KR102648293B1 - 세균 기반 단백질 전달 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 그람-음성 세균 균주, 및 이종 단백질의 진핵생물 세포내로의 전달을 위한 그의 용도에 관한 것이다.

Description

세균 기반 단백질 전달{BACTERIA-BASED PROTEIN DELIVERY}
본 발명은 재조합 그람-음성 세균 균주 및 진핵생물 세포내로 이종 단백질을 전달하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.
세포 생물학 연구에서 단백질 기능을 다루는데 수년간에 걸쳐 일시적인 형질감염 기법이 적용되어 왔다. 상기 방법은 일반적으로 연구중인 단백질의 과잉대표성을 생성시키며, 이는 신호전달 모델을 지나치게 단순화시킨다[1]. 수명이 짧은 신호전달 과정을 조절하는 단백질의 경우, 상기 관심 단백질은 상기 단백질이 조절하는 신호전달을 훨씬 더 길게 나타낸다[2]. 훨씬 더, DNA 형질감염 기반 일시 과잉-발현은 이종성이고 비동시적인 세포 집단을 유도하여, 기능 연구를 복잡하게 하고 오믹스 접근법을 방해한다. 이밖에도, 상기와 같은 분석을 보다 큰 규모로 확장시키는 것은 비용이 매우 많이 든다. 상기 언급한 점들 중 일부는, 플라스미드를 갖는 작은 GTPase를 세포막에 신속하게 표적화하는 유도성 전좌 전략[2] 또는 세포-침투성 세균 독소에 융합된 정제된 단백질의 첨가인, 정제된 단백질의 미세주입 또는 단백질 형질주입과 같은 기존의 기법들에 의해 다루어진다[3]. 그러나 이들 기법은 모두 시간-소모적이고 성가시며, 우리가 알기로는 상기 중 어느 것도 언급된 모든 기준을 충족시키지 못한다.
세균은 상이한 기전으로 진화하여 단백질을 표적 세포에 직접 주입한다[4]. 예르시니아(Yersinia), 시겔라(Shigella) 및 살모넬라(Salmonella)와 같은 세균들에 의해 사용되는 III형 분비 시스템(T3SS)은 소위 세균 이펙터(effector) 단백질을 숙주 세포에 주입하는 나노-주사기와 같은 기능을 한다. 이펙터라 칭하는 상기 T3SS를 통해 분비되는 세균 단백질은 짧은 N-말단 분비 신호를 갖는다[6]. 세균 내부에서, 일부 이펙터는 샤프론에 의해 결합된다. 샤프론은 독성 도메인을 가릴 수 있고[7], 분비 신호의 노출에 기여하며[8,9], 기질을 분비-적합 입체구조로 유지시켜[10] 분비를 촉진시킬 수 있다. 분비의 유도시, 상기 T3SS에 인접한 ATPase는 상기 샤프론을 제거하고[11], 상기 이펙터는 펴지거나 또는 부분적으로 폴딩되어 상기 바늘을 통해 이동하며[10], 일단 숙주 세포질에서 다시폴딩된다.
T3S는 하이브리드 펩티드 및 단백질을 표적 세포에 전달하기 위해 개발되었다. 이종 세균성 T3SS 이펙터는 연구중인 세균이 유전학에 의해 거의 접근할 수 없는 경우(클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)처럼; [12])에 전달되었다. 종종 리포터 단백질을 T3SS 의존성 단백질 전달을 위한 요건을 연구하기 위해 가능한 T3SS 분비 신호에 융합시켰다, 예를 들어 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 아데닐레이트 사이클라제[13], 뮤린 DHFR[10] 또는 인산화 가능한 태그[14]. 펩티드 전달은 주로 백신화를 목적으로 수행되었다. 상기는 바이러스 에피토프[15,16], 세균성 에피토프(리스테리오리신 O, [17])뿐만 아니라 인간 암세포의 에피토프를 나타내는 펩티드를 포함한다[18]. 소수의 경우에 나노바디[19], 핵 단백질(Cre-리콤비나제, MyoD)[20,21] 또는 Il10 및 IL1ra[22]의 경우와 같이, 기능성 진핵생물 단백질이 숙주 세포를 조절하기 위해 전달되었다. 상기 언급한 시스템들 중 어느 것도 하나 또는 다수의 내인성 이펙터 단백질이 여전히 암호화되는 각각의 경우에서와 같이 단일-단백질 전달을 허용하지 않는다. 더욱 또한, 상기 사용된 벡터들은, 선택 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편의 단순한 클로닝을 허용하는 방식으로 설계되지 않았으며, 이는 상기 시스템의 광범위한 적용을 방해한다.
따라서, 생리학적 농도에서 확장성이고, 신속하며, 동시적이고, 동종성이며, 조정이 가능한 관심 단백질의 전달을 허용하는 저렴하고 단순한 방법은 다수의 세포 생물학자들에게 대단히 이로울 것이다.
본 발명은 일반적으로 재조합 그람-음성 세균 균주 및 이종 단백질의 진핵생물 세포내로의 전달을 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 바이러스 단백질 및 가장 중요하게는 기능성 진핵생물 단백질의 다양한 III형 이펙터뿐만 아니라 IV형 이펙터의 전좌를 허용하는 그람-음성 세균 균주 및 그의 용도를 제공한다. 상기 숙주 세포로의 전달 후 전달의 형광 추적, 핵으로의 재국소화 및 현저하게는 세균 부속기관의 제거를 위한 수단들을 제공한다. 이는 오직 T3SS만을 사용하여 거의 고유의 단백질을 진핵생물 세포로 전달하는 최초의 전달을 허용한다. 상기 제공된 T3SS 기반 시스템은 확장성이고, 신속하며, 동시적이고, 동종성이며, 조정이 가능한 관심 단백질의 전달을 생성시킨다. 본 발명의 전달 시스템은 살아있는 동물에서 진핵생물 단백질의 주입에 적합하며 치료를 목적으로 사용될 수 있다.
첫 번째 태양에서 본 발명은 예르시니아, 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 재조합 그람-음성 세균 균주에 관한 것으로, 여기에서 상기 그람-음성 세균 균주는 5'에서 3' 방향으로
프로모터;
상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널(delivery signal)을 암호화하는 제1 DNA 서열; 및
상기 제1 DNA 서열의 3' 단부에 인프레임 융합된(fused in frame) 이종 단백질을 암호화하는 제2 DNA 서열
을 포함하는 벡터로 형질전환되고,
여기에서 상기 이종 단백질은 세포자멸(apoptosis) 또는 세포자멸 조절에 관련된 단백질들로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
추가의 태양에서, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로
프로모터;
상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널을 암호화하는 제1 DNA 서열;
상기 제1 DNA 서열의 3' 단부에 인프레임 융합된 이종 단백질을 암호화하는 제2 DNA 서열; 및
프로테아제 절단 부위를 암호화하는 제3 DNA 서열을 포함하고,
상기 제3 DNA 서열은 상기 제1 DNA 서열의 3' 단부와 상기 제2 DNA 서열의 5' 단부 사이에 위치하는, 벡터
로 형질전환된 재조합 그람-음성 세균 균주에 관한 것이다.
추가의 태양에서 본 발명은 재조합 그람-음성 세균 균주에 관한 것으로, 여기에서 상기 재조합 그람-음성 세균 균주는 예르시니아 균주이며 상기 예르시니아 균주는 야생형이거나 또는 적어도 하나의 T3SS 이펙터 단백질의 생성에 결함이 있고, 5'에서 3' 방향으로
프로모터;
상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널을 암호화하는 제1 DNA 서열(여기에서, 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널은 와이. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica) YopE 이펙터 단백질의 N-말단 138개 아미노산을 포함한다); 및
상기 제1 DNA 서열의 3' 단부에 인프레임 융합된 이종 단백질을 암호화하는 제2 DNA 서열
을 포함하는 벡터로 형질전환된다.
추가의 태양에서 본 발명은 재조합 그람-음성 세균 균주에 관한 것으로, 여기에서 상기 재조합 그람-음성 세균 균주는 살모넬라 균주이며 상기 살모넬라 균주는 야생형이거나 또는 적어도 하나의 T3SS 이펙터 단백질의 생성에 결함이 있고, 5'에서 3' 방향으로
프로모터;
상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널을 암호화하는 제1 DNA 서열(여기에서 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널은 에스. 엔테리카(S. enterica) SteA 이펙터 단백질 또는 상기 에스. 엔테리카 SopE 이펙터 단백질의 N-말단 81개 또는 105개 아미노산을 포함한다); 및
상기 제1 DNA 서열의 3' 단부에 인프레임 융합된 이종 단백질을 암호화하는 제2 DNA 서열
을 포함하는 벡터로 형질전환된다.
추가의 태양에서 본 발명은 5'에서 3' 방향으로
프로모터;
상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널을 암호화하는 제1 DNA 서열;
상기 제1 DNA 서열의 3' 단부에 인프레임 융합된 이종 단백질을 암호화하는 제2 DNA 서열; 및
프로테아제 절단 부위를 암호화하는 제3 DNA 서열(여기에서 상기 제3 DNA 서열은 상기 제1 DNA 서열의 3' 단부와 상기 제2 DNA 서열의 5' 단부 사이에 위치한다)
을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기의 단계들을 포함하는, 이종 단백질을 진핵생물 세포내로 전달하기 위한 방법에 관한 것이다:
i) 그람-음성 세균 균주를 배양하는 단계; 및
ii) 진핵생물 세포를 i)의 그람-음성 세균 균주와 접촉시키는 단계로서, 여기에서 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널 및 상기 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질은 상기 그람-음성 세균 균주에 의해 발현되며 상기 진핵생물 세포내로 전좌되는, 단계.
본 발명은 또한 하기의 단계들을 포함하는, 이종 단백질을 진핵생물 세포내로 전달하기 위한 방법에 관한 것이다:
i) 그람-음성 세균 균주를 배양하는 단계;
ii) 진핵생물 세포를 i)의 그람-음성 세균 균주와 접촉시키는 단계로서, 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널 및 상기 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질은 상기 그람-음성 세균 균주에 의해 발현되며 상기 진핵생물 세포내로 전좌되는 단계; 및
iii) 상기 이종 단백질이 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널로부터 절단되도록 상기 융합 단백질을 절단하는 단계.
본 발명은 또한 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널 및 상기 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질이 발현되고 배양 상등액내로 분비되도록 그람-음성 세균 균주를 배양함을 포함하는 이종 단백질의 정제 방법에 관한 것이다.
추가의 태양에서 본 발명은 그람-음성 세균 균주의 라이브러리에 관한 것으로, 여기에서 상기 그람-음성 세균 균주의 발현 벡터의 제2 DNA 서열에 의해 암호화된 이종 단백질은 인간 또는 뮤린 단백질이며, 그람-음성 세균 균주에 의해 발현된 각각의 인간 또는 뮤린은 아미노산 서열이 상이하다.
도 1: T3SS 단백질 전달의 특성화. (A) 주변 매질(시험관내 분비)(좌측) 또는 진핵생물 세포(우측)내로의 T3SS 의존성 단백질 분비의 도식적 표현. I: 3형 분비 시스템을 나타낸다. II는 주변 매질내로 분비된 단백질을 가리키고, III은 세포막을 통해 진핵생물 세포의 시토솔내로 전좌된 단백질을 가리킨다(VII). VI는 상기 T3SS가 삽입되며 세균 시토솔 아래에 있는 2개의 세균 세포막의 신장부를 나타낸다. IV는 YopE1-138 N-말단 단편(V)에 부착된 융합 단백질이다. (B) 항-YopE 항체를 사용하는 전체 세균 용해물(IV) 및 침전된 배양 상등액(V)상의 웨스턴 블럿팅에 의해 밝혀진 바와 같은 I: 와이. 엔테로콜리티카 E40 야생형, II: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd 또는 III: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + pBadSi_2의 시험관내 분비.
도 2: 상피세포내로의 T3SS 단백질 전달의 특성화. (A) I: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd 또는 II: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + pBad_Si2에 의해 1시간 동안 100의 MOI로 감염된 HeLa 세포상의 항-Myc 면역형광 염색. (B) HeLa 세포내 (A)로부터의 항-Myc 면역형광 염색 강도의 정량분석. 데이터는 n=20 부위로부터 합해졌으며, 표시된 오차 막대는 평균의 표준 오차이다. I: 감염되지 않음, II: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd 또는 III: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + pBad_Si2. Y-축은 항-Myc 염색 강도[임의의 단위]를 가리키고, x-축은 감염 시간(분)을 가리킨다. (C) 세포내 항-Myc 면역형광 염색 강도의 정량분석. HeLa 세포는 x-축상에 표시된 MOI로 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + pBad_Si2에 의해 1시간 동안 감염되었다. 데이터는 n=20 부위로부터 합해졌으며, 표시된 오차 막대는 평균의 표준 오차이다. Y-축은 항-Myc 염색 강도[a.u.]를 가리킨다.
도 3: T3SS 기반 단백질 전달의 변형은 YopE 1-138 융합 단백질(EGFP)의 핵 국소화를 허용한다. 플라스미드 III: +YopE1-138-EGFP 또는 IV: +YopE1-138-EGFP-NLS를 운반하는 I: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd 또는 II: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd ΔyopB에 의해 100의 MOI로 감염된 HeLa 세포에서의 EGFP 신호. EGFP 신호는 "a"에 나타내고, 국소화 비교를 위해서 핵은 "b"에서 염색되었다.
도 4: T3SS 기반 단백질 전달의 변형은 YopE 1-138 부속기관의 제거를 허용한다. HeLa 세포를 2개의 상이한 와이. 엔테로콜리티카 균주로 동시에 감염시키며, 이는 상기 두 세균 현탁액의 단순한 혼합에 의해 달성된다. 하나의 균주는 YopE1-138에 융합된 TEV 프로테아테를 전달하는 반면, 다른 균주는 이중 TEV 프로테아제 절단 부위를 함유하는 링커에 의해 YopE1-138에 융합된 관심 단백질을 전달한다. 진핵생물 세포내로의 단백질 전달 후에, 상기 TEV 프로테아제는 상기 YopE1-138 부속기관을 관심 단백질로부터 절단할 것이다 (A) 감염되지 않은(II) 또는 I: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd 및 III: + pBadSi_2, IV: + YopE1-138-2x TEV 절단 부위-Flag-INK4C, V: + YopE1-138-2x TEV 절단 부위-Flag-INK4C 및 정제된 TEV 프로테아제에 의한 추가의 밤새 처리 및 VI: + YopE1-138-2x TEV 절단 부위-Flag-INK4C 및 제2 균주 + YopE1-138-TEV로 2시간 동안 감염 후(100의 MOI)의 디지토닌 용해된 HeLa 세포를 YopE1-138-2x TEV 절단 부위-Flag-INK4C 또는 그의 절단된 형태 Flag-INK4C의 존재에 대해 항-INK4C("a"에 나타냄)를 웨스턴 블럿팅함으로써 분석하였다. 로딩 대조용으로서 항-액틴의 웨스턴 블럿팅을 수행하였다("b"에 나타냄). 하나의 경우(V)에 상기 용해된 세포를 정제된 TEV 프로테아제와 함께 밤새 배양하였다. (B) 전장(full length) YopE1-138-2x TEV 절단 부위-Flag-INK4C의 크기에서 (A)로부터의 항-INK4C 염색강도(y-축상에 [a.u.]으로서 나타냄)의 액틴 표준화된 정량분석, 이때 샘플 IV를 100%로 설정한다. I: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd 및 IV: YopE1-138-2x TEV 절단 부위-Flag-INK4C, V: + YopE1-138-2x TEV 절단 부위-Flag-INK4C 및 정제된 TEV 프로테아제에 의한 추가의 밤새 처리 및 VI: + YopE1-138-2x TEV 절단 부위-Flag-INK4C 및 제2 균주 + YopE1-138-TEV. 데이터를 n=2의 독립적인 실험들로부터 합하였고, 표시된 오차 막대는 평균의 표준 오차이다 (C) 감염되지 않은(II) 또는 I: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd 및 III: + pBadSi_2, IV: + YopE1-138-2x TEV 절단 부위-ET1-Myc, V: + YopE1-138-2x TEV 절단 부위-ET1-Myc 및 정제된 TEV 프로테아제에 의한 추가의 밤새 처리 및 VI: + YopE1-138-2x TEV 절단 부위-ET1-Myc 및 제2 균주 + YopE1-138-TEV로 2시간 동안 감염 후(100의 MOI)의 디지토닌 용해된 HeLa 세포를 YopE1-138-2x TEV 절단 부위-ET1-Myc 또는 그의 절단된 형태 ET1-Myc의 존재에 대해 항-Myc("a"에 나타냄)를 웨스턴 블럿팅함으로써 분석하였다. 로딩 대조용으로서 항-액틴의 웨스턴 블럿팅을 수행하였다("b"에 나타냄). 하나의 경우(V)에 상기 용해된 세포를 정제된 TEV 프로테아제와 함께 밤새 배양하였다.
도 5: 진핵생물 세포내로의 세균성 이펙터 단백질의 전달 (A) HeLa 세포를 상 위에 표시된 시간(2, 10 또는 60분) 동안 100의 MOI로 II: pBad_Si2 또는 III: YopE1-138-SopE를 운반하는 I: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd에 의해 감염시켰다. 고정 후에 세포를 액틴 세포골격에 대해 염색하였다. (B) HeLa 세포를 감염시키지 않은 채로 두거나(II) 또는 균주 아래에 표시된 MOI(MOI: 50; MOI50:MOI50 또는 MOI50:MOI100)로 1시간 동안 III: YopE1-138-SopE-Myc를 운반하는 I: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd에 의해 감염시키고 일부의 경우에 IV: YopE1-138-SptP에 의해 동시감염시켰다. 고정 후에 세포를 액틴 세포골격에 대해 염색시키고("a"에 나타냄) YopE1-138-SopE-Myc 융합 단백질의 존재를 항-Myc 염색을 통해 추적하였다("b"에 나타냄).
도 6: 진핵생물 세포내로 세균성 이펙터 단백질의 전달 (A) 처리되지 않은 채로 있거나(II) 또는 100의 MOI로 III: pBad_Si2 또는 IV: YopE1-138-OspF를 운반하는 I: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd에 의해 75분 동안 감염된 HeLa 세포상의 포스포-p38("a"), 전체 p38("b") 및 액틴("c") 웨스턴 블럿 분석. 세포를 지시된 바와 같이 상기 감염의 최종 30분 동안 TNFα로 자극하였다(+는 TNFα의 첨가를 나타내고, -는 TNFα에 의한 처리가 없음을 나타낸다). (B) 처리되지 않은 채로 있거나(II) 또는 100의 MOI로 III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-SopE 또는 V: YopE1-138-SopB를 운반하는 I: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd에 의해 22.5 또는 45분(블럿 아래에 표시됨) 동안 감염된 HeLa 세포상의 포스포-Akt T308("a") 및 S473("b") 및 액틴("c") 웨스턴 블럿 분석. (C) 처리되지 않은 채로 있거나(I) 또는 100의 MOI로 V: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-BepA, VI: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-BepAE305-단부, VII: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-BepGBid 또는 VIII: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + pBad_Si2에 의해 2.5시간 동안 감염된 HeLa 세포 중의 cAMP 수준(y축에 나타낸 fmol/웰). 콜레라 독소(CT)를 양성 대조용으로서 1시간 동안 샘플 II(1 ㎕/㎖), III(25 ㎍/㎖) 또는 IV(50 ㎍/㎖)에 가하였다. 데이터는 n=3의 독립적인 실험으로부터 합해졌고, 표시된 오차 막대는 평균의 표준 오차이다. 통계학적 분석을 독립표본 양방 t-검정을 사용하여 수행하였다(ns는 유의수준이 아닌 변화를 가리키고, **는 p값<0.01을 가리키고, ***은 p값<0.001을 가리킨다).
도 7: 인간 tBid의 진핵생물 세포내로의 전달은 대량 세포자멸을 유도한다. (A) 처리되지 않은 채로 있거나(II) 또는 100의 MOI로 III: pBas_Si2, IV: YopE1-138-Bid 또는 V: YopE1-138-t-Bid를 운반하는 I: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd에 의해 60분 동안 감염된 HeLa 세포상의 절단된 카스파제 3 p17("a") 및 액틴("b") 웨스턴 블럿 분석. 로딩 대조용으로서 항-액틴의 플럿팅을 수행하였다 ("b"에 나타냄). 일부의 경우에, 세포를 VI: 0.5 μM 스타우로스포린 또는 VII: 1 μM 스타우로스포린으로 처리하였다 (B) 처리되지 않은 채로 있거나(II) 또는 100의 MOI로 III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-Bid 또는 V: YopE1-138-t-Bid를 수반하는 I: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd에 의해 1시간 동안 감염 후 디지토닌 용해된 HeLa 세포를 항-Bid의 웨스턴 블럿팅("a")에 의해 분석하여 내인성 Bid 수준(Z 표시된)을 전좌된 YopE1-138-Bid(X 표시된) 또는 YopE1-138-tBid(Y 표시된) 수준과의 비교를 허용하였다. 일부의 경우에, 세포를 VI: 0.5 μM 스타우로스포린 또는 VII: 1 μM 스타우로스포린으로 처리하였다 (C) HeLa 세포를 처리되지 않은 채로 두거나(I) 또는 100의 MOI로 II: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + pBad_Si2, III: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-Bid, IV: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-tBid에 의해 1시간 동안 감염시켰다. 일부의 경우에, 세포를 V: 0.5 μM 스타우로스포린 또는 VI: 1 μM 스타우로스포린으로 처리하였다. 고정 후에 세포를 액틴 세포골격에 대해 염색하였다(회색).
도 8: 제브라피쉬 BIM의 T3SS 의존성 전달은 제브라피쉬 배에서 세포자멸을 유도한다. (A) 2 dpf 제브라피쉬 배를 후뇌 영역내에 약 400 세균의 주입에 의해 EGFP 발현 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + pBad_Sil 대조용 균주(I) 또는 zBIM 전좌 균주(II: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-zBIM)로 감염시켰다. 5.5시간 후에, 상기 배를 고정시키고, 활성화된 카스파제 3(절단된 카스파제 3, p17: "c"에 나타냄)를 염색하고 세균의 존재(EGFP 신호, "b"에 나타냄)에 대해 분석하였다. 최대 강도의 z 투영을 형광 상들에 대해 나타낸다. 명시야 z 투영을 "a"에 나타낸다 (B) (A)의 기록된 z-스택 상의 최대 강도 z 투영에 대한 자동 상 분석. 간단히, 세균을 GFP 채널을 통해 검출하였다. 세균 스폿의 각 영역 주위에 10 픽셀의 반경을 갖는 원을 생성시켰다. 중복 영역을 연결 구성원들 중에서 균등하게 분리시켰다. 세균을 가깝게 둘러싸는 영역들에서 상기 카스파제 3 p17 염색 강도를 측정하고 y-축상에 플롯팅한다([a.u.]으로서). 통계학적 분석을 만-휘트니 검정(***는 p값<0.001을 가리킨다)을 사용하여 수행하였다. 데이터는 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + pBad_Sil 대조용 균주(I)의 경우 n=14 또는 II: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-zBIM 감염된 동물의 경우 n=19로부터 합해졌고, 표시된 오차 막대는 평균의 표준 오차이다.
도 9: tBiD 의존성 인단백질체(phosphoproteome): HeLa 세포를 30분 동안 100의 MOI로 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-t-Bid 및 대조용으로서 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + pBad_Si2에 의해서 감염시켰다. (A) tBID 인단백질체의 그래프 표현. tBid 의존적인 방식으로 현저하게 조절된 포스포펩티드를 함유하는 단백질(회색)(q-값<0.01)뿐만 아니라 공지된 세포자멸 관련된 단백질(짙은 회색)을 공지된 및 예측된 단백질-단백질 상호작용의 STRING 네트워크로 나타낸다(높은-신뢰도, 점수 0.7). STRING에서 적어도 하나의 연결을 갖는 단백질만을 나타낸다. (B) 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + pBad_Si2(I) 또는 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-t-Bid(II)로 감염된 HeLa 세포의 공초점 상들은 tBid 전달시 세포자멸 표현형의 유도를 드러낸다. 세포를, 핵의 경우 훽스트(Hoechst)("a")로, F-액틴의 경우 팔로이딘("b")으로, 튜불린의 경우 항-튜불린 항체("c")로, 미토콘드리아의 경우 미토트랙커(mitotracker)("d")로 염색하였다. 스케일 바는 40 ㎛를 나타낸다.
도 10: III형 분비-기반 전달 툴박스의 기재 (A) YopE1-138을 갖는 융합 구조물의 생성에 사용된 클로닝 플라스미드 pBad_Si1 및 pBad_Si2의 벡터 지도. 샤프론 SycE 및 YopE1-138-융합은 고유의 와이. 엔테로콜리티카 프로모터하에 있다. 상기 두 플라스미드는 단지 pBad_Si1상에 존재하는 아라비노스 유도성 EGFP의 존재만이 상이하다 (B) pBad_Si1 및 pBad_Si2 플라스미드상의 yopE1-138 단편에 직접 이어지는 다수의 클로닝 부위.
도 11: 다양한 세포주내로의 T3SS 단백질 전달의 특성화. 처리되지 않은 채로 있거나(II) 또는 상위에 표시된 MOI(HUVEC에 대해서 MOI 25, 50, 100, 200 및 400)로 1시간 동안 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + pBad_Si2(I)에 의해 감염된 스위스(Swiss) 3T3 섬유아세포("a"), 주르캣 세포("b") 및 HUVEC 세포("c")상의 항-Myc 면역형광 염색.
도 12: 진핵생물 세포내로의 세균성 이펙터 단백질의 전달의 T3SS 의존성. 블럿 위에 표시된 시간 동안 100의 MOI로 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asdΔyopB + YodE1-138-SopE-Myc(I) 또는 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-SopE-Myc(II)에 의해 감염 후 디지토닌 용해된 HeLa 세포를 항-Myc의 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다. YopE1-138-SopE-Myc에 상응하는 크기를 "a"로 표시하는 반면, 내인성 c-Myc 단백질의 크기는 "b"로 표시한다.
도 13 및 14: 배양 상등액내로의 다양한 다른 단백질의 T3SS 의존적인 분비. I: 표시된 바와 같은 단백질에 융합된 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138의 시험관내 분비 실험. 전체 세균 용해물("A") 및 침전된 배양 상등액("B")의 단백질 함량을 항-YopE 항체를 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다. 기록된 숫자들은 상응하는 높이에서 kDa의 분자량을 가리킨다.
도 15A 내지 M: 본 연구에 사용된 와이. 엔테로콜리티카 및 에스. 엔테리카 균주. 배경 균주, 플라스미드 및 상응하는 플라스미드상에 암호화된 T3SS 의존적인 전달을 위한 단백질에 대한 정보를 제공하는 본 연구에 사용된 와이. 엔테로콜리티카 및 에스. 엔테리카 균주의 목록. 더욱이, 상응하는 플라스미드의 제작에 사용된 올리고뉴클레오티드, 배경 플라스미드 및 항생제 내성에 대한 정보를 제공한다.
도 16: B16F10 세포내로의 뮤린 tBid, 뮤린 Bid BH3 및 뮤린 Bax BH3의 전달은 대량 세포자멸을 유도한다. 감염되지 않은 채로 있거나(I) 또는 2.5시간 동안 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd 및 II: + pBadSi_2, III: + YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 tBid, IV: + YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 Bid HB3 또는 V: + YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 Bax BH3로 감염(50의 MOI) 후의 B16F10 세포. 고정 후 세포를 액틴 세포골격 및 핵에 대해 염색하였다(둘 다 회색으로).
도 17: D2A1 세포내로의 뮤린 tBid, 뮤린 Bid BH3 및 뮤린 Bax BH3의 전달은 대량 세포자멸을 유도한다. 감염되지 않은 채로 있거나(I) 또는 2.5시간 동안 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd 및 II: + pBadSi_2, III: + YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 tBid, IV: + YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 Bid HB3 또는 V: + YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 Bax BH3로 감염(50의 MOI) 후의 D2A1 세포. 고정 후 세포를 액틴 세포골격 및 핵에 대해 염색하였다(둘 다 회색으로).
도 18: HeLa 세포내로의 뮤린 tBid, 뮤린 Bid BH3 및 뮤린 Bax BH3의 전달은 대량 세포자멸을 유도한다. 감염되지 않은 채로 있거나(I) 또는 2.5시간 동안 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd 및 II: + pBadSi_2, III: + YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 tBid, IV: + YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 Bid HB3 또는 V: + YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 Bax BH3로 감염(50의 MOI) 후의 HeLa 세포. 고정 후 세포를 액틴 세포골격 및 핵에 대해 염색하였다(둘 다 회색으로).
도 19: 4T1 세포내로의 뮤린 tBid, 뮤린 Bid BH3 및 뮤린 Bax BH3의 전달은 대량 세포자멸을 유도한다. 감염되지 않은 채로 있거나(I) 또는 2.5시간 동안 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd 및 II: + pBadSi_2, III: + YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 tBid, IV: + YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 Bid HB3 또는 V: + YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 Bax BH3로 감염(50의 MOI) 후의 4T1 세포. 고정 후 세포를 액틴 세포골격 및 핵에 대해 염색하였다(둘 다 회색으로).
도 20: SPI-1 T3SS 유도 조건하에서 생육된 에스. 엔테리카에 의한 뮤린 tBid의 진핵생물 세포내로의 전달은 세포자멸을 유도한다. 처리되지 않은 채로 있거나(I) 또는 4시간 동안 100의 MOI로 IV: SteA1-20-t-Bid, V: SteAFL-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid 또는 VII: SopE1-105-t-Bid를 운반하는 III: 에스. 엔테리카 aroA에 의해 감염된 HeLa 세포에 대한 절단된 카스파제 3 p17 웨스턴 블럿 분석. 상기 실험을 위해서, 모든 에스. 엔테리카 aroA 균주를 SPI-1 T3SS 유도 조건하에서 생육시켰다. 일부의 경우에, 세포를 II: 1 μM 스타우로스포린으로 처리하였다. 기록된 숫자는 상응하는 높이에서 kDa의 분자량을 가리킨다.
도 21: SPI-2 T3SS 유도 조건하에서 생육된 에스. 엔테리카에 의한 뮤린 tBid의 진핵생물 세포내로의 전달은 세포자멸을 유도한다. 처리되지 않은 채로 있거나(I) 또는 4시간 동안 100의 MOI로 IV: SteA1-20-t-Bid, V: SteAFL-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid 또는 VII: SopE1-105-t-Bid를 운반하는 III: 에스. 엔테리카 aroA에 의해 감염된 HeLa 세포에 대한 절단된 카스파제 3 p17 웨스턴 블럿 분석. 상기 실험을 위해서, 모든 에스. 엔테리카 aroA 균주를 SPI-2 T3SS 유도 조건하에서 생육시켰다. 일부의 경우에, 세포를 II: 1 μM 스타우로스포린으로 처리하였다. 기록된 숫자는 상응하는 높이에서 kDa의 분자량을 가리킨다.
도 22: 다양한 세포주기 단백질의 배양 상등액내로의 에스. 엔테리카 T3SS 의존적인 분비. 하기에 나열된 바와 같은 단백질에 융합된 에스. 엔테리카 aroA + SteAFL(I, III, V, VII) 또는 SopE1-105(II, IV, VI, VIII)의 시험관내 분비 실험. I 및 II: Ink4a-MycHis; III 및 IV: Ink4c-MycHis; V 및 VI: Mad2-MycHis; VII 및 VIII: Cdk1-MycHis. 침전된 배양 상등액("A") 및 전체 세균 용해물("B")의 단백질 함량을 항-myc 항체를 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다. 기록된 숫자는 상응하는 높이에서 kDa의 분자량을 가리킨다.
도 23: 다양한 공지된 세포주기 간섭 펩티드의 배양 상등액내로의 T3SS 의존적인 분비. 하기 나열된 바와 같은 펩티드에 융합된 I: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + pBad_Si2, II-VII: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138의 시험관내 분비 실험: II: Ink4A84-103; III: p107/RBL1657-662; IV: p21141-160D149A; V: p21145-160D149A; VI: p2117-33; VII: 사이클린 D2139-147. 침전된 배양 상등액("A") 및 전체 세균 용해물("B")의 단백질 함량을 항-YopE 항체를 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다. 기록된 숫자는 상응하는 높이에서 kDa의 분자량을 가리킨다.
도 24: T3SS 전달된 단백질의 유비퀴틴에의 융합은 YopE 1-138 부속기관의 제거를 허용한다. HeLa 세포를 직접 융합된 유비퀴틴을 갖는 Yop1-138E(YopE1-138-Ubi)에 융합된 관심 단백질을 전달하는 균주로 감염시킨다. 진핵생물 세포내로 단백질 전달 후에, 내인성 유비퀴틴 특이성 프로테아제는 상기 YopE1-138-Ubi 부속기관을 상기 관심 단백질로부터 절단할 것이다. 감염되지 않은 채로 있거나(I) 또는 1시간 동안 II: 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis 또는 III: + YopE1-138-Flag-유비퀴틴-INK4C-MycHis에 의해 감염(100의 MOI) 후의 디지토닌 용해된 HeLa 세포를 IV: YopE1-138-Flag-유비퀴틴-INK4C-MycHis 또는 V: YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, 절단된 형태 VI: INK4C-MycHis 및 VII: 내인성 INK4C의 존재에 대해 항-INK4C의 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다.
본 발명은 재조합 그람-음성 세균 균주 및 이종 단백질의 진핵생물 세포내로의 전달을 위한 그의 용도를 제공한다.
본 명세서를 해석하기 위해서, 하기의 정의들을 적용할 것이며, 적합한 경우에는 언제나, 단수로 사용된 용어가 복수를 또한 포함하고 이와 역도 마찬가지일 것이다. 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정한 실시태양을 기재하기 위한 것이며 제한을 의도하지 않는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "그람-음성 세균 균주"란 용어는 하기의 세균들을 포함한다: 아에로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 아에로모나스 베로니이(Aeromonas veronii), 아나에로믹소박터 데할로게난스(Anaeromyxobacter dehalogenans), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 브라디리조븀 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum), 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia), 브루크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 브루크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 클라미디아 뮤리다룸(Chlamydia muridarum), 클라미디아 트라크모아티스(Chlamydia trachmoatis), 클라미도필라 아보르투스(Chlamydophila abortus), 클라미도필라 뉴모니아에(Chlamydophila pneumoniae), 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum), 시트로박터 로덴티움(Citrobacter rodentium), 데술포비브리오 불가리스(Desulfovibrio vulgaris), 에드와르드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 엔도조이코모나스 엘리시콜라(Endozoicomonas elysicola), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 에스케리키아 알베르티이(Escherichia albertii), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 라우소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis), 메소리조븀 로티(Mesorhizobium loti), 믹소코커스 잔투스(Myxococcus xanthus), 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans), 포토박테리움 담셀라에(Photobacterium damselae), 포토라브두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens), 포토라브두스 템페라테(Photorabdus temperate), 슈도알테로모나스 스폰지아에(Pseudoalteromonas spongiae), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida), 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 리조븀 스페시즈(Rhizobium sp), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 다른 살모넬라 스페시즈, 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 다른 시겔라 스페시즈, 솔다리스 글로시니디우스(Sodalis glossinidius), 비브리오 알기노리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 아주레우스(Vibrio azureus), 비브리오 캄펠리이(Vibrio campellii), 비브리오 카리브벤티쿠스(Vibrio caribbenthicus), 비브리오 하르베이(Vibrio harvey), 비브리오 파라하에모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 타스마니엔시스(Vibrio tasmaniensis), 비브리오 투비아시이(Vibrio tubiashii), 잔토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis), 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae), 예르시니아 엔테로콜리티카, 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 예르시니아 슈도튜베르큘로시스(Yersinia pseudotuberculosis). 본 발명의 바람직한 그람-음성 세균 균주는 엔테로박테리아세아에 및 슈도모나다세아에 과에 의해 포함되는 그람-음성 세균 균주이다. 본 발명의 그람-음성 세균 균주는 시험관내 및 생체내에서 세균성 T3SS에 의한 이종 단백질의 진핵생물 세포내로의 전달에 통상적으로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 "재조합 그람-음성 세균 균주"란 용어는 벡터에 의해 유전학적으로 형질전환된 그람-음성 세균 균주를 지칭한다. 본 발명의 유용한 벡터는 예를 들어 발현 벡터, 염색체 또는 독성 플라스미드 삽입을 위한 벡터 또는 염색체 또는 독성 플라스미드 삽입을 위한 DNA 단편이다.
"생육에 필수적인 아미노산을 생성시키는데 결함이 있는 그람-음성 세균 균주" 및 "영양요구성 돌연변이체"란 용어는 본 명세서에서 호환가능하게 사용되며 적어도 하나의 외부적으로 제공된 필수 아미노산 또는 그의 전구체의 부재하에서 생육할 수 없는 그람-음성 세균 균주를 지칭한다. 상기 균주가 생성하기에 결함이 있는 아미노산은 예를 들어 아스파테이트, 메소-2,6-디아미노피멜산, 방향족 아미노산 또는 류신-아르기닌이다[23]. 상기와 같은 균주는 예를 들어 아스파테이트-베타-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자(Δasd)의 결실에 의해 생성될 수 있다. 상기와 같은 영영요구성 돌연변이체는 외인성 메소-2,6-디아미노피멜산의 부재하에서 생육할 수 없다[24]. 상기 아스파테이트-베타-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자의 돌연변이, 예를 들어 결실은 본 발명에서, 본 발명의 생육에 필수적인 아미노산을 생성시키는데 결함이 있는 그람-음성 세균 균주에 바람직하다.
"진핵생물 세포 표면 또는 세포외 기질에 결합하는 부착 단백질을 생성시키는데 결함이 있는 그람-음성 세균 균주"란 용어는 상응하는 야생형 균주에 의해 발현된 부착 단백질에 비해 적어도 하나의 부착 단백질을 발현하지 않는 돌연변이 그람-음성 세균 균주를 지칭한다. 부착 단백질은 예를 들어 섬모/털 또는 비-털 부착소와 같은 연장된 중합체성 부착 분자를 포함할 수 있다. 털 부착소는 1형 섬모(예를 들어 FimH 부착소를 갖는 이. 콜라이 Fim-섬모), P-섬모(예를 들어 이. 콜라이로부터의 PapG 부착소를 갖는 Pap-섬모), 4형 섬모(예를 들어 피. 아에루기노사로부터의 필린 단백질로서) 또는 컬리(에스. 엔테리카로부터의 CsgA 부착소를 갖는 Csg 단백질)을 포함한다. 비-털 부착은 삼량체성 자기수송체 부착소, 예를 들어 와이. 엔테로콜리티카로부터의 YadA, BpaA(비 슈도말레이), Hia(에이치 인플루엔자에), BadA(비. 헨셀라에), NadA(엔. 메닌지티디스) 또는 UspA1(엠. 카타르할리스)뿐만 아니라 다른 자기수송체 부착소, 예를 들어 AIDA-1(이. 콜라이)뿐만 아니라 다른 부착소/침입소, 예를 들어 와이. 엔테로콜리티카로부터의 InvA 또는 인티민(이. 콜라이) 또는 Dr-과 또는 Afa-과(이. 콜라이)의 일원을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 YadA 및 InvA란 용어는 와이. 엔테로콜리티카로부터의 단백질들을 지칭한다. 자기수송체 YadA[25,26]는 상이한 형태의 콜라겐뿐만 아니라 피브로넥틴에 결합하는 반면, 침입소 InvA[27-29]는 진핵생물 세포막 중의 β-인테그린에 결합한다. 상기 그람-음성 세균 균주가 와이. 엔테로콜리티카 균주인 경우 상기 균주는 바람직하게는 InvA 및/또는 YadA가 결핍되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "엔테로박테리아세아에 과"란 용어는 토양, 물, 식물 및 동물에서 발견되는 그람-음성, 막대형, 통성 혐기성 세균의 과를 포함하며, 상기는 척추동물에서 병원체로서 빈번히 발생한다. 상기 과의 세균들은 유사한 생리학을 공유하며 각각의 게놈의 기능 요소 및 유전자내 보존을 나타낸다. 상기 과의 모든 구성원은 옥시다제 음성일뿐만 아니라, 글루코스 발효제이며 대부분 니트레이트 환원제이다.
본 발명의 엔테로박테리아세아에 세균은 상기 과로부터의 임의의 세균일 수 있으며, 구체적으로 비제한적으로 하기 속의 세균들을 포함한다: 에스케리키아, 시겔라(Shigella), 에드와르드시엘라(Edwardsiella), 살모넬라, 시트로박터(Citrobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 엔테로박터, 세라티아(Serratia), 프로테우스(Proteus), 에르위니아(Erwinia), 모르가넬라(Morganella), 프로비덴시아(Providencia) 또는 예르시니아. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 세균은 에스케리키아 콜라이, 에스케리키아 블라타에(Escherichia blattae), 에스케리키아 페르구소니이(Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르마니이(Escherichia hermanii), 에스케리키아 부네리스(Escherichia vuneris), 살모넬라 엔테리카, 살모넬라 봉고리(Salmonella bongori), 시겔라 다이센테리아에(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 보이디이(Shigella boydii), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 게르고비아에(Enterobacter gergoviae), 엔테로박터 사카자키이(Enterobacter sakazakii), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 예르시니아 슈도튜베르큘로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 예르시니아 엔테로콜리티카, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로테우스 페네리(Proteus penneri), 프로테우스 하우세리(Proteus hauseri), 프로비덴시아 알칼리파시엔스(Providencia alcalifaciens) 또는 모르가넬라 모르가니이 스페시즈(Morganella morganii species). 바람직하게는 상기 그람-음성 세균 균주는 예르시니아, 에스케리키아, 살모넬라, 시겔라, 슈도모나스, 클라미디아, 에르위니아, 판토에아, 비브리오, 부르크홀데리아, 랄스토니아, 잔토모나스, 크로모박테리움, 소달리스, 시트로박터, 에드와르드시엘라, 리조비아에, 아에로모나스, 포토라브두스, 브로데텔라 및 데술포비브리오 속으로 이루어지는 그룹으로부터, 보다 바람직하게는 예르시니아, 에스케리키아, 살모넬라 및 슈도모나스 속으로 이루어지는 그룹으로부터, 가장 바람직하게는 예르시니아 및 살모넬라 속으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "예르시니아"란 용어는 예르시니아의 모든 종, 예를 들어 예르시니아 엔테로콜리티카, 예르시니아 슈도튜베르큘로시스 및 예르시니아 페스티스를 포함한다. 예르시니아 엔테로콜리티카가 바람직하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "살모넬라"란 용어는 살모넬라의 모든 종, 예를 들어 살모넬라 엔테리카 및 에스. 봉고리를 포함한다. 살모넬라 엔테리카가 바람직하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "프로모터"는 전사 단위의 발현을 조절하는 핵산 서열을 지칭한다. "프로모터 영역"은, 세포에서 RNA 폴리머라제와 결합할 수 있고 하류(3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시시킬 수 있는 조절 영역이다. 상기 프로모터 영역내에서 전사 개시 부위(편의상 뉴클레아제 S1에 의한 지도작성(mapping)에 의해 한정된다)뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합을 맡고 있는 단백질 결합 도메인(consensus sequence: 공통 서열), 예를 들어 추정적인-35 영역 및 프리브노 상자가 발견될 것이다. "작동적으로 연결된"이란 용어는 2개의 DNA 영역간의 관계를 기술하는 경우 단순히 이들 영역이 서로 기능적으로 관련되고 동일한 핵산 단편상에 위치함을 의미한다. 프로모터는 상기가 구조 유전자의 전사를 조절하고 상기 유전자와 동일한 핵산 단편상에 위치하는 경우 상기 유전자에 작동적으로 연결된다. 대개 상기 프로모터는 상기 그람-음성 세균 균주에서 기능적이다, 즉 상기 프로모터는 본 발명의 융합 단백질을 발현할 수 있다, 즉 상기 프로모터는 추가적인 유전 공학 또는 추가적인 단백질의 발현 없이 본 발명의 융합 단백질을 발현할 수 있다. 더욱 또한, 기능적 프로모터는 세균성 T3SS를 자연적으로 역-조절할 리가 없다.
본 명세서에 사용된 "전달"이란 용어는 재조합 그람-음성 세균 균주에서 이종 단백질을 발현시키고, 상기와 같은 그람-음성 세균 균주로부터 상기 발현된 단백질(들)을 분비시키고, 상기 분비된 단백질(들)을 상기와 같은 그람-음성 세균 균주에 의해 상기 진핵생물 세포의 시토솔내로 전좌시키는 단계를 포함하는, 단백질의 재조합 그람-음성 세균 균주로부터 진핵생물 세포로의 수송을 지칭한다. 상응하게, 본 명세서에서 호환가능하게 사용되는 "전달 시그널" 또는 "분비 신호"란 용어는 상기 그람-음성 세균 균주의 분비 및 전좌 시스템에 의해 인식될 수 있고 단백질의 상기 그람-음성 세균 균주로부터 진핵생물 세포로의 전달을 지시하는 폴리펩티드 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단백질의 "분비"는 단백질을 재조합 그람-음성 세균 균주의 세포막을 가로질러 밖으로 수송함을 지칭한다. 단백질의 "전좌"는 이종 단백질을 재조합 그람-음성 세균 균주로부터 진핵생물 세포의 원형질막을 가로질러 상기와 같은 진핵생물 세포의 시토솔내로 수송함을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "진핵생물 세포"란 용어는 예를 들어 하기의 진핵생물 세포를 포함한다: Hi-5, HeLa, Hek, HUVECs, 3T3, CHO, 주르캣(Jurkat), Sf-9, HepG2, 베로(Vero), MDCK, Mefs, THP-1, J774, RAW, Caco2, NCI60, DU145, Lncap, MCF-7, MDA-MB-438, PC3, T47D, A549, U87, SHSY5Y, Ea.Hy926, Saos-2, 4T1, D2A1, B16F10, 및 1차 인간 간세포. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "진핵생물 세포"는 또한 "표적 세포" 또는 "표적 진핵생물 세포"를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "T3SS 이펙터 단백질"이란 용어는 T3S 시스템에 의해 진핵생물 세포의 시토솔내로 천연으로 주입되는 단백질, 및 예를 들어 진핵생물 막내로의 전좌 기공을 형성할 수도 있는 T3S 시스템(기공-형성 수송체(예르시니아 YopB 및 YopD로서) 및 예르시니아 LcrV와 같은 팁-단백질 포함)에 의해 천연으로 분비되는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는 T3S 시스템에 의해 진핵생물 세포의 시토솔내로 천연으로 주입되는 단백질이 사용된다. 이들 독성 인자는 상기 진핵생물 세포를 무력화하거나 병원체에 이롭게 재프로그램화할 것이다. T3S 이펙터는 큰 생화학적 활성 레퍼토리를 나타내며 중요한 숙주 조절 분자의 기능을 조절하고[5,30], AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrD1, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpm1, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, 단백질과의 GALA, HopAB2, HopAO1, HopI1, HopM1, HopN1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopU1, HsvB, IcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgB1, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspC1, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXo1, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, SrfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SspH1, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopD YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA를 포함한다.
예르시니아의 T3SS 이펙터 유전자, YopE, YopH, YopM, YopO, YopP/YopJ, 및 YopT는 예를 들어 와이. 엔테로콜리티카로부터 클로닝되었다[31]. 각각의 이펙터 유전자를 시겔라 플렉스네리(예를 들어 OspF, IpgD, IpgB1), 살모넬라 엔테리카(예를 들어 SopE, SopB, SptP), 피. 아에루기노사(예를 들어 ExoS, ExoT, ExoU, ExoY) 또는 이. 콜라이(예를 들어 Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ)로부터 클로닝할 수 있다. 이들 유전자의 핵산 서열은 예를 들어 진뱅크 데이터베이스(Genebank Database)에서 당해 분야의 숙련가들에 의해 입수될 수 있다(yopH, yopO, yopE, yopP, yopM, yopT(NC_002120 GI:10955536로부터); 에스 플렉스네리 이펙터 단백질(AF386526.1 GI:18462515로부터); 에스. 엔테리카 이펙터(NC_016810.1 GI:378697983 또는 FQ312003.1 GI:301156631로부터); 피. 아에루기노사 이펙터(AE004091.2 GI:110227054 또는 CP000438.1 GI:115583796으로부터) 및 이. 콜라이 이펙터 단백질(NC_011601.1 GI:215485161로부터)).
본 발명의 목적을 위해서, 유전자를 소문자 및 이탤릭체로 나타내어 단백질과 구분시킨다. 상기 유전자(소문자 및 이탤릭체로 나타낸)가 세균 종의 명칭(이. 콜라이같은) 다음에 있는 경우, 상기는 상응하는 세균 종 중의 상응하는 유전자의 돌연변이를 지칭한다. 예를 들어 YopE는 yopE 유전자에 의해 암호화된 이펙터 단백질을 지칭한다. 와이. 엔테로콜리티카 yopE는 yopE 유전자에 돌연변이를 갖는 와이. 엔테로콜리티카를 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드", "펩티드", "단백질", "폴리펩티드성" 및 "펩티드성"이란 용어들은 인접한 잔기들의 알파-아미노 및 카복시기 사이에서 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 아미노산 잔기들을 나타내기 위해 호환가능하게 사용된다. 적어도 10 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 20 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이 바람직하다.
본 발명에 따라, "이종 단백질"은 천연 단백질 또는 그의 일부를 포함하며 인공적으로 조작된 단백질 또는 그의 일부를 또한 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이종 단백질"이란 용어는 융합될 수 있는 상기 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편 이외의 단백질 또는 그의 일부를 지칭한다. 특히 본 명세서에 사용되는 바와 같은 이종 단백질은 본 발명에 의해 제공되고 사용되는 특정한 재조합 그람-음성 세균 균주의 단백질체, 즉 전체 천연 단백질 보체에 속하지 않는, 예를 들어 예르시니아, 에스케리키아, 살모넬라 또는 슈도모나스 속의 특정한 세균 균주의 단백질체, 즉 전체 천연 단백질 보체에 속하지 않는 단백질 또는 그의 일부를 지칭한다. 대개 상기 이종 단백질은 인간 기원을 포함한 동물 기원을 갖는다. 바람직하게 상기 이종 단백질은 인간 단백질이다. 보다 바람직하게 상기 이종 단백질은 세포자멸 또는 세포자멸 조절에 관련된 단백질, 세포주기 조절자, 안키린 반복 단백질, 세포 신호전달 단백질, 리포터 단백질, 전사 인자, 프로테아제, 작은 GTPase, GPCR 관련된 단백질, 나노바디 융합 구조물 및 나노바디, 세균성 T3SS 이펙터, 세균성 T4SS 이펙터 및 바이러스성 단백질로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 특히 바람직하게 상기 이종 단백질은 세포자멸 또는 세포자멸 조절에 관련된 단백질, 세포주기 조절자, 안키린 반복 단백질, 리포터 단백질, 작은 GTPase, GPCR 관련된 단백질, 나노바디 융합 구조물, 세균성 T3SS 이펙터, 세균성 T4SS 이펙터 및 바이러스성 단백질로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 세포자멸 또는 세포자멸 조절에 관련된 단백질, 세포주기 조절자 및 안키린 반복 단백질로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 이종 단백질이 훨씬 더 바람직하다. 세포자멸 또는 세포자멸 조절에 관련된 동물, 바람직하게는 인간 이종 단백질과 같은, 세포자멸 또는 세포자멸 조절에 관련된 단백질이 가장 바람직하다.
일부 실시태양에서 본 발명의 그람-음성 세균 균주의 벡터는 제1 DNA 서열의 3' 단부에 인프레임으로 서로 독립적으로 융합된 동일하거나 또는 2개의 상이한 이종 단백질을 암호화하는 2개의 제2 DNA 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서 본 발명의 그람-음성 세균 균주의 벡터는 제1 DNA 서열의 3' 단부에 인프레임으로 서로 독립적으로 융합된 동일하거나 또는 3개의 상이한 이종 단백질을 암호화하는 3개의 제2 DNA 서열을 포함한다.
상기 재조합 그람-음성 세균 균주에 의해 발현된 이종 단백질은 대개 1 내지 150 kD, 바람직하게는 1 내지 120 kD, 보다 바람직하게는 1 내지 100 kDa, 가장 바람직하게는 15 내지 100 kDa의 분자량을 갖는다.
본 발명에 따라, "세포자멸 또는 세포자멸 조절에 관련된 단백질"은 비제한적으로 Bad, Bcl2, Bak, Bmt, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Apaf1, 카스파제 9, 카스파제 3, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 10, DFFA, DFFB, ROCK1, APP, CAD, ICAD, CAD, EndoG, AIF, HtrA2, Smac/디아블로(Diablo), Arts, ATM, ATR, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), IAP 과, LC8, PP2B, 14-3-3 proteins, PKA, PKC, PI3K, Erk1/2, p90RSK, TRAF2, TRADD, FADD, Daxx, 카스파제8, 카스파제2, RIP, RAIDD, MKK7, JNK, FLIPs, FKHR, GSK3, CDK 및 INK4-과와 같은 이들의 억제제(p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) 및 Cip1/Waf1/Kip1-2-과(p21(Cip1/Waf1), p27(Kip1), p57(Kip2)을 포함한다. 바람직하게는 Bad, Bmt, Bcl2, Bak, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, 카스파제9, 카스파제3, 카스파제6, 카스파제7, Smac/디아블로, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), LC8, PP2B, TRADD, Daxx, 카스파제8, 카스파제2, RIP, RAIDD, FKHR, CDK 및 INK4-과와 같은 이들의 억제제(p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)), 가장 바람직하게는 BIM, Bid, 절두된 Bid, FADD, 카스파제 3(및 이들의 서브유닛), Bax, Bad, Akt, CDK 및 INK4-과와 같은 이들의 억제제(p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d))가 사용된다[32-34]. 세포자멸 또는 세포자멸 조절에 관련된 추가적인 단백질은 DIVA, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bid 및 tBid, Egl-1, Bcl-Gs, 시토크롬 C, 베클린(Beclin), CED-13, BNIP1, BNIP3, Bcl-B, Bcl-W, Ced-9, A1, NR13, Bfl-1, 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 8을 포함한다.
세포자멸 또는 세포자멸 조절에 관련된 단백질은 프로-세포자멸 단백질, 세포자멸-억제 단백질, 세포자멸-방지 경로의 억제자 및 프로-생존 신호전달 또는 경로의 억제자로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 프로-세포자멸 단백질은 Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid 및 tBid, Bok, Apaf1, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 및 CED-13, 시토크롬 C, FADD, 카스파제 과, 및 CDK 및 INK4-과와 같은 이들의 억제자(p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d))로 이루어지는 그룹 중에서 선택되거나 또는 Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid 및 tBid, Bok, Egl-1, Apaf1, Smac/디아블로, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 및 CED-13, 시토크롬 C, FADD, 및 카스파제 과로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 단백질을 포함한다. Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid 및 tBid, Bok, Egl-1, Apaf1, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, 베클린 1, Egl-1 및 CED-13, Smac/디아블로, FADD, 카스파제 과, CDK 및 INK4-과와 같은 이들의 억제제(p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d))가 바람직하다. Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid 및 tBid, Bok, Apaf1, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, 베클린 1, Egl-1 및 CED-13, Smac/디아블로, FADD, 카스파제 과가 균등하게 바람직하다.
세포자멸 억제(anti-apoptosis) 단백질은 Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13, IAP과 및 Bfl-1로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 단백질을 포함한다. Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13 및 Bfl-1이 바람직하다.
세포자멸-방지 경로의 억제제는 Bad, Noxa 및 Cdc25A로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 단백질을 포함한다. Bad 및 Noxa가 바람직하다.
프로-생존 신호전달 또는 경로의 억제자는 PTEN, ROCK, PP2A, PHLPP, JNK, p38로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 단백질을 포함한다. PTEN, ROCK, PP2A 및 PHLPP가 바람직하다.
일부 실시태양에서 세포자멸 또는 세포자멸 조절에 관련된 이종 단백질은 BH3-단독 단백질, 카스파제 및 세포자멸의 사망 수용체 조절의 세포내 신호전달 단백질로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
BH3-단독 단백질은 Bad, BIM, Bid 및 tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, 베클린(Beclin) 1, Egl-1 및 CED-13으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 단백질을 포함한다.
카스파제는 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 단백질을 포함한다. 카스파제 3, 카스파제 8 및 카스파제9가 바람직하다.
세포자멸의 사망 수용체 조절의 세포내 신호전달 단백질은 FADD, TRADD, ASC, BAP31, GULP1/CED-6, CIDEA, MFG-E8, CIDEC, RIPK1/RIP1, CRADD, RIPK3/RIP3, Crk, SHB, CrkL, DAXX, 14-3-3 과, FLIP, DFF40 및 45, PEA-15, SODD로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 단백질을 포함한다. FADD 및 TRADD가 바람직하다.
일부 실시태양에서 세포자멸 또는 세포자멸 조절에 관련된 2개의 이종 단백질은 본 발명의 그람-음성 세균 균주의 벡터에 의해 포함되며, 여기에서 하나의 단백질은 프로-세포자멸 단백질이고 다른 단백질은 세포자멸-방지 경로의 억제자이거나 또는 하나의 단백질은 프로-세포자멸 단백질이고 다른 단백질은 프로=생존 신호전달 또는 경로의 억제자이다.
본 발명에 의해 포함되는 프로-세포자멸 단백질은 대개 알파 나선 구조, 바람직하게는 양친매성 나선에 의해 둘러싸인 소수성 나선을 가지며 대개는 BH1, HB2, BH3 또는 HB4 도메인 중 적어도 하나를 포함하고, 바람직하게는 적어도 하나의 BH3 도메인을 포함한다. 대개 본 발명에 의해 포함되는 프로-세포자멸 단백질은 효소 활성이 없다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "프로테아제 절단 부위"란 용어는 아미노산 서열내, 예를 들어 단백질 또는 융합 단백질의 아미노산 서열내의 특정한 아미노산 모티프를 지칭하며, 상기는 상기 아미노산 모티프를 인식하는 특정한 프로테아제에 의해 절단된다. 리뷰를 위해서 [35]를 참조하시오. 프로테아제 절단 부위의 예는 엔테로키나제(경쇄), 엔테로펩티다제, 프로-절단 프로테아제, 인간 리노바이러스 프로테아제(HRV 3C), TEV 프로테아제, TVMV 프로테아제, 인자Xa 프로테아제 및 트롬빈으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 프로테아제에 의해 절단되는 아미노산 모티프이다.
하기의 아미노산 모티프들은 각각의 프로테아제에 의해 인식된다:
- Asp-Asp-Asp-Asp-Lys: 엔테로키나제(경쇄)/엔테로펩티다제
- Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro: 프로-절단 프로테아제/인간 리노바이러스 프로테아제(HRV 3C)
- TEV 프로테아제(담배 에치(tobacco etch) 바이러스)에 의해 인식되는 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser 및 Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly/Ser을 기본으로 하는 변형 모티프(이때 X는 임의의 아미노산이다)
- Glu-Thr-Val-Arg-Phe-Gln-Ser: TVMV 프로테아제
- Ile-(Glu 또는 Asp)-Gly-Arg: 인자Xa 프로테아제
- Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser: 트롬빈.
유비퀴틴은 본 명세서에 사용되는 바와 같은 프로테아제 절단 부위에 의해 포함된다. 따라서 일부 바람직한 실시태양에서 유비퀴틴은 프로테아제 절단 부위로서 사용된다, 즉 상기 제3 DNA 서열은 N-말단 부위에서 특이적인 유비퀴틴 가공 프로테아제에 의해 절단될 수 있는, 예를 들어 융합 단백질이 전달된 세포에서 내부적으로 N-말단 부위에서 탈유비퀴틴화 효소라 칭하는 특이적인 유비퀴틴 가공 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위로서 유비퀴틴을 암호화한다. 유비퀴틴은 그의 C-말단에서 내인성 유비퀴틴-특이적인 C-말단 프로테아제(탈유비퀴틴화 효소, DUB)의 그룹에 의해 가공된다. DUB에 의한 유비퀴틴의 절단은 유비퀴틴의 바로 C-말단 (G76 이후)에서 발생하는 것으로 생각된다.
"개인", "피험자" 또는 "환자"는 척추동물이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 영장류(인간 및 비-인간 영장류 포함) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 포유동물은 인간이다.
"돌연변이"란 용어는 본 명세서에서 일반적인 용어로서 사용되며 단일 염기쌍 및 다수 염기쌍 모두의 변화를 포함한다. 상기와 같은 돌연변이는 치환, 프레임-이동 돌연변이, 결실, 삽입 및 절두를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "표지화 분자 또는 표지화 분자에 대한 어셉터(accepter) 부위"란 용어는 증대된 녹색 형광 단백질(EGFP)로서 형광 단백질 또는 FlAsH/ReAsH 염료(라이프 테크놀로지스(life technologies))에 사용되는, 특정한 아미노산 서열에 결합하여 결합된 화학적 화합물의 형광을 생성시키는 작은 화학적 화합물, 바람직하게는 쿠마린 리가제/쿠마린 어셉터 부위(및 그의 유도체), 레소루핀 리가제/레소루핀 어셉터 부위(및 그의 유도체) 및 테트라-시스테인 모티프(Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys 및 그의 유도체로서)를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "핵 국소화 신호"란 용어는 진핵생물 세포의 핵내로의 수입을 위해 단백질을 표시하고 바람직하게는 바이러스 핵 국소화 신호, 예를 들어 SV40 큰 T-항원 유래된 NLS(PPKKKRKV)를 포함하는 아미노산 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "다중 클로닝 부위"란 용어는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 위한 다수의 제한 부위들, 예를 들어 AclI, HindIII, SspI, MluCI, Tsp509I, PciI, AgeI, BspMI, BfuAI, SexAI, MluI, BceAI, HpyCH4IV, HpyCH4III, BaeI, BsaXI, AflIII, SpeI, BsrI, BmrI, BglII, AfeI, AluI, StuI, ScaI, ClaI, BspDI, PI-SceI, NsiI, AseI, SwaI, CspCI, MfeI, BssSI, BmgBI, PmlI, DraIII, AleI, EcoP15I, PvuII, AlwNI, BtsIMutI, TspRI, NdeI, NlaIII, CviAII, FatI, MslI, FspEI, XcmI, BstXI, PflMI, BccI, NcoI, BseYI, FauI, SmaI, XmaI, TspMI, Nt.CviPII, LpnPI, AciI, SacII, BsrBI, MspI, HpaII, ScrFI, BssKI, StyD4I, BsaJI, BslI, BtgI, NciI, AvrII, MnlI, BbvCI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, SbfI, Bpu10I, Bsu36I, EcoNI, HpyAV, BstNI, PspGI, StyI, BcgI, PvuI, BstUI, EagI, RsrII, BsiEI, BsiWI, BsmBI, Hpy99I, MspA1I, MspJI, SgrAI, BfaI, BspCNI, XhoI, EarI, AcuI, PstI, BpmI, DdeI, SfcI, AflII, BpuEI, SmlI, AvaI, BsoBI, MboII, BbsI, XmnI, BsmI, Nb.BsmI, EcoRI, HgaI, AatII, ZraI, Tth111I PflFI, PshAI, AhdI, DrdI, Eco53kI, SacI, BseRI, PleI, Nt.BstNBI, MlyI, HinfI, EcoRV, MboI, Sau3AI, DpnII BfuCI, DpnI, BsaBI, TfiI, BsrDI, Nb.BsrDI, BbvI, BtsI, Nb.BtsI, BstAPI, SfaNI, SphI, NmeAIII, NaeI, NgoMIV, BglI, AsiSI, BtgZI, HinP1I, HhaI, BssHII, NotI, Fnu4HI, Cac8I, MwoI, NheI, BmtI, SapI, BspQI, Nt.BspQI, BlpI, TseI, ApeKI, Bsp1286I, AlwI, Nt.AlwI, BamHI, FokI, BtsCI, HaeIII, PhoI, FseI, SfiI, NarI, KasI, SfoI, PluTI, AscI, EciI, BsmFI, ApaI, PspOMI, Sau96I, NlaIV, KpnI, Acc65I, BsaI, HphI, BstEII, AvaII, BanI, BaeGI, BsaHI, BanII, RsaI, CviQI, BstZ17I, BciVI, SalI, Nt.BsmAI, BsmAI, BcoDI, ApaLI, BsgI, AccI, Hpy166II, Tsp45I, HpaI, PmeI, HincII, BsiHKAI, ApoI, NspI, BsrFI, BstYI, HaeII, CviKI-1, EcoO109I, PpuMI, I-CeuI, SnaBI, I-SceI, BspHI, BspEI, MmeI, TaqαI, NruI, Hpy188I, Hpy188III, XbaI, BclI, HpyCH4V, FspI, PI-PspI, MscI, BsrGI, MseI, PacI, PsiI, BstBI, DraI, PspXI, BsaWI, BsaAI, EaeI, 바람직하게는 XhoI, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, SacI, SalI, BstBI를 함유하는 짧은 DNA 서열을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "다중 클로닝 부위"란 용어는 예를 들어 통로(Gateway) 클로닝 전략에서와 같은 재조합 이벤트들 또는 깁슨(Gibbson) 조립 또는 토포 클로닝과 같은 방법에 사용되는 짧은 DNA 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "예르시니아 야생형 균주"란 용어는 천연 변이체(와이. 엔테로콜리티카 E40으로서) 또는 벡터의 사용을 허용하는 유전자 변형, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제에서의 결실 돌연변이 또는 항생제 내성 유전자를 함유하는 천연 변이체(와이. 엔테로콜리티카 MRS40, 와이. 엔테로콜리티카 E40의 암피실린 민감성 유도체로서)를 지칭한다. 이들 균주는 염색체 DNA뿐만 아니라 변형되지 않은 독성 플라스미드(pYV라 칭함)를 함유한다.
"포함하다"란 용어는 일반적으로 포함하다의 의미로, 즉 하나 이상의 특징 또는 성분의 존재를 허용하다의 의미로 사용된다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 재조합 그람-음성 세균 균주를 제공하며, 여기에서 상기 그람-음성 세균 균주는 예르시니아, 에스케리키아, 살모넬라 및 슈도모나스 속으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서 본 발명은 재조합 그람-음성 세균 균주를 제공하며, 여기에서 상기 그람-음성 세균 균주는 예르시니아 및 살모넬라 속으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 바람직하게 상기 그람-음성 세균 균주는 예르시니아 균주, 보다 바람직하게는 예르시니아 엔테로콜리티카 균주이다. 예르시니아 엔테로콜리티카 E40[13] 또는 [36]에 기재된 바와 같은 와이. 엔테로콜리티카 MRS40으로서 그의 암피실린 민감성 유도체가 가장 바람직하다. 또한 바람직하게 상기 그람-음성 세균 균주는 살모넬라 균주, 보다 바람직하게는 살모넬라 엔테리카 균주이다. 영국 공중 보건 배양 콜렉션(NCTC 13347)에 의해 기재된 바와 같은 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 SL1344가 가장 바람직하다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널은 세균성 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편을 포함하며, 여기에서 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편은 샤프론 결합 부위를 포함할 수 있다. 샤프론 결합 부위를 포함하는 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편이 본 발명에서 전달 시그널로서 특히 유용하다. 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편은 SopE, SopE2, SptP, YopE, ExoS, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgB1, IpgD, SipC, SifA, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, SspH1,VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, XopD, AvrRpt2, HopAO1, HopPtoD2, HopU1, 단백질의 GALA 과, AvrBs2, AvrD1, AvrBS3, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspC1, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpm1, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD, 및 AvrXv3으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 보다 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편은 SopE, SptP, YopE, ExoS, SopB, IpgB1, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT로 이루어지는 그룹 중에서 선택되며, 이 중에서 가장 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편은 IpgB1, SopE, SopB, SptP, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, 특히 YopE 또는 그의 N-말단 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
균등하게 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편은 SopE, SopE2, SptP, SteA, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgB1, IpgD, SipC, SifA, SifB, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, AvrRpt2, HopAO1, HopU1, 단백질의 GALA 과, AvrBs2, AvrD1, YopO, YopP, YopE, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspC1, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpm1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD, 및 AvrXv3으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 균등하게 더 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편은 SopE, SptP, SteA, SifB, SopB, IpgB1, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopT로 이루어지는 그룹 중에서 선택되며, 이 중에서 균등하게 가장 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편은 IpgB1, SopE, SopB, SptP, SteA, SifB, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE, 및 YopT, 특히 SopE, SteA, 또는 YopE 또는 그의 N-말단 단편, 보다 특히 SteA 또는 YopE 또는 그의 N-말단 단편, 가장 특히 YopE 또는 그의 N-말단 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 실시태양에서 제1 DNA 서열에 의해 암호화되는 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널은 세균성 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편을 포함하고, 여기에서 그의 N-말단 단편은 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질의 적어도 처음 10, 바람직하게는 적어도 처음 20, 보다 바람직하게는 적어도 처음 100개 아미노산을 포함한다.
일부 실시태양에서 상기 제1 DNA 서열에 의해 암호화되는 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널은 세균성 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편을 포함하고, 여기에서 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편은 샤프론 결합 부위를 포함한다.
샤프론 결합 부위를 포함하는 바람직한 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편은 하기의 샤프론 결합 부위 및 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편의 조합을 포함한다: SycE-YopE, InvB-SopE, SicP-SptP, SycT-YopT, SycO-YopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF, SycD-YopB, SycD-YopD. 보다 바람직하게는 SycE-YopE, InvB-SopE, SycT-YopT, SycO-YopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF이다. 본 명세서에서 YopE1-138로서 표시되고 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 YopE 이펙터 단백질의 N-말단 138개 아미노산을 함유하는 YopE 이펙터 단백질의 N-말단 단편과 같은 SycE 샤프론 결합 부위를 포함하는 YopE 또는 그의 N-말단 단편, 또는 본 명세서에서 각각 SopE1-81 또는 SopE1-105로서 표시되고 서열번호 142 또는 143으로서 나타내는 SopE 이펙터 단백질의 N-말단 81개 또는 105개 아미노산을 함유하는 SopE 이펙터 단백질의 N-말단 단편과 같은 InvB 샤프론 결합 부위를 포함하는 SopE 또는 그의 N-말단 단편이 가장 바람직하다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 상기 재조합 그람-음성 세균 균주는 예르시니아 균주이고 상기 제1 DNA 서열에 의해 암호화되는 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널은 YopE 이펙터 단백질 또는 N-말단 부분, 바람직하게는 와이. 엔테로콜리티카 YopE 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 부분을 포함한다. 바람직하게 상기 SycE 결합 부위는 상기 YopE 이펙터 단백질의 N-말단 부분내에 포함된다. 이와 관련하여 YopE 이펙터 단백질의 N-말단 단편은 N-말단 12, 16, 18, 52, 53, 80 또는 138개 아미노산을 포함할 수 있다[10,37,38]. 본 명세서에서 YopE1-138로서 표시되고 서열번호 2에 나타낸 바와 같은, 예를 들어 문헌[Forsberg and Wolf-Watz][39]에 기재된 바와 같은 YopE 이펙터 단백질의 N-말단 138개 아미노산을 함유하는 YopE 이펙터 단백질의 N-말단 단편이 가장 바람직하다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 상기 재조합 그람-음성 세균 균주는 살모넬라 균주이고 상기 제1 DNA 서열에 의해 암호화되는 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널은 SopE 또는 SteA 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 부분, 바람직하게는 살모넬라 엔테리카 SopE 또는 SteA 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 부분을 포함한다. 바람직하게 상기 샤프론 결합 부위는 상기 SopE 이펙터 단백질의 N-말단 부분내에 포함된다. 이와 관련하여 SopE 이펙터 단백질의 N-말단 단편은 N-말단 81 또또는 105 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어 서열번호 142 또는 143에 기재된 바와 같은, 상기 이펙터 단백질의 N-말단 105 아미노산을 함유하는 SopE 이펙터 단백질의 N-말단 단편 및 전장 SteA가 가장 바람직하다.
당해 분야의 숙련가는 단백질을 전달할 수 있는 이펙터 단백질의 폴리펩티드 서열을 확인하는 방법과 친숙하다. 예를 들어, 하나의 상기와 같은 방법은 소리(Sory) 등에 의해 기재된다[13]. 간단히, 예를 들어 Yop 단백질의 다양한 부분으로부터의 폴리펩티드 서열을 리포터 효소, 예를 들어 보르데텔라 페르투시스 사이클로리신의 칼모듈린-활성화된 아데닐레이트 사이클라제 도메인(또는 Cya)에 인-프레임 융합시킬 수 있다. Yop-Cya 하이브리드 단백질의 진핵생물 세포의 시토솔내로의 전달은 감염된 진핵생물 세포에서의, cAMP의 축적을 유도하는 사이클라제 활성의 출현에 의해 암시된다. 상기와 같은 접근법을 사용함으로써, 당해 분야의 숙련가는, 경우에 따라, 최소 서열 요건, 즉 단백질을 전달할 수 있는 가장 짧은 길이의 연속적인 아미노산 서열을 결정할 수 있다, 예를 들어 [13]을 참조하시오. 상응하게, 본 발명의 바람직한 전달 시그널은 적어도, 단백질을 전달할 수 있는 T3SS 이펙터 단백질의 아미노산의 최소 서열로 이루어진다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 돌연변이 재조합 그람-음성 세균 균주, 특히 적어도 하나의 T3SS 기능성 이펙터 단백질을 생성시키는데 결함이 있는 재조합 그람-음성 세균 균주를 제공한다.
본 발명에 따라, 상기와 같은 돌연변이 그람-음성 세균 균주, 예를 들어 상기와 같은 예르시니아 균주는 적어도 하나의 돌연변이를 적어도 하나의 이펙터-암호화 유전자내에 도입시킴으로써 생성시킬 수 있다. 바람직하게, 상기와 같은 이펙터-암호화 유전자는 예르시니아 균주에 관한 한 YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopP/YopJ 및 YopT를 포함한다. 바람직하게, 상기와 같은 이펙터-암호화 유전자는 살모넬라 균주에 관한 한 AvrA, CigR, GogB, GtgA, GtgE, PipB, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopB/SigD, SopA, SpiC/SsaB, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SopD, SopE, SopE2, SspH1, SspH2, PipB2, SifA, SopD2, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SteC, SteA, SteB, SteD, SteE, SpvB, SpvC, SpvD, SrfJ, SptP를 포함한다. 가장 바람직하게, 모든 이펙터-암호화 유전자가 결실된다. 숙련가는 이들 T3SS 이펙터 유전자에 돌연변이를 생성시키기 위해서 임의의 수의 표준 기법을 사용할 수 있다. 샘브룩(Sambrook) 등이 일반적으로 상기와 같은 기법을 기재한다. 샘브룩 등[40]을 참조하시오.
본 발명에 따라, 상기 돌연변이를 상기와 같은 이펙터 유전자의 발현이 없어지도록 이펙터-암호화 유전자의 프로모터 영역에 생성시킬 수 있다.
상기 돌연변이를 또한 암호화된 이펙터 단백질의 촉매 활성이 없어지도록 이펙터-암호화 유전자의 암호화 영역에 생성시킬 수 있다. 이펙터 단백질의 "촉매 활성"은 통상적으로 이펙터 단백질의 항-표적 세포 기능, 즉 독성을 지칭한다. 상기와 같은 활성은 이펙터 단백질의 촉매 도메인 중의 촉매 모티프에 의해 지배된다. 이펙터 단백질의 촉매 도메인 및/또는 촉매 모티프를 확인하기 위한 접근법은 당해 분야의 숙련가들에게 주지되어 있다. 예를 들어 [41,42]를 참조하시오.
상응하게, 본 발명의 하나의 바람직한 돌연변이는 전체 촉매 도메인의 결실이다. 또 다른 바람직한 돌연변이는 상기 촉매 도메인이 상기와 같은 "프레임이동된" 유전자로부터 발현된 단백질 생성물 중에 존재하지 않도록 하는 이펙터-암호화 유전자 중의 프레임이동 돌연변이이다. 가장 바람직한 돌연변이는 상기 이펙터 단백질의 전체 암호화 영역이 결실된 돌연변이이다. 다른 돌연변이들, 예를 들어 작은 결실 또는 염기쌍 치환(이는 이펙터 단백질의 촉매 모티프 중에 생성되어 주어진 이펙터 단백질의 촉매 활성의 파괴를 유도한다)이 또한 본 발명에 의해 고려된다.
상기 T3SS 기능성 이펙터 단백질의 유전자 중에 생성되는 돌연변이를 다수의 방법들에 의해 특정 균주내에 도입시킬 수 있다. 하나의 상기와 같은 방법은 돌연변이된 서열을 대립유전자 교환을 통해 상기 균주내에 도입시킬 수 있는 돌연변이된 유전자의 "자살(suicide)" 벡터내로의 클로닝을 수반한다. 상기와 같은 "자살" 벡터의 일례는 [43]에 기재되어 있다.
이와 같은 방식으로, 다수의 유전자 중에 생성된 돌연변이들을 연속적으로 그람-음성 세균 균주에 도입시켜 다중돌연변이체, 예를 들어 6중 돌연변이 재조합 균주를 생성시킬 수 있다. 이들 돌연변이된 서열을 도입시키는 순서는 중요하지 않다. 일부 상황하에서, 상기 이펙터 유전자의 전체가 아니라 단지 일부만을 돌연변이시키는 것이 요구될 수도 있다. 상응하게, 본 발명은 6중-돌연변이 예르시니아 이외의 다중돌연변이 예르시니아, 예를 들어 2중-돌연변이, 3중-돌연변이, 4중-돌연변이 및 5중-돌연변이 균주를 추가로 고려한다. 단백질을 전달하기 위해서, 본 돌연변이 균주의 분비 및 전좌 시스템은 완전할 필요가 있다.
본 발명의 바람직한 재조합 그람-음성 세균 균주는 모든 이펙터-암호화 유전자가, 상기 생성되는 예르시니아가 더 이상 어떠한 기능성 이펙터 단백질도 생성하지 않도록 돌연변이된 6중-돌연변이 예르시니아 균주이다. 상기와 같은 6중-돌연변이 예르시니아 균주를 와이. 엔테로콜리티카의 경우 ΔyopH,O,P,E,M,T로서 표시한다. 일례로서 상기와 같은 6중-돌연변이체를 와이. 엔테로콜리티카 MRS40 균주로부터 생성시켜 와이. 엔테로콜리티카 MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T(바람직하다)를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 태양은 목적하는 단백질을 진핵생물 세포에 전달하기 위해 상기 재조합 그람-음성 세균 균주와 함께 사용하기 위한 벡터에 관한 것이며, 여기에서 상기 벡터는 5'에서 3' 방향으로:
프로모터;
상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널을 암호화하는 제1 DNA 서열;
상기 제1 DNA 서열의 3' 단부에 인프레임 융합된 이종 단백질을 암호화하는 제2 DNA 서열; 및 선택적으로
프로테아제 절단 부위를 암호화하는 제3 DNA 서열(여기에서 상기 제3 DNA 서열은 상기 제1 DNA 서열의 3' 단부와 상기 제2 DNA 서열의 5' 단부 사이에 위치한다)
을 포함한다.
상기에 기재된 바와 같은 프로모터, 이종 단백질 및 프로테아제 절단 부위를 상기 그람-음성 세균 균주의 벡터에 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 벡터는 숙련가에게 공지된 바와 같이 사용되는 그람-음성 세균 균주에 따라 변한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 벡터는 발현 벡터, 염색체 또는 독성 플라스미드 삽입을 위한 벡터, 및 염색체 또는 독성 플라스미드 삽입을 위한 DNA 단편을 포함한다. 예를 들어 예르시니아, 에스케리키아, 살모넬라 또는 슈도모나스 균주에 유용한 발현 벡터는 예를 들어 pUC, pBad, pACYC, pUCP20 및 pET 플라스미드이다. 예를 들어 예르시니아, 에스케리키아, 살모넬라 또는 슈도모나스 균주에 유용한 염색체 또는 독성 플라스미드 삽입을 위한 벡터는 예를 들어 pKNG101이다. 염색체 또는 독성 플라스미드 삽입을 위한 DNA 단편은 예를 들어 람다-레드 유전 공학으로서 예를 들어 예르시니아, 에스케리키아, 살모넬라 또는 슈도모나스 균주에 사용되는 방법들을 지칭한다. 염색체 또는 독성 플라스미드 삽입을 위한 벡터 또는 염색체 또는 독성 플라스미드 삽입을 위한 DNA 단편은 본 발명의 제1, 제2 및/또는 제3 DNA 서열이 상기 재조합 그람-음성 세균 균주의 내인성 프로모터에 작동적으로 연결되도록 상기 제1, 제2 및/또는 제3 DNA 서열을 삽입시킬 수 있다. 따라서 염색체 또는 독성 플라스미드 삽입을 위한 벡터 또는 염색체 또는 독성 플라스미드 삽입을 위한 DNA 단편이 사용되는 경우에, 내인성 프로모터는 상기 내인성 세균 DNA(염색체 또는 플라스미드 DNA)상에 암호화될 수 있으며 단지 제1 및 제2 DNA 서열만이 상기 염색체 또는 독성 플라스미드 삽입을 위한 조작된 벡터 또는 염색체 또는 독성 플라스미드 삽입을 위한 DNA 단편에 의해 제공될 것이다. 따라서 프로모터를 상기 재조합 그람-음성 세균 균주의 형질전환에 사용되는 벡터에 의해 반드시 포함시킬 필요는 없다, 즉 본 발명의 재조합 그람-음성 세균 균주를 프로모터를 포함하지 않는 벡터로 형질전환시킬 수도 있다. 바람직하게 발현 벡터가 사용된다. 본 발명의 벡터는 시험관내 및 생체내에서 진핵생물 세포내로의 상기 세균성 T3SS에 의한 이종 단백질의 전달에 통상적으로 사용된다.
예르시니아에 바람직한 발현 벡터는 pBad_Si_1 및 pBad_Si_2로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. pBad_Si2는 정제된 pYV40으로부터의 YopE 및 SycE에 대한 내인성 프로모터를 함유하는 SycE-YopE1-138 단편의 pBad-MycHisA(인비트로젠)의 KpnI/HindIII 부위내로의 클로닝에 의해 제작되었다. 추가적인 변형은 절단, 클레나우 단편 처리 및 다시이어맞추기에 의한 pBad-MycHisA의 NcoI/BglII 단편의 제거를 포함한다. 추가로 YopE1-138의 3' 단부에 하기의 절단 부위들을 가하였다: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII). pBad_Si1은 pBad_Si2와 동일하지만 아라비노스 유도성 프로모터하에서 NcoI/BglII 부위 중의 pEGFP-C1(클론테크)로부터 증폭된 EGFP를 암호화한다.
살모넬라에 바람직한 발현 벡터는 pSi_266, pSi_267, pSi_268 및 pSi_269로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 상응하는 내인성 프로모터 및 SteA1-20 단편(pSi_266), 전장 SteA 서열(pSi_267), SopE1-81 단편(pSi_268) 또는 SopE1-105 단편(pSi_269)을 함유하는 플라스미드 pSi_266, pSi_267, pSi_268 및 pSi_269를 에스. 엔테리카 SL1344 게놈 DNA로부터 증폭시키고 pBad-MycHisA(인비트로젠)의 NcoI/KpnI 부위내에 클로닝하였다.
본 발명의 벡터는 다른 서열 요소들, 예를 들어 3' 종결 서열(정지 코돈 및 폴리A 서열 포함), 또는 본 벡터를 수용하는 형질전환체의 선택을 허용하는 약물 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 다수의 공지된 방법에 의해 재조합 그람-음성 세균 균주내로 형질전환될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 벡터를 도입시키기 위한 형질전환 방법은 비제한적으로 일렉트로포레이션, 칼슘 포스페이트 매개된 형질전환, 접합, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 벡터를 표준 일렉트로포레이션 과정에 의해 제1 세균 균주내로 형질전환시킬 수 있다. 연속해서, 상기와 같은 벡터를 상기 제1 세균 균주로부터 접합(소위 "동원"이라 칭한다)에 의해 목적하는 균주내로 이동시킬 수 있다. 형질전환체(즉 상기 벡터를 흡수한 그람-음성 세균 균주)를 예를 들어 항생제에 의해 선택할 수 있다. 이들 기법은 당해 분야에 주지되어 있다. 예를 들어 [13]을 참조하시오.
본 발명에 따라, 본 발명의 재조합 그람-음성 세균 균주의 발현 벡터의 프로모터는 각 균주 또는 적합한 세균 균주의 T3SS 이펙터 단백질의 고유 프로모터 또는 예를 들어 예르시니아, 에스케리키아, 살모넬라 또는 슈도모나스 균주에 유용한 발현 벡터, 예를 들어 pUC 및 pBad에 사용되는 프로모터일 수 있다. 상기와 같은 프로모터는 T7 프로모터, Plac 프로모터 또는 Ara-bad 프로모터이다.
상기 재조합 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 균주인 경우 상기 프로모터는 예르시니아 비룰론(virulon) 유전자로부터의 것일 수 있다. "예르시니아 비룰론 유전자"는 예르시니아 pYV 플라스미드상의 유전자를 지칭하며, 그의 발현은 온도 및 표적 세포와의 접촉 모두에 의해 조절된다. 상기와 같은 유전자는 분비기구의 요소를 암호화하는 유전자(Ysc 유전자), 수송체를 암호화하는 유전자(YopB, YopD 및 LcrV), 조절 요소를 암호화하는 유전자(YopN, TyeA 및 LcrG), T3SS 이펙터 샤프론을 암호화하는 유전자(SycD, SycE, SycH, SycN, SycO 및 SycT), 및 이펙터를 암호화하는 유전자(YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopT 및 YopP/YopJ)뿐만 아니라 VirF 및 YadA로서 다른 pYV 암호화된 단백질을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 프로모터는 T3SS 기능성 이펙터 암호화 유전자의 고유 프로모터이다. 상기 재조합 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 균주인 경우, 상기 프로모터는 YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM 및 YopP/YopJ 중 어느 하나로부터 선택된다. 보다 바람직하게 상기 프로모터는 YopE 또는 SycE이다.
상기 재조합 그람-음성 세균 균주가 살모넬라 균주인 경우, 상기 프로모터는 SpiI 또는 SpiII 병원성 섬 또는 그 밖에 다른 곳에서 암호화된 이펙터 단백질로부터의 것일 수 있다. 상기와 같은 유전자는 분비기구의 요소를 암호화하는 유전자, 수송체를 암호화하는 유전자, 조절 요소를 암호화하는 유전자, T3SS 이펙터 샤프론을 암호화하는 유전자, 및 SPI-1 또는 SPI-2에 의해 암호화된 다른 단백질을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 프로모터는 T3SS 기능성 이펙터 암호화 유전자의 고유 프로모터이다. 상기 재조합 그람-음성 세균 균주가 살모넬라 균주인 경우 상기 프로모터는 상기 이펙터 단백질들 중 어느 하나로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 상기 프로모터는 SopE, InvB 또는 SteA로부터의 것이다.
바람직한 실시태양에서 상기 발현 벡터는 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 기능성 및 일반적으로 적용 가능한 절단 부위의 생성은 전좌 후 전달 시그널의 절단을 허용한다. 상기 전달 시그널이 표적 세포내의 전좌된 단백질의 정확한 국소화 및/또는 기능을 방해할 수 있기 때문에, 상기 전달 시그널과 관심 단백질 사이의 프로테아제 절단 부위의 도입은 거의 고유의 단백질의 진핵생물 세포내로의 최초의 전달을 제공한다. 바람직하게 상기 프로테아제 절단 부위는 엔테로키나제(경쇄), 엔테로펩티다제, 프로-절단 프로테아제, 인간 리노바이러스 프로테아제 3C, TEV 프로테아제, TVMV 프로테아제, 인자Xa 프로테아제 및 트롬빈으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 프로테아제 또는 그의 촉매 도메인에 의해 절단되는 아미노산 모티프, 보다 바람직하게 TEV 프로테아제에 의해 절단되는 아미노산 모티프이다. 균등하게 바람직한 프로테아제 절단 부위는 엔테로키나제(경쇄), 엔테로펩티다제, 프로-절단 프로테아제, 인간 리노바이러스 프로테아제 3C, TEV 프로테아제, TVMV 프로테아제, 인자Xa 프로테아제, 유비퀴틴 가공 프로테아제(탈유비퀴틴화 효소라 칭한다) 및 트롬빈으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 프로테아제 또는 그의 촉매 도메인에 의해 절단되는 아미노산 모티프이다. TEV 프로테아제 또는 유비퀴틴 가공 프로테아제에 의해 절단되는 아미노산 모티프가 가장 바람직하다. 따라서 본 발명의 추가의 실시태양에서, 상기 이종 단백질은 프로테아제에 의해 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널로부터 절단된다. 바람직한 절단 방법은
a) 상기 프로테아제를, 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널 및 이종 단백질로서 프로테아제를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 그람-음성 세균 균주에 의해 상기 진핵생물 세포내로 전좌시키거나; 또는
b) 상기 프로테아제를 상기 진핵생물 세포에서 구성적으로 또는 일시적으로 발현시키는
방법이다.
대개 목적하는 단백질을 진핵생물 세포로 전달하는데 사용되는 재조합 그람-음성 세균 균주와, 상기 프로테아제를 상기 진핵생물 세포내로 전좌시키는 재조합 그람-음성 세균 균주는 상이하다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 상기 벡터는 표지화 분자 또는 표지화 분자에 대한 어셉터 부위를 암호화하는 추가의 DNA 서열을 포함한다. 표지화 분자 또는 표지화 분자에 대한 어셉터 부위를 암호화하는 추가의 DNA 서열을 대개는 제2 DNA 서열의 5' 단부 또는 3' 단부에 융합시킨다. 바람직한 표지화 분자 또는 표지화 분자에 대한 어셉터 부위는 증대된 녹색 형광 단백질(EGFP), 쿠마린, 쿠마린 리가제 어셉터 부위, 레소루핀, 레슈로핀 리가제 어셉터 부위, FlAsH/ReAsH 염료(라이프 테크놀로지스)에 사용되는 테트라-시스테인 모티프로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 레소루핀 및 레슈로핀 리가제 어셉터 부위 또는 EGFP가 가장 바람직하다. 표지화 분자 또는 표지화 분자에 대한 어셉터 부위의 사용은 표지화 분자의 상기 관심 이종 단백질에의 부착을 유도할 것이며, 이는 이어서 그 자체로서 상기 진핵생물 세포내로 전달되고 예를 들어 생세포 현미경검사에 의해 상기 단백질의 추적을 가능하게 할 것이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 상기 벡터는 펩티드 태그를 암호화하는 추가의 DNA 서열을 포함한다. 펩티드 태그를 암호화하는 추가의 DNA 서열은 대개 제2 DNA 서열의 5' 단부 또는 3' 단부에 융합된다. 바람직한 펩티드 태그는 Myc-태그, His-태그, Flag-태그, HA 태그, 스트렙 태그 또는 V5 태그 또는 이들 그룹 중 2개 이상의 태그의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. Myc-태그, Flag-태그, His-태그 및 조합된 Myc- 및 His-태그가 가장 바람직하다. 펩티드 태그의 사용은 예를 들어 면역형광 또는 항-표지 항체를 사용하는 웨스턴 블럿팅에 의해 상기 태그된 단백질의 추적성을 유도할 것이다. 더욱이, 펩티드 태그의 사용은 상응하는 태그를 적합화시키는 정제 방법(예를 들어 His-태그와 함께 사용되는 금속-킬레이트 친화성 정제 또는 Flag-태그와 함께 사용되는 항-Flag 항체 기반 정제)을 사용하는 2개의 경우 모두에서, 배양 상등액내로의 분비 또는 진핵생물 세포내로의 전좌 후에 목적하는 단백질의 친화성 정제를 허용한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 상기 벡터는 핵 국소화 신호(NLS)를 암호화하는 추가의 DNA 서열을 포함한다. 핵 국소화 신호(NLS)를 암호화하는 추가의 DNA 서열을 대개는 제2 DNA 서열의 5' 단부 또는 3' 단부에 융합시키며, 여기에서 상기 추가의 DNA 서열은 핵 국소화 신호(NLS)를 암호화한다. 바람직한 NLS는 SV40 큰 T-항원 NLS 및 그의 유도체[44]뿐만 아니라 다른 바이러스 NLS로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. SV40 큰 T-항원 NLS 및 그의 유도체가 가장 바람직하다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 상기 벡터는 다중 클로닝 부위를 포함한다. 상기 다중 클로닝 부위는 대개 제1 DNA 서열의 3' 단부 및/또는 제2 DNA 서열의 5' 단부 또는 3' 단부에 위치한다. 하나 또는 하나 초과의 다중 클로닝 부위가 상기 벡터에 의해 포함될 수 있다. 바람직한 다중 클로닝 부위는 XhoI, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, SacI, SalI, BstBI로 이루어지는 제한 효소의 그룹 중에서 선택된다. XbaI, XhoI, BstBI 및 HindIII가 가장 바람직하다.
상기 벡터의 융합된 제1 및 제2 및 임의의 제3 DNA 서열로부터 발현된 단백질을 또한 "융합 단백질" 또는 "하이브리드 단백질", 즉 전달 시그널 및 이종 단백질의 융합된 단백질 또는 하이브리드로서 칭한다. 상기 융합 단백질은 또한 예를 들어 전달 시그널 및 2개 이상의 상이한 이종 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 명세서에서 상기에 기재한 바와 같은 이종 단백질을 세포 배양물 중에서뿐만 아니라 생체내에서 진핵생물 세포내로 전달하는 방법을 고려한다.
따라서 하나의 실시태양에서 이종 단백질의 전달 방법은
i) 본 명세서에 기재된 바와 같은 그람-음성 세균 균주를 배양하는 단계; 및
ii) 진핵생물 세포를 i)의 그람-음성 세균 균주와 접촉시키는 단계로서, 여기에서 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널 및 상기 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질이 상기 그람-음성 세균 균주에 의해 발현되고 상기 진핵생물 세포내로 전좌되는 단계; 임의로
iii) 상기 융합 단백질을 상기 이종 단백질이 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널로부터 절단되도록 절단시키는 단계
를 포함한다.
일부 실시태양에서 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널 및 이종 단백질 각각을 포함하는 적어도 2개의 융합 단백질을 본 발명의 방법에 의해 상기 그람-음성 세균 균주에 의해 발현시키고 상기 진핵생물 세포내로 전좌시킨다.
상기 재조합 그람-음성 세균 균주를 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널 및 상기 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질이 당해 분야에 공지된 방법(예를 들어 FDA, 세균학적 분석 매뉴얼(BAM), 8장: 예르시니아 엔테로콜리티카)에 따라 발현되도록 배양시킬 수 있다. 바람직하게 상기 재조합 그람-음성 세균 균주를 예를 들어 28 ℃에서 뇌 심장 주입 브로쓰에서 배양시킬 수 있다. T3SS 및 예를 들어 YopE/SycE 프로모터 의존적인 유전자의 발현의 유도를 위해서, 세균을 37 ℃에서 생육시킬 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 상기 진핵생물 세포를 i)의 2개의 그람-음성 세균 균주와 접촉시키며, 여기에서 제1 그람-음성 세균 균주는 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널 및 제1 이종 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질을 발현하고, 제2 그람-음성 세균 균주는 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널 및 제2 이종 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 발현하며, 따라서 상기 제1 및 제2 융합 단백질이 진핵생물 세포내로 전좌된다. 본 실시태양은 예를 들어 2개의 상이한 하이브리드 단백질을 단일 세포내에 전달하여 그들의 기능적 상호작용을 다루는 합당한 방법으로서 2개의 세균 균주로, 예를 들어 진핵생물 세포를 동시-감염시킴을 제공한다.
본 발명은 본 재조합 그람-음성 세균 균주에 의해 표적화할 수 있는 광범위한 진핵생물 세포, 예를 들어 Hi-5(BTI-TN-5B1-4; 라이프 테크놀로지스 B855-02), HeLa 세포, 예를 들어 HeLa Ccl2(ATCC No. CCL-2로서), 섬유아세포, 예를 들어 3T3 섬유아세포(ATCC No. CCL-92로서) 또는 Mef(ATCC No. SCRC-1040으로서), Hek(ATCC No. CRL-1573으로서), HUVEC(ATCC No. PCS-100-013으로서), CHO(ATCC No. CCL-61으로서), 주르캣(ATCC No. TIB-152로서), Sf-9(ATCC No. CRL-1711로서), HepG2(ATCC No. HB-8065로서), 베로(ATCC No. CCL-81로서), MDCK(ATCC No. CCL-34로서), THP-1(ATCC No. TIB-202로서), J774(ATCC No. TIB-67로서), RAW(ATCC No. TIB-71로서), Caco2(ATCC No. HTB-37로서), NCI 세포주(ATCC No. HTB-182로서), DU145(ATCC No. HTB-81로서), Lncap(ATCC No. CRL-1740으로서), MCF-7(ATCC No. HTB-22로서), MDA-MB 세포주(ATCC No. HTB-128로서), PC3(ATCC No. CRL-1435로서), T47D(ATCC No. CRL-2865로서), A549(ATCC No. CCL-185로서), U87(ATCC No. HTB-14로서), SHSY5Y(ATCC No. CRL-2266으로서), Ea.Hy926(ATCC No. CRL-2922로서), Saos-2(ATCC No. HTBH-85로서), 4T1(ATCC No. CRL-2539로서), B16F10(ATCC No. CRL-6475로서), 또는 1차 인간 간세포(라이프 테크놀로지스 HMCPIS), 바람직하게 HeLa, Hek, HUVECs, 3T3, CHO, 주르캣, Sf-9, HepG2 베로, THP-1, Caco2, Mef, A549, 4T1, B16F10 및 1차 인간 간세포 및 가장 바람직하게는 HeLa, Hek, HUVECs, 3T3, CHO, 주르캣, THP-1, A549 및 Mef를 고려한다. "표적"은 진핵생물 세포에의 상기 재조합 그람-음성 세균 균주의 세포외 부착을 의미한다.
본 발명에 따라, 단백질의 전달을, 진핵생물 세포를 적합한 조건하에서 재조합 그람-음성 세균 균주와 접촉시킴으로써 성취할 수 있다. 비룰론 유전자의 발현 및 전좌를 유도하기 위한 조건, 예를 들어 목적하는 온도, Ca++ 농도, 콩고 레드로서 유도인자의 첨가, 상기 재조합 그람-음성 세균 균주 및 표적 세포를 혼합하는 방식 등에 관한 다양한 참고문헌 및 기법들을 당해 분야의 숙련가들은 통상적으로 입수할 수 있다. 예를 들어 [45]를 참조하시오. 상기 조건은 표적화되는 진핵생물 세포의 유형 및 사용되는 재조합 세균 균주에 따라 다양할 수 있다. 상기와 같은 변화는 통상적인 기법을 사용하여 당해 분야의 숙련가들에 의해 다루어질 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 또한 융합 단백질의 전달이 성공적인지의 여부를 측정하기 위한 다수의 분석을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합 단백질을 융합된 태그(Myc-태그와 같은)를 인식하는 항체를 사용하여 면역형광을 통해 검출할 수 있다. 상기 측정은 또한 전달되는 단백질의 효소 활성, 예를 들어 [13]에 의해 기재되는 분석에 기반할 수 있다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널 및 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질이 발현되고 배양 상등액내로 분비되도록 본 명세서에 기재된 바와 같은 그람-음성 세균 균주를 배양함을 포함하는 상기 이종 단백질의 정제 방법을 제공한다. 상기 발현되는 융합 단백질은 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널 및 상기 이종 단백질 사이의 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함하고/하거나 펩티드 태그를 추가로 포함할 수 있다.
따라서 특정한 실시태양에서 이종 단백질의 정제 방법은
i) 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널, 이종 단백질 및 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널과 상기 이종 단백질 사이의 프로테아제 절단 부위를 포함하는 융합 단백질이 발현되고 배양물의 상등액내로 분비되도록 본 명세서에 기재된 바와 같은 그람-음성 세균 균주를 배양하는 단계;
ii) 프로테아제를 상기 배양 상등액에 가하고, 여기에서 상기 프로테아제가 상기 이종 단백질이 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널로부터 절단되도록 상기 융합 단백질을 절단시키는 단계; 및
iii) 임의로 상기 이종 단백질을 상기 배양 상등액으로부터 단리시키는 단계
를 포함한다.
따라서, 또 다른 특정한 실시태양에서 이종 단백질의 정제 방법은
i) 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널, 이종 단백질 및 펩티드 태그를 포함하는 융합 단백질이 발현되고 배양 상등액내로 분비되도록 본 명세서에 기재된 바와 같은 그람-음성 세균 균주를 배양하는 단계; 및
ii) 상기 펩티드 태그를 예를 들어 상기 상등액의 친화성 컬럼 정제에 의해 표적화하는 단계
를 포함한다.
따라서, 또 다른 특정한 실시태양에서 이종 단백질의 정제 방법은
i) 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널, 이종 단백질, 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널과 상기 이종 단백질 사이의 프로테아제 절단 부위 및 펩티드 태그를 포함하는 융합 단백질이 발현되고 배양 상등액내로 분비되도록 본 명세서에 기재된 바와 같은 그람-음성 세균 균주를 배양하는 단계;
ii) 프로테아제를 상기 배양 상등액에 가하고, 여기에서 상기 프로테아제가 상기 이종 단백질이 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널로부터 절단되도록 상기 융합 단백질을 절단시키는 단계; 및
iii) 상기 펩티드 태그를, 예를 들어 상기 상등액의 친화성 컬럼 정제에 의해 표적화하는 단계
를 포함한다.
상술한 특정한 실시태양에서 상기 프로테아제를, 상기 배양 상등액에 예를 들어 정제된 프로테아제 단백질의 형태로 가하거나, 또는 프로테아제를 발현하고 분비하는 세균성 균주를 가함으로써 상기 배양 상등액에 가할 수 있다. 추가의 단계는 예를 들어 친화성 컬럼 정제를 통한 상기 프로테아제의 제거를 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 약제에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 그람-음성 세균 균주를 제공한다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 약제로서 또는 백신으로서 피험자에게 이종 단백질을 전달하는데 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 그람-음성 세균 균주를 제공한다. 상기 이종 단백질을 피험자에게, 상기 그람-음성 세균 균주를 진핵생물 세포와, 예를 들어 살아있는 동물과 생체내에서, 상기 이종 단백질이 상기 살아있는 동물내로 전좌되고 이어서 상기 이종 단백질에 대한 항체를 생성하도록 접촉시킴으로써 백신으로서 전달할 수 있다. 상기 생성되는 항체를 직접 사용하거나 또는 단리 및 정제하여 진단에, 연구용으로뿐만 아니라 치료법에 사용할 수 있다. 상기 항체 또는 그 중에 함유된 DNA 서열을 생성시키는 B-세포를, 진단에, 연구용으로뿐만 아니라 치료법에 사용하기 위한 특이 항체의 추가적인 생성에 사용할 수 있다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 이종 단백질의 전달 방법을 제공하며, 여기에서 상기 이종 단백질을 시험관내에서 진핵생물 세포내로 전달한다.
추가의 실시태양에서 본 발명은 이종 단백질의 전달 방법을 제공하며, 여기에서 상기 진핵생물 세포는 살아있는 동물이고, 상기 살아있는 동물을, 융합 단백질이 상기 살아있는 동물내로 전좌되도록 생체내에서 상기 그람-음성 세균 균주와 접촉시킨다. 바람직한 동물은 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다.
추가의 실시태양에서 본 발명은 상기 전좌된 이종 단백질(들)에 의해 유발되는 세포 경로 또는 이벤트에 대한 억제제의 대량고속처리 선별을 위한 상술한 바와 같은 재조합 그람-음성 세균 균주의 용도를 제공한다.
추가의 실시태양에서 본 발명은 그람-음성 세균 균주의 라이브러리를 제공하며, 여기에서 상기 그람-음성 세균 균주의 발현 벡터의 제2 DNA 서열에 의해 암호화되는 이종 단백질은 인간 또는 뮤린 단백질, 바람직하게는 인간 단백질이며, 그람-음성 세균 균주에 의해 발현되는 각각의 인간 또는 뮤린 단백질은 아미노산 서열이 상이하다. 가능한 라이브러리는 예를 들어 560 단백질 함유 애드젠(Addgene) 인간 키나제 Orf 콜렉션(애드젠 No. 1000000014)을 함유할 수 있다. 발현용 클로닝 벡터로서 상술한 발현 벡터를 사용할 수 있다.
추가의 실시태양에서 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터 및 상기 벡터에 의해 포함되는 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 발현하고 분비하는 세균 균주를 포함하는 키트를 제공한다. 특히 유용한 벡터는 목적하는 단백질을 상술한 바와 같은 진핵생물 세포내로 전달하기 위해 상기 세균 균주와 함께 사용하기 위한 벡터이며, 여기에서 상기 벡터는 5'에서 3' 방향으로:
프로모터;
상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널을 암호화하는 제1 DNA 서열;
상기 제1 DNA 서열의 3' 단부에 인프레임 융합된 이종 단백질을 암호화하는 제2 DNA 서열; 및 선택적으로
프로테아제 절단 부위를 암호화하는 제3 DNA 서열(여기에서 상기 제3 DNA 서열은 상기 제1 DNA 서열의 3' 단부와 상기 제2 DNA 서열의 5' 단부 사이에 위치한다)을 포함한다.
실시예
실시예 1:
A) 물질 및 방법
세균 균주 및 생육 조건. 본 연구에 사용된 균주들을 도 15A 내지 M에 나열한다. 플라스미드 정제 및 클로닝에 사용된 이. 콜라이 Top10, 및 접합에 사용된 이. 콜라이 Sm10 λ pir뿐만 아니라 pKNG101의 번식에 사용된 이. 콜라이 BW19610[46]을 LB 아가 플레이트 및 LB 브로쓰에서 37 ℃에서 통상적으로 생육시켰다. 암피실린을 발현 벡터의 선택을 위해 200 ㎍/㎖(예르시니아) 또는 100 ㎍/㎖(이. 콜라이)의 농도로 사용하였다. 스트렙토마이신을 자살 벡터의 선택을 위해 100 ㎍/㎖의 농도로 사용하였다. 와이. 엔테로콜리티카 MRS40[36] 비 암피실린 내성 E40-유도체[13] 및 상기로부터 유래된 균주를 RT에서 뇌 심장 주입(BHI; 디프코(Difco))상에서 통상적으로 생육시켰다. 모든 와이. 엔테로콜리티카 균주에 날리딕시산(Nalidixic acid)을 가하고(35 ㎍/㎖) 모든 와이. 엔테로콜리티카 asd 균주에 100 ㎍/㎖ 메소-2,6-디아미노피멜산(mDAP, 시그마 알드리치)을 추가로 보충하였다. 에스. 엔테리카 SL1344를 37 ℃에서 LB 아가 플레이트 및 LB 브로쓰에서 통상적으로 생육시켰다. 암피실린을 에스. 엔테리카에서의 발현 벡터의 선택을 위해서 100 ㎍/㎖의 농도로 사용하였다.
와이. 엔테로콜리티카의 유전자 조작. 와이. 엔테로콜리티카의 유전자 조작이 [47,48]에 기재되었다. 간단히, pYV 플라스미드 또는 염색체상에서의 유전자의 변형 또는 결실을 위한 돌연변이유발 유전자(mutator)를, 주형으로서 정제된 pYV40 플라스미드 또는 게놈 DNA를 사용하여, 각 유전자의 결실되거나 변형된 부분의 양쪽에 200 내지 250 bp의 인접 서열을 유도하는 2-단편 중복 PCR에 의해 제작하였다. 생성되는 단편을 이. 콜라이 BW19610[46]에서 pKNG101[43] 중에 클로닝하였다. 서열 확인된 플라스미드를 이. 콜라이 Sm10 λ pir내로 형질전환시키고, 이로부터 플라스미드를 상응하는 와이. 엔테로콜리티카 균주내로 동원시켰다. 상기 통합된 벡터를 운반하는 돌연변이체를 선택압없이 여러 세대 동안 번식시켰다. 이어서 슈크로스를 사용하여 상기 벡터를 상실한 클론을 선택하였다. 최종적으로 돌연변이체를 콜로니 PCR에 의해 확인하였다.
플라스미드의 제작. 플라스미드 pBad_Si2 또는 pBad_Si1(도 10)을 YopE(서열번호 2)의 N-말단 138개 아미노산과의 융합 단백질의 클로닝에 사용하였다. pBad_Si2를, 정제된 pYV40으로부터의 YopE 및 SycE에 대한 내인성 프로모터를 함유하는 SycE-YopE1-138 단편의 pBad-MycHisA(인비트로젠)의 KpnI/HindIII 부위내로의 클로닝에 의해 제작하였다. 추가적인 변형은 절단, 클레나우 단편 처리 및 다시이어맞추기(religation)에 의한 pBad-MycHisA의 NcoI/BgIII 단편의 제거를 포함한다. 양방향 전사 종결자(BBa_B1006; iGEM 재단)를, KpnI 절단되고 클레나우 처리되거나(pBad_Si2) 또는 BglII 절단된 부위(pBad_Si1)내로 클로닝하였다. 추가로 YopE1-138의 3' 단부에 하기의 절단 부위들을 가하였다: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII)(도 10 B). pBad_Si1은 pBad_Si2와 동일하지만 아라비노스 유도성 프로모터하에서 NcoI/BglII 부위 중의 pEGFP-C1(클론테크)로부터 증폭된 EGFP를 암호화한다. 상응하는 내인성 프로모터 및 SteA1-20 단편(pSi_266), 전장 SteA 서열(pSi_267), SopE1-81 단편(pSi_268) 또는 SopE1-105 단편(pSi_269)을 함유하는 플라스미드 pSi_266, pSi_267, pSi_268 및 pSi_269를 에스. 엔테리카 SL1344 게놈 DNA로부터 증폭시키고 pBad-MycHisA(인비트로젠)의 NcoI/KpnI 부위내로 클로닝하였다.
전장 유전자 또는 그의 단편을 하기 표 I에 나열된 특이적인 프라이머들로 증폭시키고 YopE1-138에 대한 융합물로서 플라스미드 pBad_Si2내로 또는 z-BIM(서열번호 21)의 경우에 pBad_Si1내로 클로닝하였다(하기 표 II 참조). SteA 또는 SopE에 대한 융합을 위해서, 합성 DNA 구조물을 KpnI/HindII에 의해 절단하고 각각 pSi_266, pSi_267, pSi_268 또는 pSi_269내로 클로닝하였다. 세균 종 유전자의 경우에, 정제된 게놈 DNA를 주형으로서 사용하였다(에스 플렉스네리 M90T, 살모넬라 엔테리카 서브스페시즈, 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 SL1344, 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae) ATCC 49882). 인간 유전자의 경우, 달리 서술되지 않는 한 보편적인 cDNA 라이브러리(클론테크)가 사용되었으며(도 15A 내지 M), 제브라피쉬 유전자를 cDNA 라이브러리(엠 아폴터(M. Affolter)의 친절한 선물)로부터 증폭시켰다. 이어맞춰진 플라스미드를 이. 콜라이 Top10에서 클로닝하였다. 서열분석된 플라스미드를 목적하는 와이. 엔테로콜리티카 또는 에스. 엔테리카 균주내로 표준 이. 콜라이 일렉트로포레이션에 관한 설정을 사용하여 일렉트로포레이션시켰다.
표 II: 클로닝된 융합 단백질
T3SS에 의해 전달되는 단백질 단백질 서열번호 주쇄(backbone) 플라스미드 생성되는 플라스미드 명칭 프라이머 Si_Nr.: 프라이머 서열번호
YopE1-138-MycHis 3 pBad-MycHisA (인비트로젠) pBad_Si_1 285/286 (EGFP), 287/288 (sycE-YopE1-138) 44/45 및 46/47
YopE1-138-MycHis 3 pBad-MycHisA (인비트로젠) pBad_Si_2 287/288 (sycE-YopE1-138) 46/47
YopE1-138-IpgB1 4 pBad_Si_2 pSi_16 292/293 48/49
YopE1-138-SopE 5 pBad_Si_2 pSi_20 296/297 50/51
YopE1-138-Rac1 Q61L 26 pBad_Si_2 pSi_22 299/300 52/53
YopE1-138-RhoA Q61E 27 pBad_Si_2 pSi_24 301/302 54/55
YopE1-138-SopE-MycHis 135 pBad_Si_2 pSi_28 296/306 50/56
YopE1-138-SopB 6 pBad_Si_2 pSi_30 307/308 57/58
YopE1-138-FADD 28 pBad_Si_2 pSi_37 367/386 76/79
YopE1-138-OspF 7 pBad_Si_2 pSi_38 317/318 59/60
YopE1-138-BepG 715-단부 136 pBad_Si_2 pSi_43 324/351 61/67
YopE1-138-Rac1 Q61L-MycHis 137 pBad_Si_2 pSi_51 299/339 52/62
YopE1-138-Slmb1-VhH4 32 pBad_Si_2 pSi_53 341/342 63/64
YopE1-138-Bad 29 pBad_Si_2 pSi_57 346/347 65/66
YopE1-138-SptP 8 pBad_Si_2 pSi_64 364/365 74/75
YopE1-138-NLS-Slmb1-VhH4 33 pBad_Si_2 pSi_70 369/342 77/64
YopE1-138-Bid 24 pBad_Si_2 pSi_85 387/391 80/82
YopE1-138-t-Bid 25 pBad_Si_2 pSi_87 389/391 81/82
YopE1-138-카스파제3 p17 22 pBad_Si_2 pSi_97 403/406 83/84
YopE1-138-GPCR GNA12 30 pBad_Si_2 pSi_103 410/413 85/86
YopE1-138-카스파제3 p10/12 23 pBad_Si_2 pSi_106 417/420 87/88
YopE1-138-IpgD 9 pBad_Si_2 pSi_111 423/424 89/90
YopE1-138-Slmb1-VhH4-NLS 34 pBad_Si_2 pSi_112 341/425 63/91
YopE1-138-z-Bid 19 pBad_Si_2 pSi_116 428/430 92/94
YopE1-138-z-t-Bid 20 pBad_Si_2 pSi_117 429/430 93/94
YopE1-138-BepA E305-단부 11 pBad_Si_2 pSi_118 433/435 95/97
YopE1-138-BepA 10 pBad_Si_2 pSi_119 434/435 96/97
YopE1-138-ET1 36 pBad_Si_2 pSi_120 436/437 98/99
YopE1-138-z-BIM 21 pbad_Si_1 pSi_121 438/439 100/101
EGFP를 인식하는
YopE1-138-VhH4 나노바디		 31 pBad_Si_2 pSi_124 451/373 108/78
YopE1-138-TEV 프로테아제 S219V 42 pBad_Si_2 pSi_132 463/464 109/110
YopE1-138-EGFP 37 pBad_Si_2 pSi_140 477/476 112/111
YopE1-138-Cdk1 14 pBad_Si_2 pSi_143 478/479 113/114
YopE1-138-Mad2 15 pBad_Si_2 pSi_145 482/483 115/116
YopE1-138-Ink4A 16 pBad_Si_2 pSi_147 486/487 117/118
YopE1-138-Ink4B 17 pBad_Si_2 pSi_150 492/493 119/120
YopE1-138-Ink4C 18 pBad_Si_2 pSi_151 494/495 121/122
YopE1-138-TIFA 13 pBad_Si_2 pSi_153 558/559 131/132
YopE1-138-2x TEV부위 - ET1 41 pBad_Si_2 pSi_156 504/505 123/124
YopE1-138-2xTEV부위 - EGFP - NLS 39 pBad_Si_2 pSi_159 511/513 127/129
YopE1-138-2xTEV부위 - NLS - EGFP 38 pBad_Si_2 pSi_160 512/476 128/111
YopE1-138-2x TEV부위 - INK4C 40 pBad_Si_2 pSi_161 508/509 125/126
YopE1-138-2x TEV부위 - Flag - INK4C 43 pBad_Si_2 pSi_164 515/509 130/126
YopE1-138-뮤린 Traf6 12 pBad_Si_2 pSi_166 561/562 133/134
YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 tBid BH3 부분 138 pBad_Si_2 pSi_318 677/678 148/149
YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 Bax BH3 part 139 pBad_Si_2 pSi_322 682/683 150/151
SteA1-20 140 pBad-MycHisA (인비트로젠) pSi_266 580/612 152/153
SteA 141 pBad-MycHisA (인비트로젠) pSi_267 580/613 152/154
SopE1-81 142 pBad-MycHisA (인비트로젠) pSi_268 614/615 155/156
SopE1-105 143 pBad-MycHisA (인비트로젠) pSi_269 614/616 155/157
SteA1-20-에스. 엔테리카 코돈 최적화된 뮤린 tBid 144 pSi_266 pSi_270 합성 구조물 /
SteA-에스. 엔테리카 코돈 최적화된 뮤린 tBid 145 pSi_267 pSi_271 합성 구조물 /
SopE1-81-에스. 엔테리카 코돈 최적화된 뮤린 tBid 146 pSi_268 pSi_272 합성 구조물 /
SopE1-105-에스. 엔테리카 코돈 최적화된 뮤린 tBid 147 pSi_269 pSi_273 합성 구조물 /
YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 Ink4A 84-103 158 pBad_Si_2 pSi_362 745/746 172/173
YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 p107/RBL1 657-662 (AAA02489.1) 159 pBad_Si_2 pSi_363 747/748 174/175
YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 p21 141-160 (AAH13967.1) 160 pBad_Si_2 pSi_364 749/750 176/177
YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 p21 145-160 (AAH13967.1) 161 pBad_Si_2 pSi_366 753/754 178/179
YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 p21 17-33 (AAH13967.1) 162 pBad_Si_2 pSi_367 755/756 180/181
YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 사이클린 D2 139-147 ( CAA48493.1) 163 pBad_Si_2 pSi_368 757/758 182/183
SteA-Ink4a-MycHis 164 pSi_267 pSi_333 703/704 184/185
SopE1-105-Ink4a-MycHis 165 pSi_269 pSi_334 703/704 184/185
SteA-Ink4c-MycHis 166 pSi_267 pSi_335 PCR1: 705/706; PCR2: 707/708; 중복 PCR: 705/708 186/187, 188/189
SopE1-105-Ink4c-MycHis 167 pSi_269 pSi_336 PCR1: 705/706; PCR2: 707/708; 중복 PCR: 705/708 186/187, 188/189
SteA-Mad2-MycHis 168 pSi_267 pSi_337 709/710 190/191
SopE1-105-Mad2-MycHis 169 pSi_269 pSi_338 709/710 190/191
SteA-Cdk1-MycHis 170 pSi_267 pSi_339 711/712 192/193
SopE1-105-Cdk1-MycHis 171 pSi_269 pSi_340 711/712 192/193
YopE1-138-와이. 엔테로콜리티카 코돈 최적화된 뮤린 tBid 194 pBad_Si_2 pSi_315 합성 구조물 /
YopE1-138-유비퀴틴 195 pBad_Si_2 pSi_236 585/586 197/198
YopE1-138-유비퀴틴-Flag-INK4C-MycHis 196 pSi_236 pSi_237_II 588/509 199/126
Yop 분비. yop 레귤론의 유도를, 배양물을 BHI-Ox(분비-허용 조건)[49]에서 37 ℃로 이동시킴으로써 수행하였다. 탄소원으로서 글루코스를 가하였다(4 ㎎/㎖).전체 세포 및 상등액 분획을 20 800 g에서 4 ℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 분리시켰다. 상기 세포 펠릿을 전체 세포 분획으로서 취하였다. 상기 상등액 중의 단백질을 4 ℃에서 1시간 동안 최종 10%(w/v) 트리클로로아세트산으로 침전시켰다. 원심분리(20 800 g에서 15분) 및 상기 상등액의 제거 후에, 생성되는 펠릿을 빙냉 아세톤에서 밤새 세척하였다. 상기 샘플을 다시 원심분리시키고, 상기 상등액을 버리고 상기 펠릿을 공기-건조시키고 1xSDS 로딩 염료에 재현탁하였다.
분비된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하고; 각각의 경우에, 3x108 세균에 의해 분비된 단백질을 레인당 로딩하였다. 면역블럿팅에 의한 특정한 분비된 단백질의 검출을 12.5% SDS-PAGE 젤을 사용하여 수행하였다. 전체 세포 중의 단백질의 검출을 위해서, 달리 서술되지 않는 한 2x108 세균을 레인당 로딩하고, 단백질을 면역블럿팅에 의해 검출하기 전에 12.5% SDS-PAGE 젤상에서 분리시켰다.
면역블럿팅을 YopE에 대한 래트 단클론 항체를 사용하여 수행하였다(MIPA193-13A9; 1:1000, [50]). 항혈청을 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd에 대해 밤새 2회 재흡수시켜 배경 염색을 감소시켰다. 검출을 ECL 화학발광 기질(루미글로(LumiGlo), KPM)로 전개시키기 전에, 래트 항체에 대해 발생되고 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된(1:5000; 서던 바이오테크(Southern biotech)) 2차 항체로 수행하였다.
세포 배양물 및 감염. HeLa Ccl2, swiss 3T3 섬유아세포, 4T1, B16F10 및 D2A1을 10% FCS 및 2 mM L-글루타민(cDMEM)이 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 배양하였다. HUVEC를 기재된 바와 같이 단리하고 배양하였다[51]. 주르캣 및 4T1 세포를 10% FCS 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. 와이. 엔테로콜리티카를 RT에서 밤새 첨가제가 있는 BHI에서 생육시키고, 신선한 BHI 중에서 0.2의 OD600으로 희석시키고 RT에서 2시간 동안 생육시킨 후에 추가로 30분 동안 또는 EGFP 전달의 경우 1시간 동안 37 ℃ 수욕 진탕기로 온도 이동시켰다. 최종적으로, 상기 세균을 원심분리(6000 rcf, 30초)에 의해 수집하고 10 mM HEPES 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM으로 1회 세척하였다. 에스. 엔테리카를 37 ℃에서 밤새 첨가제가 있는 LB에서 생육시키고 신선한 LB에서 1:40 희석하고 37 ℃에서 2.5시간 동안 생육시키거나(SpiI T3SS 유도 조건) 또는 밤새 배양물을 37 ℃에서 추가로 배양시켰다(SpiII T3SS 유도 조건). 최종적으로, 상기 세균을 원심분리(6000 rcf, 30초)에 의해 수집하고 10 mM HEPES 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM으로 1회 세척하였다. 96-웰(면역형광의 경우) 또는 6-웰(웨스턴 블럿팅의 경우) 플레이트에서 시딩된 세포를 10 mM HEPES 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM에서 지시된 MOI로 감염시켰다. 세균의 첨가 후에, 플레이트를 1750 rpm에서 1분 동안 원심분리시키고 37 ℃에서 지시된 시간 동안 두었다. 세포외 세균을 지시된 경우 젠타마이신(100 ㎎/㎖)에 의해 살해하였다. 면역형광 분석의 경우, 감염 분석을 4% PFA 고정에 의해 중지시켰다. 웨스턴 블럿 분석의 경우 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고 포스포-안전성 용해 완충제(노바겐(Novagen))를 가하여 상기 세포를 용해시켰다. 얼음상에서 배양 후에, 상기 세포를 원심분리시켰다(16 000 rcf, 25분, 4 ℃). 상등액을 수집하고 브래드포드(Bradford) BCA 분석(피어스(Pierce))에 의해 전체 단백질 함량에 대해 분석한 후에, 항-포스포-Akt(Ser473 및 T308, 모두 셀 시그널링(Cell Signaling), 항-액틴(밀리포어(Millipore), 항-Bid(셀 시그널링), 항-Myc(산타 크루즈(Santa Cruz)), 항-p38(셀 시그널링), 항-포스포-p-38(Thr180/Tyr182; 셀 시그널링), 항-카스파제-3 p17(셀 시그널링) 및 항-Ink4C(셀 시그널링) 항체를 사용하여 SDS PAGE 및 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
에스. 엔테리카를 사용하는 분비 분석. 에스. 엔테리카에 의한 단백질 분비의 유도를 위해서, 에스. 엔테리카를 궤도 진탕기(150rpm으로 설정)상에서 0.3M NaCl을 함유하는 LB에서 밤새 배양하였다. 이어서 에스. 엔테리카를 0.3 M NaCl을 함유하는 신선한 LB에서 1:50 희석하고 진탕 없이 37 ℃에서 4시간 동안 생육시켰다.
전체 세포 및 상등액 분획을 4 ℃에서 20분 동안 20 800 g에서 원심분리에 의해 분리시켰다. 세포 펠릿을 전체 세포 분획으로서 취하였다. 상기 상등액 중의 단백질을 4 ℃에서 1시간 동안 최종 10%(w/v) 트리클로로아세트산으로 침전시켰다. 원심분리(20 800 g에서 15분) 및 상기 상등액의 제거 후에, 생성되는 펠릿을 빙냉 아세톤에서 밤새 세척하였다. 상기 샘플을 다시 원심분리시키고, 상기 상등액을 버리고 상기 펠릿을 공기-건조시키고 1xSDS 로딩 염료에 재현탁하였다.
분비된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하고; 각각의 경우에, 3x108 세균에 의해 분비된 단백질을 레인당 로딩하였다. 면역블럿팅에 의한 특정한 분비된 단백질의 검출을 12.5% SDS-PAGE 젤을 사용하여 수행하였다. 전체 세포 중의 단백질의 검출을 위해서, 달리 서술되지 않는 한 2x108 세균을 레인당 로딩하고, 단백질을 면역블럿팅에 의해 검출하기 전에 12.5% SDS-PAGE 젤상에서 분리시켰다. 면역블럿팅을 항-Myc(산타 크루즈) 항체를 사용하여 수행하였다
감염된 세포로부터 T3SS 전좌된 단백질의 웨스턴 블럿팅. 6-웰 플레이트 중의 HeLa 세포를 상술한 바와 같이 100의 MOI로 감염시켰다. 와이. 엔테로콜리티카 균주를 전좌시키는 TEV 프로테아제와의 동시감염의 경우에, 상기 균주의 OD600을 설정하고 상기 두 세균 현탁액을 1:1의 비(달리 지시되지 않는 한)로 튜브에서 혼합한 후에 상기 세포에 가하였다. 상기 감염의 끝에서, 상기 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고 작은 부피의 빙냉 PBS 중에서 스크래핑하여 수집하였다. 원심분리(16 000 rcf, 5분, 4 ℃) 후에, 상기 펠릿을 프로테아제 억제제 칵테일(롯슈 완제품, 롯슈)이 보충된 0.002% 디지토닌 중에 용해시켰다. 상기 용해된 펠릿을 빙상에서 5분 동안 배양하고 이어서 원심분리시켰다(16 000 rcf, 25분, 4 ℃). 상등액을 수집하고 브래드포드 BCA 분석(피어스)에 의해 전체 단백질 함량에 대해 분석한 후에, 항-Myc(산타 크루즈, 9E11) 또는 항-Ink4C(셀 시그널링) 항체를 사용하여 SDS PAGE 및 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
면역형광. 96-웰 플레이트(코닝) 중에 시딩된 세포를 상술한 바와 같이 감염시키고 4% PFA로 고정시킨 후에 상기 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서 상기 웰을 RT에서 1시간 동안 PBS 0.3% 트리톤 X-100 중의 5% 염소 혈청을 사용하여 차단시켰다. 1차 항체(항-Myc, 산타 크루즈, 1:100)를 1% BSA 및 0.3% 트리톤 X-100이 있는 PBS 중에서 희석하고 세포를 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세포를 PBS로 4회 세척 후에 1% BSA 및 0.3% 트리톤 X-100이 있는 PBS 중에서 희석된 2차 항체(AF 488 항-마우스, 라이프 테크놀로지스, 1:250)를 가하였다. 필요한 경우 훽스트 DNA 염색(라이프 테크놀로지스, 1:2500) 및/또는 액틴 염색(Dy647-팔로이딘(Phalloidin), 다이오믹스(DyeOmics))을 포함시켰다. 일부의 경우에 상기 PFA 세척 후 바로 오직 DNA 및/또는 액틴 색소만을 적용하였다. 세포를 RT에서 1시간 동안 배양하고, PBS로 3회 세척하고, 하기에 기재하는 바와 같이 자동화된 상 분석에 의해 분석하였다.
자동화된 현미경검사 및 상 분석. 상을 이미지익스프레스 마이크로(ImageXpress Micro)(몰레큘라 디바이시즈(Molecular devices), 미국 서니베일 소재)에 의해 자동적으로 획득하였다. 항-Myc 염색 강도의 정량분석을 메타익스프레스(MetaXpress)(몰레큘라 디바이시즈, 미국 서니베일 소재)를 사용하여 수행하였다. 핵 영역을 제외한 세포내 영역 및 세균을 함유하는 영역을 수동으로 선택하고(40 픽셀의 면적을 갖는 원) 평균 강도를 기록하였다.
TNFα 자극 및 포스포-p38의 웨스턴 블럿팅. 6-웰 플레이트에 시딩된 HeLa 세포를 상술한 바와 같이 100의 MOI로 감염시켰다. 30분 p.i. 젠타마이신을 가하고 45분 p.i. TNFa를 가하였다(10 ng/㎖). 1시간 15분 p.i. 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고 포스포-안전성 용해 완충제(노바겐)를 가하여 상기 세포를 용해시켰다. 빙상에서 배양 후에, 상기 세포를 원심분리시켰다(16 000 rcf, 25분, 4 ℃). 상등액을 수집하고 브래드포드 BCA 분석(피어스)에 의해 전체 단백질 함량에 대해 분석한 후에, 항-포스포-p38, 전체 p38 항체(셀 시그널링) 및 항-액틴 항체(밀리포어)를 사용하여 SDS PAGE 및 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
감염된 HeLa 세포의 cAMP 수준 측정. 96-웰 플레이트에 시딩된 HeLa 세포를 상술한 바와 같이 감염시켰다. 상기 감염 30분 전에 cDMEM을 10 mM HEPES 및 2 mM L-글루타민 및 100 uM 3-아이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX, 시그마 알드리치)이 보충된 DMEM으로 교환하였다. 60분 p.i. 젠타마이신을 가하고 세포를 추가로 90분 동안 37 ℃에서 추가 배양하였다. cAMP의 측정을 제조사의 설명(에머샴, cAMP 바이오트랙(Biotrak), RPN225)에 따라 경쟁 ELISA를 사용하여 수행하였다. 양성 대조용으로서 지시된 양의 콜레라 독소(C8052, 시그마 알드리치)를 10 mM HEPES 및 2 mM L-글루타민 및 100 uM IBMX가 보충된 DMEM 중의 세포에 1시간 동안 가하였다.
제브라피쉬 배(embryo) 감염, 영상화 및 자동화된 상 정량분석. 모든 동물 실험을 승인된 지침에 따라 수행하였다. 제브라피쉬를 표준 조건에서 유지시켰다[52]. 배는 28.5 ℃에서 수정 후 수 시간(hpf)까지 단계적으로 진행하였다[53]. 하기의 제브라피쉬 주를 본 연구에 사용하였다: 야생형 피쉬(AB/EK 및 EK/TL). 감염 프로토콜은 [54]에 제공된 지침에 따랐다. 12 hpf 배를 0.2 mM N-페닐티오유레아(PTU)를 함유하는 E3 배지에서 유지시켜 색소 형성을 방지하였다. 수정 후 2일째(dpf)에 배를 0.2 ㎎/㎖ 트리케인에 의해 마취시키고 헤어 루프 도구를 사용하여 E3에서 1% 아가 플레이트상에 정렬시켰다[54]. 와이. 엔테로콜리티카를 0.4% 아라비노스 및 항생제 및 mDap가 보충된 BHI에서 RT에서 밤새 생육시키고, 0.5% 아라비노스 및 다른 첨가제가 있는 신선한 BHI에서 0.2의 OD600으로 희석하고 RT에서 2시간 동안 생육시킨 후에 추가로 45분 동안 37 ℃ 수욕 진탕기로 온도 이동시켰다. 최종적으로, 상기 세균을 원심분리(6000 rcf, 30초)에 의해 수집하고 PBS로 1회 세척하였다. 상기 OD600을 mDAP를 함유하는 PBS 중에서 2로 설정하였다. 1 내지 2 nL의 상기 현탁액을 펨토팁(Femtotip) II(에펜도르프(Eppendorf))를 사용하는 펨토젯(Femtojet) 미세주사기(에펜도르프)를 사용하여 정렬된 제브라피쉬 배의 후뇌에 주사하였으며, 이때 상기 바늘의 끝은 미세한 족집게에 의해 절단되어 있다. 상기 주사 시간을 0.2s로 설정하고 보상 압력을 15 hPa(에펜도르프, 펨토젯)로 설정하고 주사압을 600 내지 800 hPa로 조절하였다. 방울 크기 및 따라서 접종물을 현미경검사 및 대조용 도말에 의해 점검하였다. 미세주사에 이어서 상기 피쉬를 트리케인 및 PTU를 함유하는 E3에 수집하고 37 ℃에서 30분 동안 배양하고 28 ℃에서 추가로 5시간 동안 배양하였다. 형광 쌍안경(레이카(Leica))을 사용하여 제브라피쉬 후뇌 중 감염 후 1시간째의 세균성 EGFP 형광을 관찰하고, 적합하게 주사되지 않은 배는 버렸다. 상기 감염의 끝에서, 피쉬를 빙상에서 1시간 동안 2% 빙냉 PFA로 고정시키고 4 ℃에서 밤새 새로운 빙냉 PFA로 추가로 고정시켰다. 항체 염색을 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다[55, 56]. 간단히, 배를 매번 5분 동안 PBS 0.1% 트윈으로 4회 세척하고 RT에서 30분 동안 PBS-T + 0.5% 트리톤 X-100을 침투시켰다. 배를 4 ℃에서 밤새 차단 용액(PBS 0.1% 트윈 0.1% 트리톤 X-100 5% 염소 혈청 및 1% BSA) 중에서 차단시켰다. 항체(절단된 카스파제-3(Asp175), 셀 시그널링)를 차단 용액 중에서 1:100 희석하고 암실에서 4 ℃에서 진탕하에 배양하였다. 피쉬를 PBS 0.1% 트윈으로 30분 동안 7회 세척한 후에 차단 용액 중에서 희석시킨 2차 항체(염소 항-토끼 AF647, 인비트로젠, 1:500)를 가하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 유충(larvae)을 PBS 0.1% 트윈으로 4 ℃에서 30분 동안 4회 세척하고 밤새 1회 세척하고 추가로 3 내지 4회 세척하였다. 상을 40x 침수 대물렌즈를 사용하여 레이카 TCS SP5 공초점 현미경으로 촬영하였다. 상을 이마리스(Imaris)(비트플레인(Bitplane)) 및 이미지 J 소프트웨어(http://imagej. nih.gov/ij/)를 사용하여 분석하였다.
상 분석(pBad_Si2의 경우 n=14 또는 z-BIM의 경우 n=19 상에서)을 기록된 z-스택 상의 최대 강도의 z 투영상에서 셀프로파일러(CellProfiler)[57]를 통해 수행하였다. 간단히, 세균을 GFP 채널을 통해 검출하였다. 세균 스폿의 각 영역 둘레에 10 픽셀의 반경을 갖는 원이 생성되었다. 중복 영역을 상기 연결되는 구성원들간에 균등하게 분리시켰다. 세균을 가깝게 둘러싸는 영역들에서 카스파제 3 p17 염색 강도를 측정하였다.
인단백질체에 대한 샘플 제조. 각각의 조건에 대해서, 2개의 6-웰 플레이트의 HeLa CCL-2 세포를 융합(confluency)으로 생육시켰다. 세포를 상술한 바와 같이 30분 동안 감염시켰다. 지시된 시점들에서, 상기 플레이트를 빙상에 놓고 빙냉 PBS로 2회 세척하였다. 이어서 샘플을 우레아 용액[8 M 우레아(애플리캠(AppliChem)), 0.1 M 암모늄비카보네이트(시그마), 0.1% 래피게스트(RapiGest)(워터스), 1x PhosSTOP(롯슈)] 중에 수집하였다. 상기 샘플을 짧게 와동시키고, 4 ℃에서 초음파 처리하고(힐셔(Hielscher)), 열믹서(에펜도르프)상에서 5분 동안 진탕시키고 4 ℃ 및 16'000 g에서 20분 동안 원심분리시켰다. 상등액을 수집하고 추가의 가공을 위해 -80 ℃에서 보관하였다. BCA 단백질 분석(피어스)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.
포스포펩티드 농축. 디설파이드 결합을 37 ℃에서 1시간 동안 10 mM의 최종 농도로 트리스(2-카복시에틸)포스핀으로 환원시켰다. 유리 티올을 실온 암실에서 30분 동안 20 mM 요오도아세트아미드(시그마)로 알킬화시켰다. 과잉의 요오도아세트아미드를 실온에서 10분 동안 25 mM의 최종 농도로 N-아세틸 시스테인으로 급냉시켰다. Lys-C 엔도펩티다제(와코(Wako))를 1:200(w/w)의 최종 효소/단백질 비로 가하고 37 ℃에서 4시간 동안 배양하였다. 상기 용액을 후속적으로 0.1 M 암모늄비카보네이트(시그마)로 2 M 우레아 이하의 최종 농도로 희석하고 서열분석-등급 변형 트립신(프로메가)으로 50:1의 단백질 대 효소비로 37 ℃에서 밤새 절단시켰다. 펩티드를 C18 Sep-Pak 카트리지(워터스)상에서 탈염시키고 진공하에서 건조시켰다. 포스포펩티드를 앞서 기재된 바와 같이[58] TiO2와 함께 2 ㎎의 총 펩티드 질량으로부터 단리시켰다. 간단히, 건조된 펩티드를 프탈산으로 포화된 80% 아세토니트릴(ACN)-2.5% 트리플루오로아세트산(TFA) 용액 중에 용해시켰다. 펩티드를 차단된 모비콜(Mobicol) 회전 컬럼(MoBiTec) 중의 동일한 양의 평형화된 TiO2(5 ㎛ 비드 크기, GL 사이언시즈)에 가하고 거꾸로 뒤집어 회전시키면서 30분 동안 배양하였다. 상기 컬럼을 포화된 프탈산 용액으로 2회, 80% ACN 및 0.1% TFA로 2회 및 최종적으로 0.1% TFA로 2회 세척하였다. 상기 펩티드를 0.3M NH4OH 용액으로 용리시켰다. 상기 용출물의 pH를 5% TFA 용액 및 2 M HCl로 2.5 이하로 조절하였다. 포스포펩티드를 다시 미세회전(microspin) C18 카트리지(하바드 아파라투스(Harvard Apparatus))로 다시 탈염시켰다.
LC-MS/MS 분석. 펩티드의 크로마토그래피 분리를, 1.9 ㎛ C18 수지(레프로실(Reprosil)-AQ Pur, Dr. Maisch)가 내부(in-house) 충전된 가열식 RP-HPLC 컬럼(75 ㎛ x 45 ㎝)이 장착된EASY 나노-LC 시스템(써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 수행하였다. 1 ㎍의 총 포스포펩티드 샘플의 분액을 120분에 걸쳐 200 nl/분의 유량으로 98% 용액 A(0.15% 포름산) 및 2% 용매 B(98% 아세토니트릴, 2% 물, 0.15% 포름산)에서부터 30% 용매 B 범위의 선형 구배를 사용하여 LC-MS/MS 실행에 따라 분석하였다. 질량 분광분석을 나노전기분무 이온 소스가 구비된 이중 압력 LTQ-Orbitrap 질량 분광계(둘 다 써모 피셔 사이언티픽) 상에서 수행하였다. 각각의 MS1 스캔(상기 Orbitrap에서 획득됨)에 이어서 30초 동안 동적 배제와 함께 20개의 가장 풍부한 전구체 이온의 충돌-유도된(collision-induced) 해리(CID, LTQ에서 획득됨)가 이어졌다. 포스포펩티드 분석을 위해서 10개의 가장 풍부한 전구체 이온에 사용가능한 다단계 활성화와 함께 CID를 가하였다. 전체 주기 시간은 대략 2s였다. MS1의 경우, 106 이온이 최대 300 ms의 시간에 걸쳐 상기 Orbitrap 셀에서 축적되었으며 60,000 FWHM의 분해능으로 스캐닝하였다(400 m/z에서). MS2 스캔을 정규 스캔 모드, 104 이온의 표적 설정 및 25 ms의 축적 시간을 사용하여 획득하였다. 단독으로 하전된 이온 및 지정되지 않은 전하 상태를 갖는 이온은 MS2 이벤트의 유발로부터 배제시켰다. 상기 표준화된 충돌 에너지를 32%로 설정하고, 하나의 미세스캔이 각 스펙트럼에 대해서 획득되었다.
무-표지 정량분석 및 데이터베이스 검색. 상기 획득된 원-파일을 디폴트 매개변수를 사용하여 무-표지 정량분석을 위해 프로제네시스(Progenesis) 소프트웨어 도구(논라이너 다이나믹스(Nonliner Dynamics, 버전 4.0)내로 수입하였다. MS2 스펙트럼은 mgf 포맷으로 프로제네시스로부터 직접 수출되었으며 MASCOT 연산(매트릭스 사이언스(Matrix Science, 버전 2.4)를 사용하여 예상된 호모 사피엔스의 스위스프롯(SwissProt) 엔트리(www.ebi.ac.uk, 방출 날짜 16/05/2012)의 정규 및 역 서열을 함유하는 미끼 데이터베이스(decoy database)[59] 및 맥스콴트(MaxQuant) 소프트웨어(버전 1.0.13.13)로부터의 시퀀스리버서(SequenceReverser) 도구를 사용하여 생성된 통상적으로 관찰되는 오염물질(총 41,250 서열 중)에 대해 검색되었다. 와이. 엔테로콜리티카로부터 기원하는 단백질을 확인하기 위해서, 비 포스포펩티드 풍부 샘플을 와이. 엔테로콜리티카의 예측된 스위스프롯 엔트리(www.ebi.ac.uk, 방출 날짜 15/08/2013)를 포함하는 상기 동일한 데이터베이스에 대해 검색하였다. 상기 전구체 이온 허용도를 10 ppm으로 설정하였고 단편 이온 허용도는 0.6 Da으로 설정하였다. 검색 기준은 하기와 같이 설정되었다: 완전한 트립신 특이성이 요구되었으며(프롤린이 이어지지 않는 경우 리신 또는 아르기닌 뒤에서 절단), 2개의 누락 절단이 허용되었고, 카브아미도메틸화(C)를 고정 변형으로서 및 인산화(S,T,Y) 또는 산화(M)를 각각 TiO2 풍부 또는 비-풍부 샘플에 대한 가변 변형으로서 설정하였다. 최종적으로, 상기 데이터베이이스 검색 결과를 xml-파일로서 수출하고 다시 MS1 특징 지정을 위해 상기 프로제네시스 소프트웨어로 수입하였다. 포스포펩티드 정량분석을 위해서, 모든 검출된 특징의 MS1 피크 풍부성을 함유하는 csv-파일을 수출하고, 비-풍부 샘플의 경우, 단백질당 확인된 모든 펩티드의 합해진 특징 강도를 기준으로 모든 단백질 측정을 함유하는 csv-파일을 생성시켰다. 중요하게, 상기 프로제네시스 소프트웨어를, 유사한 세트의 펩티드에 의해 확인된 단백질을 함께 모으고 상기 데이터베이스 중 오직 단일 단백질에 대한 특이 서열을 갖는 비-대립 펩티드만이 단백질 정량분석에 사용되도록 설정하였다. 상기 두 파일 모두 내부 개발된 세이프콴트(SafeQuant) v1.0 R 스크립트(비공개 데이터, https://github.com/eahrne/SafeQuant에서 입수할 수 있다)를 사용하여 추가로 처리하였다. 간단히, 상기 소프트웨어는 상기 확인 수준 거짓 발견률을 1%(미끼 단백질 서열 데이터베이스 적중의 수를 기준으로)로 설정하며 모든 샘플에 걸쳐 확인된 MS1 피크 풍부성(추출된 이온 크로마토그램, XIC)을 표준화한다, 즉 모든 신뢰성 있게 확인된 펩티드 특징들을 합한 XIC를 모든 LC-MS 실행에 대해 균등하게 기준화한다. 이어서, 모든 정량분석된 포스포펩티드/단백질을 각각의 시점에 대해서, 시점당 중간 XIC를 기준으로 존재비를 지정한다. 각 비의 통계학적 유의수준은, 변형된 t-통계학적 p-값[60]을 계산하고 다수의 시험에 대해 조정함으로써[61] 획득된 그의 q-값(거짓 발견률 조절된 p-값)에 의해 제공된다. 상기 인산화된 잔기의 위치는 MASCOT(점수>10)에 의해 자동 지정되었다. 상기 사용된 MS 원 파일 및 검색 매개변수들과 함께 모든 주석이 달린 스펙트럼은 PRIDE 파트너 저장소를 통해 프로테옴엑스체인지(ProteomeXchange) 협회(http://proteomecentral.proteomexchange.org)에 기탁될 것이다[62].
서열 정렬을 http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/에서 EMBL-EBI 웹 기반 ClustalW2 다중 서열 정렬 도구를 사용하여 수행하였다.
B) 결과
YopE 융합 단백질의 3형 분비에 기반한 단백질 전달 시스템
상기 와이. 엔테로콜리티카 T3SS 이펙터 YopE(서열번호 1)의 바로 N-말단은 이종 단백질을 전좌하기에 충분한 분비 신호를 함유하지만[10], 그의 샤프론(SycE)에 대한 샤프론-결합 부위(CBS)는 포함되지 않는다[63]. 우리는 상기 YopE(서열번호 2)의 N-말단 138개 아미노산을, 전달하려는 단백질에 융합시키기 위해 선택하였는데, 그 이유는 상기가 다른 이종 T3S 기질의 전좌에 최선의 결과를 제공함이 입증되었기 때문이다[38]. 상기 YopE의 N-말단 138개 아미노산은 CBS를 함유하기 때문에, 우리는 추가로 SycE를 공발현하기로 결정하였다. 정제된 와이. 엔테로콜리티카 pYV40 독성 플라스미드로부터 클로닝된 SycE-YopE1-138 단편은 YopE 및 그의 샤프론 SycE의 내인성 프로모터를 함유한다(도 10). 따라서, SycE 및 임의의 YopE1-138 융합 단백질이 RT에서의 생육으로부터 37 ℃로의 빠른 온도 이동에 의해 유도된다. 37 ℃에서의 배양 시간은 세균 중에 존재하는 융합 단백질량에 영향을 미칠 것이다. 다중 클로닝 부위(MCS)를 YopE1-138의 3' 단부(도 10B)에 가한 다음 Myc 및 6xHis 태그 및 정지 코돈을 가하였다.
배경 균주를 조심스럽게 선택하였다. 먼저, 내인성 이펙터의 전좌를 제한하기 위해서, 우리는 모든 공지된 이펙터, Yop H, O, P, E, M 및 T가 결실된 와이. 엔테로콜리티카 균주(ΔHOPEMT라 명명함)를 사용하였다[64]. 또한, 우리는 내인성 메소-2,6-디아미노피멜산의 부재하에서는 생육할 수 없는 영양요구성 돌연변이체를 사용하였다[65]. 상기 균주는 아스파테이트-베타-세미알데히드 데하이드로게나제 유전자가 결실되었으며(Δasd), 스위스 안전 당국에 의해 생물안전 수준 1로서 분류되었다(A010088/2에 대한 수정). 또한, 우리는 배경 균주의 보다 넓은 선택을 제공하기 위해서 부착 단백질 YadA 및/또는 InvA를 결실시켰다. yadA 또는 yadA/invA 균주의 사용은 유도되는 배경 신호전달을 감소시키지만[66], 상기 전달된 단백질량이 또한 영향을 받는다[67].
진핵생물 세포내로의 YopE 융합 단백질 전달의 특성화
시험관내 분비 분석(도 1A 참조)에서, 주변 액체로의 단백질 분비를 인공적으로 유도한다. TCA 기반 단백질 침전 후에, 항-YopE 항체와 함께 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 분비된 단백질량을 측정하였다(도 1B). wt 균주는 전장 YopE를 분비하였지만, 상기 ΔHOPEMT asd 균주는 분비하지 않았다. YopE1-138-Myc-His(추가로 YopE1-138-Myc라 지칭된다; 서열번호 3)의 존재시 보다 작은 YopE 밴드가 보이게 되었다(도 1B). 따라서, 상기 YopE1-138 단편은 여기에 기재된 셋업에서 잘 분비된다. 진핵생물 세포내로의 단백질 전좌의 동종성을 분석하기 위해서, 우리는 HeLa 세포를 YopE1-138-Myc 암호화 균주로 감염시키고 상기 Myc 태그를 IF에 의해 염색하였다(도 2A 및 B). 초기에는 단지 상기 세균이 염색된 반면, 감염 후(p.i.) 30분째에는 세포 윤곽이 보이기 시작하며, 이는 감염 시간의 증가시 증대된다(도 2B). 이러한 경향은 HeLa 세포 내부의 Myc 태그 염색 강도에 의해 잘 반영된다(도 2A 및 B). 상기 YopE1-138-Myc는, 핵을 제외하고 상기 세포 어디에서나 검출될 수 있다(도 2A)[68]. 현저하게, 대부분의, 전부는 아니지만, 세포는 상기 접근법에 의해 필적하는 방식으로 달성되었다. 와이. 엔테로콜리티카는 다수의 상이한 세포 유형들을 감염시키는 것으로 공지되어 있지만[69], 우리는 다양한 세포주내로의 YopE1-138-Myc 전달을 추적하였다. 동일한 동종의 항-Myc IF 염색을 감염된 뮤린 섬유아세포, 주르캣 세포 및 HUVEC에서 관찰하였다(도 11). 훨씬 더, 상기 MOI를 상하 조정하여, 상기 세포의 대부분은 여전히 표적화하면서, 전달되는 단백질량의 조절을 허용한다(도 2C). 낮은 세균수는 전달된 단백질을 많이 갖는 소수의 세포를 생성시키지 않을 것이며 오히려 낮은량의 전달된 단백질을 함유하는 많은 세포를 생성시킬 것이다(도 2C).
핵으로의 T3SS 전달된 단백질의 방향변경
YopE 자체는 세포질로 국소화되기 때문에(도 2A), 상기 YopE1-138 단편이 핵 융합 단백질의 국소화를 방해하는지를 시험하는 것이 특히 중요하다. 따라서 우리는 SV40 NLS를 YopE1-138-EGFP(각각 서열번호 39 및 서열번호 38)의 C-말단(및 N-말단, 유사한 결과)에 가하였다. YopE1-138-EGFP(서열번호 37)는 약한 세포질 염색을 유도한 반면, YopE1-138-EGFP-NLS는 감염된 HeLa 세포에서 보다 강한 핵 EGFP 신호를 생성시켰다(도 3). 이는 상기 YopE1-138 단편이 NLS의 사용에 적합함을 암시한다. mCherry는 이미 식물 병원체에 사용되었지만[70], T3SS를 암호화하는 인간 또는 동물 병원성 세균을 통해 GFP-유사 단백질의 성공적인 전달을 나타낸다. 이는 상기 SycE 및 YopE1-138 의존적인 전략이 다수의 선택 단백질의 전달에 매우 유망함을 확인한다.
융합 단백질의 진핵생물 세포로의 전좌 후 YopE 1-138 부속기관의 제거
세균 전달의 경우 상기 YopE1-138 단편은 큰 이점을 갖지만, 상기는 융합 단백질 기능 및/또는 국소화를 방해할 수도 있다. 따라서, 단백질 전달 후 그의 제거가 최적일 수 있다. 이를 위해서, 우리는 2개의 TEV 절단 부위(ENLYFQS)[71-73]를 YopE1-138 및 융합 짝(전사 조절자 ET1-Myc(서열번호 36 및 41)[74] 및 인간 INK4C(서열번호 40 및 서열번호 43) 사이에 도입시켰다. 제공된 방법의 이점을 유지하기 위해서, 우리는 추가로 TEV 프로테아제(S219V 변이체; [75])를 또 다른 와이. 엔테로콜리티카 균주에서 YopE1-138(서열번호 42)에 융합시켰다. HeLa 세포를 한 번에 상기 2개의 균주 모두로 감염시켰다. 오직 단백질의 전좌된 분획을 분석하기 위해서, 감염된 HeLa 세포를 디지토닌(세균은 용해시키지 않는 것으로 공지되어 있다)([76]; 대조용으로 도 12를 참조하시오)으로 2h p.i.에서 용해시켰다(도 4). 웨스턴 블럿 분석은 오직 세포를 상응하는 균주로 감염시켰을 경우에만 YopE1-138-2xTEV-절단 부위-ET1-Myc 또는 YopE1-138-2xTEV-절단-부위-Flag-INK4C-Myc의 존재를 밝혀내었다(도 4A 및 C). 상기 세포-용해물을 정제된 TEV 프로테아제로 밤새 절단 시, 이동된 밴드를 관찰할 수 있었다(도 4A 및 C). 상기 밴드는 상기 TEV 절단 부위의 나머지, 가장 그럴듯하게는 단지 하나의 세린과 함께 ET1-Myc(도 4C) 또는 Flag-INK4C(도 4A)에 상응한다. 세포를 상기 TEV 프로테아제를 전달하는 균주로 동시감염시, 동일한 절단된 ET1-Myc 또는 Flag-INK4C 단편이 보이게 되었으며, 이는 상기 T3SS를 통해 전달된 TEV 프로테아제가 기능성이고 단일 세포가 상기 두 세균 균주 모두에 의해 감염되었음을 암시한다(도 4A 및 C). 절단은 완전하지 않지만, 전좌된 단백질의 대부분은 이미 감염 후 2시간째에 절단되며 심지어 정제된 TEV 프로테아제에 의한 밤새 절단은 보다 양호한 절단률을 생성시키지 않았다(도 4B). 보고된 바와 같이, TEV 프로테아제 의존적인 절단은 융합 단백질에 따른 최적화를 필요로 할 수도 있다[77,78]. 따라서 전좌 후 상기 YopE1-138 부속기관의 TEV 프로테아제 의존적인 제거는, 단지 하나의 N-말단 아미노산에 의해 아미노산 조성이 변한 거의 고유의 이종 단백질의 T3SS 단백질 전달을 처음으로 제공한다.
상기 YopE 단편의 TEV 프로테아제 의존적인 절단에 대한 또 다른 접근법은 관심 융합 단백질내로 유비퀴틴의 통합이었다. 실제로, 유비퀴틴은 그의 C-말단에서 내인성 유비퀴틴-특이성 C-말단 프로테아제(탈유비퀴틴화 효소, DUB)의 그룹에 의해 가공된다. 상기 절단은 유비퀴틴의 바로 C-말단(G76 뒤)에서 발생하는 것으로 추정되기 때문에, 상기 관심 단백질은 추가적인 아미노산 서열이 없어야 한다. 상기 방법을 YopE1-138-유비퀴틴-Flag-INK4C-MycHis 융합 단백질상에서 시험하였다. YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis-발현 세균에 의해 감염된 대조용 세포에서, YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis에 상응하는 밴드가 발견되었으며, 이는 상기 융합 단백질의 효율적인 전좌를 가리킨다(도 24). 세포를 YopE1-138-유비퀴틴-Flag-INK4C-MycHis-발현 세균으로 1시간 동안 감염시켰을 때, Flag-INK4C-MycHis의 크기에 상응하는 추가적인 밴드를 볼 수 있었으며, 이는 상기 융합 단백질의 부분이 절단되었음을 암시한다. 상기 결과는 상기 융합 단백질내로의 유비퀴틴의 도입이 상기 YopE1-138 단편을 외인성 프로테아제의 필요 없이 절단할 수 있음을 나타낸다.
III형 및 IV형 세균 이펙터의 전좌
살모넬라 엔테리카로부터의 SopE는 액틴 세포골격 재형성을 촉진하는, Cdc42와 상호작용하는 잘-특성화된 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)이다[79]. YopE1-138-Myc의 HeLa 세포내로의 전좌는 효과가 없는 반면, 전좌된 YopE1-138-SopE(서열번호 5 및 135)는 액틴 네트워크에서 극적인 변화를 유도하였다(도 5A). 유사한 결과가 또 다른 GEF 이펙터 단백질, 시겔라 플렉스네리로부터의 IpgB1(서열번호 4)에 의해 획득되었다. 현저하게, 상기 액틴 세포골격의 첫 번째 변화는 2분 p.i.만큼 빠르게 관찰되었다(도 5A). 따라서, T3SS 의존적인 단백질 전달은 감염이 원심분리에 의해 개시된 직후에 발생한다는 결론을 내릴 수 있다. 엄격한 T3SS 의존적인 수송을 증명하기 위해서, 진핵생물 세포막내에 전좌 구멍을 형성하는 T3SS 단백질 중 하나를 결실시켰다(YopB, [80] 참조)(도 12).
살모넬라 감염 동안, SopE 전좌에 이어서 SptP(Cdc42에 대한 GTPase 활성화 단백질(GAP)로서 기능한다[81])의 전좌를 수행한다. YopE1-138-SopE-Myc(서열번호 135) 단독의 전좌는 대량 F-액틴 재배열을 유발한 반면, YopE1-138-SptP(서열번호 8) 발현 세균에 의한 동시감염은 용량 의존적인 방식으로 상기 효과를 없앴다(도 5B). 항-Myc 염색은 상기 억제가 YopE1-138-SopE-Myc 전좌의 감소된 수준에 기인하지 않음을 암시하였다(도 5B). 이러한 결과들은 함께, 2개의 세균 균주에 의한 세포의 동시-감염은 이들의 기능성 상호작용을 다루기 위해 2개의 상이한 이펙터를 단일 세포에 전달하는 타당한 방법임을 입증하였다.
상기 에스 플렉스네리 III형 이펙터 OspF는 MAP 키나제 p38 및 ERK를 탈인산화하는 포스포쓰레오닌 라이아제로서 기능한다[82]. 전좌된 YopE1-138-OspF(서열번호 7)의 기능성을 시험하기 위해서, 우리는 TNFα로 자극 후 p38의 인산화를 모니터하였다. 감염되지 않은 세포 또는 YopE1-138-Myc 발현 세균으로 감염된 세포에서, TNFα는 p38 인산화를 유도하였다. 대조적으로, YopE1-138-OspF의 전좌 후 TNFα-유도된 인산화가 없어졌으며, 이는 상기 전달된 OspF가 p38에 대해 활성임을 입증한다(도 6A).
살모넬라 감염 동안, 상기 III형 이펙터 SopB는 상피세포를 Akt의 지속적인 활성화에 의해 세포자멸로부터 보호한다[83]. YopE1-138-Myc 또는 YopE1-138-SopE의 전좌는 Akt에 영향이 없지만, YopE1-138-SopB(서열번호 6)의 전좌는, 활성형태를 반영하는 T308 및 S473에서 Akt의 강한 인산화를 유도하였다(도 6B). 유사한 결과가 에스 플렉스네리로부터의 SopB-상동체(IpgD, 서열번호 9)에 의해 획득되었다. 전체적으로, 우리의 결과는 상기 YopE1-138-기반 전달 시스템이 지금까지 시험된 모든 T3S 이펙터에 대해 기능하며, 상기는 세포골격, 염증 및 세포 생존을 포함한 중심 세포 기능의 조절에 관련된 단백질의 조사를 허용함을 증명한다.
아그로박테리움 튜메파시엔스, 레지오넬라 뉴모필라 및 바르토넬라 헨셀라에를 포함한 다수의 세균이 IV형 분비를 사용하여 이펙터를 세포내로 주입한다. 우리는 비. 헨셀라에로부터의 IV형 이펙터 BepA가 우리의 도구를 사용하여 HeLa 세포내로 전좌될 수 있는지의 여부를 시험하였다. 전장 BepA(서열번호 10) 및 C-말단 Bid 도메인을 함유하는 BepAE305-단부(서열번호 11)을 클로닝하고 세포를 각각의 균주로 감염시켰다. BepA가 환상 AMP(cAMP)의 생성을 유도하는 것으로 나타났지만[84], HeLa 세포에서 cAMP의 수준을 감염 후에 측정하였다. 상기 비. 헨셀라에 이펙터 BepG(서열번호 136)의 Bid 도메인의 전좌는 cAMP를 유도하지 못했지만, 전장 BepA 및 BepAE305-단부는 예상된 양으로 cAMP 생산을 유발하였다[84](도 6C). 상기 결과는 IV형 이펙터가 또한 YopE1-138-기반 전달 시스템에 의해 숙주 세포 표적내로 효과적으로 전달될 수 있고 기능성임을 나타낸다.
상피세포내로 진핵생물 단백질의 전좌
인간 단백질이 III형 분비를 통해 전좌할 수 있음을 입증하기 위해서, 우리는 와이. 엔테로콜리티카에 의한 전달을 위해 인간 세포자멸 유도인자를 YopE1-138에 또는 에스. 엔테리카에 의한 전달을 위해 SteA1-20, SteA, SopE1-81 또는 SopE1-105에 융합시켰다. 이어서 우리는 인간 BH3 상호작용-도메인 사망 작용물질(BID, 서열번호 24)(Bcl-2 단백질과의 프로-세포자멸 일원이다)의 전좌를 모니터하였다. 상기는 카스파제-8(CASP8)에 의해 유도되는 미토콘드리아 손상의 매개체이다. CASP8은 BID를 절단하며, 절두된 BID(tBID, 서열번호 25)는 미토콘드리아로 전좌하고 여기에서 시토크롬 c 방출을 유발한다. 후자는 상기가 17 및 21 kDa 서브유닛으로 절단되는 동안 본래의 카스파제 3(CASP3)의 방식으로 된다[85]. 1시간 동안 YopE1-138-Myc 또는 YopE1-138-BID 발현 와이. 엔테로콜리티카에 의한 감염은 세포자멸을 유도하지 못했지만, 인간 tBID의 전좌는 충분히-특성화된 세포자멸 유도인자 스타우로스포린보다 더 큰 정도로 세포사를 유발하였다(도 7A 및 C). 예상된 바와 같이, 상기 tBID의 전좌는 CASP3 p17 서브유닛의 생성을, 심지어 스타우로스포린에 비해 더 큰 양으로 유도하였다(도 7A). 내인성 Bid에 대해 전좌된 단백질량을 비교할 수 있기 위해서, HeLa 세포를 디지토닌으로 용해시키고 항 Bid 항체를 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다(도 7B). T3SS 전달된 YopE1-138-tBID는 HeLa 세포에서 대략 내인성 Bid 수준에 도달한 반면, 전달된 YopE1-138-BID는 훨씬 더 많은 양으로 존재하였다(도 7B). HeLa 세포의 심부 단백질체 및 전사 지도작성은 단일 세포당 BID의 4.4배 105 사본수를 추정하였다[86]. 따라서, T3SS 의존적인 인간 단백질 전달은 세포당 105 내지 106 단백질에 달한다는 결론을 내릴 수 있다. 이러한 숫자는 이. 콜라이 T3SS를 통해 전좌된 나노바디의 세포당 사본수에 들어맞는다[19]. 상기 감염의 MOI 및 지속기간에 대해 10의 인자, 항생제 첨가의 시점 및 감염 전 37 ℃에서 배양 시간에 대해 3.2의 인자의 수평화를 가정하여, 상기 전달된 단백질 사본수/세포를 일부 1000 사본수/세포에서 일부 106 사본수/세포로 조정할 수 있다. 전체적으로, 이들 결과는 전좌된 tBID가 기능성이며 적합한 수준으로 전달됨을 암시하였다. 이는 세포 생물학의 중심 태양인 세포자멸의 조절에서 단백질의 역할을 연구하는데 상기 전좌 도구를 합당화하였다.
우리는 추가로 뮤린 tBID(와이. 엔테로콜리티카에 최적화된 코돈; 서열번호 194) 또는 뮤린 tBID 또는 뮤린 BAX(두 경우 모두 와이. 엔테로콜리티카에 최적화된 코돈; 서열번호 138 및 139)의 BH3 도메인을 와이. 엔테로콜리티카에 의한 전달을 위해서 YopE1-138에 융합시켰다. 단백질을 전달하지 않거나 YopE1-138-Myc를 전달하는 와이. 엔테로콜리티카 ΔHOPEMT asd에 의한 2.5시간 동안의 감염은 세포자멸을 유도하지 못한 반면, 뮤린 tBID(와이. 엔테로콜리티카에 최적화된 코돈, 서열번호 194)의 전좌는 B16F10(도 16), D2A1(도 17), HeLa(도 18) 및 4T1(도 19) 세포에서 세포사를 유발하였다. 와이. 엔테로콜리티카에 최적화된 뮤린 BID 코돈(서열번호 138) 또는 와이. 엔테로콜리티카에 최적화된 뮤린 BAX 코돈(서열번호 139)의 BH3 도메인의 전좌가 또한 B16F10(도 16), D2A1(도 17), HeLa(도 18) 및 4T1(도 19) 세포에서 대량 세포사를 유도하는 것으로 밝혀졌다.
에스. 엔테리카 aroA 세균에 의한 4시간 감염은 세포자멸을 유도하지 못했지만, 뮤린 tBID의 전좌는, 뮤린 tBID의 전좌가 CASP3 p17 서브유닛의 생성을 유도하기 때문에(도 20 및 21) 세포자멸을 유발하였다. SopE 융합 단백질에 대한 세포자멸 유도의 정도는 SpiI T3SS 유도 조건을 사용하는 경우(도 20) 보다 컸으며, 이는 SpiI T3SS에 의한 SopE의 수송을 광범위하게 반영한다. SteA1-20 융합된 뮤린 tBID는, SteA의 20개 N-말단 아미노산내의 분비 신호가 융합 단백질의 전달을 허용하기에 충분하지 않기 때문에 세포자멸을 유도하지 못했다(도 20 및 21). 전장 SteA에 융합된 뮤린 tBID는 HeLa 세포(도 20 및 21)에서 세포자멸 유발(둘 다 SpiI 및 SpiII T3SS 유도 조건에서)을 유도하며, 이는 상기 두 T3SS 모두에 의해 수송되는 SteA의 능력을 반영한다. SpiII T3SS 유도 조건하에서조차, 상기 SpiI T3SS의 부분 활성이 SpiII T3SS 유도 조건에서 SopE 융합 단백질의 활성에 의해 나타나는 것으로 예상됨에 유의해야 한다(도 21).
여기에서 기능적으로 정교한 전좌된 진핵생물 단백질들 외에, 다수의 다른 진핵생물 단백질들이 여기에 기재된 도구를 사용하여 분비되었다. 여기에는 와이. 엔테로콜리티카에 의한 전달을 위한(도 13, 14 및 23) 세포주기 조절로부터의 단백질(Mad2 (서열번호 15), CDK1 (서열번호 14), INK4A (서열번호 16), INK4B (서열번호 17) 및 INK4C (서열번호 18)) 뿐만 아니라 그의 부분들(INK4A 84-103 (서열번호 158), p107 657-662 (서열번호 159), p21 141-160 (서열번호 160), p21 145-160 (서열번호 161), p21 17-33 (서열번호 162) 및 사이클린 D2 139-147 (서열번호 163)), 세포자멸 관련된 단백질(Bad (서열번호 29), FADD (서열번호 28), 및 카스파제 3 p17 (서열번호 22) 및 p12 (서열번호 23), 제브라피쉬 Bid(서열번호 19) 및 t-Bid(서열번호 20)) 뿐만 아니라 그의 부분들(tBid BH3 (서열번호138), Bax BH3 (서열번호139)), 신호전달 단백질(이벤트 TRAF6 (서열번호 12), TIFA (서열번호 13)), GPCR Gα 서브유닛(GNA12, 가장 짧은 동형, (서열번호 30)), 나노바디(vhhGFP4 (서열번호 31)) 및 표적화된 단백질 분해용 나노바디 융합 구조물(Slmb-vhhGFP4; (서열번호 32, 33, 34) [87])(도 13 및 14) 뿐만 아니라 GTPases(Rac1 Q61E (서열번호 26 및 137) 및 RhoA Q63L (서열번호 27) 및 인간 Akt (서열번호 35)로부터의 Pleckstrin 상동성 도메인이 포함된다. 상기 기능상 정교한 세포자멸 관련된 단백질들(이벤트 tBid, 서열번호 144-147) 외에, 여기에는 에스. 엔테리카에 의한 전달을 위한(도 22) 세포주기 조절로부터의 단백질(Mad2 (서열번호 168-169), CDK1 (서열번호 170-171), INK4A (서열번호 164-165) 및 INK4C (서열번호 166-167)이 추가로 포함된다. 상기 단백질들은 기능적으로 확인되지 않았지만, YopE 부속기관의 가능한 제거와 함께 다양한 진핵생물 단백질의 T3SS 의존성 분비의 가능성은 세포 생물학에서 T3SS의 광범위한 적용성에 대한 새로운 전망을 연다.
제브라피쉬 배에서 절두된 Bid의 생체내 전좌는 세포자멸을 유도한다
상기 세균성 도구의 흥미로운 특징은 살아있는 동물에서의 잠재적인 용도이다. 제브라피쉬는 그의 배 상태에서 투명성을 유지하여 형광 염색 및 현미경검사를 허용할 수 있다[54,88,89]. 소수의 제브라피쉬 세포자멸 유도인자가 상세히 기재되었으며, 이 중에서 z-BIM이 가장 효능이 있다[90]. 따라서, 우리는 z-BIM을 우리의 시스템내로 클로닝하기로 하였다. 인간 BIM에 약하게 상동성이라 하더라도, 우리는 인간 상피세포에서 YopE1-138-z-BIM(서열번호 21)의 세포자멸 유도 효능을 분석하였다. YopE1-138-z-BIM을 전좌하는 균주로 1시간 동안 감염된 HeLa 세포는 세포사의 분명한 징후를 나타내었다. 이어서 우리는 수정후 2일째(dpf) 제브라피쉬 배로, 세균의 후뇌로의 미세주사를 통한 국소화된 감염 모델[54]을 사용하여 생체내 실험을 수행하였다. 5.5시간 감염 후에, 상기 피쉬를 고정시키고, 침투성으로 만들고 CASP3 p17의 존재를 염색하였다. YopE1-138-Myc 발현 균주에 의한 감염시, 세균을 후뇌 영역에서 볼 수 있었으나(염색 "b", 도 8 A I), 상기 세균 주위에서 세포자멸의 유도는 검출되지 않았다(염색 "c", 도 8 A I). 대조적으로, YopE1-138-z-BIM을 전달하는 균주로 감염시 절단된 CASP3의 존재의 강한 증가가 상기 세균 주변 영역에서 관찰되었다(도 8 A II). 최대 강도 z 투영상에서의 자동 상 분석은 YopE1-138-z-BIM 전좌 세균이 대조용 세균보다 훨씬 더 근처의 세균에서 세포자멸을 유도함을 입증한다(도 8B). 이는 z-BIM이 세균 전좌시 제브라피쉬에서 기능성임을 암시한다. 이러한 결과는 추가로 살아있는 동물에서 진핵생물 단백질 전달에 대한 T3SS의 용도를 입증한다.
인단백질체는 단백질 인산화시 전좌된 단백질의 전반적인 영향을 밝힌다
인산화는 생물학적 과정을 활성화시키거나 불활성화시킬 수 있는 광범위한 번역-후 변형이며, 따라서 신호전달 이벤트의 연구에 적합한 표적이다[91,92]. 상기에도 불구하고, 현재 세포자멸에서 인산화의 시스템-수준 분석을 입수할 수 없다. HeLa 세포내로 전달된 인간 tBid의 영향을 분석하기 위해서, 우리는 LC-MS/MS에 의해 무-표지 인단백질체적 접근법을 사용하였다. 3개의 독립적인 실험에서, 세포를 처리되지 않은 채로 두거나, 30분 동안 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-Myc 또는 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-tBid로 감염시켰다. 세포를 용해시킨 다음, 효소 절단, 포스포펩티드 농축 및 개별적인 포스포펩티드의 정량분석 및 확인을 수행하였다. 우리는 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-Myc로 감염된 세포를 ΔHOPEMT asd + YopE1-138-tBid로 감염된 세포와 비교하였으며, 이는 우리로 하여금 363개의 tBid 의존적인 인산화 이벤트을 확인하게 하였다. 286개 포스포펩티드는 인산화에서 증가를 나타낸 반면 77개는 tBid 전달시 덜 인산화되었고, 이는 우리가 tBid 인단백질체로서 정의한 243개의 상이한 단백질에 상응하였다. 상기 STRING 데이터베이스를 사용하여 상기 tBid 인단백질체의 단백질-단백질 상호작용 네트워크를 생성시켰다[93](도 9A). 추가로 미토콘드리아 세포자멸과 관련되는 것으로 공지된 추가적인 27개 단백질을 상기 네트워크에 가하여, 중심 클러스터를 형성시켰다. 흥미롭게, 상기 tBid 인단백질체로부터 단지 몇 개의 단백질만이 상기 중심 클러스터에 연결되며 이는 다수의 단백질이 인산화의 변화를 겪음을 암시하고, 상기 변화는 지금까지 세포자멸 단백질과 직접 관련되지 않았다. 상기 tBid 인단백질체에 의해 포함되는 생물학적 기능을 특성화하기 위해서, 우리는 주석달기, 가시화 및 통합된 발견을 위한 데이터베이스(DAVID, http://david.abcc.ncifcrf.gov/)의 기능적 주석달기 도구를 사용하여 유전자 존재론 분석을 수행하였다[94,95]. 확인된 생물학적 기능들은 다양한 세포 과정이 tBid에 의해 영향을 받음을 나타낸다. 크로마틴 재배열 및 전사의 조절에 관련된 다수의 단백질들이 인산화의 변화를 겪는다(즉 CBX3, CBX5, TRIM28, HDAC1). HDAC1은 예를 들어 전사의 조절에 한 역할을 하는 히스톤 데아세틸라제이다. HDAC1은, 세포자멸에 또한 관여하는 단백질인 NF-kB의 전사 활성을 조절할 수 있다. 우리는 추가로 앞서 세포자멸의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 입증된 RNA 가공에 관련된 단백질의 클러스터를 확인하였다[96]. 예를 들어 HNRPK는 DNA 손상에 대한 p53/TP53 응답을 매개하며 세포자멸의 유도에 필요하다[97]. 더욱 또한, 단백질 번역에 관련된 단백질의 인산화가 또한 영향을 받는다. 다수의 진핵생물 개시 인자(즉 EIF4E2, EIF4B, EIF3A, EIF4G2)는 인산화의 변화를 겪으며, 이는 전체 단백질 합성이 세포자멸 세포에서 감소한다는 관찰과 유사하다. 흥미롭게, 다수의 단백질들의 인산화가 세포골격 재형성에 관련되었다(예를 들어 PXN, MAP1B9는 tBid 전달시 변경된다. 이는 세포의 형태학이 tBid 전달시 대단히 변화한다는 관찰과 일치한다(도 9B). 세포 수축 및 접촉 상실은 우리가 ZO2 및 팍실린과 같은 부착 관련 단백질의 인산화를 관찰한다는 사실에 의해 반영된다. 유사하게, 핵의 수축은 라민A/C 및 라민 B1과 같은 판상 단백질의 인산화에 의해 동반된다. 전체적으로, tBID 전달은 미토콘드리아 완전성의 붕괴에 의해 또한 암시되는 빠른 세포자멸 응답을 유도한다(도 9B). 우리는 tBid 유도된 세포자멸이 다양한 세포 과정에 관여하는 수 백개의 인산화 이벤트들에 영향을 미침을 입증하였다. 다수의 확인된 단백질들이 세포자멸에 관련되었지만, 단지 몇 개만이 세포자멸 유도시 인산화되는 것으로 공지되었다. 따라서 상기 인단백질체적 접근법은 세포자멸에 대한 추가적인 연구에 유용한 자원을 제공한다.
참고 문헌
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Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly 450 455 460 Gly 465 <210> 37 <211> 381 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - EGFP <400> 37 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Met Val 130 135 140 Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu 145 150 155 160 Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly 165 170 175 Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr 180 185 190 Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr 195 200 205 Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His 210 215 220 Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr 225 230 235 240 Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys 245 250 255 Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp 260 265 270 Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr 275 280 285 Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 290 295 300 Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln 305 310 315 320 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 325 330 335 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys 340 345 350 Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr 355 360 365 Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 370 375 380 <210> 38 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - 2xTEVsite - NLS - EGFP <400> 38 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn 130 135 140 Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Pro Pro Lys Lys 145 150 155 160 Lys Arg Lys Val Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val 165 170 175 Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser 180 185 190 Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu 195 200 205 Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu 210 215 220 Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp 225 230 235 240 His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr 245 250 255 Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu 275 280 285 Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys 290 295 300 Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys 305 310 315 320 Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu 325 330 335 Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile 340 345 350 Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln 355 360 365 Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu 370 375 380 Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu 385 390 395 400 Tyr Lys <210> 39 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - 2xTEVsite - EGFP - NLS <400> 39 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn 130 135 140 Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Val Ser Lys Gly 145 150 155 160 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly 165 170 175 Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp 180 185 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400 Lys Val <210> 40 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - 2x TEVsite - INK4C <400> 40 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn 130 135 140 Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Met Ala Glu Pro 145 150 155 160 Trp Gly Asn Glu Leu Ala Ser Ala Ala Ala Arg Gly Asp Leu Glu Gln 165 170 175 Leu Thr Ser Leu Leu Gln Asn Asn Val Asn Val Asn Ala Gln Asn Gly 180 185 190 Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val Met Lys Leu Gly Asn Pro Glu Ile 195 200 205 Ala Arg Arg Leu Leu Leu Arg Gly Ala Asn Pro Asp Leu Lys Asp Arg 210 215 220 Thr Gly Phe Ala Val Ile His Asp Ala Ala Arg Ala Gly Phe Leu Asp 225 230 235 240 Thr Leu Gln Ala Leu Pro Glu Phe Gln Ala Asp Val Asn Ile Glu Asp 245 250 255 Asn Glu Gly Asn Leu Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Glu Gly His Leu 260 265 270 Arg Val Val Glu Phe Leu Val Lys His Thr Ala Ser Asn Val Gly His 275 280 285 Arg Asn His Lys Gly Asp Thr Ala Cys Asp Leu Ala Arg Leu Tyr Gly 290 295 300 Arg Asn Glu Val Val Ser Leu Met Gln Ala Asn Gly Ala Gly Gly Ala 305 310 315 320 Thr Asn Leu Gln <210> 41 <211> 479 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - 2x TEVsite - ET1 <400> 41 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn 130 135 140 Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Met Pro Arg Pro 145 150 155 160 Lys Leu Lys Ser Asp Asp Glu Val Leu Glu Ala Ala Thr Val Val Leu 165 170 175 Lys Arg Cys Gly Pro Ile Glu Phe Thr Leu Ser Gly Val Ala Lys Glu 180 185 190 Val Gly Leu Ser Arg Ala Ala Leu Ile Gln Arg Phe Thr Asn Arg Asp 195 200 205 Thr Leu Leu Val Arg Met Met Glu Arg Gly Val Glu Gln Val Arg His 210 215 220 Tyr Leu Asn Ala Ile Pro Ile Gly Ala Gly Pro Gln Gly Leu Trp Glu 225 230 235 240 Phe Leu Gln Val Leu Val Arg Ser Met Asn Thr Arg Asn Asp Phe Ser 245 250 255 Val Asn Tyr Leu Ile Ser Trp Tyr Glu Leu Gln Val Pro Glu Leu Arg 260 265 270 Thr Leu Ala Ile Gln Arg Asn Arg Ala Val Val Glu Gly Ile Arg Lys 275 280 285 Arg Leu Pro Pro Gly Ala Pro Ala Ala Ala Glu Leu Leu Leu His Ser 290 295 300 Val Ile Ala Gly Ala Thr Met Gln Trp Ala Val Asp Pro Asp Gly Glu 305 310 315 320 Leu Ala Asp His Val Leu Ala Gln Ile Ala Ala Ile Leu Cys Leu Met 325 330 335 Phe Pro Glu His Asp Asp Phe Gln Leu Leu Gln Ala His Ala Ser Ala 340 345 350 Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile Glu Gly 355 360 365 Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro Glu Glu Ala Gly Leu Ala 370 375 380 Ala Pro Arg Leu Ser Phe Leu Pro Ala Gly His Thr Arg Arg Leu Ser 385 390 395 400 Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp 405 410 415 Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp 420 425 430 Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro 435 440 445 His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe 450 455 460 Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly 465 470 475 <210> 42 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - TEV protease S219V <400> 42 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Glu Ser Leu Phe 130 135 140 Lys Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Ser Thr Ile Cys His Leu 145 150 155 160 Thr Asn Glu Ser Asp Gly His Thr Thr Ser Leu Tyr Gly Ile Gly Phe 165 170 175 Gly Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly 180 185 190 Thr Leu Leu Val Gln Ser Leu His Gly Val Phe Lys Val Lys Asn Thr 195 200 205 Thr Thr Leu Gln Gln His Leu Ile Asp Gly Arg Asp Met Ile Ile Ile 210 215 220 Arg Met Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro Gln Lys Leu Lys Phe Arg 225 230 235 240 Glu Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu Val Thr Thr Asn Phe Gln 245 250 255 Thr Lys Ser Met Ser Ser Met Val Ser Asp Thr Ser Cys Thr Phe Pro 260 265 270 Ser Ser Asp Gly Ile Phe Trp Lys His Trp Ile Gln Thr Lys Asp Gly 275 280 285 Gln Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg Asp Gly Phe Ile Val Gly 290 295 300 Ile His Ser Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr Asn Asn Tyr Phe Thr Ser 305 310 315 320 Val Pro Lys Asn Phe Met Glu Leu Leu Thr Asn Gln Glu Ala Gln Gln 325 330 335 Trp Val Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp Ser Val Leu Trp Gly Gly 340 345 350 His Lys Val Phe Met Val Lys Pro Glu Glu Pro Phe Gln Pro Val Lys 355 360 365 Glu Ala Thr Gln Leu Met Asn Arg Arg Arg Arg Arg 370 375 380 <210> 43 <211> 332 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - 2x TEVsite - Flag - INK4C <400> 43 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Glu Asn 130 135 140 Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Asp Tyr Lys Asp 145 150 155 160 Asp Asp Asp Lys Met Ala Glu Pro Trp Gly Asn Glu Leu Ala Ser Ala 165 170 175 Ala Ala Arg Gly Asp Leu Glu Gln Leu Thr Ser Leu Leu Gln Asn Asn 180 185 190 Val Asn Val Asn Ala Gln Asn Gly Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val 195 200 205 Met Lys Leu Gly Asn Pro Glu Ile Ala Arg Arg Leu Leu Leu Arg Gly 210 215 220 Ala Asn Pro Asp Leu Lys Asp Arg Thr Gly Phe Ala Val Ile His Asp 225 230 235 240 Ala Ala Arg Ala Gly Phe Leu Asp Thr Leu Gln Ala Leu Pro Glu Phe 245 250 255 Gln Ala Asp Val Asn Ile Glu Asp Asn Glu Gly Asn Leu Pro Leu His 260 265 270 Leu Ala Ala Lys Glu Gly His Leu Arg Val Val Glu Phe Leu Val Lys 275 280 285 His Thr Ala Ser Asn Val Gly His Arg Asn His Lys Gly Asp Thr Ala 290 295 300 Cys Asp Leu Ala Arg Leu Tyr Gly Arg Asn Glu Val Val Ser Leu Met 305 310 315 320 Gln Ala Asn Gly Ala Gly Gly Ala Thr Asn Leu Gln 325 330 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_285 <400> 44 cataccatgg gagtgagcaa gggcgag 27 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_286 <400> 45 ggaagatctt tacttgtaca gctcgtccat 30 <210> 46 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_287 <400> 46 cggggtacct caactaaatg accgtggtg 29 <210> 47 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_288 <400> 47 gttaaagctt ttcgaatcta gactcgagcg tggcgaactg gtc 43 <210> 48 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_292 <400> 48 cagtctcgag caaattctaa acaaaatact tccac 35 <210> 49 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_293 <400> 49 cagtttcgaa ttaatttgta ttgctttgac gg 32 <210> 50 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_296 <400> 50 cagtctcgag actaacataa cactatccac ccag 34 <210> 51 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_297 <400> 51 gttaaagctt tcaggaggca ttctgaag 28 <210> 52 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_299 <400> 52 cagtctcgag caggccatca agtgtgtg 28 <210> 53 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_300 <400> 53 cagtttcgaa tcattttctc ttcctcttct tca 33 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_301 <400> 54 cagtctcgag gctgccatcc ggaa 24 <210> 55 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_302 <400> 55 cagtttcgaa tcacaagaca aggcaccc 28 <210> 56 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_306 <400> 56 gttaaagctt ggaggcattc tgaagatact tatt 34 <210> 57 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_307 <400> 57 cagtctcgag caaatacaga gcttctatca ctcag 35 <210> 58 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_308 <400> 58 gttaaagctt tcaagatgtg attaatgaag aaatg 35 <210> 59 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_317 <400> 59 cagtttcgaa cccataaaaa agccctgtc 29 <210> 60 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_318 <400> 60 gttaaagctt ctactctatc atcaaacgat aaaatgg 37 <210> 61 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_324 <400> 61 cagtctcgag ttcactcaag aaacgcaaa 29 <210> 62 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_339 <400> 62 cagtttcgaa ttttctcttc ctcttcttca cg 32 <210> 63 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_341 <400> 63 cgtatctaga aaaatgatga aaatggagac tg 32 <210> 64 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_342 <400> 64 gttaaagctt ttagctggag acggtgac 28 <210> 65 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_346 <400> 65 cagtctcgag ttccagatcc cagagtttg 29 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_347 <400> 66 gttaaagctt tcactgggag gggg 24 <210> 67 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_351 <400> 67 cagtctcgag ctcgagttat ctactcatag aaactacttt tgcag 45 <210> 68 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_352 <400> 68 cgcggatcct cagtgtctct gcggcatta 29 <210> 69 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_353 <400> 69 catttattcc tcctagttag tcacagcaac tgctgctcct ttc 43 <210> 70 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_354 <400> 70 gaaaggagca gcagttgctg tgactaacta ggaggaataa atg 43 <210> 71 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_355 <400> 71 cgattcacgg attgctttct cattattccc tccaggtact a 41 <210> 72 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_356 <400> 72 tagtacctgg agggaataat gagaaagcaa tccgtgaatc g 41 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_357 <400> 73 cgtatctaga cggctttaag tgcgacattc 30 <210> 74 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_364 <400> 74 cgtatctaga ctaaagtatg aggagagaaa attgaa 36 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_365 <400> 75 gttaaagctt tcagcttgcc gtcgt 25 <210> 76 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_367 <400> 76 cgtatctaga gacccgttcc tggtgc 26 <210> 77 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_369 <400> 77 cgtatctaga ccccccaaga agaagc 26 <210> 78 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_373 <400> 78 gttaaagctt gctggagacg gtgacc 26 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_386 <400> 79 cgtatctaga tcaggacgct tcggaggtag 30 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_387 <400> 80 cgtatctaga atggactgtg aggtcaacaa 30 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_389 <400> 81 cgtatctaga ggcaaccgca gca 23 <210> 82 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_391 <400> 82 gttaaagctt tcagtccatc ccatttctg 29 <210> 83 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_403 <400> 83 cgtatctaga tctggaatat ccctggaca 29 <210> 84 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_406 <400> 84 gttaaagctt gtctgtctca atgccacagt 30 <210> 85 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_410 <400> 85 cagtctcgag atgtccgggg tggtg 25 <210> 86 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_413 <400> 86 cagtttcgaa tcactgcagc atgatgtc 28 <210> 87 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_417 <400> 87 cagtctcgag agtggtgttg atgatgacat g 31 <210> 88 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_420 <400> 88 cagtttcgaa ttagtgataa aaatagagtt cttttgtgag 40 <210> 89 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_423 <400> 89 cagtctcgag atgcacataa ctaatttggg att 33 <210> 90 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_424 <400> 90 cagtttcgaa ttatacaaat gacgaatacc cttt 34 <210> 91 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_425 <400> 91 gttaaagctt ttacaccttg cgcttcttct tgggcgggct ggagacggtg ac 52 <210> 92 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_428 <400> 92 cgtatctaga atggacttca acaggaactt t 31 <210> 93 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_429 <400> 93 cgtatctaga ggacatagtc caccagcg 28 <210> 94 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_430 <400> 94 gttaaagctt tcagttggat ccgaaaaac 29 <210> 95 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_433 <400> 95 cgtatctaga gaattaaaaa aaacactcat ccca 34 <210> 96 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_434 <400> 96 cgtatctaga ccaaaggcaa aagcaaaaa 29 <210> 97 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_435 <400> 97 gttaaagctt ttagctagcc atggcaagc 29 <210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_436 <400> 98 cgtatctaga atgccccgcc cc 22 <210> 99 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_437 <400> 99 gttaaagctt ctacccaccg tactcgtcaa t 31 <210> 100 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_438 <400> 100 cgtatctaga atgtctgaca cgtccagaga g 31 <210> 101 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_439 <400> 101 gttaaagctt tcatcttctt cgcaggaaaa ag 32 <210> 102 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_445 <400> 102 cgcggatcct tatgggttct cacagcaaaa 30 <210> 103 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_446 <400> 103 catttattcc tcctagttag tcaaggcaac agccaatcaa gag 43 <210> 104 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_447 <400> 104 ctcttgattg gctgttgcct tgactaacta ggaggaataa atg 43 <210> 105 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_448 <400> 105 ttgattgcag tgacatggtg cattattccc tccaggtact a 41 <210> 106 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_449 <400> 106 tagtacctgg agggaataat gcaccatgtc actgcaatca a 41 <210> 107 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_450 <400> 107 cgtatctaga tagccgcaga tgttggtatg 30 <210> 108 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_451 <400> 108 cgtatctaga gatcaagtcc aactggtgg 29 <210> 109 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_463 <400> 109 cagtctcgag gaaagcttgt ttaaggggc 29 <210> 110 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_464 <400> 110 cagtttcgaa ttagcgacgg cgacg 25 <210> 111 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_476 <400> 111 gttaaagctt ttacttgtac agctcgtcca t 31 <210> 112 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_477 <400> 112 cgtatctaga gtgagcaagg gcgag 25 <210> 113 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_478 <400> 113 cagtctcgag atggaagatt ataccaaaat agagaaa 37 <210> 114 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_479 <400> 114 gttaaagctt ctacatcttc ttaatctgat tgtcca 36 <210> 115 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_482 <400> 115 cgtatctaga atggcgctgc agct 24 <210> 116 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_483 <400> 116 gttaaagctt tcagtcattg acaggaattt tg 32 <210> 117 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_486 <400> 117 cgtatctaga atggagccgg cggcg 25 <210> 118 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_487 <400> 118 gttaaagctt tcaatcgggg atgtctg 27 <210> 119 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_492 <400> 119 cgtatctaga atgcgcgagg agaacaaggg 30 <210> 120 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_493 <400> 120 gttaaagctt tcagtcccct gtggctgtgc 30 <210> 121 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_494 <400> 121 cgtatctaga atggccgagc cttg 24 <210> 122 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_495 <400> 122 gttaaagctt ttattgaaga tttgtggctc c 31 <210> 123 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_504 <400> 123 cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtatgccccg 60 cccc 64 <210> 124 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_505 <400> 124 gttaaagctt cccaccgtac tcgtcaattc 30 <210> 125 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_508 <400> 125 cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtatggccga 60 gccttg 66 <210> 126 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_509 <400> 126 gttaaagctt ttgaagattt gtggctccc 29 <210> 127 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_511 <400> 127 cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtgtgagcaa 60 gggcgag 67 <210> 128 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_512 <400> 128 cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtccgccgaa 60 aaaaaaacgt aaagttgtga gcaagggcga g 91 <210> 129 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_513 <400> 129 gttaaagctt ttaaacttta cgtttttttt tcggcggctt gtacagctcg tccat 55 <210> 130 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_515 <400> 130 cgtatctaga gaaaatctgt attttcaaag tgaaaatctg tattttcaaa gtgattataa 60 agatgatgat gataaaatgg ccgagccttg 90 <210> 131 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_558 <400> 131 cgtatctaga atgaccagtt ttgaagatgc 30 <210> 132 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_559 <400> 132 gttaaagctt tcatgactca ttttcatcca t 31 <210> 133 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_561 <400> 133 cgtatctaga atgagtctct taaactgtga gaacag 36 <210> 134 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_562 <400> 134 gttaaagctt ctacaccccc gcatca 26 <210> 135 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - SopE - MycHis <400> 135 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Val Thr Asn Ile 130 135 140 Thr Leu Ser Thr Gln His Tyr Arg Ile His Arg Ser Asp Val Glu Pro 145 150 155 160 Val Lys Glu Lys Thr Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ala Lys Ser Ile Thr 165 170 175 Ala Val Arg Asn Ser Phe Ile Ser Leu Ser Thr Ser Leu Ser Asp Arg 180 185 190 Phe Ser Leu His Gln Gln Thr Asp Ile Pro Thr Thr His Phe His Arg 195 200 205 Gly Asn Ala Ser Glu Gly Arg Ala Val Leu Thr Ser Lys Thr Val Lys 210 215 220 Asp Phe Met Leu Gln Lys Leu Asn Ser Leu Asp Ile Lys Gly Asn Ala 225 230 235 240 Ser Lys Asp Pro Ala Tyr Ala Arg Gln Thr Cys Glu Ala Ile Leu Ser 245 250 255 Ala Val Tyr Ser Asn Asn Lys Asp Gln Cys Cys Lys Leu Leu Ile Ser 260 265 270 Lys Gly Val Ser Ile Thr Pro Phe Leu Lys Glu Ile Gly Glu Ala Ala 275 280 285 Gln Asn Ala Gly Leu Pro Gly Glu Ile Lys Asn Gly Val Phe Thr Pro 290 295 300 Gly Gly Ala Gly Ala Asn Pro Phe Val Val Pro Leu Ile Ala Ser Ala 305 310 315 320 Ser Ile Lys Tyr Pro His Met Phe Ile Asn His Asn Gln Gln Val Ser 325 330 335 Phe Lys Ala Tyr Ala Glu Lys Ile Val Met Lys Glu Val Thr Pro Leu 340 345 350 Phe Asn Lys Gly Thr Met Pro Thr Pro Gln Gln Phe Gln Leu Thr Ile 355 360 365 Glu Asn Ile Ala Asn Lys Tyr Leu Gln Asn Ala Ser Lys Leu Gly Pro 370 375 380 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His 385 390 395 400 His His His His His 405 <210> 136 <211> 435 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - BepG 715-end <400> 136 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Phe Thr Gln Glu 130 135 140 Thr Gln Lys Met Leu Ile Glu Lys Glu Ile Ile Pro Pro Leu Ser Tyr 145 150 155 160 Val Asp Val Ala Ser Lys Ile Arg Glu Ser Glu Val Val Lys Ser Ser 165 170 175 Met Gln Lys Ile Lys Thr Leu Cys Gly Val Val Tyr Gly Asn Pro Asp 180 185 190 Ile Leu Glu Gly Lys Met Pro Lys Met Gly Ile Pro Val Thr Asn Lys 195 200 205 Asn Val Glu Glu Leu Glu Lys Phe Ala Arg Gln Val Gly Asn Phe Pro 210 215 220 Ser Ser Cys Gly Lys Ile Val Gly Phe Ser Phe Leu Gly Ile Lys Ser 225 230 235 240 Glu Ala Arg Ala His Ala Glu Glu Asn Phe Leu Pro Leu Ser His Ala 245 250 255 Ile Phe Ser Tyr Ala His Asn Val Lys Gln Ala Glu Lys Asp Ile Leu 260 265 270 Glu Ala Tyr Phe Lys Glu Gln Glu Arg Cys Ala Gln Ser Val Glu Thr 275 280 285 Pro Ser Glu Glu Ile Thr Asn Leu Leu Ser Phe Thr Gln Glu Gln Gln 290 295 300 Lys Glu Ile Leu Ser Asn Ser Pro Lys Leu Arg Thr Gln Val Lys Ala 305 310 315 320 Tyr Ser Gln Lys Leu His Asn Arg Leu Ser Pro Asn Asp Leu Gln Ala 325 330 335 Ile Ser Glu Arg Ser His Thr Lys Leu Ala Glu Ser Leu Gly Thr Ser 340 345 350 Val Asn Gln Ala Glu Lys Ile Ala Gln Ile Leu Thr Gln Thr Lys Asp 355 360 365 Val Val Gln Ile Leu Gln Gln Gln Glu Lys Leu Gly Leu Tyr Gln Ser 370 375 380 Ile Met Lys Gly Asp Gly Arg Glu Thr Ala Lys Val Asn Met Ser Ala 385 390 395 400 Ile Lys Ala Thr Gln Met Thr Thr Lys Val Thr Ser Leu Lys Ala Val 405 410 415 Glu Gln Ile Val Arg Pro Pro Lys Val Glu Thr Ala Lys Val Val Ser 420 425 430 Met Ser Arg 435 <210> 137 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Rac1 Q61E - MycHis <400> 137 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gln Ala Ile Lys 130 135 140 Cys Val Val Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Lys Thr Cys Leu Leu Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Thr Thr Asn Ala Phe Pro Gly Glu Tyr Ile Pro Thr Val Phe 165 170 175 Asp Asn Tyr Ser Ala Asn Val Met Val Asp Gly Lys Pro Val Asn Leu 180 185 190 Gly Leu Trp Asp Thr Ala Gly Glu Glu Asp Tyr Asp Arg Leu Arg Pro 195 200 205 Leu Ser Tyr Pro Gln Thr Asp Val Phe Leu Ile Cys Phe Ser Leu Val 210 215 220 Ser Pro Ala Ser Phe Glu Asn Val Arg Ala Lys Trp Tyr Pro Glu Val 225 230 235 240 Arg His His Cys Pro Asn Thr Pro Ile Ile Leu Val Gly Thr Lys Leu 245 250 255 Asp Leu Arg Asp Asp Lys Asp Thr Ile Glu Lys Leu Lys Glu Lys Lys 260 265 270 Leu Thr Pro Ile Thr Tyr Pro Gln Gly Leu Ala Met Ala Lys Glu Ile 275 280 285 Gly Ala Val Lys Tyr Leu Glu Cys Ser Ala Leu Thr Gln Arg Gly Leu 290 295 300 Lys Thr Val Phe Asp Glu Ala Ile Arg Ala Val Leu Cys Pro Pro Pro 305 310 315 320 Val Lys Lys Arg Lys Arg Lys Phe Glu Lys Leu Gly Pro Glu Gln Lys 325 330 335 Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His 340 345 350 His His <210> 138 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine BID BH3 part <400> 138 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Ser Arg Phe Glu 130 135 140 Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu 145 150 155 160 Met Asp His <210> 139 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138 - Y. enterocolitica codon optimized murine Bax BH3 part <400> 139 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Lys Lys Leu Ser 130 135 140 Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser 145 150 155 <210> 140 <211> 20 <212> PRT <213> Salmonella enterica <220> <223> SteA1-20 <400> 140 Met Pro Tyr Thr Ser Val Ser Thr Tyr Ala Arg Ala Leu Ser Gly Asn 1 5 10 15 Lys Leu Pro His 20 <210> 141 <211> 210 <212> PRT <213> Salmonella enterica <220> <223> SteA <400> 141 Met Pro Tyr Thr Ser Val Ser Thr Tyr Ala Arg Ala Leu Ser Gly Asn 1 5 10 15 Lys Leu Pro His Val Ala Ala Gly Asp Tyr Glu Asn Lys Leu Ser Thr 20 25 30 Lys Ile Met Lys Gly Ile Leu Tyr Val Leu Thr Ala Gly Leu Ala Tyr 35 40 45 Gly Phe Thr Arg Val Ile Glu His Tyr Cys Asn Val Thr Pro Lys Val 50 55 60 Ala Glu Phe Cys Ala Asn Ala Gly Asn Ile His Asn His Leu Ala Asp 65 70 75 80 Ala Val Arg Asp Gly Leu Phe Thr Ile Asp Val Glu Leu Ser Asp Gly 85 90 95 Arg Met Leu Thr Phe Glu Gln Leu Ser Leu Ile Ala Glu Gly Lys Pro 100 105 110 Ile Val Arg Ile Ser Asp Gly Glu His Thr Val Glu Val Glu Gly Thr 115 120 125 Phe Glu Glu Ile Cys Met Arg Leu Glu Glu Gly Phe Phe Glu Ala Pro 130 135 140 Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ile Asp Glu Lys Tyr Lys Thr Val Arg Glu 145 150 155 160 Arg Met Ala Ala Tyr Asn Ala Leu Pro Gln Ala Leu Gly Ala Ile Pro 165 170 175 Cys Leu Glu Tyr Tyr Ile Ala Arg Ala Ser Asn Met Gln Glu Ala Lys 180 185 190 Ala Gln Trp Ala Ala Asp Ile Lys Ala Arg Tyr His Asn Tyr Leu Asp 195 200 205 Asn Tyr 210 <210> 142 <211> 81 <212> PRT <213> Salmonella enterica <220> <223> SopE1-81 <400> 142 Val Thr Lys Ile Thr Leu Ser Pro Gln Asn Phe Arg Ile Gln Lys Gln 1 5 10 15 Glu Thr Thr Leu Leu Lys Glu Lys Ser Thr Glu Lys Asn Ser Leu Ala 20 25 30 Lys Ser Ile Leu Ala Val Lys Asn His Phe Ile Glu Leu Arg Ser Lys 35 40 45 Leu Ser Glu Arg Phe Ile Ser His Lys Asn Thr Glu Ser Ser Ala Thr 50 55 60 His Phe His Arg Gly Ser Ala Ser Glu Gly Arg Ala Val Leu Thr Asn 65 70 75 80 Lys <210> 143 <211> 105 <212> PRT <213> Salmonella enterica <220> <223> SopE1-105 <400> 143 Val Thr Lys Ile Thr Leu Ser Pro Gln Asn Phe Arg Ile Gln Lys Gln 1 5 10 15 Glu Thr Thr Leu Leu Lys Glu Lys Ser Thr Glu Lys Asn Ser Leu Ala 20 25 30 Lys Ser Ile Leu Ala Val Lys Asn His Phe Ile Glu Leu Arg Ser Lys 35 40 45 Leu Ser Glu Arg Phe Ile Ser His Lys Asn Thr Glu Ser Ser Ala Thr 50 55 60 His Phe His Arg Gly Ser Ala Ser Glu Gly Arg Ala Val Leu Thr Asn 65 70 75 80 Lys Val Val Lys Asp Phe Met Leu Gln Thr Leu Asn Asp Ile Asp Ile 85 90 95 Arg Gly Ser Ala Ser Lys Asp Pro Ala 100 105 <210> 144 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SteA1-20 - S. enterica codon optimized murine t-BID <400> 144 Met Pro Tyr Thr Ser Val Ser Thr Tyr Ala Arg Ala Leu Ser Gly Asn 1 5 10 15 Lys Leu Pro His Gly Thr Gly Ser Gln Ala Ser Arg Ser Phe Asn Gln 20 25 30 Gly Arg Ile Glu Pro Asp Ser Glu Ser Gln Glu Glu Ile Ile His Asn 35 40 45 Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu Met Asp His Asn Ile 50 55 60 Gln Pro Thr Leu Val Arg Gln Leu Ala Ala Gln Phe Met Asn Gly Ser 65 70 75 80 Leu Ser Glu Glu Asp Lys Arg Asn Cys Leu Ala Lys Ala Leu Asp Glu 85 90 95 Val Lys Thr Ala Phe Pro Arg Asp Met Glu Asn Asp Lys Ala Met Leu 100 105 110 Ile Met Thr Met Leu Leu Ala Lys Lys Val Ala Ser His Ala Pro Ser 115 120 125 Leu Leu Arg Asp Val Phe His Thr Thr Val Asn Phe Ile Asn Gln Asn 130 135 140 Leu Phe Ser Tyr Val Arg Asn Leu Val Arg Asn Glu Met Asp 145 150 155 <210> 145 <211> 348 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SteA - S. enterica codon optimized murine t-BID <400> 145 Met Pro Tyr Thr Ser Val Ser Thr Tyr Ala Arg Ala Leu Ser Gly Asn 1 5 10 15 Lys Leu Pro His Val Ala Ala Gly Asp Tyr Glu Asn Lys Leu Ser Thr 20 25 30 Lys Ile Met Lys Gly Ile Leu Tyr Val Leu Thr Ala Gly Leu Ala Tyr 35 40 45 Gly Phe Thr Arg Val Ile Glu His Tyr Cys Asn Val Thr Pro Lys Val 50 55 60 Ala Glu Phe Cys Ala Asn Ala Gly Asn Ile His Asn His Leu Ala Asp 65 70 75 80 Ala Val Arg Asp Gly Leu Phe Thr Ile Asp Val Glu Leu Ser Asp Gly 85 90 95 Arg Met Leu Thr Phe Glu Gln Leu Ser Leu Ile Ala Glu Gly Lys Pro 100 105 110 Ile Val Arg Ile Ser Asp Gly Glu His Thr Val Glu Val Glu Gly Thr 115 120 125 Phe Glu Glu Ile Cys Met Arg Leu Glu Glu Gly Phe Phe Glu Ala Pro 130 135 140 Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ile Asp Glu Lys Tyr Lys Thr Val Arg Glu 145 150 155 160 Arg Met Ala Ala Tyr Asn Ala Leu Pro Gln Ala Leu Gly Ala Ile Pro 165 170 175 Cys Leu Glu Tyr Tyr Ile Ala Arg Ala Ser Asn Met Gln Glu Ala Lys 180 185 190 Ala Gln Trp Ala Ala Asp Ile Lys Ala Arg Tyr His Asn Tyr Leu Asp 195 200 205 Asn Tyr Gly Thr Gly Ser Gln Ala Ser Arg Ser Phe Asn Gln Gly Arg 210 215 220 Ile Glu Pro Asp Ser Glu Ser Gln Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala 225 230 235 240 Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu Met Asp His Asn Ile Gln Pro 245 250 255 Thr Leu Val Arg Gln Leu Ala Ala Gln Phe Met Asn Gly Ser Leu Ser 260 265 270 Glu Glu Asp Lys Arg Asn Cys Leu Ala Lys Ala Leu Asp Glu Val Lys 275 280 285 Thr Ala Phe Pro Arg Asp Met Glu Asn Asp Lys Ala Met Leu Ile Met 290 295 300 Thr Met Leu Leu Ala Lys Lys Val Ala Ser His Ala Pro Ser Leu Leu 305 310 315 320 Arg Asp Val Phe His Thr Thr Val Asn Phe Ile Asn Gln Asn Leu Phe 325 330 335 Ser Tyr Val Arg Asn Leu Val Arg Asn Glu Met Asp 340 345 <210> 146 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SopE1-81 - S. enterica codon optimized murine t-BID <400> 146 Val Thr Lys Ile Thr Leu Ser Pro Gln Asn Phe Arg Ile Gln Lys Gln 1 5 10 15 Glu Thr Thr Leu Leu Lys Glu Lys Ser Thr Glu Lys Asn Ser Leu Ala 20 25 30 Lys Ser Ile Leu Ala Val Lys Asn His Phe Ile Glu Leu Arg Ser Lys 35 40 45 Leu Ser Glu Arg Phe Ile Ser His Lys Asn Thr Glu Ser Ser Ala Thr 50 55 60 His Phe His Arg Gly Ser Ala Ser Glu Gly Arg Ala Val Leu Thr Asn 65 70 75 80 Lys Gly Thr Gly Ser Gln Ala Ser Arg Ser Phe Asn Gln Gly Arg Ile 85 90 95 Glu Pro Asp Ser Glu Ser Gln Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg 100 105 110 His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu Met Asp His Asn Ile Gln Pro Thr 115 120 125 Leu Val Arg Gln Leu Ala Ala Gln Phe Met Asn Gly Ser Leu Ser Glu 130 135 140 Glu Asp Lys Arg Asn Cys Leu Ala Lys Ala Leu Asp Glu Val Lys Thr 145 150 155 160 Ala Phe Pro Arg Asp Met Glu Asn Asp Lys Ala Met Leu Ile Met Thr 165 170 175 Met Leu Leu Ala Lys Lys Val Ala Ser His Ala Pro Ser Leu Leu Arg 180 185 190 Asp Val Phe His Thr Thr Val Asn Phe Ile Asn Gln Asn Leu Phe Ser 195 200 205 Tyr Val Arg Asn Leu Val Arg Asn Glu Met Asp 210 215 <210> 147 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SopE1-105 - S. enterica codon optimized murine t-BID <400> 147 Val Thr Lys Ile Thr Leu Ser Pro Gln Asn Phe Arg Ile Gln Lys Gln 1 5 10 15 Glu Thr Thr Leu Leu Lys Glu Lys Ser Thr Glu Lys Asn Ser Leu Ala 20 25 30 Lys Ser Ile Leu Ala Val Lys Asn His Phe Ile Glu Leu Arg Ser Lys 35 40 45 Leu Ser Glu Arg Phe Ile Ser His Lys Asn Thr Glu Ser Ser Ala Thr 50 55 60 His Phe His Arg Gly Ser Ala Ser Glu Gly Arg Ala Val Leu Thr Asn 65 70 75 80 Lys Val Val Lys Asp Phe Met Leu Gln Thr Leu Asn Asp Ile Asp Ile 85 90 95 Arg Gly Ser Ala Ser Lys Asp Pro Ala Gly Thr Gly Ser Gln Ala Ser 100 105 110 Arg Ser Phe Asn Gln Gly Arg Ile Glu Pro Asp Ser Glu Ser Gln Glu 115 120 125 Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp Glu 130 135 140 Met Asp His Asn Ile Gln Pro Thr Leu Val Arg Gln Leu Ala Ala Gln 145 150 155 160 Phe Met Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Asp Lys Arg Asn Cys Leu Ala 165 170 175 Lys Ala Leu Asp Glu Val Lys Thr Ala Phe Pro Arg Asp Met Glu Asn 180 185 190 Asp Lys Ala Met Leu Ile Met Thr Met Leu Leu Ala Lys Lys Val Ala 195 200 205 Ser His Ala Pro Ser Leu Leu Arg Asp Val Phe His Thr Thr Val Asn 210 215 220 Phe Ile Asn Gln Asn Leu Phe Ser Tyr Val Arg Asn Leu Val Arg Asn 225 230 235 240 Glu Met Asp <210> 148 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_677 <400> 148 ttactattcg aagaaattat tcataatatt gcccgccatc tggcccaaat tggtgatgaa 60 atggatcatt aagcttggag ta 82 <210> 149 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_678 <400> 149 tactccaagc ttaatgatcc atttcatcac caatttgggc cagatggcgg gcaatattat 60 gaataatttc ttcgaatagt aa 82 <210> 150 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_682 <400> 150 ttactactcg agaaaaaact gagcgaatgt ctgcgccgca ttggtgatga actggatagc 60 taagcttgga gta 73 <210> 151 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_683 <400> 151 tactccaagc ttagctatcc agttcatcac caatgcggcg cagacattcg ctcagttttt 60 tctcgagtag taa 73 <210> 152 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_580 <400> 152 catgccatgg atttatggtc atagatatga cctc 34 <210> 153 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_612 <400> 153 cggggtacca tgaggtagct tatttcctga taaag 35 <210> 154 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_613 <400> 154 cggggtacca taattgtcca aatagttatg gtagc 35 <210> 155 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_614 <400> 155 catgccatggc ggcaaggctc ctc 24 <210> 156 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_615 <400> 156 cggggtacct ttatttgtca acactgccc 29 <210> 157 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_616 <400> 157 cggggtacct gcggggtctt tactcg 26 <210> 158 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138-Y. enterocolitica codon optimized Ink4A 84-103 <400> 158 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp 130 135 140 Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg 145 150 155 160 Ala Gly Ala Arg <210> 159 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138-Y. enterocolitica codon optimized p107/RBL1 657-662 (AAA02489.1) <400> 159 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp 130 135 140 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Pro Val Lys Arg 145 150 155 160 Arg Leu Phe Gly <210> 160 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138-Y. enterocolitica codon optimized p21 141-160 (AAH13967.1) <400> 160 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp 130 135 140 Lys Arg Arg Gln Thr Ser Met Thr Ala Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg 145 150 155 160 Leu Ile Phe Ser <210> 161 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138-Y. enterocolitica codon optimized p21 145-160 (AAH13967.1) <400> 161 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp 130 135 140 Thr Ser Met Thr Ala Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu Ile Phe Ser 145 150 155 160 <210> 162 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138-Y. enterocolitica codon optimized p21 17-33 (AAH13967.1) <400> 162 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp 130 135 140 Ala Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln Leu Ser Arg 145 150 155 160 Asp <210> 163 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138-Y. enterocolitica codon optimized cyclin D2 139-147 ( CAA48493.1) <400> 163 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ala Ile Asp 130 135 140 Trp Glu Leu Val Val Leu Gly Lys Leu 145 150 <210> 164 <211> 397 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SteA-Ink4a-MycHis <400> 164 Met Pro Tyr Thr Ser Val Ser Thr Tyr Ala Arg Ala Leu Ser Gly Asn 1 5 10 15 Lys Leu Pro His Val Ala Ala Gly Asp Tyr Glu Asn Lys Leu Ser Thr 20 25 30 Lys Ile Met Lys Gly Ile Leu Tyr Val Leu Thr Ala Gly Leu Ala Tyr 35 40 45 Gly Phe Thr Arg Val Ile Glu His Tyr Cys Asn Val Thr Pro Lys Val 50 55 60 Ala Glu Phe Cys Ala Asn Ala Gly Asn Ile His Asn His Leu Ala Asp 65 70 75 80 Ala Val Arg Asp Gly Leu Phe Thr Ile Asp Val Glu Leu Ser Asp Gly 85 90 95 Arg Met Leu Thr Phe Glu Gln Leu Ser Leu Ile Ala Glu Gly Lys Pro 100 105 110 Ile Val Arg Ile Ser Asp Gly Glu His Thr Val Glu Val Glu Gly Thr 115 120 125 Phe Glu Glu Ile Cys Met Arg Leu Glu Glu Gly Phe Phe Glu Ala Pro 130 135 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ccaaaccagc atgaccgcct tttatcatag 60 caaacgccgc ctgattttta gctaattcga acatg 95 <210> 177 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_750 <400> 177 catgttcgaa ttagctaaaa atcaggcggc gtttgctatg ataaaaggcg gtcatgctgg 60 tttggcggcg tttatcgatg gcaccctcga gcatg 95 <210> 178 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_753 <400> 178 catgctcgag ggtgccatcg ataccagcat gaccgccttt tatcatagca aacgccgcct 60 gatttttagc taattcgaac atg 83 <210> 179 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_754 <400> 179 catgttcgaa ttagctaaaa atcaggcggc gtttgctatg ataaaaggcg gtcatgctgg 60 tatcgatggc accctcgagc atg 83 <210> 180 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_755 <400> 180 catgctcgag ggtgccatcg atgcctgtcg ccgcctgttt ggtccggtgg atagcgaaca 60 actgagccgc gattaattcg aacatg 86 <210> 181 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_756 <400> 181 catgttcgaa ttaatcgcgg ctcagttgtt cgctatccac cggaccaaac aggcggcgac 60 aggcatcgat ggcaccctcg agcatg 86 <210> 182 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_757 <400> 182 catgctcgag ggtgccatcg attgggaact ggtggtgctg ggtaaactgt aattcgaaca 60 tg 62 <210> 183 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_758 <400> 183 catgttcgaa ttacagttta cccagcacca ccagttccca atcgatggca ccctcgagca 60 tg 62 <210> 184 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_703 <400> 184 gacatggaat tcatggagcc ggcggcg 27 <210> 185 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_704 <400> 185 catgaagctt atcggggatg tctgaggg 28 <210> 186 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_705 <400> 186 gacatggaat tcatggccga gccttgggg 29 <210> 187 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_706 <400> 187 gttaacatca gcttgaaact ccagcaaagt ctgtaaagtg tccaggaaac c 51 <210> 188 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_707 <400> 188 ggtttcctgg acactttaca gactttgctg gagtttcaag ctgatgttaa c 51 <210> 189 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_708 <400> 189 catgaagctt ttgaagattt gtggctcccc 30 <210> 190 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_709 <400> 190 gacatggaat tcatggcgct gcagctctcc 30 <210> 191 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_710 <400> 191 catgaagctt gtcattgaca ggaattttgt agg 33 <210> 192 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_711 <400> 192 gacatggaat tcatggaaga ttataccaaa atagagaa 38 <210> 193 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_712 <400> 193 catgaagctt catcttctta atctgattgt ccaa 34 <210> 194 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138-Y. enterocolitica codon optimized murine tBid <400> 194 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Gly Ser Gln Ala 130 135 140 Ser Arg Ser Phe Asn Gln Gly Arg Ile Glu Pro Asp Ser Glu Ser Gln 145 150 155 160 Glu Glu Ile Ile His Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Ile Gly Asp 165 170 175 Glu Met Asp His Asn Ile Gln Pro Thr Leu Val Arg Gln Leu Ala Ala 180 185 190 Gln Phe Met Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Asp Lys Arg Asn Cys Leu 195 200 205 Ala Lys Ala Leu Asp Glu Val Lys Thr Ala Phe Pro Arg Asp Met Glu 210 215 220 Asn Asp Lys Ala Met Leu Ile Met Thr Met Leu Leu Ala Lys Lys Val 225 230 235 240 Ala Ser His Ala Pro Ser Leu Leu Arg Asp Val Phe His Thr Thr Val 245 250 255 Asn Phe Ile Asn Gln Asn Leu Phe Ser Tyr Val Arg Asn Leu Val Arg 260 265 270 Asn Glu Met Asp 275 <210> 195 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138-Ubiquitin <400> 195 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Met Gln Ile Phe 130 135 140 Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser 145 150 155 160 Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile 165 170 175 Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp 180 185 190 Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His 195 200 205 Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Phe Glu Ala Ser Lys Leu Gly Pro 210 215 220 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His 225 230 235 240 His His His His His 245 <210> 196 <211> 419 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YopE1-138-Ubiquitin-Flag-INK4C-MycHis <400> 196 Met Lys Ile Ser Ser Phe Ile Ser Thr Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Gly Ser Ser Ser Val Gly Glu Met Ser Gly Arg Ser Val Ser 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Asp Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Ser Pro Gln Gly Ser Ser Leu Ala Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ser Met Ala His Ser Val Ile Gly Phe Ile Gln Arg Met Phe Ser Glu 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Pro Val Val Thr Pro Ala Leu Thr Pro Ala Gln Met 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Ser Phe Ser Asp Ser Ile Lys Gln Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Leu Pro Lys Tyr Met Gln Gln Leu Ser Ser Leu Asp Ala Glu Thr 115 120 125 Leu Gln Lys Asn His Asp Gln Phe Ala Thr Leu Glu Met Gln Ile Phe 130 135 140 Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser 145 150 155 160 Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile 165 170 175 Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp 180 185 190 Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His 195 200 205 Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Phe Glu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp 210 215 220 Asp Lys Met Ala Glu Pro Trp Gly Asn Glu Leu Ala Ser Ala Ala Ala 225 230 235 240 Arg Gly Asp Leu Glu Gln Leu Thr Ser Leu Leu Gln Asn Asn Val Asn 245 250 255 Val Asn Ala Gln Asn Gly Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val Met Lys 260 265 270 Leu Gly Asn Pro Glu Ile Ala Arg Arg Leu Leu Leu Arg Gly Ala Asn 275 280 285 Pro Asp Leu Lys Asp Arg Thr Gly Phe Ala Val Ile His Asp Ala Ala 290 295 300 Arg Ala Gly Phe Leu Asp Thr Leu Gln Ala Leu Pro Glu Phe Gln Ala 305 310 315 320 Asp Val Asn Ile Glu Asp Asn Glu Gly Asn Leu Pro Leu His Leu Ala 325 330 335 Ala Lys Glu Gly His Leu Arg Val Val Glu Phe Leu Val Lys His Thr 340 345 350 Ala Ser Asn Val Gly His Arg Asn His Lys Gly Asp Thr Ala Cys Asp 355 360 365 Leu Ala Arg Leu Tyr Gly Arg Asn Glu Val Val Ser Leu Met Gln Ala 370 375 380 Asn Gly Ala Gly Gly Ala Thr Asn Leu Gln Lys Leu Gly Pro Glu Gln 385 390 395 400 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His 405 410 415 His His His <210> 197 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_585 <400> 197 cagtctcgag atgcagatct tcgtcaagac 30 <210> 198 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_586 <400> 198 gttaaagctt gctagcttcg aaaccaccac gtagacgtaa gac 43 <210> 199 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. : Si_588 <400> 199 cagtttcgaa gattataaag atgatgatga taaaatggcc gagccttg 48

Claims (34)

  1. 재조합 그람-음성 세균 균주로서, 상기 그람-음성 세균 균주가 5'에서 3' 방향으로
    프로모터;
    상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널을 암호화하는 제1 DNA 서열; 및
    상기 제1 DNA 서열의 3' 단부에 인프레임 융합된 이종 단백질을 암호화하는 제2 DNA 서열
    을 포함하는 벡터로 형질전환되고,
    상기 이종 단백질이 세포주기 조절자, 안키린 반복 단백질, 리포터 단백질, 작은 GTPase, GPCR 관련된 단백질, 나노바디 융합 구조물, 세균성 T3SS 이펙터, 세균성 T4SS 이펙터 및 바이러스성 단백질로 이루어지는 그룹 중에서 선택되며,
    상기 재조합 그람-음성 세균 균주가 InvA 및/또는 YadA에 결함이 있지 않은 예르시니아(Yersinia) 균주이고 제1 DNA 서열에 의해 암호화된 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널이 YopE 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편을 포함하는,
    재조합 그람-음성 세균 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    벡터가 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 제3 DNA 서열을 포함하고, 상기 프로테아제 절단 부위는 아미노산 모티프를 인식하는 프로테아제에 의해 절단되는 아미노산 모티프이며, 상기 제3 DNA 서열이 상기 제1 DNA 서열의 3' 단부와 상기 제2 DNA 서열의 5' 단부 사이에 위치하는, 재조합 그람-음성 세균 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 그람-음성 세균 균주가 예르시니아 균주이고 상기 예르시니아 균주가 야생형이거나 또는 적어도 하나의 T3SS 이펙터 단백질의 생성에 결함이 있고, 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널이 와이. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica) YopE 이펙터 단백질의 N-말단 138개 아미노산을 포함하는, 재조합 그람-음성 세균 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    진핵생물 세포 표면 또는 세포외 기질에 결합하는 부착 단백질을 생성시키는 데 결함이 있는, 재조합 그람-음성 세균 균주.
  5. 벡터로서, 5'에서 3' 방향으로
    프로모터;
    상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널을 암호화하는 제1 DNA 서열; 및
    상기 제1 DNA 서열의 3' 단부에 인프레임 융합된 이종 단백질을 암호화하는 제2 DNA 서열로서, 상기 이종 단백질은 세포주기 조절자, 안키린 반복 단백질, 리포터 단백질, 작은 GTPase, GPCR 관련된 단백질, 나노바디 융합 구조물, 세균성 T3SS 이펙터, 세균성 T4SS 이펙터 및 바이러스성 단백질로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 제2 DNA 서열;
    을 포함하고,
    상기 벡터는 InvA 및/또는 YadA에 결함이 있지 않은 예르시니아 균주인 그람-음성 세균 균주를 형질전환하기 위해 사용되며 제1 DNA 서열에 의해 암호화된 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널이 YopE 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편을 포함하는,
    벡터.
  6. 제5항에 있어서,
    벡터가 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 제3 DNA 서열을 포함하고, 상기 프로테아제 절단 부위는 아미노산 모티프를 인식하는 프로테아제에 의해 절단되는 아미노산 모티프이며, 상기 제3 DNA 서열이 상기 제1 DNA 서열의 3' 단부와 상기 제2 DNA 서열의 5' 단부 사이에 위치하는, 벡터.
  7. 제1항에 있어서,
    제1 DNA 서열에 의해 암호화된 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널이 세균성 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편을 포함하고, 상기 N-말단 단편이 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질의 적어도 처음 10개 N-말단 아미노산을 포함하는, 재조합 그람-음성 세균 균주.
  8. 제5항에 있어서,
    제1 DNA 서열에 의해 암호화된 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널이 세균성 T3SS 이펙터 단백질 또는 그의 N-말단 단편을 포함하고, 상기 N-말단 단편이 상기 세균성 T3SS 이펙터 단백질의 적어도 처음 10개 N-말단 아미노산을 포함하는, 벡터.
  9. i) 제1항의 그람-음성 세균 균주를 배양하는 단계; 및
    ii) 진핵생물 세포를 i)의 그람-음성 세균 균주와 접촉시키는 단계로서, 여기에서 세균성 T3SS 이펙터 단백질로부터의 전달 시그널 및 상기 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질이 상기 그람-음성 세균 균주에 의해 발현되며 상기 진핵생물 세포내로 전좌(translocation)되는 단계
    를 포함하는, 시험관내에서 상기 이종 단백질을 진핵생물 세포내로 전달하는 방법.
  10. 피험자에게 약제로서 또는 백신으로서의 이종 단백질의 전달에 사용하기 위한 제1항의 재조합 그람-음성 세균 균주.
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