RS59583B1 - Isporuka proteina zasnovana na bakterijama - Google Patents

Isporuka proteina zasnovana na bakterijama

Info

Publication number
RS59583B1
RS59583B1 RS20191450A RSP20191450A RS59583B1 RS 59583 B1 RS59583 B1 RS 59583B1 RS 20191450 A RS20191450 A RS 20191450A RS P20191450 A RSP20191450 A RS P20191450A RS 59583 B1 RS59583 B1 RS 59583B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
protein
proteins
gram
negative bacterial
bacterial strain
Prior art date
Application number
RS20191450A
Other languages
English (en)
Inventor
Cécile Arrieumerlou
Simon Ittig
Original Assignee
Univ Basel
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Basel filed Critical Univ Basel
Publication of RS59583B1 publication Critical patent/RS59583B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/245—Escherichia (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/255—Salmonella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis pronalaska
Oblast tehnike na koju se pronalazak odnosi
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantne Gram-negativne bakterijske sojeve i njihovu upotrebu za isporuku heterolognih proteina u eukariotske ćelije.
Poznato stanje tehnike
[0002] Tehnike tranzientne transfekcije su primenjivane u istraživanjima ćelijske biologije tokom mnogo godina u cilju ispitivanja funkcija proteina. Uobičajeni rezultat ovih postupaka je masivna i prekomerna prezentacija ispitivanih proteina, što može voditi prekomerno pojednostavljenim modelima prenosa signala [1]. Za proteine koji učestvuju u kontroli kratkotrajnih signalnih procesa, protein od interesa je prisutan mnogo duže u vidu događaja prenosa signala koji on kontroliše [2]. Štaviše, tranzientna prekomerna ekspresija zasnovana na transfekciji sa DNK, vodi heterogenoj i nesinhronizovanoj ćelijskoj populaciji, što komplikuje funkcionalne studije i ometa pristupe tipa -omika. Pored navedenog, povećanje obima ovakvih testova na veće skale je veoma skupo. Pojedine od prethodno navedenih stavki su prevaziđene postojećim tehnikama poput mikroinjeciranja ili proteofekcije prečišćenih proteina, strategijom inducibilne translokacije zarad brzog ciljanog usmeravanja malih GTPaza nastalih sa plazmida na ćelijsku membranu [2] ili dodavanjem prečišćenih proteina fuzionisanih sa bakterijskim toksinima koji su permeabilni za ćelije [3]. Ipak, navedene tehnike su vremenski zahtevne i zametne i, koliko je nama poznato, nijedna ne ispunjava sve navedene kriterijume.
[0003] Bakterije su razvile različite mehanizme za direktno injeciranje proteina u cilјne ćelije [4]. Sistem sekrecije tipa III (T3SS), koji koriste bakterije poput Yersinia, Shigella i Salmonella [5], funkcioniše poput nano-šprica koji injecira takozvane bakterijske efektorske proteine u ćelije domaćine. Bakterijski proteini koji će biti izlučeni preko T3SS-a, nazvani efektorima, sadrže kratki signal za sekreciju na N-kraju [6]. Unutar bakterija, pojedini efektori se vezuju za šaperone. Šaperoni mogu zamaskirati toksične domene [7], oni doprinose izlaganju signala za sekreciju [8, 9] i održavaju supstrate u konformaciji koja je pogodna za sekreciju [10] čime se olakšava izlučivanje. Nakon indukcije sekrecije, ATPaza koja se nalazi u blizini T3SS-a uklanja šaperone [11] i efektori putuju neuvijeni ili delimično uvijeni kroz iglicu [10], da bi se ponovo uvili u citoplazmi domaćina.
[0004] T3S je prethodno korišćen za isporuku hibridnih peptida i proteina u cilјne ćelije. Heterologni bakterijski T3SS efektori su isporučivani u slučajevima kada je ispitivanim bakterijama bilo teško pristupiti na genetički način (kao što je slučaj sa Chlamidia trachomatis; [12]). Često su i reporterski proteini bili fuzionisani sa mogućim T3SS signalima za sekreciju da bi se ispitali zatevi isporuke proteina koja zavisi od T3SS, kao što je isporuka adenilat ciklaze iz Bordetella pertussis [13], mišjeg DHFR-a [10] ili obeleživača koji se mogu fosforilisati [14]. Isporuka peptida je uglavnom izvođena u cilju vakcinacije. Vakcinacija podrazumeva virusne epitope [15, 16], bakterijske epitope (listeriolizin O, [17]), kao i peptide koji predstavlјaju epitope humanih kancerskih ćelija [18]. U nekoliko slučajeva, funkcionalni eukariotski proteini su bili isporučivani da bi se modulisala ćelija domaćin, kao što je rađeno sa nanoantitelima [19], jedarnim proteinima (Cre-rekombinazom, MyoD) [20, 21] ili 1110 i IL1ra [22]. Nijedan od prethodno navedenih sistema ne omogućava isporuku jednog proteina, pošto u svakom slučaju i dalje bivaju kodirani jedan ili više endogenih efektorskih proteina. Štaviše, vektori koji su upotrebljavani nisu bili dizajnirani na način koji bi omogućio jednostavno kloniranje drugih fragmenata DNK koji kodiraju proteine izbora, što je sprečilo široku primenu sistema. WO2008/019183 A2 opisuje upotrebu SL1344 i SptP iz Salmonella tiphimurium kao signala za isporuku u cilju ekspresije proteina svile. Proteini svile koje je bilo potrebno esprimirati su optimizovani za ekspresiju u bakterijama. US2008/0187520 A1 opisuje upotrebu Pseudomonas aeruginosa i ExoS kao signala za isporuku i ekspresiju i sekreciju proteina. Nivo dobijenih injeciranih proteina je uporediv sa endogenim nivoom ovog proteina.
Shodno navedenom, jeftin i jednostavan postupak koji bi omogućio isporuku proteina od interesa različitog obima, brzu, sinhronizovanu, homogenu i koja bi se mogla fino podešavati, bio bi od velike koristi za mnoge ćelijske biologe.
Kratko izlaganje suštine pronalaska
[0005] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na rekombinantne Gram-negativne bakterijske sojeve i njihovu upotrebu za isporuku heterolognih proteina u eukariotske ćelije. Predmetni pronalazak obezbeđuje Gram-negativne bakterijske sojeve i njihovu upotrebu koja omogućava translokaciju raznih efektora tipa III, ali i efektora tipa IV, virusnih proteina i što je najvažnije funkcionalnih eukariotskih proteina. Obezbeđeni su i načini praćenja isporuke fluorescencijom, radi praćenja relokalizacije u jedro, a naročito radi uklanjanje dodatnog bakterijskog sadržaja nakon isporuke ćeliji domaćinu. Navedeno po prvi put omogućava isporuku gotovo nativnih proteina u eukariotske ćelije upotrebom samo T3SS. Rezultat primene predstavljenog sistema zasnovanog na T3SS-u je isporuka proteina od interesa koja može biti različitog obima, brza, sinhronizovana, homogena i koja se može fino podešavati. Sistem isporuke predmetnog pronalaska je pogodan za injeciranje eukariotskih proteina u žive životinje i može biti upotrebljen u terapijske svrhe.
[0006] Prema jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj koji je transformisan vektorom koji sadrži, u smeru od 5' ka 3':
promotor;
prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina, operativno povezanu sa navedenim promotorom, pri čemu je bakterijski T3SS efektorski protein izabran iz grupe koja se sastoji od SopE, SteA i YopE;
drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein, fuzionisanu sa 3' krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja, pri čemu je heterologni protein izabran iz grupe koju čine proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze, regulatori ćelijskog ciklusa, proteini sa ankirinskim ponovcima, reporterski proteini, male GTPaze, proteini srodni GPCR, fuzioni konstrukti nano-antitela, bakterijski T3SS efektori, bakterijski T4SS efektori i virusni proteini; i opciono, treću DNK sekvencu koja kodira mesto cepanja za proteaze, pri čemu je treća DNK sekvenca smeštena između 3’ kraja navedene prve DNK sekvence i 5’ kraja navedene druge DNK sekvence, a pri čemu je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj Yersinia soj i signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina koga kodira prva DNK sekvenca sadrži YopE efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment, gde N-terminalni fragment uključuje najmanje prvih 20 aminokiselina YopE efektorskog proteina, ili pri čemu je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj Salmonella soj i signal za isporuku bakterijskog efektorskog proteina T3SS kodiran prvom DNK sekvencom sadrži SopE ili SteA efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment, pri čemu N-terminalni fragment uključuje najmanje prvih 20 aminokiselina bakterijskog SopE ili SteA efektorskog proteina.
[0007] Prema dodatnom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantni Gram-negativni bakterijski soj, pri čemu je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj Yersinia soj i pri čemu je navedeni Yersinia soj divlјeg tipa ili je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog T3SS efektorskog proteina i transformisan je sa vektorom koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3':
promotor;
prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina, pri čemu signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina sadrži 138 aminokiselina N-kraja YopE efektorskog proteina iz Y. enterocolitica, i pri čemu je sekvenca operativno povezana sa navedenim promotorom; i
drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein, fuzionisanu sa 3’ krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja, pri čemu je heterologni protein izabran iz grupe koju čine proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze, regulatori ćelijskog ciklusa, proteini sa ankirinskim ponovcima, reporterski proteini, malih GTPaza, proteina srodnih GCR, fuzionih konstrukata nano-antitela, bakterijskih T3SS efektora, bakterijskih T4SS efektora i virusnih proteina.
[0008] Prema daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantni Gram-negativni bakterijski soj, pri čemu je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj Salmonella soj i pri čemu je navedeni Salmonella soj divlјeg tipa ili je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog T3SS efektorskog proteina i transformisan je sa vektorom koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3':
promotor;
prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina, pri čemu signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina sadrži SteA efektorski protein S. enterica ili 81 ili 105 aminokiselina N-kraja SopE efektorskog proteina iz S. enterica, i pri čemu je sekvenca operativno povezana sa navedenim promotorom; i
drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein, fuzionisanu sa 3’ krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja, pri čemu je heterologni protein izabran iz grupe koju čine proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze, regulatori ćelijskog ciklusa, proteini sa ankirinskim ponovcima, reporterski proteini, malih GTPaza, proteina srodnih GCR, fuzionih konstrukata nano-antitela, bakterijskih T3SS efektora, bakterijski T4SS efektora i virusnih proteina.
[0009] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na vektor koji sadrži u smeru od 5’ ka 3':
promotor;
prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina, operativno povezanu sa navedenim promotorom, pri čemu je bakterijski T3SS efektorski protein izabran iz grupe koja se sastoji od SopE, SteA i YopE;
drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein, fuzionisanu sa 3’ krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja, pri čemu je heterologni protein izabran iz grupe koju čine proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze, regulatori ćelijskog ciklusa, proteini sa ankirinskim ponovcima, reporterski proteini, malih GTPaza, proteina srodnih GCR, fuzionih konstrukata nano-antitela, bakterijskih T3SS efektora, bakterijskih T4SS efektora i virusnih proteina; i treću DNK sekvencu koja kodira mesto cepanja za proteaze, pri čemu je treća DNK sekvenca smeštena između 3’ kraja navedene prve DNK sekvence i 5’ kraja navedene druge DNK sekvence.
[0010] Predmetni pronalazak se dalјe odnosi na postupak isporuke heterolognog proteina u eukariotsku ćeliju koji obuhvata sledeće korake:
i) kultivisanje Gram-negativnog bakterijskog soja ; i
ii) dovođenje eukariotske ćelije u kontakt sa Gram-negativnim bakterijskim sojem i), pri čemu je fuzioni protein, koji sadrži signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina i heterologni protein, eksprimiran od strane Gram-negativnog bakterijskog soja i premešta se u
eukariotsku ćeliju.
[0011] Predmetni pronalazak se dalјe odnosi na postupak za isporuku heterolognog proteina u eukariotsku ćeliju koji obuhvata sledeće korake:
i) kultivisanje Gram-negativnog bakterijskog soja ; i
ii) dovođenje eukariotske ćelije u kontakt sa Gram-negativnim bakterijskim sojem i), pri čemu je fuzioni protein, koji sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina i heterologni protein, eksprimiran od strane Gram-negativnog bakterijskog soja i premešta se u eukariotsku ćeliju; i
iii) cepanje fuzionog proteina tako da se heterologni protein odvaja od signala za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina.
Predmetni pronalazak se dalјe odnosi na postupak prečišćavanja heterolognog proteina, postupak koji obuhvata kultivisanje Gram-negativnog bakterijskog soja tako da se fuzioni protein, koji sadrži signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina i heterologni protein, eksprimira i izlučuje u supernatant kulture ćelija.
[0012] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na biblioteku Gram-negativnih bakterijskih sojeva, pri čemu je heterologni protein koji je kodiran drugom DNK sekvencom ekspresionog vektora Gram-negativnih bakterijskih sojeva, humani ili mišji protein i pri čemu je svaki humani ili mišji protein eksprimiran od strane Gram-negativnog bakterijskog soja sa različitom aminokiselinskom sekvencom.
Kratak opis nacrta
[0013]
Sl.1: Karakterizacija T3SS isporuke proteina. (A) Šematski prikaz T3SS zavisne sekrecije proteina u okolni medijum (in vitro sekrecija) (leva strana) ili u eukariotske ćelije (desna strana). I: prikazuje sistem sekrecije tipa 3. II ukazuje na proteine koji su izlučeni u okolni medijum, III proteini koji su traslocirani kroz memebranu u citosol eukariotskih ćelija (VII). VI prikazuje pružanje dve bakterijske membrane u koje je ubačen T3SS i bakterijski citosol ispod. IV je fuzioni protein koji je vezan za YopE1-138N-terminalni fragment (V) (B) In-vitro sekrecija I: Y.enterocolitica E40 divlјeg tipa, II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd ili III: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBadSi_2, utvrđena imunoblot analizom ukupnih bakterijskih lizata (IV) i precipitiranih supernatanata kulture ćelija (V) upotrebom anti-YopE antitela.
Sl. 2: Karakterizacija T3SS isporuke proteina u epitelne ćelije. (A) Anti-Myc imunofluorescentno bojenje HeLa ćelija inficiranih sa MOI od 100 tokom jednog sata sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd ili II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2. (B) Kvantifikacija intenziteta anti-Myc imunofluorescentnog bojenja (A) unutar HeLa ćelija. Podaci su objedinjeni za n = 20 mesta, veličine grešaka predstavljaju standardne greške srednjih vrednosti. I: neinficirane ćelije, II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd ili III: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2. Na y osi je predstavljen intenzitet anti-Myc bojenja [proizvolјne jedinice, a.u. od engl. arbitrary unit], dok je na x osi predstavljeno vreme infekcije u minutima (C) Kvantifikacija intenziteta anti-Myc imunofluorescentnog bojenja unutar ćelija. HeLa ćelije su bile inficirane sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2 tokom 1 sata sa MOI naznačenim na x-osi. Podaci su objedinjeni za n = 20 mesta, veličine grešaka predstavljaju standardne greške srednjih vrednosti. Na y osi je predstavljen intenzitet anti-Myc bojenja [a.u.].
Sl. 3: Modifikacije isporuke proteina zasnovane na T3SS-u omogućavaju jedarnu lokalizaciju YopE1-138fuzionog proteina (EGFP). EGFP signal u HeLa ćelijama inficiranim sa plazmidima koji su sadržavali I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd ili II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd ΔyopB III: YopE1-138-EGFP ili IV: YopE1-138-EGFP-NLS - MOI je iznosio 100. EGFP signal je prikazan pod "a", dok su radi poređenja lokalizacije, obojena jedra prikazana pod "b".
Sl. 4: Modifikacije isporuke proteina zasnovane na T3SS-u omogućavaju uklanjanje dodatnog YopE1-138sadržaja. HeLa ćelije su inficirane sa dva različita soja Y.enterocolitica u isto vreme, što je postignuto jedostavnim mešanjem dve bakterijske suspenzije. Jedan soj je za isporuku TEV proteaze fuzionisane sa YopE1-138, dok je drugi soj isporučio protein od interesa fuzionisan sa YopE1-138preko linkera koji je sadržavao dvostruko mesto cepanja za TEV proteaze. Nakon isporuke proteina u eukariotsku ćeliju, TEV proteaza će isecati dodatni YopE1-138sadržaj sa proteina od interesa (A) Digitoninom lizirane HeLa ćelije koje nisu bile inficirane (II) ili nakon infekcije (MOI od 100) tokom 2 sata sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i III: pBadSi_2, IV: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C, V: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C i dalјe tretman preko noći sa prečišćenom TEV proteazom i VI: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C i drugim sojem YopE1-138-TEV, a koje su analizirane imunoblot postupkom sa anti-INK4C (prikazano pod "a") na prisustvo YopE1-138- 2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C ili njegovog oblika nastalog cepanjem, Flag-INK4C. Kao kontrola imunoblot analize za nanetu količinu proteina, korišćen je aktin (prikazano pod "b"). U jednom slučaju (V) lizirane ćelije su inkubirane preko noći sa prečišćenom TEV proteazom.
(B) Kvantifikacija intenziteta anti-INK4C bojenja iz (A) koji je normalizovan sa aktinom (prikazano kao [a.u.] na y osi), na visini za YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C pune dužine, pri čemu je uzorku IV dodeljena vrednost od 100%. I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i IV: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C, V: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C i dalјe tretman preko noći sa prečišćenom TEV proteazom i VI: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C i drugi soj YopE1-138-TEV. Podaci su objedinjeni za n = 2 nezavisna eksperimenta, vrednosti grešaka predstavljaju standardne greške srednjih vrednosti (C) Digitoninom lizirane HeLa ćelije koje nisu bile inficirane (II) ili nakon infekcije (MOI od 100) u trajanju od 2 sata sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i III: pBadSi_2, IV: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-ET1-Myc, V: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-ET1-Myc i dalјe tretman preko noći sa prečišćenom TEV proteazom i VI: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-ET1-Myc i drugi soj YopE1-138-TEV su analizirani imunoblot postupkom sa anti-Myc (prikazano pod "a") na prisustvo YopE1-138- 2x mesto cepanja za TEV-ET1-Myc ili njegovog oblika nastalog cepanjem, ET1-Myc. Kao kontrola imunoblot analize za nanetu količinu proteina, korišćen je aktin (prikazano pod "b"). U jednom slučaju (V) lizirane ćelije su inkubirane preko noći sa prečišćenom TEV proteazom.
Sl. 5: Isporuka bakterijskih efektorskih proteina u eukariotske ćelije (A) HeLa ćelije su bile inficirane sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd koji je sadržavao II: pBad_Si2 ili III: YopE1-138-SopE -MOI je iznosio 100, a tokom vremena naznačenog iznad slika (2, 10 ili 60 minuta). Nakon fiksacije, u ćelijama je obojen aktinski citoskelet (B) i to u HeLa ćelijama koje su ostavljene neinficiranima (II) ili su inficirane sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd koji je sadržavao III: YopE1-138-SopE-Myc i u pojedinim slučajevima, ćelijama koinficiranim sa IV: YopE1-138-SptP pri MOI koji je naznačen ispod naziva soja (MOI 50; MOI50: MOI50 ili MOI50: MOI100) u toku 1 h. Nakon fiksacije, u ćelijama je obojen aktinski citoskelet (prikazano pod "a"), dok je prisustvo YopE1-138-SopE-Myc fuzionog proteina praćeno anti-Myc bojenjem (prikazano pod "b").
Sl. 6: Isporuka bakterijskih efektorskih proteina u eukariotske ćelije (A) Imunoblot analiza fosfop38 ("a"), ukupnog p38 ("b") i aktina ("c") u HeLa ćelijama koje su ostavljene netretiranima (II) ili su inficirane tokom 75 min sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd koji je sadržavao III: pBad_Si2 ili IV: YopE1-138-OspF - MOI je iznosio 100. Ćelije su stimulisane sa TNFa tokom poslednjih 30 minuta infekcije, kao što je naznačeno (+ označava dodavanje TNFα, - predstavlјa odsustvo tretmana sa TNFα) (B) Imunoblot analiza fosfo-Akt T308 ("a") i S473 ("b") i aktina ("c") u HeLa ćelijama koje su ostavljene netretiranima (II) ili su inficirane tokom 22,5 ili 45 min (naznačeno ispod blotova) sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd koji je sadržavao III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-SopE ili V: YopE1-138-SopB - MOI je iznosio 100 (C) nivo cAMP-a (u fmol/bunariću, prikazano na y osi ) u HeLa ćelijama koje su ostavljene netretiranima (II) ili su inficirane tokom 2,5 h sa V: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-BepA, VI: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-BepAE305-kraj, VII: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-BepGBidili VIII: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2 - MOI je iznosio 100. Toksin kolere (CT) je dodavan uzorcima tokom 1 sata kao pozitivna kontrola II (1 µg/ml), III (25 µg/ml) ili IV (50 µg/ml). Podaci su objedinjeni za n = 3 nezavisna eksperimenta, greške predstavljaju standarne greške srednjih vrednosti. Statistička analiza je urađena upotrebom neuparenog dvostranog t-testa (ns ukazuje na odsustvo značajne promene, ** označava p vrednost < 0,01, *** označava p vrednost < 0,001).
Sl.7: Isporuka humanog tBid u eukariotske ćelije izaziva masovnu apoptozu. (A) Imunoblot analiza peptida p17 koji nastaje cepanjem Kaspaze 3 ("a"), i aktina ("b") u HeLa ćelijama koje su ostavljene netretiranima (II) ili su inficirane tokom 60 min sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd koji je sadržavao III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-Bid ili V: YopE1-138-t-Bid - MOI je iznosio 100. U pojedinim slučajevima, ćelije su tretirane sa VI: 0,5 µM Staurosporinom ili VII: 1 µM Staurosporinom (B) Digitoninom lizirane HeLa ćelije koje su ostavlјene netretiranima (II) ili su inficirane tokom jednog sata sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd koji je sadržavao III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-Bid ili V: YopE1-138-t-Bid (MOI je iznosio 100), analizirane su imunoblot postupkom sa anti-Bid što je omogućilo poređenje endogenih nivoa Bid (označenih sa Z) sa nivoima translociranih YopE1-138-Bid (označenih sa X) ili YopE1-138-tBid (označenih sa Y). Kao kontrola imunoblot analize za nanetu količinu proteina je korišćen aktin (prikazano pod "b"). U pojedinim slučajevima, ćelije su tretirane sa VI: 0,5 µM Staurosporinom ili VII: 1 µM Staurosporinom (C) HeLa ćelije su ostavljene netretiranima (I) ili su inficirane sa MOI od 100 u toku 1h sa II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2, III: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-Bid, IV: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-tBid. U pojedinim slučajevima, ćelije su tretirane sa V: 0,5 µM Staurosporinom ili VI: 1 µM Staurosporinom. Nakon fiksacije, u ćelijama je obojen aktinski cistoskelet (sivo).
Sl. 8: Isporuka BIM-a iz zebra-ribica, zavisna od T3SS, indukuje apoptozu u embrionima zebraribica. (A) 2 dana nakon oplodnje, embrioni zebra-ribica su bili inficirani sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si1 kontrolnim sojem koji je eksprimirao EGFP (I) ili zBIM translocirajućim sojem (II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-zBIM), injeciranjem oko 400 bakterija u zadnji deo mozga. Nakon 5,5 h, embrioni su fiksirani, obojeni na aktiviranu Kaspazu 3 (peptid cepanja Kaspaze 3, p17; prikazano pog "c") i analizirani na prisustvo bakterija (EGFP signal, prikazano pod "b"). Za fluorescentne slike su prikazane z projekcije maksimalnog intenziteta. Svetlosna z projekcija je prikazana pod "a" (B) Automatizovana analiza slika z projekcija maksimalnog intenziteta koje su dobijene preklapanjem snimljenih slika optičkih preseka (A). Ukratko, bakterije su detektovane upotrebom GFP kanala. Oko svake površine na kojoj je bilo bakterija se obrazovao krug prečnika 10 piksela. Područja koja su se preklapala su podjednako podeljena između povezanih članova. U onim oblastima koje su blisko okruživale bakterije, intenzitet obojenosti na p17 Kaspaze 3 je izmeren i unet na grafik na y osu (kao [a.u.]). Statistička analiza je urađena upotrebom Mann-Whitney testa (*** ukazuje na p vrednost < 0,001). Podaci su objedinjeni za n = 14 za Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si1 kontrolni soj (I) ili n = 19 za II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-zBIM inficirane životinje, pri čemu veličine grešaka predstavljaju standardne greške srednjih vrednosti.
Sl. 9: Fosfoproteom zavisan od tBiD: HeLa ćelije su inficirane tokom 30 minuta sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-t-Bid pri MOI od 100 i sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2 kao kontrolom. (A) Grafički prikaz tBID fosfoproteoma. Proteini koji sadrže fosfopeptide koji su značajno regulisani na način koji je zavisan od tBid (sivo) (q-vrednost <0,01), kao i poznati proteini povezani sa apopotozom (tamno sivo) predstavlјeni su u STRING mreži poznatih i predviđenih proteinproteinskih interakcija (visoka pouzdanost, vrednost 0,7). Predstavljeni su samo proteini sa najmanje jednom vezom u STRING mreži. (B) Konfokalne slike HeLa ćelija inficiranih bilo sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2 (I) ili Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-t-Bid (II) ukazale su na indukciju apoptotskog fenotipa nakon isporuke tBid. Jedra ćelija su obojena sa Hoechst bojom ("a"), F-aktin je obojen faloidinom ("b"), za tubulin je upotrebljeno anti-tubulinsko antitelo ("c"), dok su mitohondrije obeležene sa mitotrakerom ("d)". Skala označava 40 µm.
Sl. 10: Opis načina isporuke zasnovanog na sekreciji tipa III. (A) Vektorske mape plazmida za kloniranje pBad_Si1 i pBad_Si2 koji su upotrebljavani za generisanje fuzionih konstrukata sa YopE1-138. Šaperon SycE i YopE1-138-fuzija su pod regulacijom nativnog promotora Y.enterocolitica. Dva plazmida se razlikuju samo po prisustvu EGFP koji je inducibilan dejstvom arabinoze i prisutan je na Bad_Si1 (B) Višestruko mesto kloniranja odmah nakon yopE1-138fragmenta na pBad_Si1 i pBad_Si2 plazmidima.
Sl. 11: Karakterizacija T3SS isporuke proteina u različite ćelijske linije. Anti-Myc imunofluorescentno bojenje Swiss 3T3 fibroblasta ("a"), Jurkat ćelija ("b") i HUVEC ćelija ("c") koje su ostavljene netretiranima (II) ili su inficirane sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2 (I) pri MOI koji su naznačeni iznad slika (MOI 25, 50, 100, 200 i 400 za HUVEC) tokom 1 h.
Sl. 12: Isporuke bakterijskih efektorskih proteina koja je zavisna od T3SS u eukariotsku ćeliju.
Digitoninom lizirane HeLa ćelije nakon infekcije sa MOI od 100, tokom vremena naznačenih iznad imunoblotova (0, 5, 15, 10, 60 i 120 minuta), sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd ΔyopB YopE1-138-SopE-Myc (I) ili Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-SopE-Myc (II), analizirane su na Myc imunoblot postupkom. Veličina koja odgovara YopE1-138-SopE-Myc je obeležena sa "a", dok je veličina endogenog c-Myc proteina obeležena sa "b".
Sl. 13 i 14: Sekrecija zavisna od T3SS-a za razne druge proteine, u supernatant kulture.
Eksperiment in vitro sekrecije za I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138koji je fuzionisan sa proteinom kao što je naznačeno. Sadržaj protiena ukupnih bakterijskih lizata ("A") i u istaloženim supernatantima kulture ("B") je analiziran imunoblot postupkom upotrebom anti-YopE antitela. Brojevi napisani na odgovarajućoj visini označavaju molekulsku težinu u kDa.
Slike 15A do M: Sojevi Y.enterocolitica i S. enterica upotrebljeni u ovoj studiji. Lista sojeva Y.enterocolitica i S. enterica upotrebljenih u ovoj studiji obezbeđuje informacije o matičnim sojevima, plazmidima i proteinima za isporuku zavisnu od T3SS-a koji su kodirani na odgovarajućim plazmidima. Dodatno su obezbeđene informacije o oligonukleotidima koji su upotrebljeni za konstruisanje oddgovarajućih plazmida, okosnice plazmida i za rezistenciju na antibiotike.
Sl. 16: Isporuka mišjeg tBid, mišjeg B3 BH3 i mišjeg Bax BH3 u B16F10 ćelije izaziva masovnu apoptozu. B16F10 ćelije koje nisu bile inficirane (I) ili nakon infekcije (MOI od 50) tokom 2,5 h sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i II: pBadSi_2, III: YopE1-138-Y.enterocolitica sa mišjim tBid optimizovanih kodona, IV: YopE1-138-Y.enterocolitica sa mišjim Bid BH3 optimizovanih kodona ili V: YopE1-138-Y.enterocolitica sa mišjim Bax BH3 optimizovanih kodona. Nakon fiksacije, u ćelijama su obojeni aktinski citoskelet i jedra (oba sivo).
Sl. 17: Isporuka mišjeg tBid, mišjeg Bid BH3 i mišjeg Bax BH3 u D2A1ćelije izaziva masovnu apoptozu. D2A1 ćelije koje nisu bile inficirane (I) ili nakon infekcije (MOI od 50) tokom 2,5 h sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i II: pBadSi_2, III: YopE1-138-Y.enterocolitica sa mišjim tBid optimizovanih kodona, IV: YopE1-138-Y.enterocolitica sa mišjim Bid BH3 optimizovanih kodona ili V: YopE1-138-Y enterocolitica sa mišjim Bax BH3 optimizovanih kodona. Nakon fiksacije, u ćelijama su obojeni aktinski citoskelet i jedra (oba sivo).
Sl. 18: Isporuka mišjeg tBid, mišjeg Bid BH3 i mišjeg Bax BH3 u HeLa ćelije izaziva masovnu apoptozu. HeLa ćelije koje nisu bile inficirane (I) ili nakon infekcije (MOI od 50) tokom 2,5 h sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i II: pBadSi_2, III: YopE1-138-Y.enterocolitica mišji tBid optimizovanih kodona, IV: YopE1-138-Y.enterocolitica sa mišjim Bid BH3 optimizovanih kodona ili V: YopE1-138-Y.enterocolitica sa mišjim Bax BH3 optimizovanih kodona. Nakon fiksacije, u ćelijama su obojeni aktinski citoskelet i jedra (oba sivo).
Sl. 19: Isporuka mišjeg tBid, mišjeg Bid BH3 i mišjeg Bax BH3 u 4T1ćelije izaziva masovnu apoptozu. 4T1 ćelije koje nisu bile inficirane (I) ili nakon infekcije (MOI od 50) tokom 2,5 h sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i II: pBadSi_2, III: YopE1-138-Y.enterocolitica sa mišjim tBid optimizovanih kodona, IV: YopE1-138-Y.enterocolitica sa mišjim Bid BH3 optimizovanih kodona ili V: YopE1-138-I enterocolitica sa mišjim Bax BH3 optimizovanih kodona. Nakon fiksacije, u ćelijama su obojeni aktinski citoskelet i jedra (oba sivo).
Sl. 20: Isporuka mišjeg tBid sa S. enterica gajenom pod SPI-1 T3SS indukujućim uslovima u eukariotske ćelije indukuje apoptozu. Imunoblot analiza p17 dobijenog cepanjem Kaspaze 3 u HeLa ćelijama koje su ostavljene netretiranima (I) ili su inficirane tokom 4h sa III: S. enterica aroA koja je sadržavala IV: SteA1-20-t-Bid, V: SteAFL-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid ili VII: SopE1-105-t-Bid sa MOI od 100. Za ovaj eksperiment su svi S. enterica aroA sojevi gajeni pod SPI-1 T3SS uslovima indukcije. U pojedinim slučajevima, ćelije su tretirane sa II: 1 µM Staurosporinom. Napisani brojevi označavaju molekulsku težinu u kDa, na odgovarajućoj visini.
Sl. 21: Isporuka mišjeg tBid u eukariotske ćelije putem S. enterica koja je gajena pod SPI-2 T3SS indukujućim uslovima, indukuje apoptozu. Imunoblot analiza p17 dobijenog cepanjem Kaspaze 3 u HeLa ćelijama ostavljenim netretiranima (I) ili inficiranima tokom 4h sa III: S. enterica aroA koja je sadržavala IV: SteA1-20-t-Bid, V: SteAFL-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid ili VII: SopE1-105-t-Bid, pri čemu je MOI iznosio 100. Za ovaj eksperiment, svi S. enterica aroA sojevi su gajeni pod SPI-2 T3SS indukujućim uslovima. U pojedinim slučajevima, ćelije su tretirane sa II: 1 µM Staurosporinom. Napisani brojevi označavaju molekulsku težinu u kDa, na odgovarajućoj visini.
Sl. 22: Sekrecija koja je zavisna od T3SS-a za razne proteine ćelijskog ciklusa, iz S. enterica u supernatant kulture ćelija. Eksperiment in vitro sekrecije S. enterica aroA bilo SteAFL(I, III, V, VII) ili SopE1-105(II, IV, VI, VIII) koji su bili fuzionisani sa proteinima koji su navedeni, nakon infeckije sa I i II: Ink4a-MycHis; III i IV: Ink4c-MycHis; V i VI: Mad2-MycHis; VII i VIII: Cdk1-MycHis. Sadržaj proteina u istaloženim supernatantima kultura ćelija ("A") i u ukupno bakterijskom lizatu ("B") je analiziran imunoblot postupkom upotrebome anti-myc antitela. Napisani brojevi označavaju molekulsku težinu u kDa, na odgovarajućoj visini.
Sl.23: Sekcija zavisna od T3SS u supernatant kulture ćelija, za razne peptide za koje je poznato da interferiraju sa ćelijskim ciklusom. Eksperiment in vitro sekrecije I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2. II-VII: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138koji je fuzionisan sa peptidima kao što je navedeno u listi, a nakon: II: Ink4A84-103; III: p107/RBL1657-662; IV: p21141-160D149A; V: p21145-160D149A; VI: p2117-33; VII: ciklin D2139-147. Sadržaj proteina u istaloženim supernatantima kultura ćelija ("A") i u ukupnim bakterijskim lizatima ("B") je analiziran imunoblot postupkom, upotrebome anti-YopE antitela. Napisani brojevi označavaju molekulsku težinu u kDa, na odgovarajućoj visini.
Sl. 24: Fuzija proteina isporučenog preko T3SS sa ubikvitinom omogućava uklanjanje dodatnog YopE1-138sadržaja. HeLa ćelije su inficirane sojem koji isporučuje protein od interesa fuzionisan sa YopE1-138za direktnu fuziju sa ubikvitinom (YopE1-138-Ubi). Nakon isporuke proteina u eukariotsku ćeliju, endogene proteaze specifične za ubikvitin će cepanjem odvojiti dodatni YopE1-138-Ubi sadržaj od proteina od interesa. Digitoninom lizirane HeLa ćelije koje nisu bile inficirane (I) ili nakon infekcije (MOI od 100) u trajanju od 1 sata sa II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis ili III: YopE1-138-Flag-Ubikvitin-INK4C-MycHis su analizirani imunoblot postupkom upotrebom anti-INK4C antitela na prisustvo IV: YopE1-138-Flag-Ubikvitin-INK4C-MycHis ili V: YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, oblika nakon cepanja VI: INK4C-MycHis i VII: endogenog INK4C.
Detalјan opis pronalaska
[0014] Predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantne Gram-negativne bakterijske sojeve i njihovu upotrebu za isporuku heterolognih proteina u eukariotske ćelije.
[0015] Za potrebe tumačenja ove specifikacije, primenjivaće se definicije koje slede i kada god je to potrebno, termini koji su upotrebljeni u jednini će takođe obuhvatati i množinu termina i obrnuto. Podrazumeva se da je terminologija koja je ovde upotrebljena predviđena samo za opis posebnih primera izvođenja i da nije prediđeno da bude ograničavajuća.
[0016] Izraz "Gram-negativni bakterijski soj", kako se ovde upotrebljava, uklјučuje sledeće bakterije: Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Anaeromyxobacter dehalogenans, Bordetella bronchiseptica, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachmoatis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila pneumoniae, Chromobacterium violaceum, Citrobacter rodentium, Desulfovibrio vulgaris, Edwardsiella tarda, Endozoicomonas elysicola, Erwinia amylovora, Escherichia albertii, Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Mesorhizobium loti, Myxococcus xanthus, Pantoea agglomerans, Photobacterium damselae, Photorhabdus luminescens, Photorabdus temperate, Pseudoalteromonas spongiae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhizobium sp, Salmonella enterica i druge Salmonella sp, Shigella flexneri i druge Shigella sp, Sodalis glossinidius, Vibrio alginolyticus, Vibrio azureus, Vibrio campellii, Vibrio caribbenthicus, Vibrio harvey, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio tasmaniensis, Vibrio tubiashii, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis. Poželјni Gram-negativni bakterijski sojevi pronalaska su Gram-negativni bakterijski sojevi koje čine familiju Enterobacteriaceae i Pseudomonadaceae. Gram-negativni bakterijski soj predmetnog pronalaska se normalno upotrebljava za isporuku heterolognih proteina bakterijskim T3SS u eukariotske ćelije in vitro i in vivo.
[0017] Termin "rekombinantni Gram-negativni bakterijski soj" koji se ovde upotrebljava, odnosi se na Gram-negativni bakterijski soj koji je genetički transformisan sa vektorom. Korisni vektor predmetnog pronalaska je npr. ekspresioni vektor, vektor za inserciju hromozomskih ili plazmida virulencije ili DNK fragment za inserciju hromozomskih ili plazmida virulencije.
[0018] Termini "Gram-negativni bakterijski soj deficijentan u proizvodnji aminokiseline neophodne za rast" i "autrotrofni mutant" se ovde upotreblјavaju naizmenično i odnose se na Gram-negativne bakterijske sojeve koji ne mogu da rastu u odsustvu najmanje jedne esencijalne aminokiseline ili njenog prekursora koji se egzogeno obezbeđuju. Aminokiseline čija je proizvodnja u soju deficijentna su, npr. aspartat, meso-2,6-diaminopimelinska kiselina, aromatične aminokiseline ili leucin-arginin [23]. Ovakav soj može biti proizveden npr. delecijom gena za aspartat-beta-semialdehid dehidrogenazu (Δasd). Takvav auksotrofni mutant ne može rasti u odsustvu egzogene mezo-2,6-diaminopimelinske kiseline [24]. Mutacija, npr. delecija gena za aspartat-beta-semialdehid dehidrogenazu je ovde poželјna za Gram-negativni bakterijski soj predmetnog pronalaska koji je deficijentan u proizvodinji aminokiseline koja je esencijalna za rast.
[0019] Izraz "Gram-negativni bakterijski soj deficijentan u proizvodnji adhezionih proteina koji se vezuju za površinu eukariotske ćelija ili vanćelijski matriks" se odnosi na mutantne Gram-negativne bakterijske sojeve koji ne eksprimiraju najmanje jedan adhezioni protein u poređenju sa adhezionim proteinima eksprimiranim od strane odgovarajućeg soja divljeg tipa. Adhezioni proteini mogu obuhvatati npr. produžene polimerne adhezione molekule poput adhezina pila/fimbrija ili nefimbrijalnih adhezina. Fimbrijalni adhezini obuhvataju adhezine pila tipa 1 (kao što su FimH adhezin iz Fim-pila E. coli), P-pila (poput PapG adhezin iz Pap-pila E. coli), pila tipa 4 (poput proteina pila iz npr. P. aeruginosa) ili tankih agregativnih (curli) fimbrija (Csg proteini sa CsgA adhezinom iz S. enterica). Nefimbrijalne adhezije obuhvataju trimerne autotransporterske adhezine kao što je YadA iz Y.enterocolitica, BpaA (B. pseudomallei), Hia (H. influenzae), BadA (B. henselae), NadA (N. meningitidis) ili UspA1 (M. catarrhalis) kao i druge autotransporterske adhezine poput AIDA-1 (E. coli), ali i ostale adhezine/invazine kao što su InvA iz Y.enterocolitica ili Intimin (E. coli) ili članovi Dr- ili Afa-familije (E. coli). Termini YadA i InvA, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na proteine iz Y.enterocolitica. Autotransporter YadA [25, 26] se vezuje za različite oblike kolagena, kao i za fibronektin, dok se invazin InvA [27-29] vezuje za β-integrine u membrani eukariotskih ćelija. Ukoliko je Gram-negativni bakterijski soj Y.enterocolitica, poželjno je da je soj deficijentan u InvA i/ili YadA.
[0020] Kako se ovde upotrebljava, izraz "familija Enterobacteriaceae" obuhvata porodicu Gramnegativnih, štapićastih, fakultativno anaerobnih bakterija koje se mogu naći u zemlјištu, vodi, bilјkama i životinjama, a koje se često javlјaju kao patogeni kod kičmenjaka. Bakterije ove familije su sa sličnom fiziologijom i pokazuju evolutivno očuvane funkcionalne elemente i gene odgovarajućih genoma. Osim što su negativni na oksidaze, svi članovi ove familije fermentišu glukozu, dok većina redukuje nitrate.
Enterobacteriaceae bakterije pronalaska mogu biti bilo koje bakterije iz te familije, a posebno obuhvataju, ali nisu ograničene na, bakterije sledećih rodova: Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Erwinia, Morganella, Providencia ili Yersinia. U specifičnijim primerima izvođenja, bakterija je Escherichia coli, Escherichia blattae, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vuneris, Salmonella enterica, Salmonella bongori, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Enterobacter aerogenes, Enterobacter gergoviae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Erwinia amylovora, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus hauseri, Providencia alcalifaciens ili Morganella morganii species. Poželjno je da je Gramnegativni bakterijski soj izabran iz grupe koja se sastoji od roda Yersinia, Escherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Chlamydia, Erwinia, Pantoea, Vibrio, Burkholderia, Ralstonia, Xanthomonas, Chromobacterium, Sodalis, Citrobacter, Edwardsiella, Rhizobiae, Aeromonas, Photorhabdus, Bordetella i Desulfovibrio, još poželјnije iz grupe koja se sastoji od rodova Yersinia, Escherichia, Salmonella i Pseudomonas, a najpoželјnije iz grupe koja se sastoji od rodova Yersinia i Salmonella.
[0021] Termin "Yersinia", kako se ovde upotrebljava, obuhvata sve vrste Yersinia, uklјučujući Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis i Yersinia pestis. Poželjna je Yersinia enterocolitica.
[0022] Termin "Salmonella", kako se ovde upotrebljava, obuhvata sve vrste Salmonella, uklјučujući Salmonella enterica i S. bongori. Poželjna je Salmonella enterica.
[0023] "Promotor", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na sekvencu nukleinskih kiselina koja reguliše ekspresiju transkripcione jedinice. "Promotorski region" je regulatorni region sposoban da veže RNK polimerazu u ćeliji i da započne transkripciju nizvodne (3' smer) kodirajuće sekvence. Unutar promotorskog regiona će biti pronađeno mesto otpočinjanja transkripcije (konvencionalno definisano mapiranjem sa nukleazom S1), kao i domena za vezivanje proteina (konsenzusnih sekvenci) odgovornih za vezivanje RNA polimeraze, kao što su pretpostavlјeni -35 region i Pribnow sekvenca. Izraz "operativno povezan", kada opisuje odnos između dva regiona DNK, jednostavno označava da su funcionalno srodni jedan drugome i da su locirani na istom fragment nukleinske kiseline. Promotor je operativno povezan sa strukturalnim genom ukoliko on kontroliše transkripciju gena i nalazi se na istom fragmentu nukleinske kiseline kao i gen. Obično je promotor funkcionalan u navedenom Gramnegativnom bakterijskom soju, tj. promotor je sposoban da eksprimira fuzioni protein predmetnog pronalaska, tj. promotor je sposoban da eksprimira fuzioni protein predmetnog pronalaska bez dodatnog genetičkog inženjeringa ili ekspresije dodatnih proteina. Štaviše, funkcionalni promotor ne sme biti prirodno suprotno regulisan bakterijskim T3SS.
[0024] Izraz "isporuka" koji se ovde upotrebljava, odnosi se na transport proteina iz rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja u eukariotsku ćeliju, uklјučujući korake ekspresije heterolognog proteina u rekombinantnom Gram-negativnom bakterijskom soju, sekreciju eksprimiranog proteina/eksprimiranih proteina iz takvog Gram-negativnog bakterijskog soja i translokaciju sekretovanog proteina/sekretovanih proteina iz takvog Gram-negativnog bakterijskog soja u citosol eukariotske ćelije. Shodno navedenom, termini „signal za isporuku“ ili „signal sekrecije“ koji se ovde koriste naizmenično, odnose se na polipeptidnu sekvencu koja može biti prepoznata sistemon za sekreciju i translokaciju Gram-negativnog bakterijskog soja i usmerava isporuku proteina iz Gramnegativnog bakterijskog soja u eukariotske ćelije.
[0025] Kako se ovde upotrebljava, “sekrecija/izlučivanje" proteina se odnosi na prenos heterolognog proteina ka spolja, preko ćelijske membrane rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja. "Translokacija" proteina se odnosi na transport heterolognog proteina iz rekombinantnog Gramnegativnog bakterijskog soja preko plazma membrane eukariotske ćelije, u citosol takve eukariotske ćelije.
[0026] Termin "eukariotske ćelije", kako se ovde upotrebljava, obuhvata npr. sledeće eukariotske ćelije: Hi-5, HeLa, Hek, HUVEC, 3T3, CHO, Jurkat, Sf-9, HepG2, Vero, MDCK, Mefs, THP-1, J774, RAW, Caco2, NCI60, DU145, Lncap, MCF-7, MDA-MB-438, PC3, T47D, A549, U87, SHSY5Y, Ea.Hy926, Saos-2, 4T1, D2A1, B16F10 i primarne humane hepatocite. "Eukariotske ćelije", kako se ovde upotrebljava, takođe označava "cilјne ćelije" ili "cilјne eukariotske ćelije".
[0027] Izraz "T3SS efektorski protein", kako se ovde upotrebljava, se odnosi na proteine koji se putem T3S sistema prirodno injeciraju u citosol eukariotskih ćelija i na proteine koje prirodno izlučuju T3S sistemima koji mogu npr. obrazovati pore za translokaciju u eukariotskoj membrane (uklјučujući translokatore koji obrazuju pore (kao što su YopB i YopD iz Yersinia) i proteine vrha poput LcrV iz Yersinia). Poželјno se upotrebljavaju proteini koji prirodno injeciraju putem T3S sistema u citosol eukariotskih ćelija. Ovi faktori virulencije će paralizovati ili reprogramirati eukariotsku ćeliju u korist patogena. T3S efektore karakteriše veliki repertoar biohemijskih aktivnosti i oni modulišu funkciju klјučnih regulatornih molekula domaćina [5, 30], a obuhvataju AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrD1, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpm1, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, GALA familiju proteina, HopAB2, HopAO1, HopI1, HopM1, HopN1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopU1, HsvB, IcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgB1, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspC1, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXo1, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, SrfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SspH1, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopD YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.
[0028] T3SS efektorski geni iz Yersinia su klonirani iz npr. Y.enterocolitica, a koji su YopE, YopH, YopM, YopO, YopP/YopJ i YopT [31]. Odgovarajući efektorski geni mogu biti klonirani iz Shigella flexneri (npr. OspF, IpgD, IpgB1), Salmonella enterica (npr. SopE, SopB, SptP), P. aeruginosa (npr. ExoS, ExoT, ExoU, ExoY) ili E. coli (npr. Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ). Sekvence nukleinskih kiselina ovih gena su dostupne stručnjacima, npr. u bazi podataka Genebank (yopH, yopO, yopE, yopP, yopM, yopT kao NC_002120 GI:10955536; efektorni proteini S. flexneri kao AF386526.1 GI:18462515; efektori S. enterica kao NC_016810.1 GI:378697983 ili FQ312003.1 GI:301156631; efektori P. aeruginosa kao AE004091.2 GI:110227054 ili CP000438.1 GI:115583796 i efektorni proteini E. coli kao NC_011601.1 GI:215485161).
[0029] U svrhu predmetnog pronalaska, geni su označeni malim slovima i kurzivom da bi se razlikovali od proteina. U slučaju da gene (označene malim slovima i kurzivom) prati naziv bakterijske vrste (npr. E. coli), oni se odnose na mutaciju odgovarajućeg gena u odgovarajućim bakterijskim vrstama. Na primer, YopE se odnosi na efektorski protein kodiran yopE genom. Y.enterocolitica yopE predstavlјa Y.enterocolitica sa mutacijom u yopE genu.
[0030] Kako se ovde upotrebljava, termini "polipeptid", "peptid", "protein", "polipeptidni" i "peptidni" se koriste naizmenično za označavanje niza aminokiselinskih ostataka koji su međusobno povezani peptidnim vezama između alfa-amino i karboksilne grupe susednih ostataka. Poželјni su proteini čija aminokiselinska sekvenca sadrži najmanje 10 aminokiselina, poželјnije najmanje 20 aminokiselina.
[0031] Prema predmetnom pronalasku, "heterologni protein" obuhvata proteine koji se javlјaju u prirodi ili njihove delove i takođe obuhvata proteine koji su veštački konstruisani ili njihove delove. Kako se ovde upotrebljava, pojam "heterologni protein" se odnosi na protein ili njegov deo drugačiji od T3SS efektorskog proteina ili na njegov N-terminalni fragment sa kojim može biti fuzionisan. Posebno se heterologni protein, kako se ovde upotrebljava, odnosi na protein ili njegov deo koji ne pripada proteomu, tj. celokupnom komplemnentu prirodnih proteina specifičnog rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja koji je obezbeđen i upotrebljava se u predmetnom pronalasku, npr. na protein je koji ne pripada proteomu, tj. celokupnom komplemnentu prirodnih proteina specifičnog bakterijskog soja iz rodova Yersinia, Escherichia, Salmonella ili Pseudomonas. Uobičajeno je da je heterologni protein životinjskog porekla, uklјučujući humano poreklo. Heterologni protein je izabran iz grupe koju čine proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze, regulatori ćelijskog ciklusa, proteini sa ankirinskim ponovcima, reporterski proteini, do male GTPaze, proteini srodni GPCR, fuzioni konstrukti nano-antitela, bakterijski T3SS efektori, bakterijski T4SS efektori i virusni proteini. Čak su posebno poželjniji heterologni proteini izabrani iz grupe koja se sastoji od proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, regulatori ćelijskog ciklusa i proteini sa ankirinskim ponovcima. Najpoželјniji su proteini koji su uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze, poput životinjskih, poželјno humanih heterolognih proteina koji su uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze.
U pojedinim primerima izvođenja, vektor Gram-negativnog bakterijskog soja predmetnog pronalaska sadrži dve druge DNK sekvence koje kodiraju identične ili dva različita heterologna proteina koji su fuzionisano nezavisno jedan od drugog sa 3' krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja.
U pojedinim primerima izvođenja, vektor Gram-negativnog bakterijskog soja predmetnog pronalaska
sadrži tri druge DNK sekvence koje kodiraju identične ili tri različita heterologna proteina koji su fuzionisani nezavisno jedan od drugoga sa 3' krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja.
[0032] Heterologni protein eksprimiran rekombinantnim Gram-negativnim bakterijskim sojem obično je molekulske težine između 1 i 150kD, poželјno između 1 i 120kD, poželјnije između 1 i 100kDa, najpoželјnije između 15 i 100kDa.
[0033] Prema predmetnom pronalasku, "proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze" obuhvataju, ali nisu ograničeni na, Bad, Bcl2, Bak, Bmt, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Apafl, Kaspazu 9, Kaspazu 3, Kaspazu 6, Kaspazu 7, Kaspazu 10, DFFA, DFFB, ROCK1, APP, CAD, ICAD, CAD, EndoG, AIF, HtrA2, Smac/Diablo, Arts, ATM, ATR, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), IAP familiju, LC8, PP2B, 14-3-3 proteine, PKA, PKC, PI3K, Erk1/2, p90RSK, TRAF2, TRADD, FADD, Daxx, Kaspazu 8, Kaspazu 2, RIP, RAIDD, MKK7, JNK, FLIP, FKHR, GSK3, CDK i njihove inhibitore poput INK4- familije (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) i Cip1/Wafl/Kip1-2-familije (p21(Cip1/Waf1), p27(Kip1), p57(Kip2). Poželjno se upotrebljavaju Bad, Bmt, Bcl2, Bak, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Kaspaza 9, Kaspaza 3, Kaspaza 6, Kaspaza 7, Smac/Diablo, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), LC8, PP2B, TRADD, Daxx, Kaspaza 8, Kaspaza 2, RIP, RAIDD, FKHR, CDK i njihovi inhibitori poput INK4- familije (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)), poželjnije BIM, Bid, skraćeni Bid, FADD, Kapsaza 3 (i njene subjedinice), Bax, Bad, Akt, CDK i njihovi inhibitori poput INK4- familije (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) [32-34]. Dodatno, proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze uklјučuju DIVA, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bid i tBid, Egl-1, Bcl-Gs, Citohrom C, Beklin, CED-13, BNIP1, BNIP3, Bcl-B, Bcl-W, Ced-9, A1, NR13, Bfl-1, Kaspazu 1, Kaspazu 2, Kaspazu 4, Kaspazu 5, Kaspazu 8. Proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze su izabrani iz grupe koja se sastoji od pro-apoptotskih proteina, anti-apoptotskih proteini, inhibitora puteva koji sprečavaju apoptozu i inhibitora signalnih puteva ili puteva i signala ili puteva za preživlјavanje. Pro-apoptotski proteini sadrže proteine izabrane iz grupe koju čine Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid i tBid, Bok, Apafl, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beklin 1, Egl-1 i CED13, Citohrom C, FADD, familija Kaspaza i CDK i njihovi inhibitori poput INK4 familije (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) ili izabrane iz grupe koju čine Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid i tBid, Bok, Egl-1, Apafl, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beklin 1, Egl-1 i CED-13, Citohrom C, FADD i familija Kaspaza. Poželjni su Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid i tBid, Bok, Egl-1, Apafl, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beklin 1, Egl-1 i CED-13, Smac/Diablo, FADD, familija Kaspaza, CDK i njihovi inhibitori poptu INK4-familije (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)). Podjednako su poželjni Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid i tBid, Bok, Apafl, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beklin 1, Egl-1 i CED-13, Smac/Diablo, FADD, familija Kaspaza.
Anti-apoptotski proteini obuhvataju proteine izabrane iz grupe koju čine Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced9, A1, NR13, IAP familija i Bfl-1. Poželjni su Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13 i Bfl-1.
Inhibitori signalnih puteva ili puteva za preživlјavanje obuhvataju proteine izabrane iz grupe koja se sastoji od PTEN, ROCK, PP2A, PHLPP, JNK, p38. Poželјni su PTEN, ROCK, PP2A i PHLPP.
[0034] U pojedinim primerima izvođenja, heterologni proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze su izabrani iz grupe koja se sastoji od “proteina sa samo jednim BH3 domenom”, kaspaza i unutarćelijskih signalnih proteina receptora smrti u kontroli apoptoze.
Takozvani “proteini sa samo jednim BH3 domenom” (engl. BH3-only) obuhvataju proteine izabrane iz grupe koju čine Bad, BIM, Bid i tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, Bekin 1, Egl-1 i CED-13. Poželjni su Bad, BIM, Bid i tBid.
Kaspaze obuhvataju proteine izabrane iz grupe koja se sastoji od Kaspaze 1, Kaspaze 2, Kaspaze 3, Kaspaze 4, Kaspaze 5, Kaspaze 6, Kaspaze 7, Kaspaze 8, Kaspaze 9, Kaspaze 10. Poželjni su Kaspaza 3, Kaspaza 8 i Kaspaza 9.
“Unutarćelijski signalni proteini receptora smrti u kontroli apoptoze” obuhvataju proteine izabrane iz grupe koja se sastoji od FADD, TRADD, ASC, BAP31, GULP1/CED-6, CIDEA, MFG-E8, CIDEC, RIPK1/RIP1, CRADD, RIPK3/RIP3, Crk, SHB, CrkL, DAXX, 14-3-3 familije, FLIP, DFF40 i 45, PEA-15, SODD. Poželјni su FADD i TRADD.
[0035] U pojedinim primerima izvođenja, dva heterologna proteina uklјučena u apoptozu ili regulaciju apoptoze su sadržana u vektoru Gram-negativnog bakterijskog soja predmetnog pronalaska, pri čemu je jedan protein pro-apoptotski protein, a drugi protein je inhibitor puteva sprečavanja apoptoze, ili pri čemu je jedan protein pro-apoptotski protein, a drugi protein je inhibitor signala ili puteva preživlјavanja.
Pro-apoptotskih proteini obuhvaćeni predmetnim pronalaskom su obično sa strukturom alfa-heliksa, poželjno hidrofobnog heliksa okruženog amfipatičnim heliksima, a obično sadrže i najmanje jedan od BH1, BH2, BH3 ili BH4 domena, pri čemu je poželjno da sadrži najmanje jedan BH3 domen. Obično su pro-apoptotski proteini koji su obuhvaćeni predmetnim pronalaskom bez enzimske aktivnosti.
[0036] Izraz "mesto cepanja za proteazu", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na specifičan aminokiselinski motiv unutar aminokiselinske sekvence, npr. unutar aminokiselinske sekvence proteina ili fuzionisanog proteina, koga cepa specifična proteaza koja prepoznaje aminokiselinski motiv. Za revijski pregled pogledati [35]. Primeri mesta cepanja proteazama su aminokiselinski motivi koji se cepaju proteazama izbranim iz grupe koja se sastoji od enterokinaze (laki lanac), enteropeptidaze, presizicione proteaze, humane rinovirusne proteaze (HRV 3C), TEV proteaze, TVMV proteaze, proteaze Faktora Xa i trombina.
Sledeće aminokiselinske motive prepoznaju odgovarajuće proteaze:
- Asp-Asp-Asp-Asp-Lis: Enterokinaza (laki lanac) / Enteropeptidaza
- Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro: Presiziona proteza/humana Rinovirusna proteaza (HRV 3C)
- Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser i modifikovani motivi zasnovani na Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly/Ser (gde je X bilo koja aminokiselina) koje preopoznaje TEV proteaza (virus mozaika duvana)
- Glu-Thr-Val-Arg-Phe-Gln-Ser: TVMV proteaza
- Ile-(Glu ili Asp)-Gly-Arg: proteaza FaktoraXa
- Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser: trombin.
Obuhvaćen mestima cepanja proteazom, kako se ovde upotrebljava, je ubikvitin. Stoga, u pojedinim poželјnim primerima izvođenja, ubikvitin se koristi kao mesto cepanja proteazom, tj. treća sekvenca DNK kodira ubikvitin kao mesto cepanja proteazom, a koje može biti isečeno specifičnom proteazom obrade ubikvitina na N-terminalnom mestu, npr. koje može biti isečeno specifičnom proteazom obrade ubikvitina koja se naziva Deubikvitinacionim enzimom, a koja deluje na N-terminalnom mestu endogeno u ćeliji u koju je fuzioni protein isporučen. Ubikvitin podleže obradi i na svom C-kraju, grupom endogenih C-terminalnih protaza specifičnih za ubikvitin (deubikvitinacionih enzima, DUB). Za cepanje ubikvitina sa DUB se pretpostavlja da se odvija na samom C-kraju ubikvitina (nakon G76).
[0037] „Pojedinac“, „subjekt“ ili „pacijent“ je kičmenjak. U pojedinim primerima izvođenja, kičmenjak je sisar. Sisari uklјučuju, ali nisu ograničeni na, primate (uklјučujući humane i primate različite od čoveka) i glodare (npr. miševe i pacove). U pojedinim primerima izvođenja, sisar je čovek.
[0038] Pojam "mutacija" se ovde upotrebljava kao opšti pojam i uklјučuje promene i jednog baznog para i višestrukih baznih parova. Takve mutacije mogu obuhvatati supstitucije, mutacije tipa pomeraja okvira čitanja, delecije, insercije i skraćivanja.
[0039] Izraz "molekul obeleživača ili akceptorsko mesto za molekul obeleživača", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na malo hemijsko jedinjenje koje se vezuje za specifičnu aminokiselinsku sekvencu što rezultuje fluorescencom vezanog hemijskog jedinjenja, poželјno akceptorskog mesta kumarin ligaze/kumarina (i njegovih derivata), akceptorskog mesta rezorufin ligaze/rezorufina (i njegovih dervata) i tetra-cisteinskih motiva (kao Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys i njegovih derivata) pri upotrebi FlAsH/ReAsH boje (Life technologies) ili fluorescentnog proteina poput pojačanog zelenog fluorescentnog proteina (EGFP, od engl. Enhanced Green Fluorescent Protein).
[0040] Izraz "signal jedarne lokalizacije" (NLS), kako se ovde upotrebljava, se odnosi na aminokiselinsku sekvencu koja obeležava protein za unos u jedro eukariotske ćelije i poželјno uklјučuje virusni signal jedarne lokalizacije, kao što je NLS izvedeni iz velikog T-antigena SV40 (PPKKKRKV).
[0041] Izraz "mesto višestrukog kloniranja", kako se ovde upotrebljava, se odnosi na kratku DNK sekvencu koja sadrži nekoliko restrikcionih mesta za cepanje restrikcionim endonukleazama kao što su AclI, HindIII, SspI, MluCI, Tsp509I, PciI, Agel, BspMI, BfuAI, SexAI, MluI, BceAI, HpyCH4IV, HpyCH4III, BaeI, BsaXI, AflIII, SpeI, BsrI, BmrI, BglII, AfeI, AluI, StuI, ScaI, ClaI, BspDI, PI-SceI, NsiI, AseI, SwaI, CspCI, MfeI, BssSI, BmgBI, PmlI, DraIII, AleI, EcoP15I, PvuII, AlwNI, BtsIMutI, TspRI, NdeI, NlaIII, CviAII, FatI, MslI, FspEI, XcmI, BstXI, PflMI, BccI, NcoI, BseYI, FauI, SmaI, XmaI, TspMI, Nt.CviPII, LpnPI, AciI, SacII, BsrBI, MspI, HpaII, ScrFI, BssKI, StyD4I, BsaJI, BslI, BtgI, NciI, AvrII, MnlI, BbvCI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, SbfI, Bpu10I, Bsu36I, EcoNI, HpyAV, BstNI, PspGI, StyI, BcgI, PvuI, BstUI, EagI, RsrII, BsiEI, BsiWI, BsmBI, Hpy99I, MspA1I, MspJI, SgrAI, BfaI, BspCNI, XhoI, Earl, AcuI, PstI, BpmI, DdeI, SfcI, AflII, BpuEI, SmlI, AvaI, BsoBI, MboII, BbsI, XmnI, BsmI, Nb.BsmI, EcoRI, HgaI, AatII, ZraI, Tth111I PflFI, PshAI, AhdI, DrdI, Eco53kI, SacI, BseRI, PleI, Nt.BstNBI, MlyI, HinfI, EcoRV, MboI, Sau3AI, DpnII BfuCI, DpnI, BsaBI, TfiI, BsrDI, Nb.BsrDI, BbvI, BtsI, Nb.BtsI, BstAPI, SfaNI, SphI, NmeAIII, NaeI, NgoMIV, BglI, AsiSI, BtgZI, HinP1I, HhaI, BssHII, NotI, Fnu4HI, Cac8I, MwoI, NheI, BmtI, SapI, BspQI, Nt.BspQI, BlpI, TseI, ApeKI, Bsp1286I, AlwI, Nt.AlwI, BamHI, FokI, BtsCI, HaeIII, PhoI, FseI, SfiI, Narl, KasI, SfoI, PluTI, AscI, EciI, BsmFI, ApaI, PspOMI, Sau96I, NlaIV, KpnI, Acc65I, BsaI, HphI, BstEII, AvaII, BanI, BaeGI, BsaHI, BanII, RsaI, CviQI, BstZ17I, BciVI, SalI, Nt.BsmAI, BsmAI, BcoDI, ApaLI, BsgI, AccI, Hpy166II, Tsp45I, HpaI, PmeI, HincII, BsiHKAI, ApoI, NspI, BsrFI, BstYI, HaeII, CviKI-1, EcoO109I, PpuMI, I-CeuI, SnaBI, I-SceI, BspHI, BspEI, MmeI, TaqαI, NruI, Hpy188I, Hpy188III, XbaI, BclI, HpyCH4V, FspI, PI-PspI, MscI, BsrGI, MseI, PacI, PsiI, BstBI, DraI, PspXI, BsaWI, BsaAI, EaeI, poželjno XhoI, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, SacI, SalI, BstBI. Izraz "mesto višestrukog kloniranja", kako se ovde upotrebljava, dalјe se odnosi na kratku DNK sekvencu koja se upotrebljava za rekombinacione događaje kao, na primer, u Gatewayevoj strategiji kloniranja ili u postupcima poput Gibbson-ovog udruživanje ili topo kloniranja.
[0042] Termin "Yersinia soj divlјeg tipa", kako se ovde upotrebljava, se odnosi na varijantu koja se javlja u prirodi (poput Y.enterocolitica E40) ili varijantu koja se javlja u prirodi i sadrži genetičke modifikacije koje omogućavaju upotrebu vektora, kao što su mutacije tipa delecija u restrikcionim endonukleazama ili genima za rezistenciju na antibiotike (poput Y.enterocolitica MRS40, derivata Y.enterocolitica E40 koji je osetlјiv na ampicilin) Ovakvi sojevi sadrže hromozomsku DNK, kao i nemodifikovani plazmid virulencije (nazvan pYV).
[0043] Termin "obuhvatati" se uglavnom upotrebljava u smislu uklјučivanja, odnosno dozvolјava prisustvo jedne ili više karakteristika ili komponenti.
[0044] Poželјno je da Gram-negativni bakterijski soj predstavlja soj Yersinia, poželјnije soj Yersinia enterocolitica. Najpoželјniji je Yersinia enterocolitica E40 [13] ili njegovi derivati koji su osetlјivi na ampicilin poput Y.enterocolitica MRS40, kao što je opisano u [36]. Takođe je poželjno da je Gramnegativni bakterijski soj Salmonella soj, poželјnije soj Salmonella enterica. Najpoželјnija je Salmonella enterica Serovar Typhimurium SL1344, kao što je opisano u Kolekciji kultura ćelija Javnog zdravlja Engleske (NCTC 13347).
[0045] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina sadrži bakterijski T3SS efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment, pri čemu T3SS efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment može sadržavati mesto za vezanje šaperona. T3SS efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment koji sadrži mesto vezivanja šaperona je naročito koristan kao signal za isporuku u predmetnom pronalasku. Najpoželјniji T3SS efektorski protein ili njegovi N-terminalni fragmenti su SteA ili YopE ili njihov N-terminalni fragment koji uključuje najmanje prvih 20 aminokiselina YopE efektorskog proteina ili najmanje prvih 20 aminokiselina SteA efektorskog proteina, najpreciznije YopE ili njegov N-terminalni fragment koji uključuje najmanje prvih 20 aminokiselina YopE efektorskog proteina. U pojedinim primerima izvođenja, signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina koji je kodiran prvom DNK sekvencom, sadrži bakterijski T3SS efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment, pri čemu je najpoželjnije da njegov N-terminalni fragment uklјučuje najmanje prvih 100 aminokiselina bakterijskog T3SS efektorskog proteina.
U pojedinim primerima izvođenja, signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina kodiranog prvom DNK sekvencom sadrži bakterijski T3SS efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment, pri čemu bakterijski T3SS efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment sadrži mesto vezanja šaperona.
Najpoželјniji je da T3SS efektorski proteini ili njegov N-terminalni fragment koji sadrži mesto vezivanja šaperona, sadrže i sledeće kombinacije mesta vezivanja šaperona i T3SS efektorskog proteina ili njegovog N-terminalnog fragmenta: YopE ili njegov N-terminalni fragment koji sadrži SycE mesto vezivanja šaperona kao što je N-terminalni fragment YopE efektorskog proteina koji sadrži 138 aminokiselina N-kraja YopE efektorskog proteina koji je ovde označen kao YopE1-138i prikazan u SEQ ID NO.2 ili SopE ili njegov N-terminalni fragment koji sadrži mesto vezanja InvB šaperona, kao što je N-terminalni fragment SopE efektorskog proteinaskog proteina koji sadrži 81 ili 105 aminokiselina N-kraja SopE efektorskog proteina i koji je ovde označen kao SopE1-81ili SopE1-105, tim redom, a kao što je prikazano u SEQ ID NO.142 ili 143.
[0046] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj je Yersinia soj, a signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina koji je kodiran prvom DNK sekvencom sadrži YopE efektorski protein ili N-terminalni deo, poželјno Y.enterocolitica YopE efektorski protein ili njegov N-terminalni deo. Poželјno mesto vezivanja SycE je sadržano unutar N-kraja YopE efektorskog proteina. U vezi sa navedenim, N-terminalni fragment YopE efektorskog proteina može sadržavati 12, 16, 18, 52, 53, 80 ili 138 aminokiselina N-kraja [10, 37, 38]. Najpoželјniji je N-terminalni fragment YopE efektorskog proteina koji sadrži 138 N-terminalnih aminokiselina YopE efektorskog proteina, npr. kao što je opisano u Forsberg i Wolf-Watz [39] i koji su ovde označeni kao YopE1-138, a kao što je prikazano u SEQ ID NO.2.
[0047] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj je Salmonella soj i signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina koji je kodiran prvom DNK sekvencom sadrži SopE ili SteA efektorski protein ili njihov N-terminalni deo, poželјno SopE ili SteA efektorski protein Salmonella enterica ili njihov N-terminalni deo. Poželјno mesto vezanja šaperona se nalazi u N-terminalnom delu SopE efektorskog proteina. U vezi sa navedenim, N-terminalni fragment SopE efektorskog proteina može sadržavati 81 ili 105 aminokiselinu N-kraja. Najpoželјniji je SteA pune dužine i N-terminalni fragment SopE efektorskog proteina koji sadrži 105 N-terminalnih aminokiselina efektorskog proteina, npr. kao što je opisano u SEQ ID NO.142 ili 143.
[0048] Stručnjaku iz oblasti će biti poznati postupci za identifikaciju polipeptidnih sekvenci efektorskog proteina koji su sposobni za isporuku proteina. Na primer, jedan takav postupak je opisan od strane Sori-a i saradnika [13]. Ukratko, polipeptidne sekvence, npr. razni delovi Yop proteina, mogu biti fuzionisani tako da se zadrži okvir čitanja, sa reporterskim enzimom poput domena adenilat ciklaze koji se aktivira kalmodulinom (ili Cya) iz ciklolizina Bordetella pertussis. Na isporuku Yop-Cya hibridnog proteina u citosol eukariotskih ćelija ukazuje pojava aktivnosti ciklaze u inficiranim eukariotskim ćelijama, a koji vodi nakuplјanju cAMP-a. Upotrebom takvog pristupa, stručnjak može odrediti, ukoliko je poželjno, zahtev tipa minimalne sekvence, tj. kontinualne aminokiselinske sekvence najkraće dužine koja je sposobna da isporuči protein, pogledati npr. [13]. Shodno navedenom, poželјni signali isporuke predmetnog pronalaska se sastoje od najmanje minimalne sekvence aminokiselina T3SS efektorskog proteina koja je sposobna da isporuči protein.
[0049] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje mutantni rekombinantne Gram-negativne bakterijske sojeve, naročito rekombinantne Gram-negativne bakterijske sojeve koji su deficijentni u proizvodnji najmanje jednog T3SS funkcionalnog efektorskog proteina.
Prema predmetnom pronalasku, takav mutantni Gram-negativni soj bakterija, npr. takav mutant Yersinia soja može biti generisan uvođenjem najmanje jedne mutacije u najmanje jedan gen koji kodira efektor. Poželјno, takvi geni koji kodiraju efektor uklјučuju YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopP/YopJ i YopT sve dok se razmatra Yersinia soj. Poželјno, takvi geni koji kodiraju efektor uklјučuju AvrA, CigR, GogB, GtgA, GtgE, PipB, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopB/SigD, SopA, SpiC/SsaB, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SopD, SopE, SopE2, SspH1, SspH2, PipB2, SifA, SopD2, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SteC, SteA, SteB, SteD, SteE, SpvB, SpvC, SpvD, SrfJ, SptP, sve dok se razmatra Salmonella soj. Najpoželјnije je da su svi geni koji kodiraju efektor uklonjeni delecijom. Iskusan stručnjak može koristiti bilo koji broj standardnih tehnika za generisanje mutacija u ovakvim T3SS efektorskim genima. Sambrook i saradnici opisuju opšte principe takvih tehnika. Pogledati Sambrook i saradnici [40].
U skladu sa predmetnim pronalaskom, mutacija može biti generisana u promotorskom regionu gena koji kodira efektor tako da se poništava ekspresija takvog efektorskog gena.
Mutacija se takođe može generisati u kodirajućem regionu gena koji kodira efektor tako da se katalitička aktivnost kodiranog efektorskog proteina ukine. "Katalitička aktivnost" efektorskog proteina se normalno odnosi na ćelijsku funkciju na koju efektorski protein deluje, odnosno toksičnost. Takva aktivnost je usmerena katalitičkim motivima u katalitičkom domenu efektorskog proteina. Pristupi za identifikaciju katalitičkog domena i/ili katalitičkih motiva efektorskog proteina su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti tehnike. Pogledati, na primer, [41, 42]. Prema tome, jedna poželјna mutacija predmetnog pronalaska je delecija celokupnog katalitičkog domena. Druga poželjna mutacija je mutacija tipa promene okvira čitanja u genu koji kodira efektor tako da katalitički domen nije prisutan u proteinskom proizvodu eksprimiranom sa takvog gena sa “promenjenim okvirom čitanja”. Najpoželјnija mutacija je mutacija sa delecijom celokupnog kodirajućeg regiona efektorskog proteina. Predmetni pronalazak takođe razmatra druge mutacije, kao što su male delecije ili supstitucije baznih parova, koje se uvode u katalitičke motive efektorskog proteina vodeći uništavanju katalitičke aktivnosti datog efektorskog proteina.
Mutacije koje su nastale u genima funkcionalnih T3SS efektorskih proteina mogu biti uvedene u poseban soj brojnim postupcima. Jedan takav postupak obuhvata kloniranje mutiranog gena u vektor "samoubistva" koji je sposoban da uvede mutiranu sekvencu u soj putem alelske izmene. Primer takvog vektora “samoubistva” je opisan u [43].
Na ovaj način, mutacije generisane u višestrukim genima mogu biti sukcesivno uvedene u Gramnegativni bakterijski soj koji stvara polimutanta, npr. šesterostruko mutiran rekombinantni soj. Redosled uvođenja ovih mutiranih sekvenci nije važan. U pojedinim okolnostima, može biti poželjno da se mutira samo neki, ali ne svi od efektorskih gena. Stoga, predmetni pronalazak dalјe razmatra polimutanta Yersinia koji su drugačiji od šesterostrukog mutanta Yersinia, npr. duplo mutirane, trostruko mutirane, četvorostruko mutirane i petostruko mutirane sojeve. U cilju isporuke proteina, sistem sekrecije i translokacije trenutnog mutantnog soja mora biti ostati intaktan.
Poželјni rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj predmetnog pronalaska je šestostruki mutant Yersinia soja u kome su mutirani svi geni koji kodiraju efektor tako da to rezultuje Yersinia sojem koji više ne proizvodi bilo kakav funkcionalan efektorski protein. Takav šestostruko mutiran Yersinia soj je označen kao ΔyopH, O, P, E, M, T za Y.enterocolitica. Kao jedan od primera, takav šestostruki mutant može biti proizveden iz Y.enterocolitica MRS40 soja čime se dobija Y.enterocolitica MRS40 ΔyopH, O, P, E, M, T, što je poželјno.
[0050] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska je usmeren na vektor za upotrebu u kombinaciji sa rekombinantnim Gram-negativnim bakterijskim sojevima za isporuku želјenog proteina u eukariotske ćelije, pri čemu vektor sadrži, u smeru od 5' ka 3':
promotor;
prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina, operativno povezanu sa navedenim promotorom, pri čemu je bakterijski T3SS efektorski protein izabran iz grupe koja se sastoji od SopE, SteA i YopE;
drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein, fuzionisanu sa 3’ krajem navedene prve DNK sekvence tako da ostaje očuvan okvir čitanja, pri čemu je heterologni protein izabran iz grupe koju čine proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze, regulatori ćelijskog ciklusa, proteini sa ankirinskim ponovcima, reporterski proteini, male GTPaze, proteini srodni GPCR, fuzioni konstrukti nano-antitela, bakterijski T3SS efektori, bakterijski T4SS efektori i virusni proteini; i opciono treću DNK sekvencu koja kodira mesto cepanja za proteaze, pri čemu je treća DNK sekvenca smeštena između 3’ kraja navedene prve DNK sekvence i 5’ kraja navedene druge DNK sekvence.
Promotor, heterologni protein i mesto cepanja proteaze, kao što je prethodno opisano, mogu biti upotrebljeni za vektore Gram-negativnog bakterijskog soja.
Vektori koji mogu biti upotrebljeni prema pronalasku zavise od Gram-negativnih bakterijskih sojeva koji se upotrebljavaju, kao što je poznato stručnjaku. Vektori koji mogu biti upotrebljeni prema pronalasku obuhvataju ekspresione vektore, vektore za inserciju hromozomskih ili plazmida virulencije i fragmente DNK za inserciju hromozomskih ili plazmida virulencije. Ekspresioni vektori koji su korisni za npr. Yersinia, Escherichia, Salmonella ili Pseudomonas soj su npr. pUC, pBad, pACYC, pUCP20 i pET plazmidi. Vektori za inserciju hromozomskih ili plazmida virulencije koji su korisni za npr. Yersinia, Escherichia, Salmonella ili Pseudomonas soj su npr. pKNG101. Fragmenti DNK za inserciju hromozomskih ili plazmida virulencije se odnose na postupke korišćene za npr. Yersinia, Escherichia, Salmonella ili Pseudomonas soj kao što je npr. lambda-crveni genetički inženjering. Vektori za inserciju hromozomskih ili plazmida virulencije ili fragmenti DNK za inserciju hromozomskih ili plazmida virulencije mogu insertovati prvu, drugu i/ili treću DNK sekvencu predmetnog pronalaska tako da je prva, druga i/ili treća DNK sekvenca operativno povezana sa endogenim promotorom rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja. Stoga, ukoliko se upotrebljava vektor za inserciju hromozomskih ili plazmida virulencije ili DNK fragment za inserciju hromozomskih ili virulentnih plazmida, endogeni promotor može biti kodiran sa endogenom bakterijskom DNK (hromozomskom ili plazmidnom DNK) i samo će prva i druga DNK sekvenca biti obezbeđene konstruisanim vekotrom za inserciju hromozomskih ili plazmida virulencije ili fragmenta DNK za inserciju hromozomskih ili plazmide virulencije. Shodno navedenom, nije neophodno da promotor bude prisutan u okviru vektora koji se upotrebljava za trasformaciju rekombinantnih Gram-negativnih bakterijskih sojeva, tj. rekombinantni Gram-negativni bakterijski sojevi predmetnog pronalaska mogu biti transformisani vektorom koji ne sadrži promotor. Poželјno se upotrebljava ekspresioni vektor. Vektor predmetnog pronalaska se normalno upotrebljava za isporuku heterolognih proteina putem bakterijskog T3SS u eukariotske ćelije in vitro i in vivo.
[0051] Poželјni ekspresioni vektor za Yersinia soj je izabran iz grupe koja se sastoji od pBad_Si_1 i pBad_Si_2. pBad_Si2 je konstruisan kloniranjem SycE-YopE1-138fragmenta koji sadrži endogene promotore za YopE i SycE iz prečišćenog pYV40 u KpnI/HindIII mesto pBad-MycHisA (Invitrogen). Dodatne modifikacije uklјučuju uklanjanje NcoI/BglII fragmenta iz pBad-MycHisA digestijom, tretman Klenovim fragmentom i ponovnu ligaciju. Dalje, na 3’ kraju YopE1-138se dodaju sledeća mesta cepanja: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII). pBad_Si1 je jednak pBad_Si2, ali kodira EGFP amplifikovan iz pEGFP-C1 (Clontech) na NcoI/BglII mestu pod kontrolom Arabinoznog inducibilnog promotora.
Poželјni ekspresioni vektor za Salmonella soj je izabran iz grupe koja se sastoji od pSi_266, pSi_267, pSi_268 i pSi_269. Plazmidi pSi_266, pSi_267, pSi_268 i pSi_269 koji sadrže odgovarajući endogeni promotor i SteA1-20fragment (pSi _266), SteA sekvencu pune dužine (pSi_267), SopE1-81fragment (pSi_268) ili SopE1-105fragment (pSi_269) su amplifikovani iz S. enterica SL1344 genomske DNK i klonirani u NcoI/KpnI mesto pBad-MycHisA (Invitrogen).
Vektori predmetnog pronalaska mogu uključivati druge elemente sekvenci, kao što je 3’ sekvenca terminacije (uklјučujući stop-kodon i poli A sekvencu), ili gen koji obezbeđuje otpornost na lek, a što omogućava selekciju tranformisanih bakterija koje su primile predmetni vektor. Vektori predmetnog pronalaska mogu biti transformisani u rekombinantne Gram-negativne bakterijske sojeve brojnim poznatim postupcima. U svrhu predmetnog pronalaska, postupci transformacije za uvođenje vektora uklјučuju, ali nisu ograničeni na, elektroporaciju, transformaciju posredovanu kalcijum fosfatom, konjugaciju ili njihove kombinacije. Na primer, vektor može biti transformisan u prvi bakterijski soj standardnom procedurom elektroporacije. Nakon toga, takav vektor može biti prebačen iz prvog bakterijskog soja u željeni soj konjugacijom, procesom koji se takođe naziva "mobilizacija". Transformisan soj (tj. Gram-negativni bakterijski sojevi koji su preuzeli vektor) mogu biti selektovani, npr. sa antibioticima. Ove tehnike su dobro poznate u oblasti tehnike. Pogledati, na primer, [13].
[0052] U skladu sa predmetnim pronalaskom, promotor ekspresionog vektora rekombinantnog Gramnegativnog bakterijskog soja pronalaska može biti prirodni promotor T3SS efektorskog proteina odgovarajućeg soja ili kompatibilnog bakterijskog soja ili promotor upotrebljen u ekspresionim vektorima korisnim za npr. Yersinia, Escherichia, Salmonella ili Pseudomonas soj npr. pUC i pBad. Takvi promotori su T7 promotor, Plac promotor ili Ara-bad promotor.
[0053] Ukoliko je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj Yersinia soj, promotor može biti iz Yersinia virulonskog gena. "Yersinia virulonski gen" se odnosi na gene Yersinia pYV plazmida, čija je ekspresija pod kontrolom i temperature i kontakta sa cilјanom ćelijom. Takvi geni uklјučuju gene koji kodiraju elemente mašinerije za sekreciju (Ysc gene), gene koji kodiraju translokatore (YopB, YopD i LcrV), gene koji kodiraju kontrolne elemente (YopN, TyeA i LcrG), gene koji kodiraju T3SS efektorske šaperone (SycD, SycE, SycH, SycN, SycO i SycT) i gene koji kodiraju efektore (YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopT i YopP/YopJ), kao i druge proteine kodirane sa pYV kao što su VirF i YadA. U poželјnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, promotor je nativni promotor gena koji kodira funkcionalan T3SS efektor. Ukoliko je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj Yersinia soj, promotor je izabran od bilo kog od YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM i YopP/YopJ. Poželјnije, promotor je iz YopE ili SycE. Ukoliko je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj Salmonella soj, promotor može biti za SpiI ili SpiII sekvencu (“ostrvo”) patogenosti ili iz efektorskog proteina koji je kodiran negde drugde. Takvi geni obuhvataju gene koji kodiraju elemente mašinerije za sekreciju, gene koji kodiraju translokatore, gene koji kodiraju kontrolne elemente, gene koji kodiraju T3SS efektorske šaperone i gene koji kodiraju efektore, kao i druge proteine kodirane sa SPI-1 ili SPI-2. U poželјnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, promotor je nativni promotor gena koji kodira funkcionalan T3SS efektor. Ukoliko je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj Salmonella soj, promotora je izabran od bilo kog od efektorskih proteina. Poželјnije, promotor je iz SopE, InvB ili SteA.
[0054] U poželјnom primeru izvođenja, ekspresioni vektor sadrži DNK sekvencu koja kodira mesto cepanja za proteazu. Generisanje funkcionalnog i generalno primenjivog mesta cepanja omogućava isecanje signala za isporuku nakon translokacije. Pošto signal za isporuku može ometati ispravnu lokalizaciju i/ili funkciju translociranog proteina unutar cilјnih ćelija, uvođenje mesta cepanja proteaze između signala za isporuku i proteina od interesa obezbeđuje po prvi put isporuku gotovo nativnih proteina u eukariotske ćelije. Poželјno mesto cepanja proteaze je aminokiselinski motiv koji se iseca proteazom ili njenim katalitičkim domenima izabranim iz grupe koja se sastoji od enterokinaze (lakog lanca), enteropeptidaze, presizicione proteaze, humane rinovirusne proteaze 3C, TEV proteaze, TVMV proteaze, proteaze FaktoraXa i trombina, poželјnije aminokiselinski motiv koji se cepa TEV proteazom. Jednako poželјno mesto cepanja proteaze je aminokiselinski motiv koji se cepa proteazom ili njenim katalitičkim domenima izabranim iz grupe koja se sastoji od enterokinaze (lakog lanca), enteropeptidaze, presizicione proteaze, humane rinovirusne proteaze 3C, TEV proteaze, TVMV proteaze, proteaze FaktoraXa, proteaze za obradu ubikvitina, nazvane deubikvitinacionim enzimom, i trombina. Najpoželјniji je aminokiselinski motiv koji se cepa TEV proteazom ili proteazom obrade ubikvitina. Stoga, u daljem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, heterologni protein se odvaja od signala za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina proteazom. Poželјni postupci cepanja su postupci gde:
a) proteaza se transportuje u eukariotsku ćeliju rekombinantnim Gram-negativnim bakterijskim sojem, kao što je ovde opisano, koji eksprimira fuzionisani protein koji sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina i proteazu kao heterologni protein; ili
b) proteaza se konstitutivno ili tranzientno eksprimira u eukariotskoj ćeliji.
Obično su rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj koji se upotrebljava za isporuku želјenog proteina u eukariotsku ćeliju i rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj koji prenosi proteazu u eukariotsku ćeliju različiti.
[0055] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, vektor sadrži dodatnu DNK sekvencu koja kodira molekul obeleživača ili akceptorsko mesto za molekul obeleživača. Dodatna DNK sekvenca koja kodira molekul obeleživača ili akceptorsko mesto za molekul obeleživača se obično fuzioniše na 5’ kraj ili na 3' kraj druge DNK sekvence. Poželјni molekul za obeležavanje ili akceptorsko mesto za molekul obeleživača su izabrani iz grupe koja se sastoji od pojačanog zelenog fluorescentnog proteina (EGFP), kumarina, akceptorskog mesta kumarin ligaze, rezorufina, akceptorskog mesta rezorufin ligaze, tetracisteinskog motiva pri upotrebi FlAsH/ReAsH boje (Life technologies). Najpoželјniji je rezorufin i akceptorsko mesto rezorufin ligaze ili EGFP. Upotreba molekula obeleživača ili akceptorskog mesta za molekul obeleživača će dovesti do vezanja molekula obeleživača za heterologni protein od interesa, koji će tada biti isporučen kao takav u eukariotsku ćeliju i omogućiti praćenje proteina npr. ćelijskom mikroskopijom uživo.
[0056] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, vektor sadrži dodatnu DNK sekvencu koja kodira peptidni tag. Dodatna DNK sekvenca koja kodira peptidni tag je obično fuzionisana na 5’ kraj ili na 3' kraj druge DNK sekvence. Poželјan peptidni tag je izabran iz grupe koja se sastoji od Myc-taga, His-taga, Flag-taga, HA taga, Strep-taga ili V5 taga ili kombinacije dve ili više tagova iz ovih grupa. Najpoželјniji su Myc-tag, Flag-tag, His-tag i kombinacija Myc- i His-taga. Upotreba peptidnog taga će dovesti do mogućnosti praćenja tag-obeleženog proteina, npr. imunofluorescencijom ili imunoblot analizom, upotrebom antitela na tag-obeleživač. Nadalјe, upotreba peptidnog taga omogućava afinitetno prečišćavanje želјenog proteina bilo nakon sekrecije u supernatant kulture ćelija ili nakon translokacije u eukariotske ćelije, u oba slučaja upotrebom postuka pogodnog za odgovarajući tag (npr. metal-helatno afinitetno prečišćavanje pri upotrebi prečišćavanja zasnovanog na anti-His-tagu ili anti-Flag antitela pri upotrebi Flag-taga).
[0057] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, vektor sadrži dalјu DNK sekvencu koja kodira signal lokalizacije u jedro (NLS). Dalјa DNK sekvenca koja kodira signal lokalizacije u jedro (NLS) se obično fuzioniše na 5'-kraj ili na 3'-kraj druge DNK sekvence, pri čemu navedena dalјa DNK sekvencija kodira signal lokalizacije u jedro (NLS). Poželјni NLS je izabran iz grupe koju čine veliki T-antigenski NLS iz SV40 i njegovi derivati [44] kao i drugi virusni NLS. Najpoželјniji je veliki T-antigenski NLS iz SV40 i njegovi derivati.
[0058] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, vektor sadrži mesto višestrukog kloniranja. Mesto višestrukog kloniranja se obično nalazi na 3’ kraju prve DNK sekvence i/ili na 5' kraju ili 3' kraju druge DNK sekvence. Vektor može sadržavati jedno ili više od mesta višestrukog kloniranja. Poželјno mesto višestrukog kloniranja je izabrano iz grupe restrikcionih enzima koja se sastoji od XhoI, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, SacI, SalI, BstBI. Najpoželјnije je XbaI, XhoI, BstBI i HindIII.
[0059] Protein eksprimiran sa fuzionisane prve i druge i opciono treće DNK sekvence vektora se takođe definiše kao "fuzioni protein" ili "hibridni protein", tj. fuzionisani protein ili hibrid signala za isporuku i heterolognog proteina. Fuzioni protein može takođe sadržavati npr. signal za isporuku i dva ili više različitih heterolognih proteina.
[0060] Predmetni pronalazak razmatra postupak za isporuku heterolognih proteina, kao što je prethodno opisano, u eukariotske ćelije u ćelijskoj kulturi, kao i in vivo.
[0061] Shodno navedenom, u jednom primeru izvođenjam postupak za isporuku heterolognih proteina obuhvata
i) kultivisanje Gram-negativnog bakterijskog soja kao što je ovde opisano;
ii) dovođenje eukariotske ćelije u kontakt sa Gram-negativnim bakterijskim sojem i), pri čemu fuzioni protein sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina i heterologni protein, eksprimiran je od strane Gram-negativnog bakterijskog soja i translocira se u eukariotsku ćeliju; a opciono
iii) cepanje fuzionog proteina tako da se heterologni protein iseca i odvaja od signala za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina.
[0062] U pojedinim primerima izvođenja, najmanje dva fuziona proteina, od kojih svaki sadrži signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina i heterologni protein, eksprimirani su od strane Gram-negativnog bakterijskog soja i prenose se u eukariotsku ćeliju postupcima predmetnog pronalaska.
[0063] Rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj može biti kultivisan tako da se eksprimira fuzioni protein koji sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina i heterologni protein, u skladu sa postupcima poznatim u oblasti tehnike (npr. FDA, Bacteriological Analytical Manual (BAM), poglavlјe 8: Yersinia enterocolitica). Poželјno, rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj može biti kultivisan u BHI medijumu, npr. na 28°C. Za indukciju ekspresije T3SS-a i npr. gena koji zavise od YopE/SycE promotora, bakterije mogu biti gajene na 37°C.
[0064] U poželјnom primeru izvođenja, eukariotska ćelija je u kontaktu sa dva Gram-negativna bakterijska soja i), pri čemu prvi Gram-negativni bakterijski soj eksprimira prvi fuzioni protein koji sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina i prvi heterologni protein, dok drugi Gramnegativni bakterijski soj eksprimira drugi fuzioni protein koji sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina i drugi heterologni protein, tako da se prvi i drugi fuzioni protein premeštaju u eukariotsku ćeliju. Ovaj primer izvođenja obezbeđuje istovremenu infekciju npr. eukariotskih ćelija sa dva bakterijska soja, kao validan postupak za isporuku npr. dva različita hibridna proteina u pojedinačne ćelije da bi se ispitala njihova fukcionalna interakcija.
[0065] Predmetni pronalazak razmatra širok spektar eukariotskih ćelija na koje može biti ciljano delovano predmetnim rekombinantnim Gram-negativnim sojem bakterija, npr. Hi-5 (BTI-TN-5B1-4; Life technologies B855-02), HeLa ćelije, npr. HeLa Ccl2 (ATCC br. CCL-2), ćelije fibroblasta, npr. 3T3 ćelije fibroblasta (ATCC br. CCL-92) ili Mef (ATCC br. SCRC-1040), Hek (ATCC br. CRL-1573), HUVEC (ATCC br. PCS-100-013), CHO (ATCC br. CCL-61), Jurkat (ATCC br. TIB-152), Sf-9 (ATCC br. CRL-1711), HepG2 (ATCC br. HB-8065), Vero (ATCC br. CCL-81), MDCK (ATCC br. CCL-34), THP-1 (ATCC br. TIB-202), J774 (ATCC br. TIB-67), RAW (ATCC br. TIB-71), Caco2 (ATCC br. HTB-37), NCI ćelijske linije (ATCC br. HTB-182), DU145 (ATCC br. HTB-81), Lncap (ATCC br. CRL-1740), MCF-7 (ATCC br. HTB-22), MDA-MB ćelijske linije (ATCC br. HTB-128), PC3 (ATCC br. CRL-1435), T47D (ATCC br. CRL-2865), A549 (ATCC br. CCL-185), U87 (ATCC br. HTB-14), SHSY5Y (ATCC br. CRL-2266s), Ea.Hi926 (ATCC br. CRL-2922), Saos-2 (ATCC br. HTBH-85), 4T1 (ATCC br. CRL-2539), B16F10 (ATCC br. CRL-6475) ili primarne humane hepatocite (HMCPIS firme Life technologies), poželјno HeLa, Hek, HUVEC, 3T3, CHO, Jurkat, Sf-9, HepG2 Vero, THP-1, Caco2, Mef, A549, 4T1, B16F10 i primarne humane hepatocite, a najpoželјnije HeLa, Hek, HUVEC, 3T3, CHO, Jurkat, THP-1, A549 i Mef. Pod "ciljanim dejstvom" se podrazumeva vanćelijska adhezija rekombinantnog, Gram-negativnog bakterijskog soja za eukariotsku ćeliju.
[0066] U skladu sa predmetnim pronalaskom, isporuka proteina može biti postignuta dovođenjem u kontakt eukariotske ćelije sa rekombinantnim Gram-negativnim bakterijskim sojem pod odgovarajućim uslovima. Stručnjacima iz oblasti tehnike su konvencionalno dostupne razne reference i tehnike u pogledu uslova za indukciju ekspresije i translokacije virulonskih gena, uklјučujući želјenu temperaturu, koncentraciju Ca<++>, dodavanje induktora poput Congo crvenog, načina na koji se mešaju rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj i ciljne ćelije i slično. Pogledati, na primer, [45]. Uslovi mogu varirati u zavisnosti od vrste eukariotskih ćelija na koje se ciljano deluje, kao i od rekombinantnog bakterijskog soja koji se upotrebljava. Navedene varijacije mogu biti ispitane od strane stručnjaka iz oblasti tehnike, upotrebom konvencionalnih tehnika. Stučnjaci takođe mogu upotrebiti brojne testove za određivanje da li je isporuka fuzionog proteina uspešna. Na primer, fuzioni protein se može detektovati imunofluorescencijom, upotrebom antitela koja prepoznaju fuzionisani tag (kao npr. Myctag). Određivanje se takođe može zasnivati na enzimskoj aktivnosti proteina koji je isporučen, npr. ispitivanjem koje je opisano u [13].
[0067] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak prečišćavanja heterolognog proteina koji obuhvata kultivisanje Gram-negativnog bakterijskog soja, kao što je ovde opisano, tako da se fuzioni protein koji sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina i heterologni protein, eksprimira i izlučuje u supernatant culture ćelija. Fuzioni protein koji je eksprimiran, može dalјe sadržavati mesto cepanja proteazom, između signala za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina i heterolognog proteina i/ili može dalјe sadržavati peptidni tag.
Stoga, u posebnom primeru izvođenja, postupak prečišćavanja heterolognog proteina obuhvata
i) kultivisanje Gram-negativnog bakterijskog soja kao što je opisano, tako da se fuzioni protein koji sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina, heterologni protein i mesto cepanja proteazom između signala za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina i heterolognog proteina, eksprimira i izlučuje u supernatant kulture ćelija;
ii) dodavanje proteaze u supernatant kulture, pri čemu proteaza cepa fuzioni protein tako da se heterologni protein odvaja od signala za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina;
iii) opciono, izolovanje heterolognog proteina iz supernatanta kulture ćelija.
[0068] Shodno navedenom, u drugom posebnom primeru izvođenja, postupak prečišćavanja heterolognog proteina obuhvata
i) kultivisanje Gram-negativnog bakterijskog soja kao što je opisano, tako da se fuzioni protein koji sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina, heterologni protein i peptidni tag, eksprimira i izlučuje u supernatant kulture ćelija;
ii) ciljano dejstvo na peptidni tag, npr. afinitetnim prečišćavanjem supernatanta na koloni;
[0069] Dakle, u još jednom posebnom primeru izvođenja, postupak prečišćavanja heterolognog proteina obuhvata
i) kultivisanje Gram-negativnog bakterijskog soja kao što je opisano, tako da se fuzioni protein koji sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina, heterologni protein, mesto cepanja proteazom između signala za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina i peptidni tag, eksprimiraju i izlučuju u supernatant kulture ćelija;
ii) dodavanje proteaze u supernatant kulture, pri čemu proteaza cepa fuzioni protein tako da se heterologni protein odvaja od signala za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina;
iii) ciljano dejstvo na peptidni tag, npr. afinitetnim prečišćavanjem supernatanta na koloni.
[0070] U prethodno opisanim posebnim primerima izvođenja, proteaza može biti dodata u supernatant kulture u obliku, npr. prečišćenog proteaznog proteina ili dodavanjem bakterijskog soja koji eksprimira i izlučuje proteazu u supernatant kulture. Sledeći koraci mogu uklјučivati uklanjanje proteaze, npr. afinitetnim prečišćavanjem na koloni.
[0071] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantan Gramnegativni bakterijski soj koji je ovde opisan, za upotrebu u medicini.
[0072] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantan Gramnegativni bakterijski soj koji je ovde opisan, za upotrebu u isporuci heterolognog proteina subjektu u vidu leka ili u vidu vakcine. Heterologni protein može biti isporučen subjektu kao vakcina, kontaktom Gram-negativnog bakterijskog soja sa eukariotskim ćelijama, npr. sa živom životinjom in vivo, tako da se heterologni protein prebacuje u živu životinju koja tada stvara antitela na heterologni protein. Proizvedena antitela mogu biti direktno upotrebljena ili izolovana i prečišćena, pa upotrebljena u dijagnostici, istraživanjima, kao i u terapiji. B-ćelije koje poizvode antitela ili one koje sadrže DNK sekvencu, mogu biti upotrebljene za dalju proizvodnju specifičnih antitela za upotrebu u dijagnostici, istraživanjima, kao i u terapiji.
[0073] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za isporuku heterolognog proteina, pri čemu se heterologni protein isporučuje u eukariotsku ćeliju in vitro.
[0074] U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za isporuku heterolognog proteina, pri čemu je eukariotska ćelija živa životinja i pri čemi je živa životinja u kontaktu sa Gram-negativnim bakterijskim sojem in vivo, tako da je fuzioni protein translocira u živu životinju. Poželјna životinja je sisar, poželјnije ljudsko biće.
[0075] U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja koji je prethodno opisan, za skrining velikog obima u cilju identifikacije inhibitora ćelijskih puteva ili događaja pokrenutih translociranim heterolognim proteinom/proteinima.
[0076] U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje biblioteku Gram-negativnih bakterijskih sojeva, pri čemu je heterologni protein kodiran drugom DNK sekvencom ekspresionog vektora Gram-negativnih bakterijskih sojeva, humani ili mišji protein, poželјno humani protein, i pri čemu je svaki humani ili mišji protein koji je eksprimiran od strane Gram-negativnog bakterijskog soja različit po aminokiselinskoj sekvenci. Moguća biblioteka može npr. sadržavati 560 proteina koji sadrži Addgene kolekciju Orf humane kinaze (Addgene br.1000000014). Kao vektori kloniranja za ekspresiju mogu biti upotrebljeni prethodno opisani ekspresioni vektori.
[0077] U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži vektor koji je ovde opisan i bakterijski soj koji eksprimira i luči proteazu sposobnu da deluje na mesto cepanja proteazom koji je sadržan u vektoru. Posebno koristan vektor je vektor za upotrebu u kombinaciji sa bakterijskim sojem za isporuku želјenog proteina u eukariotske ćelije, kao što je prethodno opisano, pri čemu vektor sadrži, u smeru od 5’ ka 3':
promotor;
prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina, operativno povezanu sa navedenim promotorom;
drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein fuzionisan na 3’ kraj navedene prve DNK sekvence uz održavanje okvira čitanja; i alternativno
treću DNK sekvencu koja kodira mesto cepanja proteazom, pri čemu je treća DNK sekvenca smeštena između 3’ kraja navedene prve DNK sekvence i 5’ kraja navedene druge DNK sekvence.
Primeri
Primer 1:
A) Materijali i metode
[0078] Sojevi bakterija i uslovi rasta. Sojevi upotrebljeni u ovoj studiji su navedeni u vidu liste na Slikama od 15A do M. E. coli Top10 koja je upotrebljena za prečišćavanje i kloniranje plazmida, E. coli Sm10 λ pir koja je upotrebljena za konjugaciju, kao i E. coli BW19610 [46] koja je upotrebljena za propagaciju pKNG101, rutinski su gajene na LB agaroznim podlogama i u LB bujonu na 37°C. Ampicilin je upotrebljavan u koncentraciji od 200 µg/ml (Yersinia) ili 100 µg/ml (E. coli) da bi se selektovali ekspresioni vektori. Streptomicin je upotrebljavan u koncentraciji od 100 µg/ml da bi se selektovali vekotori “samoubistva”. Y.enterocolitica MRS40 [36], derivat E40 koji nije rezistentan na ampicilin [13] i sojevi koji su izvedeni iz njega, rutinski su gajeni na BHI podlozi (od engl. Brain Heart Infusion; Difco) na sobnoj temperaturi. Svim sojevima Y.enterocolitica je dodata Nalidiksična kiselina (35 µg/ml) i svim Y.enterocolitica asd sojevi je dodatno, u vidu suplementa, dodato po 100 µg/ml meso-2,6-diaminopimelinske kiseline (mDAP, Sigma Aldrich). S. enterica SL1344 su rutinski gajeni na LB agaroznoj podlozi i u LB bujonu na 37°C. Ampicilin je korišćen u koncentraciji od 100 µg/ml da bi se selektovali ekspresioni vektori u S. enterica.
[0079] Genetičke manipulacije Y.enterocolitica. Genetičke manipulacije Y.enterocolitica su opisane [47, 48]. Ukratko, mutirajuće supstance za modifikaciju ili deleciju gena u pYV plazmidima ili na hromozomu su konstruisani upotrebom PCR postupka sa 2 preklapajuća fragmenta, upotrebom prečišćenog pYV40 plazmida ili genomske DNK kao matrice, što je dovelo do obrazovanja uokvirujućih sekvenci od po 200-250 bp na oba kraja dela odgovarajućeg gena koji je uklonjen delecijom ili modifikovan. Dobijeni fragmenti su klonirani u pKNG101 [43] u E. coli BW19610 [46]. Plazmidi verifikovane sekvence su transformisani u E. coli Sm10 λ pir, odakle su plazmidi mobilizovani u odgovarajući soj Y.enterocolitica. Mutanti koji su sadržavali integrisan vektor su propagirani tokom nekoliko generacija bez primene selekcionog pritiska. Potom je za selekciju klonova koji su izgubili vektor upotrebljena saharoza. Konačno, mutanti su identifikovani PCR-om za detekciju kolonija.
[0080] Konstrukcija plazmida. Plazmid pBad_Si2 ili pBad_Si1 (Slika 10) je upotrebljen za kloniranje fuzionog proteina koji je sadržavao 138 aminokiselina N-kraja YopE (SEQ ID No. 2). pBad_Si2 je konstruisan kloniranjem SycE-YopE1-138fragmenta koji je sadržavao endogene promotore za YopE i SycE iz prečišćenog pYV40 u KpnI/HindIII mesto pBad-MycHisA (Invitrogen).
[0081] Dodatne modifikacije obuhvataju uklanjanje NcoI/BglII fragmenta pBad-MycHisA digestijom, tretman Klenovim fragmentom i ponovnu ligaciju. Bidirekciona sekvenca terminacije transkripcije (BBa_B1006; iGEM foundation) je klonirana u isečeno KpnI mesto i tretirana Klenovim fragmentom (pBad_Si2) ili u BglII mesto sečenja (pBad_Si1). Dalјe su na 3’ kraj YopE1-138dodata sledeća mesta cepanja: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII) (Sl. 10 B). pBad_Si1 je jednak pBad_Si2, s time da on kodira EGFP amplifikovan iz pEGFP-C1 (Clontech) u NcoI/BglII mesto pod kontrolom promotora koji je inducibilan na arabinozu. Plazmidi pSi_266, pSi_267, pSi_268 i pSi_269 koji sadrže odgovarajući endogeni promotor i SteA1-20fragment (pSi_266), SteA sekvencu pune dužine (pSi_267), SopE1-81fragment (pSi_268) ili SopE1-105fragment (pSi_269) su amplifikovani iz genomske DNK S. enterica SL1344 i klonirani u NcoI/KpnI mesto pBad-MycHisA (Invitrogen).
[0082] Geni pune dužine ili njihovi fragmenti su amplifikovani sa specifičnim primerima koji su navedeni u Tabeli I ispod, nakon čega su klonirani kao fuzije sa YopE1-138u plazmid pBad_Si2 ili u slučaju z-BIM (SEQ ID No.21) u pBad_Si1 (pogledati Tabelu II ispod). Za fuziju sa SteA ili SopE, sintetski DNK konstrukti su isečeni sa KpnI/HindII i klonirani u pSi_266, pSi_267, pSi_268 ili pSi_269, tim redom. U slučaju gena bakterijskih vrsta, upotrebljavana je prečišćena genomska DNK kao matrica (S. flexneri M90T, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Tiphimurium SL1344, Bartonella henselae ATCC 49882). Za humane gene je upotrebljavana univerzalna cDNK biblioteka (Clontech), ukoliko nije drugačije naznačeno (Slike od 15A do M), dok su geni zebra-ribica amplifikovani iz cDNK biblioteka (ljubazan poklon M. Affolter). Ligacijom povezani plazmidi su kloniraniu E. coli Top 10. Sekvencirani plazmidi su elektroporacijom uvedeni u želјeni Y.enterocolitica ili S. enterica soj, upotrebom uslova koji su standardni za E. coli.
Tabela I (Prajmer br. Si: Sekvenca)
GGA
Tabela II: Klonirani fuzioni roteini
[0083] Sekrecija Yop. Indukcija yop regulona je izvedena premeštanjem kulture na 37°C u BHI-Ox (uslovi koji dozvolјavaju izlučivanje) [49]. Kao izvor uglјenika je dodata glukoza (4 mg/ml).
Ukupne ćelije i frakcije supernatanta su razdvojene centrifugiranjem na 20800 g tokom 10 min na 4°C. Talog ćelija je uzet kao ukupna ćelijska frakcija. Proteini u supernatantu su istaloženi sa trihlorsirćetnom kiselinom u finalnoj koncentraciji od 10% (w/v) tokom 1 h na 4°C. Nakon centrifugiranja (20800 g tokom 15 minuta) i uklanjanja supernatanta, dobijeni talog je ispran ledeno hladnim acetonom preko noći. Uzorci su ponovo centrifugirani, supernatant je odbačen, a talog je osušen na vazduhu i resuspendovan u 1x boji sa SDS-om za nanošenje uzoraka.
Izlučeni proteini su analizirani SDS-PAGE postupkom; u svakom slučaju, proteini koje je izlučilo 3 × 10<8>bakterija su nanošeni u svaki bunarić/traku. Detekcija specifičnih proteina koji su izlučeni urađena je imunoblot postupkom, upotrebom SDS-PAGE gelova od 12,5%. Za detekciju proteina u ukupnim ćelijama, u bunariće je naneto po 2 × 10<8>bakterija, ukoliko nije drugačije navedeno, pa su proteini razdvojeni na 12,5% SDS-PAGE gelovima pre detekcije imunoblotovanjem.
Imunoblotovanje je urađeno upotrebom monoklonskih antitela pacova na YopE (MIPA193 - 13A9; 1:1000, [50]). Antiserum je prethodno dva puta apsorbovan preko noći sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd da bi se smanjilo bojenje pozadine. Detekcija je rađena sa sekundarnim antitelom dobijenim na antitela pacova koja su bila konjugovana sa peroksidazom rena (1:5000; Southern biotech), pre razvijanja sa ECL hemiluminescentnim supstratom (LumiGlo, KPM).
[0084] Ćelijska kultura i infekcije. HeLa Ccl2, ćelije Swiss 3T3 fibroblasta, 4T1, B16F10 i D2A1 su gajene u Dulbecco-vom modifikovanom Eagle-ovom medijumu (DMEM) u koje je dodato 10% FCS-a i 2 mM L-glutamina (cDMEM). HUVEC su izolovani i gajene kao što je opisano [51]. Jurkat i 4T1 ćelije su gajene u RPMI 1640 medijumu u koji je dodato 10% FCS-a i 2 mM L-glutamina. Y.enterocolitica su gajene u BHI sa aditivima, preko noći na ST, nakon čega su ćelije razblažene u svežem BHI do OD600od 0,2 i dozvoljen im je rast tokom 2 sata na ST, a pre nego što je temperatura prebačena na 37°C premeštanjem u vodeno kupatilo sa klackalicom, gde su inkubirane tokom narednih 30 minuta ili 1 sata, u slučaju isporuke EGFP-a. Konačno, bakterije su prikuplјene centrifugiranjem (6000 rcf, 30 s) i isprane jedan put sa DMEM-om u koji je bilo dodato 10 mM HEPES-a i 2 mM L-glutamina. S. enterica su gajene u LB-u sa aditivima preko noći na 37°C ili su razblažene u odnosu 1:40 u svežem LB i gajene tokom 2,5 h na 37°C (Spil T3SS uslovi indukcije) ili je pak prekonoćna kultura dalјe inkubirana na 37°C (SpiIl T3SS uslovi indukcije). Konačno, bakterije su prikuplјene centrifugiranjem (6000 rcf, 30 s) i isprane jednom sa DMEM-om u koji su bili dodati 10 mM HEPES i 2 mM L-glutamin. Ćelije su dalje zasejane u mikrotitar ploče sa 96 bunarića (za imunofluorescenciju) ili sa 6 bunarića (za imunoblot analizu), pa su inficirane sa naznačenim MOI u DMEM-u u koji su bili dodati 10 mM HEPES i 2 mM L-glutamin. Nakon dodavanja bakterija, ploče su centrifugirane tokom 1 min na 1750 obrtaja/min, pa su premete na 37°C i inkubirane tokom naznačenih vremenskih perioda. Bakterije van ćelija su ubijene gentamicinom (100 mg/ml), ukoliko je naznačeno. U slučaju imunofluorescentne analize, testovi infekcije su zaustavlјeni fiksacijom sa 4% PFA. Za imunoblot analizu, ćelije su isprane dva puta ledenim PBS-om, pa je dodat pufer za lizu koji je pogodan za sprečavanje gubitka fosfo grupa (Phospho-safe; Novagen), a da bi se ćelije lizirale. Nakon inkubacije na ledu, ćelije su centrifugirane (16000 rcf, 25 min, 4°C). Supernatanti su prikuplјeni i analizirani na ukupan sadržaj proteina Bradford BCA testom (Pierce), pre SDS PAGE i imunoblot analize, upotrebom anti-fosfo-Akt (Ser473 i T308, oba do firme Cell Signaling), anti-Actin (Millipore), Anti-Bid (Cell Signaling), anti-Myc (Santa Cruz), anti-p38 (Cell Signaling), anti-fosfo-p-38 (Thr180/Tyr182; Cell Signaling), anti- p17 Kaspaze-3 (Cell Signaling) i anti-Ink4C (Cell Signaling) antitela.
[0085] Analiza sekrecije sa S. enterica. Za indukciju sekrecije proteina sa S. enterica, S. enterica su gajene preko noći u LB medijumu koji je sadržavao 0,3 M NaCl i upotrebom orbitalnog mešača (podešenoj na 150 obrtaja/min). S. enterica su zatim razblažene na 1:50 u svežem LB-u koji je sadržavao 0,3 M NaCl i gajene su na 37°C tokom 4 sata bez mućkanja.
Ukupne ćelije i frakcije supernatanta su razdvojene centrifugiranjem na 20800 g tokom 10 min na 4°C. Talog ćelija je uzet kao ukupna ćelijska frakcija. Proteini u supernatantu su istaloženi trihlorsirćetnom kiselinom u finalnoj koncentraciji od 10% (w/v) tokom 1 h na 4°C. Nakon centrifugiranja (20800 g tokom 15 minuta) i uklanjanja supernatanta, dobijeni talog je ispran ledeno hladnim acetonom preko noći. Uzorci su ponovo centrifugirani, supernatant je odbačen, a talog je osušen na vazduhu i resuspendovan u 1x boji sa SDS-om za nanošenje uzoraka.
Izlučeni proteini su analizirani SDS-PAGE postupkom; u svakom slučaju, proteini koje je izlučilo po 3 × 10<8>bakterija je nanošeno u bunariće/po traci. Detekcija specifičnih izlučenih proteina imunoblot postupkom je urađena upotrebom SDS-PAGE gelova od 12,5%. Za detekciju proteina u ukupnim ćelijama, u bunariće je nanošeno po 2 × 10<8>bakterija, ukoliko nije drugačije navedeno, pa su proteini razdvojeni na 12,5% SDS-PAGE gelovovima pre detekcije imunoblotovanjem. Imunoblot analiza je urađena upotrebom anti-Myc antitela (Santa Cruz).
[0086] Imunoblot analiza proteina translociranih sa T3SS iz inficiranih ćelija. HeLa ćelije u pločicama sa 6 bunarića su inficirane sa MOI od 100, kao što je prethodno opisano. U slučaju koinfekcije sa sojem Y.enterocolitica koji translocira TEV proteazu, OD600sojeva je podešen i dve suspenzije bakterija su pomešane u epruveti u odnosu od 1:1 (ukoliko nije drugačije naznačeno) pre dodavanja ćelijama. Na kraju infekcije, ćelije su isprane dva puta ledeno hladnim PBS-om i struganjem su prikupljene u malu količini ledeno hladnog PBS-a. Nakon centrifugiranja (16000 rcf, 5 min, 4°C) talog je rastvoren u 0,002% digitoninu u koji je dodat koktel proteaznih inhibitora (Roche complete, Roche). Rastvoreni talozi su inkubirani 5 minuta na ledu i zatim centrifugirani (16000 rcf, 25 min, 4°C). Supernatanti su prikuplјeni i analizirani na ukupan sadržaj proteina Bradford BCA testom (Pierce) pre SDS PAGE i imunoblot analize upotrebom anti-Myc (Santa Cruz, 9E11) ili anti-Ink4C antitela (Cell Signaling).
[0087] Imunofluorescencija. Ćelije, zasejane u pločama sa 96 bunarića (Corning), su inficirane kao što je prethodno opisano, a nakon fiksacije sa 4% PFA, ćelije su isprane tri puta PBS-om. Bunarići su zatim blokirani tokom 1 h na ST upotrebom 5% seruma koze u PBS-u sa 0,3% Tritona X-100. Primarno antitelo (anti-Myc, Santa Cruz, 1:100) je razblaženo u PBS-u sa 1% BSA i 0,3% Triton X-100, pa su ćelije inkubirane preko noći na 4°C. Ćelije su zatim isprane 4 puta sa PBS-om, pre dodavanja sekundarnog antitela (AF 488 anti-mišji, Life technologies, 1:250) koje je bilo razblaženo u PBS-u sa 1% BSA i 0,3% Tritona X-100. Ukoliko je bilo potrebno, uklјučeno je bojenje Hoechst DNK bojom (Life technologies, 1:2500) i/ili bojenje aktina (Dy647-Phalloidin, DyeOmics). U pojedinim slučajevima, samo su DNK ili boja za aktin direktno primenjivane nakon ispiranja PFA. Ćelije su inkubirane tokom 1h na ST, isprane su tri puta PBS-om i analizirane automatskom analizom slike, kao što je opisano u dalјem tekstu.
[0088] Automatizovana mikroskopija i analiza slike. Slike su snimane automatski, upotrebom ImageXpress Micro sistema (Molecular devices, Sunnyvale, SAD). Kvantifikacija intenziteta anti-Myc bojenja je urađena upotrebom MetaX-press kompjuterskog programa (Molecular devices, Sunnyvale, SAD). Regioni unutar ćelija, isklјučujući regione jedra i regione koji su sadržavali bakterije, su ručno birani (krugovi površine od 40 piksela) i zabeleženi su prosečni intenziteti.
[0089] Stimulacija TNFa i imunoblot analiza fosfo-p38. HeLa ćelije, zasejane u ploče sa 6 bunarića, su inficirane sa MOI od 100, kao što je prethodno opisano. Zatim je 30 min nakon infekcije (p.i.) dodat gentamicin, a 45 p.i. je dodat i TNFa (10 ng/ml). Nakon 1 h 15min p.i., ćelije su isprane ledenim PBS-om dva puta i dodat je Phospho-safe pufer za lizu (Novagen) da bi se ćelije lizirale. Nakon inkubacije na ledu, ćelije su centrifugirane (16 000 rcf, 25 min, 4°C). Supernatanti su prikuplјeni i analizirani na ukupan sadržaj proteina Bradford BCA testom (Pierce) pre SDS PAGE i imunoblot analize upotrebom anti-fosfo-p38, ukupnog p38 antitela (Cell Signaling) i antitela za aktin (Millipore).
[0090] Određivanje nivoa cAMP u inficiranim HeLa ćelija. HeLa ćelije, zasejane u ploče sa 96 bunarića, su inficirane kao što je prethodno opisano.30 min pre infekcije, cDMEM je promenjen u DMEM koji je sadržavao 10 mM HEPES-a i 2 mM L-glutamina, kao i 100 µM 3-Izobutil-1-metilksantina (IBMX, Sigma Aldrich). Gentamicin je dodavan 60 min p.i., pa su ćelije inkubirane na 37°C tokom dodatnih 90 min. Određivanje cAMP je urađeno upotrebom kompetitivnog ELISA testa, prema uputstvima proizvođača (Amersham, cAMP Biotrak, RPN225). Kao pozitivna kontrola, ćelijama je dodata naznačena količina toksina kolere (C8052, Sigma Aldrich) koja je inkubirana tokom 1 h u DMEM-u koji je sadržavao 10 mM HEPES i 2 mM L-glutamin i 100 µM IBMX.
[0091] Infekcije embriona zebra-ribica, snimanje i automatizovana kvantifikacija slika. Svi eksperimenti sa životinjama su urađeni u skladu sa odobrenim smernicama. Zebra-ribice su održavane u standardnim uslovima [52]. Stadijumi embriona su definisani prema satima nakon oplodnje (hpf, od engl. hours postfertilization) na 28,5°C [53]. U ovom istraživanju su upotrebljene sledeće linije zebraribica: ribice divlјeg tipa (AB/EK i EK/TL). Protokol infekcije je bio u skladu sa smernicama navedenim u [54]. Embrioni stari 12 hpf su održavani u E3 medijumu koji je sadržavao 0,2 mM N-feniltioureu (PTU) da bi se sprečilo obrazovanje pigmenta. Embrioni stari 2 dana nakon oplodnje (dpf) su anestezirani sa 0,2 mg/ml Trikaina i poređani su na 1% agarozne podloge u E3, upotrebom eza sa omčom [54]. Y.enterocolitica su gajene u BHI sa dodatkom 0,4% arabinoze i antibiotika i mDap preko noći na ST, pa su razblažene u svežem BHI sa 0,5% arabinoze i drugih aditiva do OD600od 0,2 i ostavljene da rastu tokom 2 sata na ST pre promene temperature na 37°C premeštanjem na šejker u vodenom kupatilu i inkubacijom tokom sledećih 45 minuta. Konačno, bakterije su prikuplјene centrifugiranjem (6000 rcf, 30 s) i isprane jedan put PBS-om. OD600je podešen na 2 sa PBS-om koji je sadržavao mDAP. Po 1-2 nL ove suspenzije je injecirano u zadnji deo mozga poravnatih embriona zebra-ribica upotrebom Femtojet mikroinjektora (Eppendorf) i Femtotips II mikrokapilara (Eppendorf), pri čemu je vrh igle odlomljen finom pincetom. Vreme injeciranja je bilo podešeno na 0,2 s, a kompenzatoni pritisak na 15 hPa (Eppendorf, Femtojet), dok je pritisak injeciranja podešen između 600 i 800 hPa. Veličina kaplјica i time inokuluma je proveravana pod mikroskopom, kao i kontrolnim zasejavanjem. Nakon mikroinjeciranja, ribice su sakupljene u E3 koji je sadržavao trikain i PTU i inkubirane su 30 minuta na 37°C, a potom tokom dodatnih 5 sati i na 28°C. Fluorescentni binokular (Leica) je upotrebljen za posmatranje bakterijske EGFP fluorescence nakon 1 sata od infekcije u zadnjim delovima mozgova zebra-ribica, a embrioni koji nisu bili propisno injecirani su odbačeni. Na kraju infekcije, ribice su fiksirane sa 2% ledenim PFA tokom 1 sata na ledu i dalјe sa svežim ledeno hladnim PFA preko noći na 4°C. Bojenje antitelima je rađeno kao što je prethodno opisano [55, 56]. Ukratko, embrioni su isprani 4 puta sa PBS / 0,1% Tween, svaki put tokom 5 minuta, pa su permeabilizovani sa PBS-T 0,5% Triton X-100 tokom 30 minuta na ST. Embrioni su blokirani u rastvoru za blokiranje (PBS 0,1% Tween 0,1% TritonX-1005% kozji serum i 1% BSA) na 4°C preko noći. Antitelo (isečena Kaspaza-3 (Asp175), Cell Signaling) je razblaženo 1:100 u rastvoru za blokiranje i inkubirano uz mešanje na 4°C u mraku. Ribice su bile isprane 7 puta sa PBS-om / 0,1% Tween-om tokom 30 minuta, pre dodavanja sekundarnog antitela (kozjeg anti-zečjeg AF647, Invitrogen, 1:500) razblaženog u rastvoru za blokiranje koje je dalje inkubirano na 4°C preko noći. Larve su isprane sa PBS / 0,1% Tween-om četiri puta po 30 min na 4°C i jedan put preko noći, nakon čega su dodatno isprane 3-4 puta. Slike su snimlјene konfokalnim mikroskopom Leica TCS SP5, upotrebom vodenog imerzionog objektiva (40X). Slike su analizirane upotrebom Imaris (Bitplane) i Image J kompjuterskih programa (http://imagej.nih.gov/ij/).
[0092] Analiza slike (na n=14 za pBad_Si2 ili n=19 za z-BIM) je urađena upotrebom kompjuterskog programa CellProfiler [57], upotrebom projekcija maksimalnog intenziteta dobijenih preklapanjem snimljenih optičkih preseka (z osa). Ukratko, bakterije su detektovane preko GFP kanala. Oko svake površine zauzete bakterijama, ucrtan je krug prečnika 10 piksela. Regioni koji su se preklapali su podjednako razdvojeni između povezanih članova. Na površinama koje su blisko okruživale bakterije, izmeren je intenzitet obojenosti p17 Kaspaze 3.
[0093] Priprema uzorka za fosfoproteomiku. Za sve uslove, HeLa CCL-2 ćelije su gajene do konfluentnosti u dve ploče sa 6 bunarića. Ćelije su zatim inficirane tokom 30 minuta kao što je prethodno opisano. U naznačenim vremenskim tačkama, ploče su stavlјane na led i ispirane dva puta ledenim PBS-om. Uzorci su zatim prikupljeni u rastvor uree [8 M urea (AppliChem), 0,1 M amonijumibikarbonat (Sigma), 0,1% RapiGest (Waters), 1 × PhosSTOP (Roche)]. Uzorci su dalje kratko vorteksovani, sonikovani na 4°C (Hielscher), mućkani 5 minuta u termomikseru (Eppendorf) i centrifugirani tokom 20 minuta na 4°C i 16'000g. Supernatanti su prikuplјeni i čuvani na -80°C do dalje analize. BCA test za proteine (Pierce) je upotrebljen za merenje koncentracije proteina.
[0094] Obogaćivanje fosfopeptidima. Disulfidne veze su redukovane sa tris(2-karboksietil)fosfinom u finalnoj koncentraciji od 10 mM, na 37°C tokom 1 h. Slobodni tioli su alkilovani sa 20 mM jodoacetamidom (Sigma) na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta u mraku. Reakcija viška jodoacetamida je zaustavljena N-acetil cisteinom u finalnoj koncentraciji od 25 mM, tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je dodata Lis-C endopeptidaza (Wako) tako da finalni odnos enzima i proteina iznosio 1:200 (w/w), pa je sve inkubirano 4 sata na 37°C. Rastvor je potom razblažen sa 0,1 M amonijumibikarbonatom (Sigma) do finalne koncentracije uree ispod 2 M i urađenna je digestija preko noći na 37°C, sa modifikovanim tripsinom koji je bio stepena čistoće za sekvenciranje (Promega) – odnos proteina i enzima od 50:1. Peptidi su desalinizovani na C18 Sep-Pak koloni (Waters), pa su osušeni pod vakuumom. Fosfopeptidi su izolovani iz 2 mg ukupne peptidne mase sa TiO2, kao što je prethodno opisano [58]. Ukratko, osušeni peptidi su rastvoreni u rastvoru 80% acetonitrila (ACN) i 2,5% trifluorosirćetne kiseline (TFA) koji je bio zasićen ftalnom kiselinom. Peptidi su zatim dodati istoj količini ekvilibrisanog TiO2(veličina zrna 5-µm, GL Sciences) u blokiranu kolonu firme Mobicol (MoBiTec) koji je inkubirana tokom 30 min uz rotacije sa kraja na kraj. Kolona je isprana dva puta sa zasićenim rastvorom ftalne kiseline, potom i dva puta sa 80% ACN i 0,1% TFA, i na kraju dva puta sa 0,1% TFA.
Peptidi su eluirani sa 0,3 M rastvorom NH4OH. pH eluata je podešen da bude ispod 2,5 sa 5% rastvorom TFA i 2 M HCl. Fosfopeptidi su ponovo desalinizovani upotrebom mikrospin C18 kolona (Harvard Apparatus).
[0095] LC-MS/MS analiza. Hromatografsko razdvajanje peptide je urađeno upotrebom EASY nano-LC sistema (Thermo Fisher Scientific), opremlјenog zagrejanom RP-HPLC kolonom (75 µm x 45 cm) koja je bila upakovana interno, u laboratoriji, sa C18 smolom od 1,9 µm ((Reprosil-AQ Pur, dr Maisch). Alikvoti od po 1 µg ukupnog uzorka fosfopeptida su analizirani u svakom LC-MS/MS koraku upotrebom linearnog gradijenta koji je bio opsega od 98% rastvarača A (0,15% mravlјe kiseline) i 2% rastvarača B (98% acetonitril, 2% vode, 0,15% mravlјe kiseline ) do 30% rastvarača B, tokom 120 minuta i pri brzini protoka od 200 nl/min. Analiza masene spektrometrije je rađena na LTQ-Orbitrap masenom spektrometru dvostrukog pritiska opremlјenom sa nanoelektrosprej izvorom jona (oba firme Thermo Fisher Scientific). Svako MS1 skeniranje (dobijeno u Orbitrap-u) je bilo praćeno disocijacijom izazvanom sudarom (CID, dobijeno u LTQ) za 20 najzastupljenijih prekusorskih jona, uz dinamičko isključenje na 30 sekundi. Za fosfopeptidnu analizu, 10 najzastupljenijih prekusorskih jona je podvrgnuto CID uz omogućenu višestepenu aktivaciju. Ukupno vreme ciklusa je bilo oko 2 s. Za MS1, 10<6>jona je prikupljeno u Orbitrap ćeliju tokom maksimalnog vremena od 300 ms, pa je urađeno skeniranje sa rezolucijom od 60000 FWHM (na 400 m/z). MS2 skeniranja su dobijena upotrebom normalnog režima skeniranja i upotrebom ciljne postavke od 10<4>jona, kao i vremenom akumulacije od 25 ms. Pojedinačno naelektrisani joni i joni sa neutvrđenim stanjem naelektrisanja su isklјučeni iz pokretanja MS2 događaja. Normalizovana energija sudara je podešena na 32%, a po jedno mikroskeniranje je snimljeno za svaki spektar.
[0096] Kvantifikacija oslobođena obeležavanja i pretraživanje baza podataka. Neobrađene snimljene datoteke su uvedene u kompjuterski program Progenesis ((Nonlinear Dynamics, verzija 4.0) radi kvantifikacije bez obeležavanja, upotrebom zadatih parametara. MS2 spektri su eksportovani direktno iz Progenesis programa u mgf formatu i pretraženi su upotrebom MASCOT algoritma (Matrix Science, verzija 2.4) u bazi “mamaca” [59] koja je sadržavala normalne i obrnute sekvence predviđenih unosa u SwissProt bazi podataka za Homo sapiens (www.ebi.ac.uk, datum objave 16.05.2012.), kao i uobičajeno uočavane kontaminante (ukupno 41,250 sekvenci) koje su dobijene upotrebom SequenceReverser alatki kompjuterskog programa MaxQuant (verzija 1.0.13.13). Da bi se identifikovali proteini koji potiču iz Y.enterocolitica, u istoj bazi podataka su pretraženi iuzorci koji nisu bili obogaćeni fosfopeptidom, uklјučujući predviđene unose SwissProt za Y.enterocolitica (www.ebi.ac.uk, datum objave 15.08.2013.) Tolerancija za prekursorski jon je podešena na 10 ppm, a tolerancija na jone fragmenta je podešena na 0,6 Da. Kriterijumi pretrage su postavljeni na sledeći način: bila je potrebna potpuna tripsinska specifičnost (cepanje nakon ostataka lizina ili arginina ukoliko nisu praćeni prolinom), dozvolјena su 2 propuštanja predviđanja cepanja, a kao fiksna modifikacija je podešena karbamidometilacija (C), dok su fosforilacija (S, T, Y) ili oksidacija (M) podešene kao varijabilne modifikacije za uzorke obogaćene ili one koji nisu obogaćeni sa TiO2, tim redom. Konačno, rezultati pretraživanja baza podataka su eksportovani u vidu xml-datoteke i ponovo uneti u Progenesis kompjuterski program radi dodele MS1 funkcija. Za kvantifikaciju fosfopeptida, eksportovana je i csv-datoteka koja je sadržavala zastupljenosti MS1 pikova za sve detektovane osobine, dok je za neobogaćene uzorke napravljena csv-datoteka koja je sadržavala sva proteinska merenja zasnovana na zbirnim karakteristikama intenziteta svih identifikovanih peptida po proteinu. Važno je napomenuti da je Progenesis kompjuterski program bio podešen tako da se proteini koji su identifikovani kao oni koji su slični, grupišu zajedno i da su za kvantifikaciju proteina upotrebljavani samo peptidi koji se ne preklapaju sa specifičnim sekvencama za pojedinačne proteine u bazi podataka. Obe datoteke su dalјe obrađene upotrebom interno razvijenog SafeQuant v1.0 R skripta (neobjavlјeni podaci, dostupni na https://github.com/eahrne/SafeQuant/). Ukratko, kompjuterski program postavlјa identifikacioni nivo Stope pogrešne procene od 1% (na osnovu broja pogodaka proteinskih sekvenci “mamaca”) i normalizuje identifikovane zastupljenosti MS1 pikova (ekstrahovan jonski hromatogram, XIC) duž svih uzoraka, tj. sumirani XIC svih pouzdano idetnifikovanih peptidnih karakteristika su svedeni na jednake vrednosti za sve LC-MS analize. Dodatno su svim kvantifikovanim fosfopeptidima/proteinima dodeljene stope zastupljenosti za svaku vremensku tačku, na osnovu medijana XIC po vremenskoj tački. Statistička značajnosti svake stope je izražena kao njegova q-vrednost (stopa pogrešne procene podešena prema p-vrednostima) koja je dobijena izračunavanjem modifikovanih t-statističkih p-vrednosti [60] i prilagođavanjem za višestruka testiranja [61].
[0097] MASCOT je automatski dodeljivao lokaciju fosforiliranih ostataka (ocena> 10). Svi naznačeni spekteri, zajedno sa korišćenim sirovim MS-datotekama i parametrima pretrage će biti deponovani u konzorcijum ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) putem partnerskog repozitorijuma PRIDE [62]. Poravnanje sekvenci je rađeno upotrebom EMBL-EBI alata za višestruko poravnavanje sekvenci ClustalW2 na internet adresi http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalv2/.
B) REZULTATI
Sistem za isporuku proteina zasnovan na sekreciji tipa 3 YopE fuzionih proteina
[0098] Dok sam N-kraj T3SS efektorskog YopE (SEQ ID No.1) Y.enterocolitica sadrži signal za sekreciju koji je dovolјan za translokaciju heterolognih proteina [10], mesto vezanja šaperona (CBS) za njegov šaperon (SycE) nije uklјučeno [63]. Odabrali smo 138 aminokiselina N-kraja YopE (SEQ ID No. 2) da budu fuzionisani sa proteinom koje će biti isporučen, pošto je za isto pokazano da daje najbolјe rezultate u slučaju translokacija drugih heterolognih T3S supstrata [38]. Kako ovih 138 aminokiselina N-kraja YopE sadrže CBS, dalje smo se odlučili za koekspresiju SycE. SycE-YopE1-138fragment koji je kloniran iz prečišćenog Y.enterocolitica pYV40 plazmida virulencije sadrži endogene promotore YopE i njegovog šaperone SycE (Sl. 10). Stoga, fuzioni protein SycE i bilo kog YopE1-138se indukuju brzom promenom temperature za rast sa ST na 37°C. Vreme gajenja kulture na 37°C će uticati na količinu fuzionog proteina koja je prisutna u bakterijama. Višestruko mesto kloniranja (MCS) je dodato na 3’ kraj YopE1-138(Sl.10 B), a nakon njega su sledili Myc i 6xHis tag i Stop kodon.
[0099] Matični soj je pažlјivo selektovan. Najpre, da bi se ograničila translokacija endogenih efektora, upotrebili smo soj Y.enterocolitica kome su delecijom bili uklonjeni svi poznati efektori, Yop H, O, P, E, M i T (nazvan je ΔHOPEMT) [64]. Dodatno, upotrebili smo auksotrofnog mutanta koji ne može da raste u odsustvu egzogeno dodate meso-2,6-diaminopimelinske kiseline [65]. Ovaj soj je bio sa delecijom gena za aspartat-beta-semialdehid dehidrogenazu (Δasd) i klasifikovan je kao soj Nivoa bezbednosti 1 od strane Švajcarske agencije za bezbednost (amandman na A010088/2). Pored navedenog, deletirali smo i adhezioni protein YadA i/ili InvA, da bi se obezbedio veći izbor matičnih sojeva. Iako je upotreba yadA ili yadA/invA sojeva smanjiila indukovan prenos signala u okviru pozadine [66], utvrđen je i uticaj na količinu isporučenog proteina [67].
Karakterizacija isporuke YopE fuzionog proteina u eukariotske ćelije
[0100] U in vitro analizi sekrecije (pogledati Sl. 1 A), sekrecija proteina u okolnu tečnost je veštački indukovana. Nakon taloženja proteina zasnovanog na TCA, urađena je imunoblot analiza sa anti-YopE antitelom, da bi se odredile količine proteina koje su izlučene (Slika 1B). Dok je wt soj izlučivao YopE pune dužine, ΔHOPEMT asd sojevi nisu. Prisustvom YopE-a1-138-Myc-His (u daljem tekstu označenog kao YopE1-138-Myc; SEQ_ID_No._3) je postala vidljiva manja YopE traka (Sl. 1 B). Otuda, YopE1-138fragment je dobro izlučen u postavci koja je ovde opisana. Da bi se analizirala homogenost translokacije proteina u eukariotske ćelije, inficirali smo HeLa ćelije sa sojem koji kodira YopE1-138-Myc, pa su sa IF obojeni Myc tagovi (Sl.2A i B). Iako su u početku bile obojene samo bakterije, 30 minuta nakon infekcije (p.i.) obrisi ćelija su počinjali da budu vidlјivi, što se pojačavalo sa dužim vremenom infekcije (Sl.2 B). Ovaj trend dobro odražava intenzitet bojenja Myc taga unutar HeLa ćelija (Sl. 2A i B). YopE1-138-Myc može biti detektovan svuda u ćelijama (Sl.2 A), osim u jedrima [68]. Izuzetno je što se ovim pristupom postiglo da bude obojena većina, ukoliko ne sve ćelije, na uporediv način. Kako je poznato da Y.enterocolitica inficira različite tipove ćelija [69], pratili smo dalje isporuku YopE1-138-Myc u različite ćelijske linije. Isto homogeno anti-Myc IF bojenje je uočeno kod inficiranih mišjih fibroblasta, Jurkat ćelija i HUVEC (Sl. 11). Štaviše, podešavanje MOI naviše ili naniže je omogućilo modulisaje količine isporučenih proteina (Sl. 2 C), pri čemu je ciljano dejstvo pokazano kod većine ćelija. Nizak broj bakterija neće dovesti do razultata da u nekoliko ćelija bude puno isporučenog proteina, već da većina ćelija sadrži nisku količinu isporučenog proteina (Sl.2 C).
Preusmeravanje proteina isporučenih putem T3SS u jedro
[0101] Kako sam YopE lokalizuje u citoplazmu (Sl.2 A), od posebnog je interesa ispitati da li YopE1-138fragment sprečava lokalizaciju jedarnih fuzionih proteina. Stoga smo dodali NLS iz SV40 na C-kraj (i N-kraj, slični rezultati) YopE1-138-EGFP-a (SEQ ID No.39 i SEQ ID No.38, tim redom). Dok je YopE1-138-EGFP (SEQ ID No. 37) doveo je do slabog bojenja citoplazme, YopE1-138-EGFP-NLS je doveo do jakog EGFP signal u jedru inficiranih HeLa ćelija (Sl.3). Navedeno ukazuje da je YopE1-138fragment kompatibilan sa upotrebom NLS. Iako se mCherry boja već upotreljavala u bilјnim patogenima [70], navedeno predstavlјa uspešnu isporuku proteina sličnu GFP-u putem humanih ili životinjskih patogenih bakterija koje kodiraju T3SS. Navedeno potvrđuje da je strategija koja je zavisna od SycE i YopE1-138vrlo obećavajuća za isporuku mnogih proteina izbora.
Uklanjanje dodatnog YopE1-138sadržaja nakon translokacije fuzionog proteina u eukariotsku ćeliju
[0102] Dok je za bakterijsku isporuku od velike koristi YopE1-138fragment, on može ometati funkciju i/ili lokalizaciju fuzionih proteina. Stoga je optimalno njegovo ukljanjanje nakon isporuke proteina. U ovu svrhu, između YopE1-138i fuzionog partnera (transkripcionog regulatora ET1-Myc (SEQ ID No.36 i 41) [74] i humanog INK4C (SEQ ID No.40 i SEQ ID No.43)) su uvedena dva mesta cepanja za TEV proteazu (ENLYFQS) [71-73]. Da bi se održala prednost predstavljenog postupka, dodatno smo fuzionisali TEV proteazu (varijanta S219V; [75]) na YopE1-138(SEQ ID No.42) u drugom soju Y.enterocolitica. HeLa ćelije su odjednom inficirane sa oba soja. Da bi se omogućila analiza samo translocirane frakcije proteina, inficirane HeLa ćelije su lizirane 2 h p.i. (Sl.4) sa Digitoninom, za koga je poznato da ne lizira bakterije ([76]; za kontrolu, pogledati sliku 12). Imunoblot analiza je ukazala na prisustvo YopE1-138-2xTEV-mesto cepanja-ET1-Myc ili YopE1-138-2xTEV-mesto cepanja-Flag-INK4C-Myc samo kada su ćelije bile inficirane sa odgovarajućim sojem (Sl. 4A i C). Nakon digestije ovih lizata preko noći sa prečišćenom TEV proteazom, mogao se uočiti pomeraj pozicije specifične trake (Sl.4A i C). Ova traka odgovara ET1-Myc (Sl.4 C) ili Flag-INK4C (Sl.4 A) sa ostacima N-kraja mesta cepanja za TEV, najverovatnije samo jednog Serina. Nakon istovremene infekcije ćelija sa sojem koji isporučuje TEV proteazu, isti isečeni fragment ET1-Myc ili Flag-INK4C je postao vidlјiv, što ukazuje da je TEV proteaza koja je isporučena preko T3SS funkcionalna i da su pojedinačne ćelije bile inficirane sa oba bakterijska soja (Sl.4 A i C). Iako cepanje nije završeno, većina translociranog proteina se cepa već 2 sata nakon infekcije, a čak ni digestija preko noći sa prečišćenom TEV proteazom nije dovelo do boljeg stepena cepanja (Slika 4 B). Kao što je prijavljeno, moguće je da je za cepanje zavisno od TEV proteaze potrebna optimizacija koja će zavisiti od fuzionog proteina [77, 78]. Uklanjanje dodatnog YopE1-138sadržaja nakon translokacije, koje je zavisno od TEV protease, stoga obezbeđuje po prvi put T3SS proteinsku isporuku za gotovo nativne heterologne proteine, a izmenom sastava aminokiselina sa samo jednom N-terminalnom aminokiselinom.
[0103] Alternativan pristup cepanju YopE fragmenta koje je zavisno od TEV proteaze podrazumeva ugradnju ubikvitina u fuzioni protein od interesa. Zaista, ubikvitin se na svom C-kraju obrađuje grupom endogenih C-terminalnih proteaza koje su specifične za ubikvitin (deubikvitinizirajućih enzima, DUB). Kako cepanje treba da se dogodi na samom C-kraju ubikvitina (nakon G76), protein od interesa treba da bude bez dodatnih aminokiselinskih sekvenci. Ovaj postupak je ispitan na fuzionom proteinu YopE1-138-Ubikvitin-Flag-INK4C-MycHis. U kontrolnim ćelijama inficiranim sa bakterijama koje eksprimiraju YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis je utvrđena traka koja odgovara YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, što ukazuje na efikasnu translokaciju fuzionisanog proteina (Slika 24). Kada su ćelije bile inficirane tokom 1 sata bakterijama koje eksprimiraju YopE1-138-Ubikvitin-Flag-INK4C-MycHis, postala je vidljiva dodatna traka koja po veličini odgovara Flag-INK4C-MycHis, što ukazuje da je deo fuzionisanog proteina isečen. Ovakav rezultat pokazuje da uvođenje ubikvitina u fuzioni protein omogućava isecanje YopE1-138 fragmenta bez potrebe za egzogenom proteazom.
Translokacija bakterijskih efektora tipa III i IV
[0104] SopE iz Salmonella enterica je dobro okarakterisan faktor izmene guaninskih nukleotida (GEF) koji interaguje sa Cdc42, promovišući remodelovanje aktinskog citoskeleta [79]. Dok je translokacija YopE1-138-Myc u HeLa ćelije bila bez efekta, translokacija YopE1-138-SopE (SEQ ID No.5 i 135) je izazvala dramatične promene u aktinskoj mreži (Sl.5 A). Slični rezultati su dobijeni sa drugim GEF efektorskim proteinom, IpgB1 iz Shigella flexneri (SEQ ID No. 4). Izuzetno je da su prve promene u aktinskom citoskeletu primećene već 2 minuta p.i. (Sl. 5 A). Stoga, može se zaključiti da se isporuka proteina zavisna od T3SS događa odmah nakon što je infekcija započeta centrifugiranjem. Da bi se dokazao isključivi transport koji je zavisan od T3SS, delecijom je uklonjen jedan od T3SS proteina koji obrazuje poru za translokaciju na membrani eukariotskih ćelija (YopB, pogledati [80]) (Sl.12).
[0105] Tokom infekcije Salmonelom, nakon translokacije SopE sledi translokacija SptP-a, koji deluje kao protein koji aktivira GTPazu (GAP) za Cdc42 [81]. Dok translokacija YopE1-138-SopE-Myc (SEQ ID No.
135) samostalno pokreće masivno preuređenje F-aktina, koinfekcija sa bakterijama koje eksprimiraju YopE1-138-SptP (SEQ ID No. 8) poništavaju ovaj efekat na način koji zavisi od doze (Sl. 5 B). Anti-Myc bojenje je ukazalo da ova inhibicija nije posledica smanjenog nivoa YopE1-138-SopE-Myc translokacije (Sl.5 B). Ovi rezultati su zajedno pokazali da je koinfekcija ćelija sa dva bakterijska soja validan postupak za isporuku dva različita efektora u pojedinačne ćelije da bi se ispitala njihova funkcionalna interakcija.
Efektor tipa III OspF iz S. flexneri deluje kao fosfotreoninska liaza koja defosforiliše MAP kinaze p38 i ERK [82]. Da bi se ispitala funkcionalnost translociranog YopE1-138-OspF (SEQ ID No. 7), pratili smo fosforilaciju p38 nakon stimulacije sa TNFa. U neinficiranim ćelijama ili ćelijama koje su bile inficirane sa bakterijama koje eksprimiraju YopE1-138-Myc, TNFa je izazvao fosforilaciju p38. Nasuprot navedenom, nakon translokacije YopE1-138-OspF, fosforilacija indukovana sa TNFa je bila poništena, što pokazuje da je isporučeni OspF aktivan za p38 (Sl.6 A).
Tokom infekcije sa Salmonella bakterijama, efektor SopB tipa III štiti epitelne ćelije od apoptoze stalnom aktivacijom Akt [83]. Dok je translokacija YopE1-138-Myc ili YopE1-138-SopE bila bez efekta na Akt, translokacija YopE1-138-SopB (SEQ ID No.6) je indukovala snažnu fosforilaciju Akt na T308 i S473, što predstavlja aktivan oblik (Sl.6 B). Slični rezultati su dobijeni sa SopB-homologom iz S. flexneri (IpgD, SEQ ID No.9). Sveukupno, naši rezultati pokazuju da sistem isporuke zasnovan na YopE1-18funkcioniše kod svih do sada ispitanih T3S efektora i omogućava ispitivanje proteina koji su uklјučeni u kontrolu centralnih ćelijskih funkcija, uklјučujući citoskelet, inflamaciju i ćelijsko preživlјavanje.
[0106] Brojne bakterije, uklјučujući Agrobacterium tumefaciens, Legionella pneumophila i Bartonella henselae, koristite sekreciju tipa IV za injeciranje efektora u ćelije. Ispitali smo da li efektor tipa IV BepA iz B. henselae može biti translociran u HeLa ćelije upotrebom našeg pristupa. BepA pune dužine (SEQ ID No.10) i BepAE305-kraj(SEQ ID No.11) koji sadrži Bid domen C-kraja, su klonirani i ćelije su inficirane odgovarajućim sojevima. Kako se pokazalo da BepA indukuje proizvodnju cikličnog AMP-a (cAMP) [84], nakon infekcije je izmeren nivo cAMP-a u HeLa ćelijama. Dok translokacija Bid domenea BepG efektora iz B. henselae (SEQ ID No. 136) nije uspela da indukuje cAMP, BepA pune dužine i BepAE305-krajsu pokrenuli proizvodnju cAMP-a u očekivanim količinama [84] (Sl.6 C). Ovaj rezultat pokazuje da efektori tipa IV takođe mogu biti efikasno isporučeni u ciljne ćelije domaćine putem sistema za isporuku zasnovanih na YopE1-138i da su oni funkcionalni.
Translokacija eukariotskih proteina u epitelne ćelije
[0107] Da bi pokazali da se humani proteini mogu translocirati sekrecijom tipa III, fuzionisali smo izazivače humane apoptoze sa YopE1-138radi isporuke sa Y.enterocolitica ili sa SteA1-20, SteA, SopE1-81ili SopE1-105u slučaju isporuke sa S. enterica. Zatim smo pratili translokaciju agoniste humanog domena smrti koji interaguje sa BH3 (BID, SEQ ID No.24) kao pro-apoptotskim članom Bcl-2 familije proteina. Ovaj protein je posrednik oštećenja mitohondrija indukovanih sa kaspazom-8 (CASP8). CASP8 cepa BID, a skraćeni BID (tBID, SEQ ID No. 25) prelazi u mitohondrije gde pokreće oslobađanje citohroma c. Poslednje navedeno dovodi do intrinzičkog načina aktivacije kaspaze 3 (CASP3) tokom koga se ona cepa na podjedinice od 17 i 12 kDa [85]. Iako infekcija tokom 1 sata sa Y.enterocolitica koje eksprimiraju YopE1-138-Myc ili YopE1-138-BID nije uspela da indukuje apoptozu, translokacija humanog tBID je pokrenula ćelijsku smrt u većem obimu od dobro okarakterisanog izazivača apoptoze, Staurosporina (slike 7 A i C). Kao što se očekivalo, translokacija tBID-a je dovela do proizvodnje p17 subjedinice CASP3, čak u većim količinama nego prlikom upotrebe Staurosporina (Sl. 7 A). Da bi mogli da uporedimo translocirane količine proteina sa endogenim Bid, HeLa ćelije su lizirane Digitoninom i analizirane su imunoblot postupkom upotrebom anti-Bid antitela (Sl. 7 B). YopE1-138-tBID koji je isporučen putem T3SS-a je dostigao nivo blizak nivou endogenog Bid u HeLa ćelijama, dok je isporučen YopE1-138-BID bio prisutan u još većim količinama (2,5 puta) (Sl. 7 B). Detaljnim proteomskim i transkriptomskim mapiranjem HeLa ćelija je procenjeno da je po jdenoj ćeliji prisutno 4,4 puta 10<5>kopija BID-a [86]. Stoga, može se zaključiti da isporuka humanih proteina koja zavisi od T3SS dostiže 10<5>do 10<6>proteina po ćeliji. Ovi brojevi odgovaraju kopijama nano-antitela po ćeliji koja su translocirana putem T3SS-a E. coli [19]. Pod pretpostavkom izravnavanja faktora od 10 za MOI i za trajanje infekcije, faktora 3,2 za vremensku tačku dodavanja antibiotika i za vreme kultivisanja na 37°C pre infekcije, isporučene proteinske kopije/ćeliji mogu biti fino podešene od nekih 1000 kopija/ćeliji do nekih 10<6>kopija/ćeliji. Sveukupno, navedeni rezultati ukazuju da je translociran tBID funkcionalan i isporučen u relevantnim nivoima. Navedeno potvrđuje validnost pristupa za translokaciju u cilju proučavanja uloge proteina u regulaciji apoptoze, centralnog aspekta ćelijske biologije.
Dodanto smo fuzionisali mišji tBID (optimizovanih kodona za Y.enterocolitica; SEQ ID No.194) ili BH3 domene mišjeg tBID ili mišjeg BAX (u oba slučaja optimizovanih kodona za Y.enterocolitica; SEQ ID No.
138 i 139) sa YopE1-138radi isporuke sa Y.enterocolitica. Dok je infekcija tokom 2,5 h sa Y.enterocolitica ΔHOPPEM asd bila bez isporuke proteina ili takva da YopE1-138-Myc nije uspeo da indukuje apoptozu, translokacija mišjeg tBID (optimizovanih kodona za Y.enterocolitica, SEQ ID No.194) je izazvao ćelijsku smrt u B16F10 (Sl. 16), D2A1 (Sl. 17), HeLa (Sl. 18) i 4T1 (Sl. 19) ćelijama. Utvrđeno je takođe da tranasalokacija BH3 domena mišjeg BID koji je bio optimizovanih kodona za Y.enterocolitica (SEQ ID 138) ili mišjeg BAX koji je bio optimizovanih kodona za Y.enterocolitica (SEQ ID 139) indukuje masovnu ćelijsku smrt u B16F10 (Sl.16), D2A1 (Sl.17), HeLa (Sl.18) i 4T1 (Sl.19).
Iako infekcija tokom 4 h sa S. enterica aroA bakterijma nije uspela da indukuje apoptozu, translokacija mišjeg tBID je pokrenula apoptozu, pošto translokacija mišjeg tBID dovodi do proizvodnje p17 subjedinice CASP3 (Sl.20 i 21). Stepen indukcije apoptoze za SopE fuzione proteine je bio veći prilikom upotrebe SpiI T3SS uslova indukcije (Sl.20), što odražava transport SopE isklјučivo sa SpiI T3SS. Mišji tBID koji je bio fuzionisan sa SteA1-20nije uspeo da indukuje apoptozu, vrlo verovatno pošto signal sekrecije unutar 20 aminokiselina N-kraja SteA nije dovolјan da omogući isporuku fuzionisanog proteina (Sl.20 i 21). Mišji tBID fuzionisan sa SteA pune dužine je doveo do indukcije apoptoze u HeLa ćelijama (Sl. 20 i 21), kako u SpiI tako i u SpiII T3SS indukujućim uslovima, što odražava sposobnost presnošenja SteA sa oba T3SS mehanizma. Potrebno je naglastiti da se čak i pod Spill T3SS indukujućim uslovima očekuje delimična aktivnost SpiI T3SS, što se vidi iz aktivnosti SopE fuzionisanih proteina u uslovima indukcije sa SpiII T3SS (Sl.21).
[0108] Pored ovde funkcionalno razrađenih translociranih eukariotskih proteina, nekoliko drugih eukariotskih proteina je izlučeno upotrebom sredstava koja su ovde opisana. Navedeno obuhvata, za isporuku sa Y.enterocolitica (Sl.13, 14 i 23), proteine iz regulacije ćelijskog ciklusa (Mad2 (SEQ ID No.
15), CDK1 (SEQ ID No.14), INK4A (SEQ ID No.16), INK4B (SEQ ID No.17) i INK4C (SEQ ID No.18)) kao i njihove delove (INK4A 84-103 (SEQ ID No.158), p107657-662 (SEQ ID No.159), p21141-160 (SEQ ID No.160), p21145-160 (SEQ ID No.161), p2117-33 (SEQ ID No.162) i ciklin D2139-147 (SEQ ID No 163)), proteine povezane sa apoptozom (Bad (SEQ ID No.29), FADD (SEQ ID No.28) i p17 Kaspaze 3 (SEQ ID No.22), kao i p12 (SEQ ID No.23), Bid zebra-ribica (SEQ ID No.19) i t-Bid (SEQ ID No.20)) kao i njihove delove (tBid BH3 (SEQ ID No.138), Bax BH3 (SEQ ID No.139)), signalne proteine (mišji TRAF6 (SEQ ID No.12), TIFA (SEQ ID No.13)), GPCR Gα subjedinicu (GNA12, najkraća izoforma, (SEQ ID No.
30)), nano-antitelo (vhhGFP4, (SEQ ID No.31)) i fuzione konstrukte nano-antitela za ciljanu degradaciju proteina (Slmb-vhhGFP4; (SEQ_ID_No.32, 33, 34) [87]) (Sl.13 i 14), kao i male GTPaze (Rac1 Q61E (SEQ ID No. 26 i 137), pa i RhoA Q63L (SEQ ID No. 27) i domene homologne Plekstrinu iz humanog Akt-a (SEQ ID No.35). Pored funkcionalno razrađenih proteina povezanih sa apoptozom (mišjeg tBid, SEQ ID No. 144-147), navedeno dalјe uklјučuje, za isporuku sa S. enterica (Sl. 22), proteine iz regulacije ćelijskog ciklusa (Mad2 (SEQ ID No.168-169), CDK1 (SEQ ID No.170-171), INK4A (SEQ ID No.164-165) i INK4C (SEQ ID No.166-167)). Iako ovi proteini nisu funkcionalno validirani, mogućnost T3SS zavisne sekrecije različitih eukariotskih proteina u kombinaciji sa mogućim uklanjanjem dodatnog YopE sadržaja otvara nove vidove široke primenlјivosti T3SS u ćelijskoj biologiji.
In vivo translokacija skraćenog Bid u embrionima zebra-ribica izaziva apoptozu
[0109] Zanimlјivo svojstvo ovog bakterijskog sredstva je potencijalna upotreba u živim životinjama. Zebra-ribica u svom embrionalnom stanju može biti održavana providnom, što omogućava fluorescentno bojenje i mikroskopiju [54, 88, 89]. Detaljno je opisano nekoliko izazivača apoptoze za zebra-ribice, od čega je z-BIM najpotentniji [90]. Stoga, odlučili smo da kloniramo z-BIM u naš sistem. Čak i ako je slabe homologije sa humanim BIM, ispitali smo potenciju indukcije apoptoze za YopE1-138-z-BIM (SEQ ID No.21) u humanim epitelnim ćelijama. HeLa ćelije inficirane tokom 1 sata sa sojem koji prenosi YopE1-138-z-BIM su ispoljile jasne znake ćelijske smrti. Zatim smo sproveli in vivo eksperimente sa embrionima zebra-ribica starim 2 dana nakon oplodnje (dpf), upotrebom modela lokalizovane infekcije, mikroinjeciranjem bakterija u zadnji deo mozga [54]. Nakon infekcije od 5,5 h, ribice su fiksirane, permeabilizovane i obojene na prisustvo p17 CASP3. Nakon infekcije sa sojem koji je eksprimirao YopE1-138-Myc, bakterije su bile vidlјive u zadnjem delu mozga (bojenje "b", Sl. 8 A I), ali nije otkrivena indukcija apoptoze oko bakterija (bojenje "c", Sl. 8 A I). Nasuprot navedenom, nakon infekcije sa sojem koji isporučuje YopE1-138-z-BIM, uočeno je snažno povećanje prisustva isečene CASP3 u regionima koji okružuju bakterije (Sl. 8 A II). Automatizovana analiza slike na z projekcijama maksimalnog intenziteta je potvdila da bakterije koje translociraju YopE1-138-z-BIM indukuju apoptozu u obližnjim ćelijama daleko više nego što to čine kontrolne bakterije (Sl.8 B). Navedeno ukazuje da je z-BIM funkcionalan kod zebra-ribica nakon bakterijske translokacije. Ovi rezultati dalјe potvrđuju upotrebu T3SS za isporuku eukariotskog proteina kod živih životinja.
Fosfoproteomika ukazuje na opšti uticaj translociranih proteina na fosforilaciju proteina
[0110] Fosforilacija je široko rasprostranjena post-translaciona modifikacija koja može ili aktivirati ili inaktivirati biološke procese i stoga je pogodan ciljni događaj u proučavanju signalnih događaja [91, 92]. Uprkos tome, danas nije dostupna analiza fosforilacije u apoptozi na nivou sistema. Da bismo analizirali uticaj humanog tBid-a koji je isporučen u HeLa ćelije, upotrebili smo fosfoproteomski pristup bez obeležavanja upotrebom LC-MS/MS postupka. U tri nezavisna eksperimenta, ćelije su ili ostavljene netretiranima ili su inficirane sa ΔHOPEMT asd YopE1-138-Myc ili sa ΔHOPEMT asd YopE1-138-tBid tokom 30 minuta. Ćelije su zatim lizirane, nakon čega su sledili enzimska digestija, obogaćivanje fosfopeptidima i kvantifikacija i identifikacija pojedinačnih fosfpeptida. Uporedili smo ćelije inficirane sa ΔHOPEMT asd YopE1-138-Myc sa ćelijama inficiranim sa ΔHOPEMT asd YopE1-138-tBid, što nam je omogućilo da identifikujemo 363 događaja fosforilacije koji su bili zavisni od tBid. Porast u fosforilaciji je pokazan za 286 fosfopeptida, dok je 77 bilo manje fosforilirano nakon isporuke tBid, što ukupno odgovara broju od 243 različita proteina koji smo definisali kao tBid fosfoproteom. Za obrazovanje mreže protein-proteinskih interakcija tBid fosfoproteoma upotreljena je STRING baza podataka [93] (Sl. 9 A). U mrežu je dodato još 27 proteina za koje je poznatao da su povezani sa apoptozom posredovanom mitohondrijama, čime je izgrađen centralni klaster. Zanimlјivo je da je samo nekoliko proteina iz tBid fosfoproteoma povezano sa ovim centralnim klasterom, što ukazuje da mnogi proteini podležu promenama u fosforilaciji koje do sada nisu bile direktno povezane sa apoptotskim proteinima. Da bi se okarakterisala biološke funkcije obuhvaćene fosfoproteomom tBid, uradili smo analizu genske ontologije, upotrebom funkcionalnog alata za obeležavanje iz baze podataka za obeležavanje, vizualizaciju i integrisano otkrivanje (DAVID, http://david.abcc.ncifcrf.gov/) [94, 95]. Identifikovane biološke funkcije pokazuju da tBid utiče na različite ćelijske procese. Mnogi proteini koji su uklјučeni u preuređivanje hromatina i regulaciju transkripcije podležu promeni u fosforilaciji (tj. CBX3, CBX5, TRIM28, HDAC1). HDAC1, na primer, je histon deacetilaza koja ima ulogu u regulaciji transkripcije. Pokazano je da HDAC1 može modulisati transkripcionu aktivnost NF-kB, proteina koji takođe učestvuje u apoptozi. Dodatno smo identifikovali klaster proteina koji su uklјučeni u obradu RNK, a za koje je ranije pokazano da imaju važnu ulogu u regulaciji apoptoze [96]. Na primer, HNRPK posreduje odgovor p53/TP53 na oštećenje DNK i neophodan je za indukciju apoptoze [97]. Štaviše, bio je utvrđen i uticaj na fosforilaciju proteina koji su uklјučeni u translaciju proteina. Nekoliko eukariotskih faktora inicijacije (tj. EIF4E2, EIF4B, EIF3A, EIF4G2) prolaze kroz promene u statusu fosforilacije, što je u skladu sa zapažanjem da je ukupna sinteza proteina u apoptotskim ćelijama smanjena. Zanimlјivo je da se fosforilacija mnogih proteina koji su uklјučeni u remodelovanje citoskeleta (npr. PXN, MAP1B9 menja nakon isporuke tBid. Ovo je bilo u skladu sa zapažanjem da se morfologija ćelija dramatično menja nakon isporuke tBid-a (slika 9B). Smanjenje zapremine ćelija i gubitak kontakta se odražava činjenicom da opažamo fosforilaciju proteina povezanih sa adhezijom poput ZO2 i Paksilina. Slično navedenom, smanjenje zapremine jedara prati fosforilacija laminarnih proteina poput Lamina A/C i Lamina B1. Sveukupno, isporuka tBID izaziva brz apoptotski odgovor takođe naznačen narušavanjem integriteta mitohondrija (Sl.9B). Pokazali smo da apoptoza izazvana sa tBid utiče na stotine događaja fosforilacije koji učestvuju u različitim ćelijskim procesima. Iako su mnogi identifikovani proteini povezani sa apoptozom, za malobrojne je poznato da su fosforilisani nakon indukcije apoptoze. Fosfoproteomski pristup omogućava stoga koristan izvor za dalјe studije apoptoze.
Lista referenci
[0111]
1. Gibson, T.J., M. Seiler i R.A. Veitia (2013) The transience of transient overexpression. Nat Methods.10: 715-21.
2. Inoue, T., W.D. Heo, J.S. Grimley, T.J. Wandless i T. Meyer (2005) An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat Methods.2: 415-8.
3. Pust, S., H. Hochmann, E. Kaiser, G. von Figura, K. Heine, i sadradnici (2007) A cell-permeable fusion toxin as a tool to study the consequences of actin-ADP-ribosylation caused by the Salmonella enterica virulence factor SpvB in intact cells. J Biol Chem.282: 10272-82.
4. Hayes, C.S., S.K. Aoki i D.A. Low (2010) Bacterial contact-dependent delivery systems. Annu Rev Genet.44: 71-90.
5. Cornelis, G.R. (2006) The type III secretion injectisome. Nat Rev Microbiol.4: 811-25.
6. Michiels, T., P. Wattiau, R. Brasseur, J.M. Ruysschaert i G. Cornelis (1990) Secretion of Yop proteins by Yersiniae. Infect Immun.58: 2840-9.
7. Letzelter, M., I. Sorg, L.J. Mota, S. Meyer, J. Stalder, i sadradnici (2006) The discovery of SycO highlights a new function for type III secretion effector chaperones. EMBO J.25: 3223-33. 8. Gauthier, A. i B.B. Finlay (2003) Translocated intimin receptor and its chaperone interact with ATPase of the type III secretion apparatus of enteropathogenic Escherichia coli. J Bacteriol.185: 6747-55.
9. Wattiau, P. i G.R. Cornelis (1993) SycE, a chaperone-like protein of Yersinia enterocolitica involved in the secretion of YopE. Mol Microbiol.8: 123-31.
Feldman, M.F., S. Muller, E. Wuest i G.R. Cornelis (2002) SycE allows secretion of YopE-DHFR hybrids by the Yersinia enterocolitica type III Ysc system. Mol Microbiol.46: 1183-97.
Akeda, Y. i J.E. Galan (2005) Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature.437: 911-5.
Pais, S.V., C. Milho, F. Almeida i L.J. Mota (2013) Identification of novel type III secretion chaperone-substrate complexes of Chlamydia trachomatis. PLoS One.8: e56292.
Sory, M.P. i G.R. Cornelis (1994) Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol.
583-94. 14. Garcia, J.T., F. Ferracci, M.W. Jackson, S.S. Joseph, I. Pattis, i sadradnici (2006) Measurement of effector protein injection by type III and type IV secretion systems by using a 13-residue phosphorylatable glycogen synthase kinase tag. Infect Immun.74: 5645-57.
Chen, L.M., G. Briones, R.O. Donis i J.E. Galan (2006) Optimization of the delivery of heterologous proteins by the Salmonella enterica serovar Typhimurium type III secretion system for vaccine development. Infect Immun.74: 5826-33.
Russmann, H., H. Shams, F. Poblete, Y. Fu, J.E. Galan, i sadradnici (1998) Delivery of epitopes by the Salmonella type III secretion system for vaccine development. Science.281: 565-8.
Russmann, H., U. Gerdemann, E.I. Igwe, K. Panthel, J. Heesemann, i sadradnici (2003) Attenuated Yersinia pseudotuberculosis carrier vaccine for simultaneous antigen-specific CD4 and CD8 T-cell induction. Infect Immun.71: 3463-72.
Chaux, P., R. Luiten, N. Demotte, V. Vantomme, V. Stroobant, i sadradnici (1999) Identification of five MAGE-A1 epitopes recognized by cytolytic T lymphocytes obtained by in vitro stimulation with dendritic cells transduced with MAGE-A1. J Immunol.163: 2928-36.
Blanco-Toribio, A., S. Muyldermans, G. Frankel i L.A. Fernandez (2010) Direct injection of functional singledomain antibodies from E. coli into human cells. PLoS One.5: e15227.
Bichsel, C., D. Neeld, T. Hamazaki, L.J. Chang, L.J. Yang, i sadradnici (2013) Direct reprogramming of fibroblasts to myocytes via bacterial injection of MyoD protein. Cell Reprogram.15: 117-25. Bichsel, C., D.K. Neeld, T. Hamazaki, D. Wu, L.J. Chang, i sadradnici (2011) Bacterial delivery of nuclear proteins into pluripotent and differentiated cells. PLoS One.6: e16465. Chamekh, M., A. Phalipon, R. Quertainmont, I. Salmon, P. Sansonetti, i sadradnici (2008) Delivery of biologically active anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-1ra in vivo by the Shigella type III secretion apparatus. J Immunol.180: 4292-8.23.
Hoffman, R.M. (2011) Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol.
22: 917-23.
Hoang, T.T., S. Williams, H.P. Schweizer i J.S. Lam (1997) Molecular genetic analysis of the region containing the essential Pseudomonas aeruginosa asd gene encoding aspartate-betasemialdehyde dehydrogenase. Microbiology.143 (Pt 3): 899-907.
Skurnik, M. i H. Wolf-Watz (1989) Analysis of the yopA gene encoding the Yop1 virulence determinants of Yersinia spp. Mol Microbiol.3: 517-29.
Tertti, R., M. Skurnik, T. Vartio i P. Kuusela (1992) Adhesion protein YadA of Yersinia species mediates binding of bacteria to fibronectin. Infect Immun.60: 3021-4.
Isberg, R.R. i J.M. Leong (1990) Multiple beta 1 chain integrins are receptors for invasin, a protein that promotes bacterial penetration into mammalian cells. Cell.60: 861-71.
Isberg, R.R., D.L. Voorhis i S. Falkow (1987) Identification of invasin: a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells. Cell.50: 769-78.
Leong, J.M., R.S. Fournier i R.R. Isberg (1990) Identification of the integrin binding domain of the Yersinia pseudotuberculosis invasin protein. EMBO J.9: 1979-89.
Mota, L.J. i G.R. Cornelis (2005) The bacterial injection kit: type III secretion systems. Ann Med.
37: 234-49.
Trosky, J.E., A.D. Liverman i K. Orth (2008) Yersinia outer proteins: Yops. Cell Microbiol.10: 557-65.
Brenner, D. i T.W. Mak (2009) Mitochondrial cell death effectors. Curr Opin Cell Biol.21: 871-7.
Chalah, A. i R. Khosravi-Far (2008) The mitochondrial death pathway. Adv Exp Med Biol.615: 25-45.
Fuchs, Y. i H. Steller (2011) Programmed cell death in animal development and disease. Cell.
147: 742-58.
Waugh, D.S. (2011) An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif.80: 283-93.
Sarker, M.R., C. Neyt, I. Stainier i G.R. Cornelis (1998) The Yersinia Yop virulon: LcrV is required for extrusion of the translocators YopB and YopD. J Bacteriol.180: 1207-14.
Ramamurthi, K.S. i O. Schneewind (2005) A synonymous mutation in Yersinia enterocolitica yopE affects the function of the YopE type III secretion signal. J Bacteriol.187: 707-15.
Wolke, S., N. Ackermann i J. Heesemann (2011) The Yersinia enterocolitica type 3 secretion system (T3SS) as toolbox for studying the cell biological effects of bacterial Rho GTPase modulating T3SS effector proteins. Cell Microbiol.13: 1339-57.
Forsberg, A. i H. Wolf-Watz (1990) Genetic analysis of the yopE region of Yersinia spp.: identification of a novel conserved locus, yerA, regulating yopE expression. J Bacteriol. 172: 1547-55.40. Sambrook, J.2001. Molecular cloning : a laboratory manual. D.W. Russell, urednik. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Alto, N.M. i J.E. Dixon (2008) Analysis of Rho-GTPase mimicry by a family of bacterial type III effector proteins. Methods Enzymol.439: 131-43.
Alto, N.M., F. Shao, C.S. Lazar, R.L. Brost, G. Chua, i sadradnici (2006) Identification of a bacterial type III effector family with G protein mimicry functions. Cell.124: 133-45.
Kaniga, K., I. Delor i G.R. Cornelis (1991) A wide-host-range suicide vector for improving reverse genetics in gram-negative bacteria: inactivation of the blaA gene of Yersinia enterocolitica. Gene.109: 137-41.
Yoneda, Y., T. Semba, Y. Kaneda, R.L. Noble, Y. Matsuoka, i sadradnici (1992) A long synthetic peptide containing a nuclear localization signal and its flanking sequences of SV40 T-antigen directs the transport of IgM into the nucleus efficiently. Exp Cell Res.201: 313-20.
Cornelis, G.R. 1997. Cross talk between Yersinia and eukaryotic cells. In Molecular aspects of host-pathoge interactions. S. MoCRAE, SMYTH, STOW, urednik. Cambridge University Press. Metcalf, W.W., W. Jiang i B.L. Wanner (1994) Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K gamma origin plasmids at different copy numbers. Gene.138: 1-7.
Diepold, A., M. Amstutz, S. Abel, I. Sorg, U. Jenal, i sadradnici (2010) Deciphering the assembly of the Yersinia type III secretion injectisome. EMBO J.29: 1928-40.
Iriarte, M., I. Stainier i G.R. Cornelis (1995) The rpoS gene from Yersinia enterocolitica and its influence on expression of virulence factors. Infect Immun.63: 1840-7.
Cornelis, G., J.C. Vanootegem i C. Sluiters (1987) Transcription of the yop regulon from Y. enterocolitica requires trans acting pYV and chromosomal genes. Microb Pathog.2: 367-79. Grosdent, N., I. Maridonneau-Parini, M.P. Sory i G.R. Cornelis (2002) Role of Yops and adhesins in resistance of Yersinia enterocolitica to phagocytosis. Infect Immun.70: 4165-76.
Dehio, C., M. Meyer, J. Berger, H. Schwarz i C. Lanz (1997) Interaction of Bartonella henselae with endothelial cells results in bacterial aggregation on the cell surface and the subsequent engulfment and internalisation of the bacterial aggregate by a unique structure, the invasome. J Cell Sci.110 (Pt 18): 2141-54.
Westerfield, M. (2000) The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish Danio rerio University of Oregon Press, Eugene, ORp.
Kimmel, C.B., W.W. Ballard, S.R. Kimmel, B. Ullmann i T.F. Schilling (1995) Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn.203: 253-310.
Benard, E.L., A.M. van der Sar, F. Ellett, G.J. Lieschke, H.P. Spaink, i sadradnici (2012) Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp.
Blum, Y., H.G. Belting, E. Ellertsdottir, L. Herwig, F. Luders, i sadradnici (2008) Complex cell rearrangements during intersegmental vessel sprouting and vessel fusion in the zebrafish embryo. Dev Biol.316: 312-22.
Herwig, L., Y. Blum, A. Krudewig, E. Ellertsdottir, A. Lenard, i sadradnici (2011) Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol.21: 1942-8.
Carpenter, A.E., T.R. Jones, M.R. Lamprecht, C. Clarke, I.H. Kang, i sadradnici (2006) CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol.7: R100. Bensimon, A., A. Schmidt, Y. Ziv, R. Elkon, S.Y. Wang, i sadradnici (2010) ATM-dependent and -independent dynamics of the nuclear phosphoproteome after DNA damage. Sci Signal.3: rs3. Perkins, D.N., D.J. Pappin, D.M. Creasy i J.S. Cottrell (1999) Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis.
20: 3551-67.
Smyth, G.K. (2004) Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol.3: Article3.
Ting, L., M.J. Cowley, S.L. Hoon, M. Guilhaus, M.J. Raftery, i sadradnici (2009) Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics.8: 2227-42.
Vizcaino, J.A., R.G. Cote, A. Csordas, J.A. Dianes, A. Fabregat, i sadradnici (2013) The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41: D1063-9.
Boyd, A.P., I. Lambermont i G.R. Cornelis (2000) Competition between the Yops of Yersinia enterocolitica for delivery into eukaryotic cells: role of the SycE chaperone binding domain of YopE. J Bacteriol.182: 4811-21.
Iriarte, M. i G.R. Cornelis (1998) YopT, a new Yersinia Yop effector protein, affects the cytoskeleton of host cells. Mol Microbiol.29: 915-29.
Kudryashev, M., M. Stenta, S. Schmelz, M. Amstutz, U. Wiesand, i sadradnici (2013) In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. Elife.2: e00792.
Schulte, R., G.A. Grassl, S. Preger, S. Fessele, C.A. Jacobi, i sadradnici (2000) Yersinia enterocolitica invasin protein triggers IL-8 production in epithelial cells via activation of Rel p65-p65 homodimers. FASEB J.14: 1471-84.
Mota, L.J., L. Journet, I. Sorg, C. Agrain i G.R. Cornelis (2005) Bacterial injectisomes: needle length does matter. Science.307: 1278.
Isaksson, E.L., M. Aili, A. Fahlgren, S.E. Carlsson, R. Rosqvist, i sadradnici (2009) The membrane localization domain is required for intracellular localization and autoregulation of YopE in Yersinia pseudotuberculosis. Infect Immun.77: 4740-9.
Denecker, G., S. Totemeyer, L.J. Mota, P. Troisfontaines, I. Lambermont, i sadradnici (2002) Effect of low- and highvirulence Yersinia enterocolitica strains on the inflammatory response of human umbilical vein endothelial cells. Infect Immun.70: 3510-20.
Sharma, S., A. Hirabuchi, K. Yoshida, K. Fujisaki, A. Ito, i sadradnici (2013) Deployment of the Burkholderia glumae type III secretion system as an efficient tool for translocating pathogen effectors to monocot cells. Plant J.74: 701-12.
Carrington, J.C. i W.G. Dougherty (1988) A viral cleavage site cassette: identification of amino acid sequences required for tobacco etch virus polyprotein processing. Proc Natl Acad Sci U S A.85: 3391-5.
Kapust, R.B., J. Tozser, T.D. Copeland i D.S. Waugh (2002) The P1’ specificity of tobacco etch virus protease. Biochem Biophys Res Commun.294: 949-55.
Liang, H., H. Gao, C.A. Maynard i W.A. Powell (2005) Expression of a self-processing, pathogen resistanceenhancing gene construct in Arabidopsis. Biotechnol Lett.27: 435-42.
Weber, W., C. Fux, M. Daoud-el Baba, B. Keller, C.C. Weber, i sadradnici (2002) Macrolide-based transgene control in mammalian cells and mice. Nat Biotechnol.20: 901-7.
Kapust, R.B., J. Tozser, J.D. Fox, D.E. Anderson, S. Cherry, i sadradnici (2001) Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng.14: 993-1000.
Lee, V.T., D.M. Anderson i O. Schneewind (1998) Targeting of Yersinia Yop proteins into the cytosol of HeLa cells: one-step translocation of YopE across bacterial and eukaryotic membranes is dependent on SycE chaperone. Mol Microbiol.28: 593-601.
Gray, D.C., S. Mahrus i J.A. Wells (2010) Activation of specific apoptotic caspases with an engineered smallmolecule-activated protease. Cell.142: 637-46.
Henrichs, T., N. Mikhaleva, C. Conz, E. Deuerling, D. Boyd, i sadradnici (2005) Target-directed proteolysis at the ribosome. Proc Natl Acad Sci USA.102: 4246-51.
Hardt, W.D., L.M. Chen, K.E. Schuebel, X.R. Bustelo i J.E. Galan (1998) S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells. Cell.93: 815-26.
Hakansson, S., K. Schesser, C. Persson, E.E. Galyov, R. Rosqvist, i sadradnici (1996) The YopB protein of Yersinia pseudotuberculosis is essential for the translocation of Yop effector proteins across the target cell plasma membrane and displays a contact-dependent membrane disrupting activity. EMBO J.15: 5812-23.
Stebbins, C.E. i J.E. Galan (2001) Structural mimicry in bacterial virulence. Nature.412: 701-5. Li, H., H. Xu, Y. Zhou, J. Zhang, C. Long, i sadradnici (2007) The phosphothreonine lyase activity of a bacterial type III effector family. Science.315: 1000-3.
Norris, F.A., M.P. Wilson, T.S. Wallis, E.E. Galyov i P.W. Majerus (1998) SopB, a protein required for EP 3145946 B1365 1015 20 25 3035 40 45 5055 virulence of Salmonella dublin, is an inositol phosphate phosphatase. Proc Natl Acad Sci USA.95: 14057-9.
Pulliainen, A.T., K. Pieles, C.S. Brand, B. Hauert, A. Bohm, i sadradnici (2012) Bacterial effector binds host cell adenylyl cyclase to potentiate Galphas-dependent cAMP production. Proc Natl Acad Sci USA.109: 9581-6.
Li, H., H. Zhu, C.J. Xu i J. Yuan (1998) Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell.94: 491-501.
Nagaraj, N., J.R. Wisniewski, T. Geiger, J. Cox, M. Kircher, i sadradnici (2011) Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line. Mol Syst Biol.7: 548.
Caussinus, E., O. Kanca i M. Affolter (2011) Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nat Struct Mol Biol.19: 117-21.
Cosma, C.L., L.E. Swaim, H. Volkman, L. Ramakrishnan i J.M. Davis (2006) Zebrafish and frog models of Mycobacterium marinum infection. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10: Unit 10B 2. Mathias, J.R., M.E. Dodd, K.B. Walters, S.K. Yoo, E.A. Ranheim, i sadradnici (2009) Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol.33: 1212-7.
Jette, C.A., A.M. Flanagan, J. Ryan, U.J. Pyati, S. Carbonneau, i sadradnici (2008) BIM and other BCL-2 family proteins exhibit cross-species conservation of function between zebrafish and mammals. Cell Death Differ.15: 1063-72.
Olsen, J.V., B. Blagoev, F. Gnad, B. Macek, C. Kumar, i sadradnici (2006) Global, in vivo i sitespecific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell.127: 635-48.
Schmutz, C., E. Ahrne, C.A. Kasper, T. Tschon, I. Sorg, i sadradnici (2013) Systems-Level Overview of Host Protein Phosphorylation During Shigella flexneri Infection Revealed by Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics.12: 2952-68.
Szklarczyk, D., A. Franceschini, M. Kuhn, M. Simonovic, A. Roth, i sadradnici (2011) The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res.39: D561-8.
Huang da, W., B.T. Sherman i R.A. Lempicki (2009) Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res.37: 1-13. Huang da, W., B.T. Sherman, R. Stephens, M.W. Baseler, H.C. Lane, i sadradnici (2008) DAVID gene ID conversion tool. Bioinformation.2: 428-30.
94. Schwerk, C. i K. Schulze-Osthoff (2005) Regulation of apoptosis by alternative pre-mRNA splicing. Mol Cell.19: 1-13.
95. Papagiannakopoulos, T., A. Shapiro i K.S. Kosik (2008) MicroRNA-21 targets a network of key tumorsuppressive pathways in glioblastoma cells. Cancer Res.68: 8164-72.
96. Hoiseth, S.K., B.A. Stocker (1981) Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are nonvirulent and effective as live vaccines. Nature 291:238-239.

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Vektor koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:
promotor;
prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina, operativno povezanu sa navedenim promotorom, pri čemu je bakterijski T3SS efektorski protein izabran iz grupe koja se sastoji od SopE, SteA i YopE;
drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein, fuzionisanu sa 3’ krajem navedene prve DNK sekvence tako da je očuvan okvir čitanja, pri čemu je heterologni protein izabran iz grupe koju čine proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze, regulatori ćelijskog ciklusa, proteini sa ankirinskim ponovcima, reporterski proteini, male GTPaze, proteini srodni GPCR, fuzioni konstrukti nano-antitela, bakterijski T3SS efektori, bakterijski T4SS efektori i virusni proteini; i opciono
treću DNK sekvencu koja kodira mesto cepanja proteazama, pri čemu je treća DNK sekvenca smeštena između 3’ kraja navedene prve DNK sekvence i 5’ kraja navedene druge DNK sekvence.
2. Rekombinantni Gram-negativni bakterijski soj, pri čemu je navedeni Gram-negativni bakterijski soj transformisan sa vektorom iz patentnog zahteva 1,
pri čemu je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj Yersinia soj i signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina koji je kodiran prvom DNK sekvencom sadrži YopE efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment, pri čemu N-terminalni fragment uklјučuje najmanje prvih 20 aminokiselina efektorskog proteina YopE, ili pri čemu je rekombinantan Gramnegativni bakterijski soj Salmonella soj i signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina koji je kodiran prvom DNK sekvencom sadrži SopE ili SteA efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment, pri čemu N-terminalni fragment uključuje najmanje prvih 20 aminokiselina SopE ili SteA efektorskog proteina.
3. Rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj prema patentnom zahtevu 2, pri čemu je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj sa deficijencijom u proizvodnji najmanje jednog T3SS efektorskog proteina.
4. Rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj prema bilo kom od patentnih zahteva 2-3, pri čemu je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj Yersinia soj i pri čemu je navedeni Yersinia soj divlјeg tipa ili je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog T3SS efektorskog proteina, a gde signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina sadrži 138 aminokiselina N-kraja YopE efektorskog proteina Y.enterocolitica, ili pri čemu je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj Salmonella soj i pri čemu je navedeni Salmonella soj divlјeg tipa ili je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog T3SS efektorskog proteina, a gde signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina sadrži SteA efektorski protein S. enterica ili 81 ili 105 aminokiselina N-kraja SopE efektorskog proteina S. enterica.
5. Rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj prema bilo kom od patentnih zahteva 2-4, pri čemu je Gram-negativni bakterijski soj sa deficijencijom u proizvodnji aminokiseline koja je esencijalna za rast.
6. Rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj prema bilo kom od patentnih zahteva 2-5, pri čemu je Gram-negativni bakterijski soj sa deficijencijom u proizvodnji adhezivnih proteina koji se vezuju za površinu eukariotskih ćelija ili vanćelijski matriks.
7. Rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj ili vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu je heterologni protein izabran iz grupe koju čine proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze, regulatori ćelijskog ciklusa i proteini sa ankirinskim ponovcima.
8. Rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj ili vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu su proteini uključeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze izabrani iz grupe koja se sastoji od proteina sa samo jednim BH3 domenom, kaspaza i unutarćelijski signalnih proteina u kontroli apoptoze posredstvom receptora smrti.
9. Postupak za isporuku heterolognog proteina u eukariotsku ćeliju koji obuhvata sledeće korake:
i) kultivisanje Gram-negativnog bakterijskog soja bilo kog od patentnih zahteva 2-6 ;
ii) dovođenje eukariotske ćelije u kontakt sa Gram-negativnim bakterijskim sojem iz i), pri čemu je fuzioni protein koji sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina i heterologni protein, eksprimiran od strane Gram-negativnog bakterijskog soja i translociran u eukariotsku ćeliju.
10. Postupak prečišćavanja heterolognog proteina koji obuhvata
kultivisanje Gram-negativnog bakterijskog soja bilo kog od patentnih zahteva 2-6 tako da se fuzioni protein, koji sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina i heterologni protein, eksprimira i izlučuje u supernatant kulture ćelija
11. Rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj prema bilo kom od patentnih zahteva 2-6, za upotrebu u isporuci heterolognog proteina u vidu medikamenta ili vakcine subjektu.
12. Upotreba rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja prema bilo kom od patentnih zahteva 2-6 za skrining velikog obima u cilju identifikacije inhibitora za ćelijski put ili događaj pokrenut translociranim heterolognim proteinom/proteinima.
13. Biblioteka Gram-negativnih bakterijskih sojeva prema bilo kom od patentnih zahteva 2-6, pri čemu je heterologni protein koji je kodiran drugom DNK sekvencom ekspresionog vektora Gramnegativnih bakterijskih sojeva humani ili mišji protein i pri čemu je svaki humani ili mišji protein koji je eksprimiran od strane Gram-negativnih bakterijskih sojeva sa različitom aminokiselinskom sekvencom.
RS20191450A 2014-05-21 2015-05-20 Isporuka proteina zasnovana na bakterijama RS59583B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14169335 2014-05-21
EP15725282.6A EP3145946B1 (en) 2014-05-21 2015-05-20 Bacteria-based protein delivery
PCT/EP2015/061086 WO2015177197A1 (en) 2014-05-21 2015-05-20 Bacteria-based protein delivery

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59583B1 true RS59583B1 (sr) 2019-12-31

Family

ID=50771120

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191450A RS59583B1 (sr) 2014-05-21 2015-05-20 Isporuka proteina zasnovana na bakterijama

Country Status (23)

Country Link
US (3) US10889823B2 (sr)
EP (2) EP3145946B1 (sr)
JP (3) JP6797025B2 (sr)
KR (2) KR102440293B1 (sr)
CN (2) CN107001431B (sr)
AU (1) AU2015261905B2 (sr)
BR (1) BR112016027196B1 (sr)
CA (1) CA2948570C (sr)
CY (1) CY1122701T1 (sr)
DK (1) DK3145946T3 (sr)
EA (1) EA201692025A1 (sr)
ES (1) ES2754508T3 (sr)
HR (1) HRP20192050T1 (sr)
HU (1) HUE046025T2 (sr)
IL (2) IL248827B (sr)
LT (1) LT3145946T (sr)
PL (1) PL3145946T3 (sr)
PT (1) PT3145946T (sr)
RS (1) RS59583B1 (sr)
SG (1) SG11201609629YA (sr)
SI (1) SI3145946T1 (sr)
SM (1) SMT201900626T1 (sr)
WO (1) WO2015177197A1 (sr)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112016027196B1 (pt) 2014-05-21 2023-05-02 Universität Basel Vetor e cepa bacteriana gram-negativa recombinante
HUE051184T2 (hu) * 2015-11-19 2021-03-01 Univ Basel Baktériumalapú fehérjeszállítás
US12351805B2 (en) 2015-11-19 2025-07-08 Northeastern University Method of making recombinant silk and silk-amyloid hybrid proteins using bacteria
US11365225B2 (en) * 2015-11-19 2022-06-21 President And Fellows Of Harvard College Method of making recombinant silk and silk-amyloid hybrid proteins using bacteria
SG11201803643TA (en) 2015-11-19 2018-06-28 Univ Basel Virulence attenuated bacteria for treatment of malignant solid tumors
EA201991157A1 (ru) * 2016-12-20 2020-01-16 Университет Базель Доставка белков на основе бактерий, аттенуированных по вирулентности
US11484603B2 (en) 2017-03-31 2022-11-01 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Methods, systems, and compositions for inhibiting virulence of A/E family pathogens
CN107858367A (zh) * 2017-12-05 2018-03-30 复旦大学附属肿瘤医院 一种利用细菌靶向投递治疗性蛋白的系统及其应用
AU2020265755A1 (en) * 2019-05-01 2021-12-16 Innate Biologics Llc Immunomodulatory compositions and methods
EP4045672A4 (en) * 2019-10-18 2023-11-22 University of Virginia Patent Foundation COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING ENHANCED IMMUNE RESPONSES AND RAPID ANTIBODY PRODUCTION
CN111848803B (zh) * 2020-07-21 2022-04-08 珠海中科先进技术研究院有限公司 一种具有突出酸碱稳定性的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体及其制备方法
CN114480463B (zh) * 2020-10-26 2024-07-16 南京吉芮康生物科技研究院有限公司 一种减毒沙门氏菌分泌表达rbd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用
CN114712496B (zh) * 2022-04-29 2023-10-13 中山大学·深圳 一种展示新抗原的细菌衍生外膜囊泡疫苗及制备方法和在制备癌症免疫治疗试剂盒中的应用
CN115896314A (zh) * 2022-07-14 2023-04-04 四川大学 一种基于lf-rpa的猕猴桃细菌性溃疡病菌的无设备、可视化检测方法
CN117511912B (zh) * 2023-12-22 2024-03-29 辉大(上海)生物科技有限公司 IscB多肽、包含其的系统及其用途

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965381A (en) * 1998-03-06 1999-10-12 Ludwig Institute For Cancer Research Delivery of proteins into eukaryotic cells with recombinant yersinia
WO2000002996A2 (en) * 1998-07-10 2000-01-20 Cornell Research Foundation, Inc. Recombinant constructs and systems for secretion of proteins via type iii secretion systems
CA2424004A1 (en) 2000-09-26 2002-04-04 Roger William Hospital Recombinant bcg vaccines for the prevention and treatment of cancer
WO2002077249A2 (en) 2001-03-26 2002-10-03 Universite Catholique De Louvain Type iii bacterial strains for use in medicine
FR2862312B1 (fr) * 2003-11-13 2006-02-17 Univ Grenoble 1 Outil de transfert et de production de proteines mettant en oeuvre le systeme de secretion de type iii de pseudomonas
US20080205879A1 (en) 2005-07-15 2008-08-28 M2Sys Co., Ltd. Opening and Closing Apparatus For Small Image Photographing Devices
WO2007044406A2 (en) 2005-10-04 2007-04-19 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for stimulating an immune response using bacterial antigen delivery system
WO2008019183A2 (en) * 2006-05-18 2008-02-14 The Regents Of The University Of California Biopolymer and protein production using type iii secretion systems of gram negative bacteria
TW200819540A (en) 2006-07-11 2008-05-01 Genelux Corp Methods and compositions for detection of microorganisms and cells and treatment of diseases and disorders
EP1921149A1 (en) * 2006-11-13 2008-05-14 AEterna Zentaris GmbH Microorganisms as carriers of nucleotide sequences coding for antigens and protein toxins, process of manufacturing and uses thereof
EP2268313A2 (en) 2008-03-17 2011-01-05 Universitätsklinikum Münster Yopm as delivery vehicle for cargo molecules and as biological therapeutic for immunomodulation of inflammatory reactions
GB2483595B (en) * 2009-05-22 2017-03-29 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State Univ Recombinant bacterium and methods of antigen and nucleic acid delivery
JP6936934B2 (ja) 2013-09-24 2021-09-22 メディシナ セラピューティクス インコーポレイテッド インターロイキン−４受容体結合融合タンパク質及びその使用
US10143743B2 (en) 2013-11-18 2018-12-04 Yale University Non-replicating bacterial nanoparticle delivery system and methods of use
BR112016027196B1 (pt) 2014-05-21 2023-05-02 Universität Basel Vetor e cepa bacteriana gram-negativa recombinante
SG11201803643TA (en) 2015-11-19 2018-06-28 Univ Basel Virulence attenuated bacteria for treatment of malignant solid tumors
HUE051184T2 (hu) 2015-11-19 2021-03-01 Univ Basel Baktériumalapú fehérjeszállítás
EA201991157A1 (ru) 2016-12-20 2020-01-16 Университет Базель Доставка белков на основе бактерий, аттенуированных по вирулентности

Also Published As

Publication number Publication date
DK3145946T3 (da) 2019-11-18
EP3660034A1 (en) 2020-06-03
CA2948570C (en) 2023-09-12
HRP20192050T1 (hr) 2020-02-07
US20170198297A1 (en) 2017-07-13
WO2015177197A1 (en) 2015-11-26
JP2022109967A (ja) 2022-07-28
SG11201609629YA (en) 2016-12-29
BR112016027196B1 (pt) 2023-05-02
EA201692025A1 (ru) 2017-05-31
SI3145946T1 (sl) 2019-12-31
CN107001431B (zh) 2022-11-01
EP3145946B1 (en) 2019-08-14
US20210155942A1 (en) 2021-05-27
ES2754508T3 (es) 2020-04-17
KR102648293B1 (ko) 2024-03-15
CA2948570A1 (en) 2015-11-26
JP6797025B2 (ja) 2020-12-09
HUE046025T2 (hu) 2020-01-28
US20240401065A1 (en) 2024-12-05
KR20220127345A (ko) 2022-09-19
JP7509821B2 (ja) 2024-07-02
CN107001431A (zh) 2017-08-01
SMT201900626T1 (it) 2020-01-14
IL283280B1 (en) 2023-04-01
IL248827B (en) 2021-07-29
JP2020182478A (ja) 2020-11-12
US10889823B2 (en) 2021-01-12
IL283280B2 (en) 2023-08-01
EP3145946A1 (en) 2017-03-29
AU2015261905B2 (en) 2020-07-09
JP2017517257A (ja) 2017-06-29
LT3145946T (lt) 2019-11-25
CN115960919A (zh) 2023-04-14
CY1122701T1 (el) 2021-03-12
KR102440293B1 (ko) 2022-09-05
PL3145946T3 (pl) 2020-02-28
AU2015261905A1 (en) 2016-12-01
BR112016027196A2 (pt) 2018-01-30
PT3145946T (pt) 2019-11-20
IL248827A0 (en) 2017-01-31
KR20170010803A (ko) 2017-02-01
US12091670B2 (en) 2024-09-17
IL283280A (en) 2021-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240401065A1 (en) Bacteria-Based Protein Delivery
CN108884466B (zh) 基于细菌的蛋白递送
CA3005380C (en) Bacteria-based protein delivery
HK1236208B (en) Bacteria-based protein delivery
HK1236208A1 (en) Bacteria-based protein delivery
EA041646B1 (ru) Доставка белков, осуществляемая на основе бактерий
HK1256138B (en) Bacteria-based protein delivery
BR112018009782B1 (pt) Cepas bacterianas recombinantes gram-negativas transformadas com um vetor e vetores