriana gram-negativa recombinante é uma cepa de Yersinia e o sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS codificado pela primeira sequência de DNA compreende uma proteína efetora YopE ou uma parte do N-terminal, preferivelmente, da proteína efetora YopE de Y. enterocolitica ou uma parte do N-terminal da mesma. Preferivelmente, o sítio de ligação SycE é compreendido dentro da parte N-terminal de uma proteína efetora YopE. Nesta conexão, um fragmento N-terminal de uma proteína efetora YopE pode compreender 12, 16, 18, 52, 53, 80 ou 138 aminoácidos do N-terminal [10, 37, 38]. Mais preferivelmente, é um fragmento N-terminal de uma proteína efetora YopE contendo os 138 aminoácidos N-terminal da proteína efetora YopE, por exemplo, como descrito em “Forsberg e Wolf-Watz” [39] designada aqui como YopE1-138 e como mostrada na SEQ ID NO:2.
[0089] Em uma concretização da presente invenção, a cepa bacteriana gram-negativa recombinante é uma cepa de Salmonella, e o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana, codificado pela primeira sequência de DNA compreende uma proteína efetora SopE ou SteA ou uma parte do N-terminal da mesma, preferivelmente, da proteína efetora SopE ou SteA da Salmonella enterica ou uma parte do N- terminal da mesma. Preferivelmente, o sítio de ligação da chaperona é compreendido dentro da parte N-terminal de uma proteína efetora SopE. Nesta conexão, um fragmento N-terminal de uma proteína efetora SopE pode compreender 81 ou 105 aminoácidos do N-terminal. Mais preferivelmente, é toda a extensão do fragmento N-terminal e SteA de uma proteína efetora SopE contendo os 105 aminoácidos N-terminal da proteína efetora, por exemplo, como descrito nas SEQ ID NOs: 142 ou 143.
[0090] Um técnico no assunto está familiarizado com os métodos para identificação de sequências de polipeptídeos de uma proteína efetora que são capazes de liberar uma proteína. Por exemplo, tal método é descrito por Sory et al. [13]. Resumidamente, as sequências de polipeptídeo a partir, por exemplo, de várias porções das proteínas Yop podem ser fundidas na estrutura para uma enzima repórter, tal como o domínio adenilato ciclase ativado por calmodulina (ou Cya) da ciclolisina de Bordetella petussis. A liberação de uma proteína híbrida Yop-Cya dentro do citossol das células eucarióticas é indicada pela aparência da atividade ciclase nas células eucarióticas infectadas que conduzem ao acúmulo de cAMP. Através do emprego de tal abordagem, um técnico no assunto pode determinar se desejado, a sequência mínima requerida, ou seja, uma sequência de aminoácido contínua do comprimento curto, ou seja, é capaz de liberar a proteína, ver, por exemplo [13]. Consequentemente, os sinais liberados preferidos da presente invenção consiste de pelo menos uma sequência mínima de aminoácidos de uma proteína efetora T3SS que é capaz de liberar a proteína.
[0091] Em uma concretização, a presente invenção provê cepas bacterianas gram-negativas recombinantes mutantes, em particular, cepas bacterianas gram-negativas recombinantes que são deficientes na produção de pelo menos uma proteína efetora funcional T3SS.
[0092] De acordo com a presente invenção, tal cepa bacteriana gram-negativa mutante, por exemplo, tal como uma cepa de Yersinia mutante pode ser gerada através a introdução de pelo menos uma mutação dentro de pelo menos um gene codificante da efetora. Preferivelmente, tal gene codificante da efetora inclui YopE, YopH, YopO/Y pkA, YopM, YopP/YopJ e YopT enquanto relacionado com a cepa Yersinia. Preferivelmente, tais genes de codificação da efetora incluem: AvrA, CigR, GogB, GtgA, GtgE, PipB, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopB/SigD, SopA, SpiC/SsaB, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, Ssel/SrfH, SopD, SopE, SopE2, SspHl, SspH2, PipB2, SifA, SopD2, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SteC, SteA, SteB, SteD, SteE, SpvB, SpvC, SpvD, SrfJ, SptP, quando relacionados com a cepa de Salmonella. Mais preferivelmente, todos os genes codificantes da efetora são deletados. Um técnico no assunto pode empregar qualquer número de técnicas padrão para gerar mutações nestes genes efetores T3SS. Sambrook et al., descreve em geral tais técnicas. Ver, Sambrook et al.. [40].
[0093] De acordo com a presente invenção, a mutação pode ser gerada na região promotora de um gene codificante da efetora de modo que a expressão e tal gene efetor sejam abolidos. A mutação pode também ser gerada na região de codificação de um gene de codificação da efetora, de modo que a atividade catalítica da proteína efetora codificada seja abolida. A “atividade catalítica” de uma proteína efetora refere-se, normalmente, à função anti-célula alvo de uma proteína efetora, ou seja, toxicidade. Tal atividade é governada pelas parcelas (“motifs”) catalíticas no domínio catalítico de uma proteína efetora. A abordagem para identificação do domínio catalítico e/ou a parcela catalítica de uma proteína efetora são bem conhecidas pelos técnicos no assunto. Ver, por exemplo, [41, 42].
[0094] Consequentemente, uma mutação preferida da presente invenção é uma deleção do domínio catalítico inteiro. Uma outra mutação preferida é uma mutação de deslocamento da estrutura em um gene de codificação da efetora, de modo que o domínio catalítico não esteja presente no produto da proteína expresso a partir do referido gene de “deslocamento da estrutura”. Uma mutação mais preferida é uma mutação com a deleção da região inteira de codificação da proteína efetora. Outras mutações são também contempladas pela presente invenção, tal como deleções menores ou substituições de pares de base, que são geradas nas parcelas catalíticas de uma proteína efetora conduzindo à destruição da atividade catalítica de uma determinada proteína efetora.
[0095] As mutações que são geradas nos genes das proteínas efetoras funcionais T3SS podem ser introduzidas dentro da cepa particular através de um grande número de métodos. Um dos referidos métodos envolve a clonagem de um gene alterado em um vetor “suicida” que é capaz de introduzir a sequência mutada dentro da cepa ia troca alélica. Um exemplo de tal vetor “suicida” é descrito por [43].
[0096] Desta maneira, as mutações geradas em múltiplos genes podem ser introduzidas sucessivamente dentro de uma cepa bacteriana gram-negativa resultando em um aumento de polimutações, por exemplo, uma mutação sêxtupla da cepa recombinante mutante. A ordem em que esta sequência mutada é introduzida não é importante. Sob certas circunstâncias, pode ser desejado mudar apenas alguns, mas não todos os genes efetores. Consequentemente, a presente invenção contempla adicionalmente a Yersinia polimutante além daquela mutante sêxtupla de Yersinia, por exemplo, cepas de dupla mutação, cepas de tripla mutação, de mutação quádrupla, e cepas com mutações quíntuplas. Para o propósito de liberação de proteínas, a secreção e o sistema de transporte da cepa mutante exemplificada precisa ser intacto.
[0097] Uma cepa bacterina gram-negativa recombinante preferida, da presente invenção é uma cepa de Yersinia com mutação sêxtupla, na qual todos os genes de codificação da efetora são mutados, de modo que a Yersinia resultante não mais produza qualquer proteína efetora funcional. Tal cepa de Yersinia com mutação sêxtupla é designada como ΔyopH,O,P,E,M,T para Y. enterocolitica. Como um exemplo, tal como mutação sêxtupla pode ser produzido pela cepa Y. enterocolitica MRS40 resultando em um aumento para a Y. enterocolitica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T, que é preferida.
[0098] Um aspecto adicional da presente invenção é dirigido a um vetor para uso em combinação com a cepa bacteriana gram- negativa recombinante para liberar uma proteína desejada dentro de células eucarióticas, sendo que o vetor compreende na direção 5’ para 3’: um promotor; uma primeira sequência de DNA codificante de um sinal de liberação de uma proteína efetora T3SS bacteriana, operavelmente ligada ao citado promotor; uma segunda sequência de DNA codificante de uma proteína heteróloga fundida à estrutura da extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA; e, alternativamente, uma terceira sequência de DNA codificante do sítio de clivagem da protease, sendo que a terceira sequência de DNA está localizada entre a extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA e a extremidade 5’ da referida segunda sequência de DNA.
[0099] O promotor, a proteína heteróloga e o sítio de clivagem da protease como descrito supra, pode ser utilizado para o vetor da cepa bacterina gram-negativa.
[0100] Os vetores podem ser utilizados de acordo com a invenção e dependem da cepa bacteriana gram-negativa utilizada como é conhecido pelos técnicos no assunto. Os vetores que podem ser utilizados, de acordo com a invenção, incluem vetores de expressão, vetores para inserção cromossomal ou vetores de inserção de plasmídeo de virulência, e fragmentos de DNA para inserção cromossomal ou inserção de plasmídeo de virulência. Vetores de expressão que são úteis, por exemplo, nas cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella ou Pseudomonas são, por exemplo, os plasmídeos pUC, pBad, pACYC, pUCP20 e pET. Os vetores para inserção cromossomal ou inserção de plasmídeo de virulência que são utilizados nas cepas, por exemplo, de Yersinia, Escherichia, Salmonella ou Pseudomonas são, por exemplo, os plasmídeos pKNG101. Os fragmentos de DNA para inserção cromossomal ou inserção de plasmídeo de virulência referem-se aos métodos utilizados, por exemplo, em cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella ou Pseudomonas como, por exemplo, engenharia genética lambada-red. Os vetores para inserção cromossomal ou inserção de plasmídeo de virulência ou fragmentos de DNA para inserção cromossomal ou inserção de plasmídeo de virulência podem inserir a primeira, a segunda e/ou a terceira sequência de DNA da presente invenção, de modo que a primeira, segunda e/ou a terceira sequência de DNA seja operavelmente ligada a um promotor endógeno da cepa bacteriana gram-negativa recombinante. Assim, se um vetor para inserção cromossomal ou inserção de plasmídeo de virulência ou um fragmento de DNA para inserção cromossomal ou inserção de plasmídeo de virulência for utilizado, um promotor endógeno pode ser codificado no DNA bacteriano endógeno (DNA cromossomal ou DNA plasmidial) e apenas a primeira sequência de DNA e a segunda sequência de DNA serão providas pelo vetor construído para para inserção cromossomal ou inserção de plasmídeo de virulência ou o fragmento de DNA para inserção cromossomal ou inserção de plasmídeo de virulência.
[0101] Assim, o promotor não necessariamente precisa estar compreendido pelo vetor utilizado para transformação da cepa bacteriana gram-negativa recombinante, ou seja, a cepa bacterina gram-negativa recombinante da presente invenção pode ser transformada com um vetor que não compreende um promotor. Preferivelmente, um vetor de expressão é utilizado. O vetor da presente invenção é, normalmente, utilizado para liberação das proteínas heterólogas através da T3SS bacteriana dentro das células eucarióticas in vitro e in vivo.
[0102] Um vetor de expressão preferido para Yersinia é selecionado a partir do grupo consistindo de pBad_Si_1 e pBad_Si_2. O vetor pBad_Si2 foi construído por clonagem do fragmento SycE-YopE1-138 contendo o fragmento dos promotores endógenos para YopE e SycE a partir de pYV40 purificado dentro do sítio KpnI/HindIII do pBad-MycHisa (Invitrogen). As modificações adicionais incluem a remoção do fragmento NcoI/BglII de pBad-MycHisA por digestão, tratamento e religação do fragmento Klenow. Adicionalmente, na extremidade 3’ do YopE1-138, os sítios de clivagem a seguir foram adicionados: Xbal-XhoI-BstBI-(Hindlll). O sítio pBad Sil é igual ao pBad_Si2, mas codifica a EGFP amplificada de Pegfp-1 (Clontech) no sítio NcoI/Bg1II sob o promotor induzível pro Arabinose.
[0103] Um vetor de expressão preferida para Salmonella é selecionado a partir do grupo consistindo de pSi_266, pSi_267, pSi_268 e pSi_269. Os plasmídeos pSi_266, pSi_267, pSi_268 e pSi_269 contendo o promotor endógeno correspondente e o fragmento SteAi_2o (pSi_266), a sequência de extensão total de SteA (pSi_267), o fragmento SopEi_8i (pSi_268) ou o fragmento SopEi_i05 (pSi_269) foram amplificados a partir do DNA genômica de S. entérica SL1344 e clonados dentro do sítio NcoI/KnpI de pBad-MycHisA (Invitrogen).
[0104] O vetor da presente invenção pode incluir outros elementos de sequência tais como, uma sequência terminal 3’ (incluindo um códon de parada e uma sequência de poli-A), ou um gene conferindo uma resistência a um fármaco que permite a seleção de transformantes tendo recebido o vetor exemplificado. Os vetores da presente invenção podem ser transformados por um número de métodos conhecidos dentro das cepas bacterianas gram-negativas recombinantes. Para o propósito da presente invenção, o método de transformação para introdução de um vetor inclui, mas não estão limitados a, eletroporação, fosfato de cálcio, transformação mediada, conjugação, ou combinações das mesmas. Por exemplo, um vetor pode ser transformado em uma primeira cepa bacteriana através de um procedimento de eletroporação padrão. Subsequentemente, tal vetor pode ser transferido a partir de uma primeira cepa bacteriana para a cepa desejada por conjugação, um processo também chamado “mobilização”. A transformante (ou seja, as cepas bacterianas gram-negativas tendo tomado o vetor) pode ser selecionada a partir de, por exemplo, antibióticos. Estas técnicas são bem conhecidas do estado da técnica. Ver, por exemplo, [13].
[0105] De acordo com a presente invenção, o promotor do vetor de expressão da cepa bacteriana gram-negativa recombinante da presente invenção pode ser um promotor nativo de uma proteína efetora T3SS da respectiva cepa ou de uma cepa bacteriana compatível ou um promotor utilizado nos vetores de expressão que são úteis em, por exemplo, cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella ou Pseudomonas, por exemplo, pUC e pBad. Tais promotores são o promotor T7, o promotor Plac ou um promotor Ara-bad.
[0106] Se a cepa bacteriana gram-negativa recombinante seja uma cepa Yersinia, o promotor pode ser de um gene virulon de Yersinia. Um “gene virulon de Yersinia” refere-se às genes sobre o plasmídeo pYV de Yersinia, a expressão dos quais é controlada por ambos, pela temperatura e pelo contato com uma célula alvo. Tais genes incluem genes de codificação para elementos da máquina de secreção (os genes Ysc), genes de codificação para translocação (YopB, YopD, e LcrV), os genes de codificação para os elementos controle (YopN, TyeA e LcrG), os genes codificantes para as chaperonas efetoras T3SS (YopE, YopH, YopO/Y pkA, YopM, YopT and YopP/YopJ) bem como outras proteínas codificadas por pYV como VirF e YadA. Em uma concretização preferida da presente invenção, o promotor é o promotor nativo de um gene codificante da efetora funcional T3SS. Se a cepa bacteriana gram-negativa recombinante é uma cepa de Yersinia, o promotor é selecionado a partir de qualquer um de YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM and YopP/YopJ. Mais preferivelmente, o promotor é de YopE ou ScycE. Se a cepa bacteriana gram-negativa recombinante é uma cepa de Salmonella, o promotor pode ser da ilhota (“island”) de patogenicidade SiI ou SpiII ou a partir de uma proteína efetora codificada em outro lugar. Tais genes incluem genes codificantes para os elementos do maquinário da secreção, genes codificantes para transporte, genes codificantes para os elementos de controle, genes codificantes para as chaperonas efetoras T3SS, e genes codificantes para as efetoras, bem como outras proteínas codificadas por SPI-1 ou SPI-2. Em uma concretização preferida da presente invenção, o promotor é o promotor nativo de um gene codificante efetora funcional T3SS. Se a cepa bacteriana gram-negativa recombinante é uma cepa de Salmonella, o promotor é selecionado a partir de qualquer uma das proteínas efetoras. Mais preferivelmente, o promotor é de SopE, InvB ou SteA.
[0107] Em uma concretização preferida, o vetor de expressão compreende uma sequência de DNA codificante de um sítio de clivagem da protease. A geração de um sítio de clivagem aplicável funcional e geral permite a clivagem do sinal de liberação após o transporte. Como um sinal de liberação pode interferir com a localização correta e/ou funcional da proteína transportada dentro das células alvas, a introdução de um sítio de clivagem de protease entre o sinal de liberação e a proteína de interesse provê para o primeiro período deliberação de quase todas as proteínas nativas dentro das células eucarióticas. Preferivelmente, o sítio de clivagem de protease é uma parcela de aminoácidos que é clivada por um domínio de protease ou o domínio catalítico do mesmo, selecionado a partir do grupo consistindo de enteroquinase (cadeia leve), enteropeptidase, protease de precisão, protease rinovírus humano 3C, protease TEV, protease TVMV, protease do Fator Xa, e trombina, mais preferivelmente, uma parcela de aminoácidos que é clivada pela protease TEV. Igualmente preferível, o sítio de clivagem da protease é uma parcela de aminoácido que é clivada por uma protease ou do domínio catalítico do mesmo, selecionado a partir do grupo consistindo de enteroquinase (cadeia leve), enteropeptidase, protease de precisão, protease rinovírus humana 3C, protease TEV, protease TVMV, protease do Fator Xa, protease do processamento de ubiquitina, enzimas chamadas de deubiquitinação, e trombina. Mais preferivelmente, é uma parcela de aminoácido que é clivada pela protease TEV ou por uma protease de processamento de ubiquitina. Assim, em uma concretização adicional da presente invenção, a proteína heteróloga é clivada a partir do sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS bacteriana por uma protease. Os métodos preferidos de clivagem são os métodos aqui descritos: a) a protease é transportada dentro da célula eucariótica por uma cepa bacteriana gram-negativa recombinante como descrito aqui que expressa uma proteína de fusão que compreende o sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana e a protease como proteína heteróloga; ou b) a protease é expressa constitutivamente ou transitoriamente na célula eucariótica. Usualmente, a cepa bacteriana gram-negativa recombinante utilizada para liberar uma proteína desejada dentro de uma célula eucariótica e a cepa bacteriana gram-negativa recombinante transportando a protease para dentro da célula eucariótica é diferente.
[0108] Em uma concretização da presente invenção, o vetor compreende uma sequência de DNA adicional, codificante de uma molécula marcada ou um sítio aceptor para uma molécula marcada. A sequência de DNA adicional codificante de uma molécula marcada ou de um sítio aceptor para uma molécula marcada é usualmente fundido à extremidade 5’ ou à extremidade 3’ da segunda sequência de DNA. Uma molécula marcada preferida ou um sítio aceptor para uma molécula marcada é selecionado a partir do grupo consistindo da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP), coumarina, sítio aceptor da ligase de coumarina, resorufina, sítio aceptor da ligase resorufina, a parcela tetra-cisteína em uso com o corante FIAsH/ReaSH (Life Technologies). Mais preferido é a resorufina e um sítio do aceptor ligase de resorufina ou EGFP. O uso de uma molécula marcada ou de um sítio aceptor para uma molécula marcada irá conduzir à ligação de uma molécula marcada à proteína heteróloga de interesse, que será então ser liberada como tal dentro da célula eucariótica e capacitando a localização da proteína por, por exemplo, microscopia de célula viva.
[0109] Em uma concretização da presente invenção, o vetor compreende uma sequência de DNA adicional codificante de um tag de peptídeo. A sequência de DNA adicional codificante de um tag de peptídeo é usualmente fundida à extremidade 5’ ou à extremidade 3’ da segunda sequência de DNA. Um tag de peptídeo preferido é selecionado a partir do grupo consistindo de Myc-tag, His-tag, Flag-tag, HA tag, Strep tag ou V5 tag ou uma combinação de dois ou mais tags além desse grupo. Mais preferido é o Myc-tag, Flag-tag, His-tag e Myc- e His-tag combinados. O uso de um tag de peptídeo irá conduzir à capacidade de traços da proteína alvo, por exemplo, pela imunofluorescência ou Western blotting usando os anticorpos anti-tag. Adicionalmente, o uso de um tag de peptídeo permite a purificação por afinidade da proteína desejada tanto após a secreção dentro do sobrenadante da cultura quanto após o transporte dentro das células eucarióticas, em ambos os casos usando um método de purificação satisfazendo o tag correspondente (por exemplo, purificação por afinidade de metal-quelado em uso com uma purificação a base de anticorpo His-tag ou anti-Flag em uso com a Flag-tag).
[0110] Em uma concretização da presente invenção, o vetor compreende uma sequência de DNA adicional codificante de um sinal de localização nuclear (NLS). A sequência de DNA adicional codificante de um sinal de localização nuclear (NLS) é usualmente fundido à extremidade 5’ ou à extremidade 3’ da segunda sequência de DNA sendo que a referida segunda sequência de DNA, onde a referida segunda sequência de DNA codifica um sinal de localização nuclear (NLS). Uma NLS preferida é selecionada a partir do grupo consistindo de NLS T-antígeno grande SV40 e derivados das mesmas [44], bem como outras NLS virais. Mais preferido é a NLS T-antígeno SV40 grande e derivados dos mesmos.
[0111] Em uma concretização da presente invenção, o vetor compreende um sítio de clonagem múltipla. O sítio de clonagem múltiplo é usualmente localizado na extremidade 3’ da primeira sequência DNA e/ou na extremidade 5’ ou extremidade 3’ da segunda sequência DNA. Um ou mais dos múltiplos sítios de clonagem podem ser compreendidos pelo vetor. Um sítio de clonagem múltiplo preferido é selecionado a partir do grupo de enzima de restrição consistindo de XhoI, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRi, EcoRV, BamHI, NheeI, SacI, SalI, BstBi. Mais preferidas são XbaI, XhoI, BstBi e HindIII.
[0112] A proteína expressa a partir das primeira e segunda proteínas fundidas e da terceira sequência de DNA opcional do vetor também é denominada como uma “proteína de fusão” ou uma “proteína híbrida”, ou seja, uma proteína fundida ou híbrido do sinal de liberação e uma proteína heteróloga. A proteína de fusão pode também compreender, por exemplo, um sinal de liberação e duas ou mais proteínas heterólogas diferentes.
[0113] A presente invenção contempla um método para liberação das proteínas heterólogas como descrita daqui em diante dentro das células eucarióticas na cultura celular bem como in vivo.
[0114] Assim, em uma concretização preferida, o método para liberação das proteínas heterólogas compreende:(i) cultivar a cepa bacteriana gram-negativa como descrita aqui; (ii) contatar a célula eucariótica com a cepa bacteriana gram-negativa de (i), sendo que uma proteína de fusão que compreende um sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana e a proteína heteróloga ser expressa através da cepa bacteriana gram-negativa e ser transportada para dentro de uma célula eucariótica; e opcionalmente (iii) clivar a proteína de fusão de modo que a proteína heteróloga seja clivada a partir do sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana.
[0115] Em algumas concretizações, pelo menos duas proteínas de fusão que compreendem cada uma um sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS bacterina e uma proteína heteróloga são expressas pela cepa bacterina gram-negativa e são transportadas dentro das células eucarióticas através dos métodos da presente invenção.
[0116] A cepa bacterina gram-negativa recombinante pode ser cultivada de modo que uma proteína de fusão seja expressa, a qual compreende o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacterina e a proteína heteróloga de acordo com os métodos conhecidos do estado da técnica (por exemplo, FDA, “Bacterial Analytical Manual (BAM), chapter 8: Yersinia enterocolitica”). Preferivelmente, a cepa bacteriana gram- negativa recombinante pode ser cultivada no caldo de infusão Cérebro-coração, por exemplo, a 28°C. Para indução da expressão de T3SS e, por exemplo, os genes dependentes do promotor YopE/SycE, a bactéria pode ser crescida em 37°C.
[0117] Em uma concretização preferida, a célula eucariótica é contatada com duas cepas bacterianas gram-negativas de (i), sendo que a primeira cepa bacteriana gram-negativa expresse uma primeira proteína de fusão que compreende o sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana e uma primeira proteína heteróloga e a segunda cepa bacterina gram- negativa expressa uma segunda proteína de fusão que compreende o sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana e uma segunda proteína heteróloga, de modo que a primeira e a segunda proteína de fusão são transportadas dentro da célula eucariótica. Esta concretização provê para co-infecção de, por exemplo, células eucarióticas com duas cepas bacterianas como um método válido para liberar, por exemplo, duas proteínas híbridas diferentes dentro de células únicas para direcionar sua interação funcional.
[0118] A presente invenção contempla uma ampla variedade de células eucarióticas que podem ser localizadas pela cepa bacteriana gram-negativa recombinante da presente invenção, por exemplo, Hi-5 (BTI-TN-5B1-4; Life Technologies B855-02), células HeLa, por exemplo, HeLa Ccl2 (as ATCC No. CCL-2), células de fibroblastos, por exemplo, células de fibroblastos 3T3 (as ATCC No. CCL-92) ou Mef (as ATCC No. SCRC-1040), Hek (as ATCC No. CRL-1573), HUVECs (as ATCC No. PCS- 100-013), CHO (as ATCC No. CCL-61), Jurkat (as ATCC No. TIB-152), Sf-9 (como ATCC No. CRL-1711), HepG2 (as ATCC No. HB-8065), Vera (como ATCC No. CCL-81), MDCK (as ATCC No. CCL-34), THP-1 (como ATCC No. TIB-202), J774 (as ATCC No. TIB-67), RAW (como ATCC No. TIB-71), Caco2 (as ATCC No. HTB-37), linhas celulares NCI (como ATCC No. HTB-182), DU145 (como ATCC No. HTB-81), Lncap (como ATCC No. CRL-1740), MCF-7 (como ATCC No. HTB-22), linhas celulares MDA-MB (como ATCC No. HTB-128), PC3 (como ATCC No. CRL-1435), T47D (como ATCC No. CRL-2865), A549 (como ATCC No. CCL-185), U87 (como ATCC No. HTB-14), SHSY5Y (como ATCC No. CRL-2266s), Ea.Hy926 (como ATCC No. CRL-2922), Saos-2 (como ATCC No. HTBH-85), 4T1 (como ATCC No. CRL-2539), B16F10 (como ATCC No. CRL-6475), ou hepatócitos humanos primários (como da Life Technologies HMCPIS), preferivelmente HeLa, Hek, HUVECs, 3T3, CHO, Jurkat, Sf-9, HepG2 Vera, THP-1, Caco2, Mef, A549, 4T1, B16F10 e hepatócitos primários humanos e mais preferivelmente, HeLa, Hek, HUVECs, 3T3, CHO, Jurkat, THP-1, A549 e Mef. Por “alvo”, entende-se a adesão extracelular da cepa bacteriana gram-negativa recombinante em uma célula eucariótica.
[0119] De acordo com a presente invenção, a liberação de uma proteína pode ser conseguida pelo contato de uma célula eucariótica com uma cepa bacterina gram-negativa recombinante sob condições apropriadas. Várias referências e técnicas são convencionalmente disponíveis para os técnicos no assunto, com relação às condições para indução da expressão e transporte de genes virulon, incluindo a temperatura desejada, concentração Ca++, adição de indutores como Congo Red, maneiras na quais a cepa bacteriana gram-negativa recombinante e as células alvos são misturadas, e do gênero. Ver, por exemplo, [45]. As condições podem variar dependendo do tipo de célula eucariótica a ser buscada e a cepa bacteriana recombinante a ser utilizada. Tal como, variações podem ser dirigidas pelos técnicos no assunto usando técnicas convencionais. Os técnicos no assunto podem também utilizar um número de ensaios para determinar se a liberação de uma proteína de fusão terá sucesso. Por exemplo, a proteína de fusão pode ser detectada via imunofluorescência usando anticorpos reconhecidos por um tag de fusão (do tipo Myc- tag). A determinação pode também ser utilizada com base na atividade enzimática da proteína sendo liberada, por exemplo, o ensaio descrito por [13].
[0120] Em uma concretização, a presente invenção provê um método de purificação de uma proteína heteróloga compreendendo o cultivo da cepa bacteriana gram-negativa como descrito aqui, de modo que a proteína de fusão que compreende um sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS bacteriana e a proteína heteróloga seja expressa e secretada dentro do sobrenadante da cultura. A proteína de fusão expressa pode ainda compreender um sítio de clivagem da protease entre o sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana e a proteína heteróloga e/ou pode compreender ainda um tag de peptídeo.
[0121] Assim, em uma concretização particular, o método de purificação de uma proteína heteróloga compreende:(i) cultivar a cepa bacteriana gram-negativa como descrito aqui de modo que uma proteína de fusão que compreende um sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS bacteriana, a proteína heteróloga e o sítio de clivagem de proteínas entre o sinal de liberação e a proteína efetora T3SS e a proteína heteróloga é expressa e secretada dentro do sobrenadante da cultura; (ii) adicionar uma protease ao sobrenadante da cultura, onde a protease cliva a proteína de fusão de modo que a proteína heteróloga seja clivada a partir do sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana;(iii) opcionalmente, isolar a proteína heteróloga a partir do sobrenadante da cultura.
[0122] Assim, em uma outra concretização particular, o método de purificação de uma proteína heteróloga compreende: (i) cultivar a cepa bacteriana gram-negativa como descrita aqui de modo que uma proteína de fusão que compreende um sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS bacteriana, a proteína heteróloga e o tag de peptídeo seja expresso e secretado dentro do sobrenadante da cultura; (ii) localizar o tag de peptídeo, por exemplo, por purificação de coluna de afinidade do sobrenadante.
[0123] Assim, em uma outra concretização particular, o método para purificação de uma proteína heteróloga compreende: (i) cultivar a cepa bacteriana gram-negativa como descrito aqui de modo que uma proteína de fusão que compreenda um sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS bacterina, a proteína heteróloga, um sítio de clivagem de protease entre o sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana e a proteína heteróloga e um tag de peptídeo é expresso e secretado dentro do sobrenadante da cultura; (ii) adicionar uma protease ao sobrenadante da cultura, sendo que a protease cliva a proteína de fusão de modo que a proteína heteróloga seja clivada a partir do sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana;(iii) localizar o tag de peptídeo, por exemplo, através da purificação por afinidade de coluna do sobrenadante.
[0124] Nas concretizações particulares acima descritas, a protease pode ser adicionada ao sobrenadante da cultura na forma de, por exemplo, uma proteína de protease purificada ou através da adição de uma cepa bacteriana expressando e secretando uma protease ao sobrenadante da cultura. Etapas adicionais podem incluir a remoção da protease, por exemplo, via purificação por afinidade de coluna.
[0125] Em uma concretização, a presente invenção provê a cepa bacteriana gram-negativa recombinante como descrito aqui par auso na medicina.
[0126] Em uma concretização, a presente invenção provê a cepa bacteriana gram-negativa recombinante como descrita aqui par auso na liberação de uma proteína heteróloga como um medicamento ou como uma vacina a um indivíduo. A proteína heteróloga pode ser liberada em um indivíduo como uma vacina através do contato da cepa bacteriana gram-negativa com células eucarióticas, por exemplo, com um animal vivo, in vivo, de modo que a proteína heteróloga seja transportada dentro do animal vivo, o qual produz então anticorpos contra a proteína heteróloga. Os métodos produzidos podem ser diretamente utilizados ou ser utilizado e purificado e utilizado no diagnóstico, utilizado na pesquisa usa, bem como na terapia.
[0127] Em uma concretização, a presente invenção provê um método para liberação de uma proteína heteróloga, onde a proteína heteróloga seja liberada in vitro dentro de uma célula eucariótica.
[0128] Em uma concretização adicional, a presente invenção provê um método para liberação de uma proteína heteróloga, onde a célula eucariótica é um animal vivo, sendo que o animal vivo é contatada com a cepa bacteriana gram-negativa, in vivo, de modo que uma proteína de fusão seja transportada dentro do animal vivo. O animal preferido é um mamífero, mais preferivelmente, um ser humano.
[0129] Em uma concretização adicional, a presente invenção provê o uso da cepa bacteriana gram-negativa recombinante como descrito supra, para varredura de alto rendimento dos inibidores para uma rota celular ou evento de gatilho, através da proteína heteróloga transportada.
[0130] Em uma concretização adicional, a presente invenção provê um banco de cepa bacteriana gram-negativa, sendo que a proteína heteróloga codificada por uma segunda sequência de DNA do vetor de expressão das cepas bacterinas gram-negativas ser uma proteína humana ou uma proteína de murino, preferivelmente, uma proteína humana e, sendo que cada proteína humana ou proteína de murino expressa por uma cepa bacteriana gram-negativa é diferente na sequência de aminoácido. Um banco de dados possíveis poderia, por exemplo, conter os 560 proteínas contendo a coleção de Orf da quinase humana Addgene (Addgene No. 1000000014). Como vetor de clonagem para expressão dos vetores de expressão descrita acima pode ser utilizado.
[0131] Em uma concretização adicional, a presente invenção provê um kit compreendendo um vetor como descrito aqui e, uma cepa bacteriana expressando e secretando uma protease capaz de clivar o sítio de clivagem da protease compreendido pelo vetor. Um vetor útil particular é um vetor para uso em combinação com a cepa bacteriana para liberar uma proteína desejada dentro das células eucarióticas como descrito acima, sendo que o vetor compreende a direção 5’ para 3’: um promotor; uma primeira sequência de DNA codificante de um sinal de liberação a partir de uma proteína efetora T3SS bacteriana, operavelmente ligado ao referido promotor; uma segunda sequência de DNA codificante a uma proteína heteróloga fundida na estrutura da extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA, e alternativamente, uma terceira sequência de DNA codificante de um sítio de clivagem de protease, sendo que a terceira sequência de DNA está localizada entre a extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA e a extremidade 5’ da referida segunda sequência de DNA.
EXEMPLOS Exemplo 1: (A) Materiais e Métodos:
[0132] Cepas bacterianas e Condições de crescimento. As cepas utilizadas neste estudo são listadas nas figuras 15A a 15M. E. coli Top 10, utilizado para purificação de plasmídeo e clonagem, e a E. coli Sm10 À pir, utilizada pela conjugação, bem como E. coli BW19610 [46], utilizada para propagar pKNG101, foram rotineiramente crescida sobre placas de ágar LB e caldo LB a 37°C. A ampicilina foi utilizado em uma concentração de 200 μg/ml (Yersinia) ou 100 μg/ml (E. coli) para selecionar os vetores de expressão. A estreptomicina foi utilizada em uma concentração de 100 μg/ml para selecionar os vetores suicidas. Y. enterocolitica MRS40 [36] um derivado E40 não-resistente à ampicilina [13] e cepas derivadas dos mesmos, foram rotineiramente crescidas em infusão de cérebro-coração (BHI; Difco) em RT. Para todas as cepas Y. enterocolitica o ácido nalidixico foi adicionado (35 μg/ml) e todas as cepas Y. enterocolitica asd foram adicionalmente suplementadas com 100 μg/ml de ácido meso-2,6- diaminopimélico (mDAP, Sigma Aldrich). S. entérica SL1344 foram rotineiramente crescidas em placas de ágar LB e em caldo LB a 37°C. A ampicilina foi utilizada em uma concentração de 100 μg/ml para selecionar os vetores de expressão em S. entérica.
[0133] Manipulação genética de Y. enterocolitica. As manipulações genéticas de Y. enterocolitica foi descrita em [47, 48]. Resumidamente, os alteradores para modificação ou deleção dos genes nos plasmídeos pYV ou em o cromossomo foram construídos por PCR de sobreposição de 2 fragmentos usando o plasmídeo pYV40 purificado ou DNA genômico como padrão, conduzindo a 200-250 bp das sequências dos flancos sobre ambos os lados da parte deletada ou da parte modificada do respectivo gene. Os fragmentos resultantes foram clonados em pKNG101 [43] em E. coli BW19610 [46]. As sequências de plasmídeos verificados foram transformados dentro de E. coli Sm10 À pir, a partir de onde os plasmídeos forma mobilizados dentro da cepa correspondente Y. enterocolitica. Os mutantes carregando o vetor integrado foram propagados para gerações severas sem seleção por pressão. Então sucrose foi utilizada para selecionar os clones que tem perda de vetor. Finalmente, os mutantes foram identificados por PCR de colonização.
[0134] Construção de plasmídeos. Os plasmídeos pBad_Si2 ou pBAD_SiI (Figura 10) foram utilizados para clonagem das proteínas de fusão com os 138 aminoácidos de N-terminal de YopE (SEQ ID NO: 2). pBad_Si2 foi construído por clonagem do fragmento SycE-YopE1-138 contendo os promotores endógenos para YopE e SycE a partir do pYV40 purificado dentro do sítio KpnI/HindIII de pBad-MycHisA (Invitrogen).
[0135] Modificações adicionais incluem a remoção do fragmento NcoI/BglII de pBad-MycHisA por digestão, tratamento do fragmento Klenow e religação. Um terminal de transcrição bidirecional (BBa_B1006; iGEM Foundation) foi clonado dentro do corte KpnI e Klenw tratado (pBad_Si2) ou sítio de corte BglII (pBad_Sil). Adicionalmente, na extremidade 3’ de YopE1- 138, os sítios de clivagem a seguir foram adicionados: Xbal- XhoI-BstBI-(Hindlll) (Fig. 10B). pBad_Sil é igual ao pBad_Si2, mas codifica o EGFP amplificado a partir de pEGFP- C1 (Clontech) no sítio NcoI/BflII sob o promotor induzível por Arabinose. Os plasmídeos pSi_266, pSi_267, pSi_268 e pSi_269 contendo o promotor endógeno correspondente e o fragmento SteA1-20 (pSi_266), a extensão completa da sequência SteA (pSi_267), o fragmento SpoE1-81 (pSi_268) ou o fragmento SopE1-105 (pSi_269) foram amplificados a partir do DNA genômico de S. entérica SL1344 e clonada dentro do sítio NcoI/KpnI de pBad-MycHisA (Invitrogen).
[0136] A extensão completa dos genes ou fragmentos dos mesmos foram amplificados com os primers específicos listados na Tabela 1 abaixo e clonados como fusões para YopE1-138 dentro do plasmídeo pBad_Si2 ou em caso de z-BIM (SEQ ID NO:21) dentro de pBad_SiI (ver, tabela II abaixo). Para a fusão de SteA ou SopE, constructo de DNA sintético foram clivados por KpnI/HindII e clonado dentro pSi_266, pSi_267, pSi_268 ou pSi_269 respectivamente. no caso dos genes de espécies bacterianas, DNA genômico purificado foi utilizado como padrão (S. flexneri M90T, Salmonella enterica subespécie enterica serovar Typhimurium SL 1344, Bartonella henselae ATCC 49882). Para os genes humanos um banco de cDNA universal (Clontech) foi utilizado se não de outra forma declarado (Figuras 15A a 15M), genes de peixe-zebra foram amplificados a partir de uma biblioteca de cDNA (um tipo de presente de M. Affolter). Os plasmídeos ligados foram clonados em E. coli Top10. Os plasmídeos sequenciais foram eletroporados dentro da cepa Y. enterocolitica ou S. entérica usando ajustes, como para o padrão de eletroporação de E. coli.Tabela 1
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Tabela II
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[0137] Secreção Yop. A indução do regulon yop foi realizada por troca da cultura a 37°C em BHI-Ox (condições secreção-permisiva) [49]. Como a fonte de carbono, glicose, foi adicionada (4 mg/ml).
[0138] As células totais e as frações de sobrenadante foram separadas por centrifugação a 20 800 g por 10 minutos em 4°C. a pelota de célula foi tomada como a fração celular total. As proteínas no sobrenadante foram precipitadas com ácido tricloroacético 10% (p/v) final por 1 hora a 4°C. Após a centrifugação (20.800 g por 15 minutos) e remoção do sobrenadante, a pelota resultante foi lavada em acetona em banho de gelo durante a noite. As amostras foram centrifugadas novamente, o sobrenadante foi descartado e a pelota foi seca ao ar e ressuspenso em 1 x SDS de carga de corante.
[0139] As proteínas secretadas foram analisadas por SDS- PAGE, em cada caso, as proteínas secretadas por 3x108 bactérias foram carregadas por coluna. A detecção das proteínas secretadas especifica por imunoblot foi realizada usando 12,5% de géis SDS-PAGE. Para detecção das proteínas em um total de células de 2x 108 bactérias foram carregada por coluna, se não for declarado de outro modo, e as proteínas foram separadas sobre 12,5% de géis de SDS-PAGE antes da detecção por imunoblot.
[0140] O imunoblot foi realizado usando anticorpos de ratos contra YopE (MIPA193-13a9: 1:1000, [50]). O antissoro foi pré-absorvido duas vezes durante a noite contra Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd para reduzir a coloração antecedentes. A detecção foi realizada com anticorpos secundários dirigidas contra os anticorpos de ratos e conjugados para peroxidase de rábano silvestre (1:5000; Southern Biotech), antes do desenvolvimento com substrato quimioluminescente ECL (LumiGlo, KPM).
[0141] Cultura celular e infecção. As células HeLa, células de fibroblatos 3T3 Suíça, 4T1, B16F10 e D2A1 foram cultivadas em meio Eagle modificado Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% FCS e 2mM de L-glutamine (cDMEM). HUVECs foram isoladas e cultivadas como descrito [51]. As células Jurkat e 4T1 foram cultivadas e RPMI 1640 suplementada com 10% de FCS e 2 mM de L-glutamina. As Y. enterocolitica foram crescidas em BHI com aditivos durante a noite em RT, diluída em BHI fresco a um OD600 de 0,2 e crescido por 2 horas em RT antes em uma temperatura de troca de 37°C em agitador em banho-maria por 30 minutos adicionais ou por 1 hora em caso de liberação de EGFP. Finalmente, a bactéria foi colhida por centrifugação (6000 rcf, 30 segundos) e lavada uma vez com DMEM suplementado com 10 mM de HEPES e 2 mM de L-glutamina. A S. enterica foi crescida em LB com aditivos durante a noite a 37°C e também diluída a 1:40 em LB fresco e crescido por 2,5 horas a 37°C (condições de indução SpiI T3SS) ou a cultura durante a noite foi adicionalmente incubada a 37°C (condições de indução SpiII T3SS). Finalmente, a bactéria foi colhida por centrifugação (6000 rcf, 30 segundos) e lavada uma vez com DMEM suplementado com 10 mM HEPES e 2 mM de l-glutamina. As células semeadas em 96 poços (para Imunofluorescência) ou placas de 6-poços (para Western blotting) foram infectados em MOIs indicados em DMEM suplementado com 10 mM HEPES e 2 mM de L-glutamina. Após a adição da bactéria, as placas foram centrifugadas por 1 minuto a 1750 rpm e colocadas a 37°C pelo período de tempo indicado. A bactéria extracelular foram mortas por gentamicina (100 mg/ml) se indicado. No caso da analise por imunofluorescência, o ensaio de infecção foram interrompidas por 4% de fixação PFA. Para a análise por Western blot foram lavadas duas vezes com PBS resfriado em gelo e tampão de lise fosfo (Novagen) foram adicionadas para lisar as células. Após incubação em gelo, as células foram centrifugadas (16.000 rcf, 25 minutos, 4°C). Os sobrenadantes foram colhidos e analisados quanto ao conteúdo total de proteína pelo ensaio Bradford BCA (Pierce) antes de SDS PAGE e Western blotting usando os anticorpos anti-Fosfo-Akt (Ser473 e T308, ambas da Cell Signaling), anti-actina (Millipore), anti-Bid (Cell Signaling), anti-Myc (Santa Cruz), anti-p38 (Cell Signaling), anti-fosfo-p-38 (Thr180/Tyr182; Cell Signaling), anti-Caspase-3 p17 (Cell Signaling) e anti-Ink4C (Cell Signaling).
[0142] Análise da Secreção com S. enterica. Para indução da secreção da proteína por S. enterica, S. enterica foram cultivadas durante a noite em LB contendo 0,3 M de NaCl em um agitador orbital (ajuste a 150 rpm). S. entérica foram então diluídas 1:50 em LB fresco contendo 0,3 M de NaCl e crescida por 4 horas a 37°C sem agitação.
[0143] As células totais e as frações de sobrenadante foram separadas por centrifugação a 20.800 g por 20 minutos em 4°C. As pelotas celulares foram toamdas como fração celular total. As proteínas no sobrenadante foram precipitadas com ácido tricloroacético 10% (p/v) final pro 1hora a 4°C. Após centrifugação (20.800 g por 15 minutos) e remoção do sobrenadante, a pelota resultante foi lavada em acetona resfriada em gelo durante a noite. As amostras foram novamente centrifugadas, o sobrenadante foi descartado e a pelota foi seca ao ar e ressuspensa em carga de corante de 1 x SDS.
[0144] As proteínas secretadas foram analisdas pro SDS- PAGE, em cada caso, as proteínas secretadas por 3 x 108 bactéria foram carregadas por coluna. As detecções de proteínas especificas secretadas por imunoblot foram realizadas usando 12,5% de géis SDS-PAGE. Para detecção de proteínas em células totais, 2 x 108 bactérias foram carregada spor coluna, se não declarado de outra forma, e proteínas foram separadas sobre 12,5% de géis em SDS-PAGE antes detecção por imunoblot. O imunoblot foi realizado usando o anticopor anti-Myc (Santa Cruz).
[0145] Western blotting de proteínas T3SS transportadas a partir das células infectadas. As células HeLa em placas com 6-poços foram infectadas em um MOI de 100 como descrito acima. No caso de co-infecção com a protease TEV de transporte da cepa Y. enterocolitica, o OD600 das cepas foi ajustado e as duas suspensões bacterianas foram misturadas em um tubo em uma proporção de 1:1 (se não de outro modo indicado) antes de adição das células. Na extremidade da infecção, as células foram lavadas duas vezes com PBS resfriado em gelo e colhido por atrito em um volume pequeno de PBS resfriado em gelo. Após a centrifugação (16.000 rcf, 5 minutos, 4°C) as pelotas foram dissolvidas em 0,002% de digitonina suplementada com um coquetel inibidor de protease (Roche complete, Roche). As pelotas dissolvidas foram incubadas por 5 mintuos em gelo e, então centrifugado (16.000 rcf, 25 minutos, 4°C). Os sobrenadantes foram colhidos e analisados pelo conteúdo de proteína total pelo ensaio de Bradford BCA (Pierce) antes de SDS PAGE e Western blotting usando um anti-Myc (Santa Cruz, 9E11) ou anticorpo anti-Ink4C (Cell Signaling).
[0146] Imunofluorescencia. As células foram semeadas em placas com 96 poços (Corning) foram infectados como descrito acima e após fixação com 4% de PFA das células foram lavadas três vezes com PBS. As células forma então bloqueadas usando 5% de soro de cabra em PBS 0,3% de Triton X-100 por 1 hora a RT. O anticorpo primário (anti-Myc, Santa Cruz, 1:100) foi dluído em PBS com 1% de BSA e 0,3% de Triton X-100 e as células foram incubadas durante a noite à 4°C. As células foram lavadas 4 vezes com PBS antes de o anticorpo secundário (AF 488 anti-camundongo, Life Technologes, 1:250) diluído em OS com 1% de BSA e 0,3% de Triton X-100 foi adicionado. Se necessário a coloração do DNA Hoechst (Life Technologies, 1:2500) e/ou coloração com actina (Dy647-Phalloidina, DyeOmics) foram incluídas. Em alguns casos, apenas o DNA e/ou coloração de actina foi aplicada diretamente após a lavagem com PFA. As células foram incubadas durante 1 hora a RT, lavada três vexes com PBS e analisada por imagem automatizada como descrito abaixo.
[0147] Microscopia automatizada e Análise de imagem. As imagens foram automaticamente adquiridas com um Micro ImageXpres (Molecular Devices, Sunnyvale, USA). A quantificação da intensidade de coloração anti-Myc foi realizada usando MetaXpress (Molecular Device, Sunnyvale, USA), As regiões dentro das células excluindo as regiões nucleaes e regiões contendo as bactérias foram manualmente escolhidas (círculos com uma área de 40 pixels) e intensidade média foi registrada.
[0148] Estímulo TNFα e Western blotting de fosfo-p38. As células HeLa semeadas em placas de 6 poços foram infectadas com MOI de 100 como descrito acima. 30 minutos de gentamicina p.i foi adicionada e 45 minutos de TNFα p.i. foi adicionado (10 ng/ml). Em 1 hora 1 5 minutos, as células p.i. foram lavadas duas vezes com PBS resfriado em gelo e o tampão del ise fosfo-safe (Novagen) foi adicionado para lise das células. Após incubação em gelo, as células foram centrifugadas (16.000 rcf, 25 minutos, 4°C). Os sobrenadantes foram colhidos e analisados quanto o conteúdo de proteína total por análise Bradfor BCA (Pierce) antes de SDS PAGE e Western blotting usando um anticorpo anti-fosfo-p38, p38 total (Cell Signaling) e anticorpo anti-actina (Millipore).
[0149] Determinação do nível cAMP das células HeLa infectadas. As células HeLa semeadas em placas de 96 poços foram infectadas como descrito acima. 30 minutos antes, a infecção cDMEM foi alterada para o suplemento DMEM com 10 mM de HEPES e 2 mM de L-glutamina e 100 uM 3-Isobutil-1- metilxantina (1BMX, Sigma Aldrich). 60 minutos de gentamicina p.i. foi adicionado e as células foram adicionalmente incubadas a 37°C por outros 90 minutos. A determinação de cAMP foi realizada usando um ELISA competitivo de acordo com as instruções do fabricante (Amersham, cAMP Biotrak, RPN225). Como um controle positivo indicou a quantidade de toxina cólera (C8052, Sigma Aldrich) foi adicionado por 1 hora para as células em DMEM suplementado com 10 mM de HEPES e 2 mM de L-glutamina e 100 uM de IBMX.
[0150] Infecções de embriões de peixe zebra, quantificação por imagem e imagem automatizada. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os guias aprovados. Os peixes zebra foram mantidos em condições padrão [52]. Os embriões foram estagiados por horas pós-fertilização (hpf) em 28,5°C [53]. As colunas de peixe zebra a seguir foram utilizadas neste estudo; o peixe alelo-selvagem (AB/EK e EK/TL). O protocolo de infecção seguiu o guia mencionado a seguir em [54]. 12 hpf de embriões foram antidos em meio E3 contendo 0,2 mM de N-feniltiouréia (PTU) para prevenir a formação de pigmento. 2 dias após a fertilização (dpf) os embriões foram anestesiados pro 0,2 mg/ml de tricaína e alinhados em 1% de placas de águar em E3 usando uma ferramenta de grampo de cabelo [54]. A Y. enterocolitica foram crescidas em bHI suplementado com 0,4% de arabinose e antibióticos e mDap durante a noite a RT, dluído em BHI fresco com 0,5% de arabinose e outros aditivos em um OD600 de 0,2 e crescidas por 2 horas a RT antes de uma troca de temperatura a 37°C em um agitador de banho-maria por 45 minutos adicionais. Finalmente, a bactéria foi colhida por centrifugação (6000 rcf, 30 segundos) e lavada uma vez com PBS. O OD600 foi ajustado em 2 em PBS contendo mDAP, 1-2 nL desta suspensão foi injetada dentro do cérebro posterior de embriões de peixe zebra alinhados usando um Microinjetor Femtojet (eppendorf) usando Femtotips II (Eppendorf), onde a ponta da agulha foi quegrada com tesouras finas. O tempo de injeção foi ajustado há 0,2 segundos e a pressão de compensação a 15 hPa (Eppendorf, Femtojet) e a pressão de injeção foi ajustada entre 600 e 800 hPa. O tamanho da gota e, assim, o inóculo foi checado por microscopia e por controle de placa. Após a microinjeção, o peixe foi colhido em E3 contendo Tricaína e PTU e incubado por 30 minutos a 37°C e incubado por 5 horas adicionais a 28°C. Um binocular fluorescente (Leica) foi utilizado para observar a fluorescência EGFP bacteriana 1 hora após a infecção no cérebro posterior, e embriões que não são adequadamente injetados foram descartados. Na extremidade da infecção, o peixe foi fixado com 2% de PFA resfriado em gelo por 1 hora em gelo e, adicionalmente, com PFA resfriado em gelo fresco durante a noite em 4°C. A coloração do anticorpo foi realizada como descrito previamente [55, 56]. Resumidamente, os embriões foram lavados 4 vezes com PBS a 0,1% de Tween por 5 minutos de cada um lavada e permealizada com PBS-T + 0,5% de Triton X-100 por 3 minutos a RT. Os embriões foram bloqueados em solução de bloqueio (PBS 0,1% de Tween 0,1% de Triton X-100 5% de soro de cabra e 1% de BSA) em 4°C durante a noite. O anticorpo (Cleaved Caspase-3 (Asp 175), Cell Signaling) foi diluído em 1:100 em solução de bloqueio e incubada sob agitação a 4°C no escuro. O peixe foi lavado 7 vezes com PBS 0,1% em Tween por 30 minutos antes do anticorpo secundário (anti-coelho cabra AF647, Invitrogen, 1:500) diluído em solução de bloqueio foi adicionado e incubado a 4°C durante a noite. A larva foi lavada com PBS de 0,1% de Tween quatro vezes 30 minutos a 4°C e uma vez durante a noite e, adicionalmente lavada 3-4 vezes. As imagens foram tomadas com Leica TCS SP5 - microscopia confocal usando uma objetiva de emersão em água de 40x. As imagens foram analisadas usando Imaris (Bitplane) e Image J. software (http://imagej.nih.gov/ij/).
[0151] A análise da imagem (sobre n=14 por pBad_Si2 ou n+19 para z-BIM) foi realizada via CellProfiler [57] sobre as projeções de intensidade máxima z de imagens z-stack registradas. Resumidamente, a bactéria foram detectadas via canal GFP. Em torno de cada área de um ponto bacteriano, umcírculo com um raio de 10 pixels foi criado. As regiões de sobreposição foram separadas igualmente entre os membros de conexão. Naquelas áreas, muito próximas da bactéria, a intensidade de coloração da caspase 3 p17 foi medida.
[0152] Preparação da amostra para fosfoproteômicas. Para cada condição, duas placas de 6 poços de células HeLa CCL-2 foram crescidas em confluência. As células foram infectadas por 30 minutos como descrito acima. No ponto de tempo indicado, as placas foram colocadas em gelo e lavadas duas vezes em PBS resfriado em gelo. As amostras foram então colhidas em solução de uréia [8 M de Urea (AppliChem), 0,1 M de bicarbonato de amônio (Sigma), 0,1% de RapiGest (Waters), 1x de PhosSTOP (Roche)]. As amostras foram resumidamente agitados, sonicaas em 4°C (Hielscher), agitadas por 5 minutos sobre um termomisturador (Eppendor) e centrifugado por 20 minutos em 4°C e 16.000g. Os sobrenadantes foram colhidos e armazenados a -80°C por processamento adicional. O ensaio da proteína BCA (Pierce) foi utilizado para medir a concentração da proteína.
[0153] Enriquecimento do fosfopeptídeo. As ligações de dissulfeto foram reduzidas com tri(2-carboxietil)fosfina em uma concentração final de 10 mM a 37°C por 1 hora. Os tióis livres foram alquilados com 20 mM de iodoacetamida (Sigma) em temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. O excesso de iodoacetamida foi extinta com cisteína N-acetil em uma concentração final de 25 mM para 10 minutos em temperatura ambiente. A endopeptidase Lys-C (Wako) foi adicionada em uma enzima final/proteína em proporção de 1:200 (p/p) e incubada por 4 horas em 37°C. A solução foi subsequentemente diluída com 0,1 M de bicarbonato de amônio (Sigma) para uma concentração final abaixo de 2 M de uréia e digerida durante a noite a 37°C com tripsina modificada em grau de sequenciamento (Promega) em uma proporção de proteína-para- enzima de 50:1. Os peptídeos foram dessalgados em um cartucho de Sept-Pak C18 (Waters) e seco sob vácuo. Os fosfopeptídeos foram isolados a partir de 2 mg da massa de peptídeo total com TiO2 como descrito previamente [58]. Resumidamente, os peptídeos secos foram dissolvidos em uma solução de acetonitrila a 80% (ACN)-2,5% de ácido trifluoroacético (TFA) saturada com ácido ftálico. Os peptídeos foram adicionaas em uma mesma quantidade de TiO2 equilibrado (5-μm tamanho de conta, GL Sciences) em uma coluna spin Mobicol bloqueada (MoBiTec) que foi incubada por 30 minutos com uma rotação de extremidade para extremidade. A coluna foi lavada duas vezes com a solução de ácido ftálica saturada, duas vezes com 80% de ACN e 0,1% de TFA, e finalmente duas vezes com 0,1% de TFA. Os peptídeos foram eluídos com uma solução de 0,3 M de NH4OH. O pH dos eluídos foi ajustado para ficar abaixo de 2,5 com 5% da solução de TFA e 2 M de HCl. Os fosfopeptídeos foram novamente dessalgados com cartuchos C18 de microspina (Harvad Apparatus).
[0154] Análise LC-MS/MS. A separação cromatográfica dos peptídeos foi realizada usando um sistema nano-LC EASY (Thermo Fisher Scientific), equipado com uma coluna RP-HPLC aquecida (75 μm x 4 5 cm) embacotada internamente com 1,9 μm da resina C18 (Reprosil-Aq Pur, Dr. Maisch). Alíquotas de 1 μg da amostra de fosfopeptídeos total foram analisadas por uma corrida LC-MS/MS usando um gradiente linear variando de 98% d e solvente A (0,15% de ácido fórmico) e 2% de solvente B (98% de acetonitrila, 2% de água, 0,15% de ácido fórmico) a 30% de solvente B sobre 120 minutos em uma taxa de fluxo de 200 nl/minuto. A análise de espectrometria de massa foi realizada em uma pressão dupla de espectrometria de massa LTQ-Orbitrap equipado com uma fonte de íon nanoeletro- pulverização (ambos da Thermo Fisher Scientific). Cada varredura MS1 (adquirida no Orbitrap) foi seguida por dissociação induzida por colisão (CID, adquirida no LTQ) de mais 20 ions precursores abundantes com exclusão dinâmica por 30 segundos. Para análise fosfopeptídeos, os 10 íons precursores mais abundantes foram submetidos ao CID com ativação de multiestágio capacitado. O tempo de ciclo total foi aproximadamente de 2 segundos. Para MS1, os íons 106 foram acumulados na célula Orbitrap sobre um tempo máximo de 300 ms e varrido em uma resulação de 60.000 FWHM (em 400 m/z). A varredura MS2 foi adquirida usando o modo de varredura normal, um ajuste alvo de íons 104, e acúmulo de tempod e 25 ms. Separadamente, os íons carregados e os íons com estado de carga não-assinado excluídos a partir dos eventos MS2 alvos. A energia de colisão normalizada foi ajustada a 32%, e um microscan foi adquirido por cada espectro.
[0155] Quantificação livre de marcação e busca em base de dados. Os arquivos brutos adquiridos foram importados para dentro da ferramenta de software Progenesis (Nonlinear Dynamics, Versão 4.0) para quantificação livre de marcação usando os parâmetros de falha (“default”). Os espectros MS2 foram exportados diretamente da Progenesis em formato mgf e pesquisados usando o algoritmo MASCOT (Matrix Science, Versão 2.4) contra uma base de dados Decoy [59], contendo sequências normais e reversas das entradas SwissProt previstas de Homo sapiens (wwr. ebi. ac. uk, data de liberação 16.05.2012) e os contaminantes comumente observados (um total de 1.0.13.13 sequências). Para identificar as proteínas originárias de amostras enriquecidas de Y. enterocolitica, não- fosfopeptídicas foram pesquisadas contra a mesma base de dados cima, incluindo as entradas SwissProt previstas de Y. enterocolitica (www.ebi.ac.uk, data de liberação 15.08.2013). A tolerância do ion precursor foi ajustada para 10 ppm e a tolerância do fragmento de ion foi ajustada para 0,6 Da. O critério de pesquisa foi ajustado como a seguir: especificidade trípiticatotal foi requerida (clivagem após os resíduos de lisina ou arginina a menos que seguido por prolina), 2 clivagens perdidas foram deixadas, carbamidometilação © foi ajustada cmo modificação fixada e fosforilação (S, T, Y), ou oxidação (M) como uma modificação variável para amostras enriquecidas ou não enriquecidas com TiO2, respectivamente. Finalmente, a pesquina no base de dados foi exportada como um arquivo xml e importada de volta para o software Progenesis para designação da característica MS1. Para quantificação do fosfopeptídeos, um arquivo csv contendo o pico MS1 em abundância de todas as características detectadas foi exportado e para as amostras não enriquecidas, um arquivo csv contendo todas as medidas de proteína com base na intensidade de características somadas para todos os peptídeos identificados por proteína foi criado. Importantemente, o software da Progenesis foi ajustado de modo que as proteínas foram identificadas por conjuntos de semelhança de peptídeos sendo agrupados juntos e de modo que apenas os peptídeos não-conflitantes com sequências específcias para proteínas únicas na base de dados foram emrpegados para quantificação da proteína. Ambos os arquivos forma adicionalmente processados usando o desenvolvimento interno SafeQuant v1.0 R script (dados não publicados, disponíveis em https://github.com/eahrne/SafeQuant). Em resumo, o conjunto de software do nível de identificação para uma taxa falsa de descoberta de 1% (com base no número de hits da base de dados das sequências de proteína chamariz) e normaliza as abundâncias do pico MS1 identificado (Extraído por Cromatograma de Ion, XIC) através de todas as amostras, ou seja, XIC somado de todas as características de peptídeos identificados seguramente é escalonado para ser igual a todas as corridas LC-MS. Em seguida, todas as protéinas/fosfopeptídeos quantificadas são designadas em uma proporção abundante para cada ponto de tempo, com base na XIC média por período de tempo. A significância estatística de cada proporção é data por seu valor q (Falsa taxa de descoberta ajustada ao valor p), obtido através do cálculo de valores p- estatísticos (t) modificados [60] e ajustados para o teste múltiplo [61]. O local dos resíduos fosforilados foi automaticamente designado por MASCOT (classificação > 10). Todos os espectros anotados juntos com os arquivos brutos MS e os parâmetros de pesquisa empregados, serão depositados em ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) via PRIDE partner repositor [62].
[0156] O alinhamento de sequência foi realizado usando a web EMBL-EBI com base na ferramenta de alinhamento de sequências múltiplas ClustalW2 em http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/.
[0157] (B) Resultados - Sistema de liberação de proteína com base na secreção do tipo 3 de proteínas de fusão YopE:
[0158] Embora muitos N-terminais da YopE efetora T3SS de Y. enterocolitica (SEQ ID NO:1) contenham o sinal de secreção suficiente para transportar as proteínas heterólogas [10], o sítio de ligação da chaperona (CBS) para sua chaperona (SycE) não está incluído [63]. Nós selecionamos os 138 aminoácidos N-terminal de YopE (SEQ ID NO:2) para ser fundido às proteínas a sere liberadas, como está sendo mostrado para dar o melhor resultado para transporte de outros substratos T3S heterólogo [38]. Como estes 138 aminoáciso N-terminal de YopE contém a CBS, nós decidimos, adicionalmente, co-expressar SycE. O fragmento SycE-YopE1-138 clonado a partir de Y. enterocolitica purificada no plasmídeo de virulência pYV40 contém os promotores endógenos de YopE e seus chaperona SycE (Figura 10). Portanto, SycE e qualquer proteína de fusão YopE1-138 são induzidas por uma troca de temperatura rápida a partir do crescimento em RT a 37°C. O tempo de cultura a 37°C irá afetar a quantidade de proteína de fusão presente na bactéria. Um sítio de clonagem múltiplo (MCS) foi adicionado na extremidade 3’ da YopE1-138 (figura 10B) seguido por um Myc e um tag 6xHis e um códon de parada.
[0159] A cepa antecedente foi cuidadosamente selecionada. Primeiro, para limitar o transporte de efetores endógenos, nós utilizados uma cepa de Y. enterocolitica que foi deletada em todas as efetoras conhecidas, Yop H, O, P, E, M e T (chamada ΔHOPEMT) [64]. Em adição, nós utilizamos um mutante auxotrófico que não pode crescer na ausência de ácido meso- 2,6-diaminopimélico exógeno [65]. Esta cepa foi deletada quanto ao gene desidrogenase aspartato-beta-semialdeído (Δasd), e classificada como nível de biossegurança 1, pela agência de segurança Suíça (modificada para A010088/2). Em adição, nós deletamos as proteínas de adesão YadA e/ou InvA para oferecer uma escolha maior das cepas antecedentes.Embora o uso das cepas yadA ou yadA/InvA reduz a sinalização anterior induzida [66], a quantidade de proteína liberada é afetada também [67].
[0160] Caracterização da proteína de fusão YopE liberada dentro das células eucarióticas:
[0161] Em uma análise de secreção in vitro (ver figura 1A), a secreção da proteína dentro do liquido em torno é artificialmente induzido. Após a precipitação da proteína a base de TCA, a análise de Western blot com o anticorpo anti- YopE foi utilizado para determinar quantidades de proteína secretada (figura 1B). Enquanto uma cepa wt secretou a extensão completa de YopE, as cepas ΔHOPEMT asd não secretaram. Na presença de YopE1-138-Myc-His (adicionalmente denomidado YopE1-138-Myc; SEQ_ID_NO._30) uma banda menor YopE se torna visível (figura 1B). Portanto, o fragmento YopE1-138 é bem secretado na montagem descrita aqui. Para analisar a homogenicidade do transporte de proteína dentro das células eucarióticas, nós infectamos as células HeLa com a cepa codificante de YopE1-138-Myc e corada com Myc-tag por IF (Figura2 A e 2B). Embora no início apenas as bactérias foram coradas, em 30 mintuos após a infecção (p.i.) as células destacadas começam a se tornar visívei, o que é melhorado durante o aumento do tempo de infecção (figura 2B). Esta tendência é bem refletida pela intensidade de coloração Myc- tag dentro das células HeLa (figura 2A e 2B). O YopE1-138-Myc pode ser detectado em qualquer lugar nas células (Figura 2A), exceto no núcleo [68]. Notavelmente, muitas se não todas as células foram alcançadas por esta abordagem em uma via comparável. Como Y. enterocolitica é conhecida por infectar muitos tipos diferentes de célla [69], nós observamos que YopE1-138-Myc liberaou dentro de várias linhas de células. A mesma coloração anti-Myc IV homogênea foi observada em fibroblastos de murino infectados, células Jurkat e HUVECs (Figura 11). Ainda mais, sintonizado o MOI acima ou abaixo permitiu a modulação da quantidade de proteína liberada (figura 2C), enquanto ainda muito mais células permaneceram localizadas. Um baixo número de bactérias não irá resultar em poucas células com lotes de proteína liberada, mas sim com muitas células contendo uma quantidade baixa de proteína liberada (Figura 2C).
[0162] Redireção das proteínas liberadas T3SS para o núcleo:
[0163] Como a própria YopE localizada no citoplasma (Figura 2A), ela é de interesse especial para testar se o fragmento de YopE1-138 dificulta a localização das proteínas de fusão nuclear. Nós, portanto, adicionamos o SV40 NLS ao C-terminal (e N-temrinal, resultados similares) de YopE1-138-EGFP (SEQ DI NO:39, e SEQ ID NO:38, respectivamente). Enquanto o YopE1-138- EGFP (SEQ ID NO:37) conduz a uma coloração citoplásmica fraca, YopE1-138-EGFP-NLS elevando a um sinal EGFP nuclear muito forte nas células HeLa infectadas (figura 3). Isto indica que o fragmento YopE1-138 é compatível com o uso de uma NLS. Embora mCherry já tenha sido utilizada em patógenos de planta [70], isto representa uma liberação com sucesso de uma proteína do tipo GFP via bactéria patogênica de humano ou animal codificante de uma T3SS. Isto valida a estratégia dependente de SycE and YopE1-138 como sendo muito promissora para liberação de muitas proteínas de escolha.
[0164] Remoção do apêndice YopE1-138 após transporte da proteína de fusão para a célula eucariótica:
[0165] Enquanto a liberação bacteriana do fragmento YopE1-138 é de grande benefício, ela pode dificultar a função das proteínas de fusão e/ou a localização. Portanto, sua remoção após a liberação da proteína seria ótima. Para este fim, nós introduzimos dois sítios de clivagem TEV (ENLYFQS) [71 - 73] entre YopE1-138 e um parceiro de fusão (o regulador de transcrição ETI-Myc (SEQ ID NOs:36 e 41) [74] e o INK4C humano (SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 43)). Para manter as vantagens do método apresentado, nós fundimos ainda a protease TEV (variante S219V; [75]) para uma YopE1-138 (SEQ ID NO:42) em outra cepa Y. enterocolitica. As células HeLa foram infectadas com ambas as cepas de uma vez. Para analisar a fração transportada das proteínas únicas, as células HeLa infectadas foram lisadas em 2 horas p.i. (Figura 4) com Digitonin, que é conhecido por não lisar a bactéria ([76}; ver Figura 12 para controle). A análise por Western Blot revelou a presença do YoE1-138 2xTEV-sítio de clivagem ET1- Myc ou de YopE1-138-2xTEV-sítio de clivagem Flag-INK4C-Myc apenas quando as células foram infectadas com a cepa correspondente (Figuras 4A e 4C). Durante a digestão à noite deste lisado celular com a protease TEV purificada, uma troca de banda poderia ser observada (figuras 4A e 4C). Esta banda corresponde ao ET1-Myc (Figura 4C) ou ao Falg-INK4C (Figura 4A) com os vestígios do N-terminal do sítio de clivagem TEv, mais igualmente apenas uma Serina. Durante a coinfecção das células com a cepa de liberação da protease TEV, o mesmo fragmento ET1-Myc clivado ou Flag-INK4C tornou-se visível, indicando que a protease TEV liberada via T3SS foi funcional e que as células únicas foram infectadas por ambas as cepas bacterianas (Figuras 4A e 4C). Enquanto a clivagem não for completada, a maioria da proteína translocada é clivada já 2 horas após a infecção e mesmo durante a noite a digestão com a protease TEV purificada não resultaria em melhores taxas de clivagem (Figura 4B). Como reportado, a clivagem dependente da protease TEV pode necessitar dda otimização dependente da proteína de fusão [77, 78]. A remoção dependente da protease TEVe do apêndice YopE1-138 após a translocação provê ainda um primeiro tempo de uma proteína T3SS liberando quase todas as proteínas heterólogas nativas, alterando a composição do aminoácido através apenas de um aminoácido no N-terminal.
[0166] Uma abordagem alternativa para a clivagem dependente da protease TEV do fragmento YopE consistiu na incorporação de Uquitina dentro da proteína de fusão de interesse. Ao contrário, a ubiquitina foi processada em seu C-terminal por um grupo de proteases C-terminal Ubiquitina específica endógeno (Enzimas de Deubiquitinação, DUBs). Como a clivagem é suposta por acontecer em muitos C-terminais de Ubiquitina (após g76), a proteína de interesse seria livre das sequências de aminoácidos adicionais. Este método foi testado na proteína de fusão YopE1-138-Ubiquitina-Flag-INK4C-MycHIs. No controle das células infectadas por uma bactéria expressando YopE1-138-Flag-INK4C-MycHIs, uma banda correspondente ao YopE1-138-Flag-INK4C-MycHIs foi encontrada, indicativo de translocação eficiente da proteína de fusão (Figura 24). Quando as células foram infectadas por 1 hora com a bactéria expressando YopE1-138-Ubiquitina-Flag-INK4C- MycHIs, uma banda adicional correspondente ao tamanho de Flag-INK4C-MycHIs foi visível, indicando que parte da proteína de fusão foi clivada. Este resultado mostra que a introdução de Ubiquitina dentro da proteína de fusão capacita a clivagem do fragmento YopE1-138 sem a necessidade de uma protease exógena.
Translocação do tipo III e do tipo IV de efetores bacterianos:
[0167] SopE de Salmonella enterica é um fator de permuta do nucleotídeo guanina bem caracterizado (GEF) que interage com Cdc42, promovendo o remodelamento do citoesqueleto de actina [79]. Embora a translocação de YopE1-138-Myc dentro das células HeLa não tenha efeito, a YopE1-138-SopE translocada (SEQ ID NOs: 5 e 135) induziram mudanças drásticas na rede de actina (Figura 5A). Resultados similares foram obtidos com uma outra proteína efetora GEF, IpgB1 de Shigella flexneri (SEQ ID NO:4). Notavelmente, as priemiras mudanças no citoesquelo de actina foram observadas muito rápido, 2 mintuos em p.i. (Figura 5A). portanto, pode-se concluir a liberação da proteína dependente de T3SS acontece imediatamente após a infecção ser iniciada por centrifugação. Para uma prova precisa do transporte dependente de T3SS, uma das proteínas T3SS formando o poro de translocação dentro da membrana da célula eucariótica foi deletado (YopB, ver [80]) (Figura 12).
[0168] Durante a infecção por Salmonella, a translocação/o transporte SopE foi seguido pelo transporte de SptP, que funciona como uma proteína de ativação de GTPase (GAP), para Cdc42 [81]. Enquanto a translocação de YopE1-138-SopE-Myc (SEQ ID NO:135) sozinha ativa de forma massiva os rearranjos F- actina, a coinfecção com a bactéria expressão a YopE1-138-SptP (SEQ ID NO:8) aboliu este efeito de uma maneira dependente da dosagem (Figura 5B). Uma coloração anti-Myc indicou que esta inibição não foi devido a um nível reduzido de transporte/translocação de YopE1-138-SopE-Myc (figura 5B). Juntos estes resultados mostraram que a coinfecção de células com duas cepas bacterianas é um método válido para liberar dois efetores diferentes dentro de células úncias para dirigir sua interação funcional.
[0169] As funções OspE dos efetores tipo III de S. flexneri como um lisado fosfotreonina que defosforiliza a quinase MAP p38 e ERK [82]. Para testar a funcionalidade do YopE1-138-OspE (SEQ ID NO: 7), nós monitoramos a fosforilação de p38 após o estímulo com TNFα. Nas células não infectadas ou nas células infectadas com a bactéria expressando YopE1-138-Myc, a TNFα induziu a fosforilação p38. Em contraste, após a translocação de YopE1-138-OspF, a fosforilação induzida por TNFa foi abolidada, mostrando que a OspE liberada foi ativa emr elação ao p38 (Figura 6A).
[0170] Durante a infecção com Salmonella, o efetor SopB efetor do tipo III protege as células epiteliais da apoptose através da ativação sustentada de Akt [83]. Enquanto a translocação de YopE1-138-Myc ou YopE1-138-SopE não tem efeito sobre Akt, a translocação de YopE1-138-SopB (SEQ ID NO:6) induziu uma forte fosforilação de Akt em T308 e S473, refletindo na forma ativa (Figura 6B). Resultados similares foram obtidos com o homólogo SopB de S. flexneri (IpgD, SEQ ID NO:9). Completamente, nossos resultados mostraram que o sistema de liberação a base de YopE1-138 funciona para todos os efetores T3S testados ate agora, e que ele permite a investigação de proteínas envolvidas no controle das funções celulares central incluindo o citoesqueleto, inflamação e sobrevivência celular.
[0171] Um número de bactérias, incluindo Agrobacterium tumefaciens, Legionlella pneumophila e Bartonella henselae, usam a secreção do tipo IV para injetar os efetores dentro das células. Nós testamos se o efetor BepA do tipo IV de B. henselae poderia ser translocado/transportado para dentro das células HeLa usando nossa ferramenta. A extensão total de BepA (SEQ ID NO:10) e BepAE305-end (SEQ ID NO:11) contendo o domínio Bid C-terminal foram clonados e as células foram infectadas com as respectivas cepas. Como BepA demonstrou induzir a produção de AMP cíclico (cAMP) [84], o nível de cAMP em células HeLa foi medido após a infecção. Embora a translocação/transporte do domínio Bid do efetor de B. henselae BepG (SEQ ID NO:136) falhe em induzir cAMP, a extensão total de BepA e BepAE305-end ativa a produção de cAMP nas quantidades esperadas [84] (Figura 6C). Este resultado mostrada, que os efetores do tipo IV podem também ser efetivamente liberados pelo sistema de liberação à base de YopE1-138 dentro de células hospedeiras alvo e que eles são funcionais.
Translocação de proteínas eucarióticas dentro de células epiteliais:
[0172] Para mostrar que as proteínas humanas podem translocar via secreção do tipo III, nós fundimos os indutores de apoptose humana para liberação por Y. enterocolitica para YopE1-138 ou para liberação por S. entérica para SteA1-20, SteA, SopE1-81 ou SopE1-105. Nós então monitoramos a translocação do domínio de interação BH3 mata o agnosita (BID, SEQ ID NO;24), que é um membro pró-apoptótico da família da proteína Bcl-2. Ele é um mediador do dano mitocondrial pela caspase-8 (CASP8). A CASP8 cliva BID, e o BID truncado (tBID, SEQ ID NO:25) se transloca/transporta para a mitocôndria onde ele ativa a liberação do citocromo c. o útlimo conduz à form intrínseca de ativação da caspase 3 (CASP3) durante o que ela é clivada em unidades de 17 e 12 kDa [85]. Embora a infecção por 1 hora com YopE1-138-Myc ou YopE1-138-BID expressando Y. entereocolitda falhou em induzir a apoptose, o transporte/translocalção de tBDI humano ativado pela morte celular em uma extensão maior do que o indutor estauroposrina de apoptose bem caracterizado (Figura 7A e 7C). Como esperado, a translocação de tBID conduz à produção da subunidade CASP3 p17, mesmo em quantidades maiores como como Estaurosporina (Figura 7A). Para capacitar a comparação das quantidades de proteína transportada pela Bid endógena, as células HeLa foram lisadas com digitonina e analisadas por Western blotting usando um anticorpo anti-Bid (Figura 7B). O T3SS liberando YopE1-138-tBID alcançou cerca de níveis Bid endógenos em células HeLa, enquanto liberou YopE1-138-BID estava presente em quantidades ainda maiores (2,5 vezes) (Figura 7B). Uma proteoma profunda e um mapeamento de transcriptoma de células HeLa estimado em 4,4 vezes 105 cópias de BID por célula única [86]. Portanto, pode se concluir que a liberação da proteína humana dependente de T3SS alcança 105 a 106 proteínas por célula. Estes números ajustam as cópias por célula de nanocorpos translocados via E. coli T3SS [19]. Assumindo um nivelmaneto de um fator d e1 para o MOI e para a duração da infecção, um fator de 3,2 por ponto de tempo de adição de antibiótico e para o tempo de cultura a 37°C antes da infecção, as cópias/célula de proteína liberadas são modulados a partir de algumas 1000 cópias/célula até alguns 106 cópias/célula. Em geral, estes resultados indicaram que o tBID translocado/transportado foi funcional e liberou níveis relevanes. Isto validou a ferramento de translocação/transporte para estudar a regra das proteínas na regulação da apoptose, um aspecto central da biologia celular.
[0173] Nós fundimos adicionalmente o tBID murino (códon otimizado para Y. enterocolitica; SEQ ID NO: 194) ou os dom'minios BH3 de tBID murino ou BAX murino (em ambos os casos de códon otimizado para Y. enterocolitica; SEQ ID NO: 138 e 139) para YopE1-138 para liberação por Y. enterocolitica. Embora a infecção por 2,5 horas com Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd sem liberação de proteína ou YopE1-138-Myc falhou em induzir a apoptose, o transporte de tBID murino (códon otimizado para Y. enterocolitica, SEQ ID NO:194) ativado pela morte celular em B16F10 (Figura 16), células D2A1 (Figura 17), HeLa (Figura 18) e 4T1 (Figura 19). O transporte/translocação do domínio BH3 do códon BID murino otimizado para Y. enterocolitica (SEQ ID NO:138) ou o códon BAX murino otimizado para Y. enterocolitica (SEQ ID NO:139) foram bem como encontrado para induzir a morte massiva da célula em B16F10 (Figura 16) nas células D2 A1 (Figura 17), HeLa (Figura 18), e célula 4T1 (figura 19).
[0174] Embora a infecção por 4 horas com a bactéria S.entérica aroA falhou em induzir a apoptose, o transporte/translocação de tBID murino ativado por apoptose, como a translocação de tBID murino conduziu a produção da subunidade CASP3 p17 (Figuras 20 e 21). A extensão da indução da apoptose para as proteínas de fusão SopE foi mairo quando usando as condições de indução SpiI T3Ss (Figura 20), que reflete no transporte de SopE excluviamente por SpiI T3SS. O tBID de murino fundido ao SteA1-20 falhou em induzir a apoptose, muito provavelmente devido ao sinal de secreção dentro dos 20 aminoácidos do N-terminal de SteA não é suficiente para permitir a liberação de uma proteína de fusão (Figuras 20 e 21). O tBID murino fundido à extensão total de SteA conduz à indução da apoptose em células HeLa (Figuras 20 e 21), ambas as condições de indução de SpiI e SpiII T3SS, refletindo a capacidade de SteA a ser transportado por ambas as T3SS. Deve ser observado que mesmo sob condições de indução SpiII T3SS, uma atividade parcial do SpiI T3SS é esperada como vista pela atividade das proteínas de fusão SoPE em condições de indução SpiII T3SS (Figura 21).
[0175] Apesar da funcionalidade aqui elaborada pelas proteínas eucarióticas translocadas/transportadas, várias outras proteínas eucarióticas foram secretadas usando a ferramenta aqui descrita. Isto inclui a liberação por Y. enterocolitica (Figuras 13, 14 e 23) proteínas a partir da regulação do ciclo celular (Mad2 (SEQ ID NO: 15), CDK1 (SEQ ID No: 14), INK4A (SEQ ID No. 16), INK4B (SEQ ID No. 17) e INK4C (SEQ ID No. 18)) bem como parte das mesmas (INK4A 84103 (SEQ ID No. 158), pl07 657-662 (SEQ ID No. 159), p21 141160 (SEQ ID No. 160), p21 145-160 (SEQ ID No. 161), p21 17-33 (SEQ ID No. 162) e ciclina D2 139-147 (SEQ ID No 163)), proteínas relacionadas à apoptose (Bad (SEQ ID No. 29), FADD (SEQ ID No. 28), e Caspase 3 pl7 (SEQ ID No. 22) e pl2 (SEQ ID No. 23), Bid do peixe zebra (SEQ ID No. 19) e t-Bid (SEQ ID No. 20)) bem como parte das mesmas (tBid BH3 (SEQ ID No.138), Bax BH3 (SEQ ID No.139)), proteínas sinalização proteínas (TRAF6 (SEQ ID No. 12), TIFA (SEQ ID No. 13)), subunidade GPCR Ga (GNA12, isoforma mais curta, (SEQ ID No. 30)), nanocorpo (vhhGFP4, (SEQ ID No. 31)) e constructos de fusão do nanocorpos para a degradação da proteína alvo (Slmb- vhhGFP4; (SEQ ID Nos. 32, 33, 34) [87]) (Figuras 13 e 14) bem como GTPases pequenas (Racl Q61E (SEQ ID Nos.: 26 e 137) e RhoA Q63L (SEQ ID No. 27) e domínio homólogo Pleckstrin de Akt humana (SEQ ID No. 35). Além da funcionalidade elaborada das proteínas relacionadas à apoptose (tBid murino, SEQ ID Nos.: 144-147), isto inclui, adicionalmente a liberação das proteínas S. enterica (Figura 22) a partir da regulação do ciclo celular (Mad2 (SEQ ID Nos.: 168-169), CDKl (SEQ ID Nos.: 170-171), INK4A (SEQ ID Nos.: 164-165) e INK4C (SEQ ID Nos.: 166-167)). Embora aquelas proteínas tenham tido sua funcionalidade validada, a possibilidade da secreção dependente de T3SS das proteínas eucarióticas diveras em combinação com a possível remoção do apêndice YopE aberto a novas vistas sobre a ampla aplicação de T3SS na biologia celular.
Translocação in vivo de Bid truncado em embriões de peixe zebra induz a apoptose:
[0176] Uma característica de interesse desta ferramenta bacteriana é o uso potencial nos animais vivos. O peixe zebra em seu estado embriônico pode ser mantido transparente permitindo a coloração fluorescente e microscopia [54, 88, 89]. Poucos indutores na apoptose de peixe zebra foram descritos em detalhes, enquanto o z'BIM é o mais potente [90]. Portanto, nós decidimos clonar z-BIM dentro de nosso sistema. Mesmo se a homologia fraca para BIM humano, nós avaliamos a potência da indução apoptose de YopE1-138-z-BIM (SEQ ID NO:21) em células eptileiais humanos. As células HeLa infectada por 1 hora com a cepa de translocação YopE1-138-z- BIM mostrou sinais claros de morte celular. Nós realizamos então experimentos in-vivo com 2 dias após-fertilização (dpf) de embriões de peixe-zebra, usando um modelo de infecção via micro-injeção de bactéria dentro do cérebro posterior [54]. Após a infecção por 5,5 horas, os peixes foram fixados, permeabilizados e corados pela presença de CASP3 p17. Durante a infecção com a cepa expressando YopE1-138-Myc, a bactéria foram visíveis na região do cérebro posterior (coloração “b”, Figura 8A-8I) mas sem indução em torno da apoptose da bactéria foi detectada (coloração “c”, figura 8A - 8I) . Em contraste, durante a infecção com a cepa de liberação de YopE1-138-z-BIM, um aumenot forte na presença de CASP3 clivado foi observada nas regiões em torno da bactéria (Figura 8A II). A análise da imagem automatizada sobre a intensidade máxima das projeções z confirma que YopE1-138-z-BIM da bactéria de transporte induz a apoptose nas proximidades da célula muito mais do que o controle da bactéria faz (Figura 8B). Isto indica que z-BIM é funcional no peixe-zebra durante o transporte bacteriano. Estes resultados validam adicionalmente o uso de T3SS para liberação da proteína eucariótica nos animais vivos.
Os fosfoproteômicos revelam o impact global das proteínas transportadas sobre a fosforilação da proteína:
[0177] A fosforilação é uma modificação de pós-translação de ampla pulverização que pode tanto ativar ou inativar o processo biológico e é, portanto, um alvo apropriado para estudar os eventos de sinalização [91, 92]. Apesar disto,nenhuma análise em nível de sistema de fosforilação na apoptose está disponível atualmente. Para analisar o impacto do tBid humano liberado dentro das células HeLa, nós utilizamos uma abordagem fosfoproteômica livre de marcação por LC-MS/MS. Em três experimentos independentes, as células foram tanto deixadas não tratadas, infectadas com ΔHOPEMT asd + YopE1-138-Myc ou com ΔHOPEMT asd + YopE1-138-tBid por 30 minutos. As células foram lisadas, seguida pela digestão enzimática enriquecida com o fosfopeptídeos e quantificação e identificação de fosfopeptídeos individuais. Nós comparamos células infectadas com DHOPEMT asd + YopE1-138-Myc para as células infectadas com DHOPEMT asd + YopE1-138-tBid, permitindo a identificação da fosforilação dependente de eventos 363 tyBid. 286 fosfopeptídeos mostrou um auemnto na fosforilação enquanto 77 foram menos fosforilados durante a liberação tBid, correspondente ao 243 proteínas diferentes, que nós definimos como os fosfoproteoma tBid. A base de dados STRING foi utilizada para criar uma rede de interação proteína-proteína do fosfoproteoma tBid [93] (Figura 9A). Adicionalmente, 27 proteínas mostraram ser relacionadas à apoptose mitocrondiral foram adicionadas à rede, construindo um grupo central. Interessantemente, apenas poucas proteínas a partir do fosfoproteoma tBId são conectados a este grupo central indicando que muitas proteínas passam por uma mudança na fosforilação que foi até agora não diretamente ligada às proteínas apoptótica. Para caracterizar as funções biológicas cobertas pelo fosfoproteoma tBid, nós realizamos uma análise ontologia gene usando a ferramenta de anotação funcional da base de dados para anotação, a visualização, e a descoberta integrada (DAVID, http://david.abcc.ncifcrf.gov/) [94, 95]. As funções biológicas identificadas mostram que os processos celulares diversos são afetadas por tBid. Muitas proteínas envolvidas no rearranjo de cromatina e na regulação da transcrição passam por uma mudança na fosforilação (ou seja, CBX3, CBX5, TRIM28, HDAC1). HDAC1 por exemplo, é uma deacetilase histona participando de uma regra na regulação da transcrição. Foi mostrado que HDAC1 pode modular a atividade de transcrição de NF-kB, uma proteína também participa na apoptose. Nós identificamos adicionalmente um grupo de proteínas envolvida no processamento do RNA que previamente demosntrou participar de uma regra importante na regulação da apoptose [96]. HNRPK, por exemplo, media uma resposta p53/TP53 ao dano do DNA e é necessário para a indução da apoptose [97]. Além disso, a fosforilação das proteínas envolvidas na tradução da proteína também é afetada. Vários fatores de iniciação eucariótica (ou seja, EIF4E2, EIF4B, EIF3A, EIF4G2) passam por uma mudança na fosforilação, que está em linha com a observação que a síntese total da proteína é diminuída nas células apoptóticas. Interessantemente, a fosforilação de muitas proteíns envolvidas no remodelamento do citoesqueleto (por exemplo, PXN, MAP1B9 são alteradas durante a liberação tBid). Isto está em concordância com a observação de que a morfologia de células mudando dramaticamente durante a liberação de tBid (Figura 9B). A redução das células e a perda de contato é refletida pelo fato de que nós observamos a fosforilação da das proteínas relacionadas à adesão do tipo ZO2 e Paxilina. Similarmente, a redução do núcleo é acompanhada pela fosforilação das proteínas laminar tipo LaminA/C e Lamin B1. Em geral, a liberação de tBID induz uma resposta de apoptose rápida também indicada pela ruptura da integridade mitocondrial (figura 9B). Nós observamos que a apoptose induzida por tBid afeta centenas de eventos de fosforilação participando de diversos processos celulares. Enquanto muitas proteínas identificadas foram relacionadas à apoptose, apenas poucos foram conhecidas por serem fosforiladas durante a indução da apoptose. A abordagem fosfoproteômica provê, assim, uma fonte útil para estudos adicionais sobre a apoptose. Referências bibliográficas 1. Gibson, T.J., M. Seiler, and R.A. Veitia (2013) The transience of transient overexpression. Nat Methods. 10: 71521. 2. Inoue, T., W.D. Heo, J.S. Grimley, T.J. Wandless, and T. Meyer (2005) An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat Methods. 2: 415-8. 3. 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Claims (6)

1. Vetor compreendendo um sinal de liberação de uma proteína efetora T3SS bacteriana, sendo o vetor caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir do grupo consistindo de pBad_Si_1, pBad_Si_2, pSi_266, pSi_267, pSi_268 e pSi_269, e compreender na direção 5’ para 3’: - um promotor, sendo o promotor selecionado a partir do grupo consistindo do promotor YopE, promotor SycE; promotor SopE, promotor InvB, e promotor SteA; - uma primeira sequência de DNA codificante de um sinal de liberação de uma proteína efetora T3SS bacteriana, operavelmente ligada ao citado promotor, sendo que a proteína efetora T3SS bacteriana é selecionada do grupo consistindo de SopE, SteA, e YopE, sendo que sopE e SteA são originários de Salmonella entérica, e YopE é originário de Yersinia enterocolitica; - uma segunda sequência de DNA codificante de uma proteína heteróloga fundida à estrutura da extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA , sendo que a proteína heteróloga é selecionada do grupo consistindo de proteínas envolvidas na apoptose ou regulação da apoptose, reguladores do cilco celular, proteínas de repetição anquirina, proteínas repórteres, GTPase pequenas, proteínas relacionaas ao GPCR, constructos de fusão de nanocorpos, efetores T3SS bacterianos, efetores bacterianos T4SS e proteínas virais, sendo que a proteína heteróloga é selecionada a partir do grupo de proteínas representado nas SEQ ID Nos: 4-43, 135139, 144-147, 158-171 e 194-196; e opcionalmente, - uma terceira sequência de DNA codificante de um sítio de clivagem da protease, sendo que a terceira sequência de DNA está localizada entre a extremidade 3’ da referida primeira sequência de DNA e a extremidade 5’ da referida segunda sequência de DNA, sendo que a sequência codificante de um sítio de clivagem da protease é compreendido pela sequência representada na SEQ ID NO: 41.
2. Cepa bacteriana gram-negativa recombinante, sendo a referida cepa bacteriana gram-negativa transformada com o vetor definido na reivindicação 1, dita cepa bacteriana gram- negativa recombinante sendo caracterizada pelo fato de ser uma Y. enterocolitica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T e o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana codificado pela primeira sequência de DNA compreendendo a proteína efetora YopE de Yersinia enterocolitica ou um fragmento N-terminal da mesma, sendo que o fragmento N-terminal inclui pelo menos os primeiros 20 aminoácidos da proteína efetora YopE, ou sendo que a cepa bacteriana gram-negativa recombinante é uma Salmonella enterica Serovar Typimurium SL1344 e o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana codificado pela primeira sequência de DNA compreende o SopE ou a proteína efetora SteA ou um fragmento N-terminal das mesmas; sendo que o fragmento N-terminal inclui pelo menos os primeiros 20 aminoácidos do SopE ou a proteína efetora SteA.
3. Cepa bacteriana gram-negativa recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de a referida cepa bacteriana gram-negativa recombinante ser deficiente na produção de pelo menos uma proteína T3SS efetora.
4. Cepa bacteriana gram-negativa recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3, caracterizada pelo fato de a cepa bacteriana gram-negativa recombinante ser Y. enterocolitica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T e sendo que a referida cepa Yersinia é uma cepa alelo-selvagem ou é uma cepa deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora T3SS e sendo que o sinal de liberação a partir da proteína efetora T3SS bacteriana compreende os 138 aminoácidos do N- terminal da proteína efetora YopE de Y. enterocolitica ou, sendo que a cepa bacteriana gram-negativa é Salmonella entérica Serovar Typhimurium SL1344 e sendo que a referida cepa de Salmonella é alelo-selvagem ou cepa deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora T3SS e sendo que o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacterina compreende a proteína efetora SteA de S. enterica ou os 81 ou 105 aminoácidos do N-terminal da proteína efetora SopE de S. enterica.
5. Cepa bacteriana gram-negativa recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, caracterizada pelo fato de a cepa bacteriana gram-negativa ser deficiente para produzir um aminoácido essencial para crescimento.
6. Cepa bacteriana gram-negativa recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, caracterizada pelo fato de a cepa bacteriana gram-negativa ser deficiente para produzir a ligação das proteínas de adesão à superfície celular eucariótica ou à matriz extracelular.
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