JP2014518627A - 運動性細胞の分析及び選別 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2011年5月20日に出願された米国特許出願第61/488,300号の恩典を主張するものである。上記の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された認可番号R01 AI081534、R21 AI087107、及びR21 EB007707;米軍医学研究調達機関協力協定(U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement)に基づく医学及び革新的技術統合センター(Integration of Medicine and Innovative Technology)(CIMIT)の認可(DAMD17−02−2−0006);米国陸軍医学研究司令部(U.S. Army Medical Research & Materiel Command)(USAMRMC)及び遠隔医療応用研究センター(Telemedicine & Advanced Technology Research Center)(TATRC)により付与された認可(W81XWH−10−1−1050)に基づき、政府の支援により達成された。政府は、本発明においてある特定の権利を有し得る。
本発明は、運動性細胞、例えば、哺乳動物の精子細胞などの分析及び選別のためのシステム及び方法に関する。
生殖年齢の530万人のアメリカ人夫婦(9%)が不妊症を患っており、そのうち、男性側の要因は症例の50%を占めている。細胞質内精子注入(ICSI)の有無にかかわらず、体外受精(IVF)は、男性不妊症の問題を克服するために、現代の臨床診療において最も広く使用される生殖補助医療技術となっている。IVF及びICSIの障害の1つは、低精子数(乏精子症(oligozoospermia))及び/又は低精子運動性(精子無力症(oligospermaesthenia))を有し得る精液サンプルから、最も運動性が高く、おそらく最も健康である精子を特定し、単離することである。
本明細書において説明される運動性細胞の選別及び分析システムは、運動性細胞、例えば精子などの集団を、空間制約のあるマイクロ流体チャネル内において、インサイチューでリアルタイムに撮像し、追跡し、選別することができる。当該運動性細胞の選別及び分析システムは、迅速でハイスループットの細胞分析及び選別が可能な、化学薬品不含の無流システムである。運動性細胞の特性、例えば、細胞の数、平均運動性、及び特定の細胞の運動性などを特定することができる。そのような特性の分析は、受胎能に影響を及ぼし得る様々な状態、例えば低精子数(乏精子症)及び低精子運動性(精子無力症)などの診断において重要である。さらに、最も運動性の高い細胞は、ポンプ又は他の周辺機器を必要とせずに、当該選別及び分析システムによって受動的に選別される。主に非常に運動性の高い精子で構成されるサンプルは、例えば、生殖補助医療技術での使用にとって望ましい。
図1を参照すると、運動性細胞の選別及び分析システム100は、運動性細胞、例えば精子などの集団を、空間制約のあるマイクロ流体チャネル内において、インサイチューでかつリアルタイムに撮像し、追跡し、及び/又は選別する。当該運動性細胞の選別及び分析システム100は、迅速でハイスループットの細胞分析及び選別が可能な、化学薬品不含の無流システムである。運動性細胞の特性、例えば、細胞の数、平均運動性、及び特定の細胞の運動性などを特定することができる。そのような特性の分析は、受胎能に影響を及ぼし得る様々な状態、例えば低精子数(乏精子症)及び低精子運動性(精子無力症)などの診断において重要である。さらに、最も運動性の高い細胞は、ポンプ又は他の周辺機器の必要性なしに、当該選別及び分析システムによって受動的に選別される。主に運動性の高い精子で構成されたサンプルは、例えば、生殖補助医療技術での使用にとって望ましい。
図2A及び2Bを参照すると、マイクロ流体チップ102は、1つ又は複数のマイクロ流体チャネル200a、200b、200c、200dを有する。選別及び/又は分析のために、例えば、ピペット204による注入などによって、入口ポート206a、206b、206c、206dに、精子202が導入される。十分なインキュベーション期間の後、下記において説明されるように、選別された精子のサンプルが、出口ポート208a、208b、208c、208dから抜き取られる。
再び図1を参照すると、いくつかの実施形態において、精子の選別及び分析システム100は、マイクロ流体チップ102を含み、その構造は、上記において説明されており、任意により撮像システム106と統合されている。マイクロ流体チップ102と撮像システム106とを統合することにより、1つ又は複数のマイクロ流体チャネル200における精子の集団又は個々の精子を追跡及び分析することが可能となる。いくつかの実施形態において、当該撮像システム106は、マイクロ流体チップ102の1つ又は複数のチャネル200に対して自動での広視野撮像を実施するレンズレス撮像システムである。他の実施形態において、撮像システム104は、例えば10×対物レンズを備える光学顕微鏡である。
生体適合性媒体、例えば、ヒト卵管液(Human Tubal Fluid)(HTF)又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などに懸濁された精子が、例えばピペットなどを使用して、チャネルの入口ポート206からマイクロ流体チップ102のマイクロ流体チャネル200内に導入される。当該チャネルは、既に生体適合性媒体を含み得る。マイクロ流体チップ102は、37℃で、運動性精子がチャネルに沿ってチャネルの出口ポート208へと移動するのに十分な時間、インキュベーションされる。例えば、インキュベーション期間は、約20〜40分間、例えば、約30分間、又は約1若しくは2時間未満、或いは、結果として出口ポートにおいて精子の疲弊をもたらす時間量未満などであり得る。インキュベーション期間後、精子は、例えば、微細な先端を有する抜き取り器具又はピペットを使用することによって、又はチップ入口に媒体をポンプ送流することによって、出口208から抜き取られる。運動性精子のみがチャネルの長さに沿って移動することができるので、出口から抜き取られた精子は運動性精子であり、すなわち、インキュベーション期間は、(例えば、所定の時間内に出口に到達する精子を選択することによって)高い運動性を有する精子のみを得るために最適化することができる。入口付近に残っている精子は、チャネルの全長を移動することができなかった低運動性精子であるか、又はランダムな動きによってのみ移動する非運動性精子である。このようにして、マイクロ流体チップ102は、簡単で、受動的で、無流の精子選別を達成し、並びに高運動性の精子のサンプルを抜き出すことができる。
再び図2を参照すると、精子が入口ポート206からマイクロ流体チャネル200に導入されると、運動性精子は当該マイクロ流体チャネル内を移動する。マイクロ流体チャネル200は、運動性精子をマイクロ流体チャネルの長さに沿って出口ポート208に向かって移動するように仕向ける、空間制約のある環境を精子に提示する。結果として、十分なインキュベーション期間の後、高運動性精子の集団は出口ポート付近に到達するが、低運動性精子又は非運動性精子の集団は入口ポート206付近のそれらが元居た場所か又はその付近に残っている。したがって、マイクロ流体チャネル内での精子の空間制約により、結果として、チャネル内での精子の運動性による受動的選別が生じる。
本発明について、以下の実施例においてさらに説明するが、これは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
精液サンプルは、Jackson Laboratories(バーハーバー、ME)からの7〜12週齢のB6D2F1マウスから採取した。動きが止まるまでマウスをCO2に曝露し、次いで頸椎脱臼によって安楽死させた。胴体の中央部を小さく切開し、皮膚をめくり、鋭的に切開して腹膜を開いて内臓を露出させた。両方の脂肪体を引き下げて、精巣及び精巣上体を露出させた。精巣上体尾及び輸精管部分を摘出して、10mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma、セントルイス、MO)を補ったヒト卵管液(HTF)(Irvine Scientific、サンタアナ、CA)300μLの入った中央ウェル皿に入れた。解剖顕微鏡下において、一対の鉗子で精巣上体を適所に保持し、精巣上体の遠位末端を切開して、精子を流出させた。インスリン針で臓器を固定して、一対の鉗子を一方の端から他方の端へとゆっくりと移動させて、精子を輸精管から押し出した。当該皿をインキュベータ(37℃、5%のCO2)に10分間入れて、全ての精子を精巣上体から泳ぎ出させた。精巣上体、輸精管、及びより大きな壊死組織片を手作業で取り出して破棄した。
運動性に基づいて精子を選別するマイクロ流体チップの能力を実証するために、入口ポート及び出口ポートでの精子の運動性を、光学顕微鏡を使用して得られた連続する画像に基づいて、非選別精子の運動性と比較した。この選別試験では、7mmのチャネル長、4mmのチャネル幅、50μmのチャネル高さ、0.65mmの入口ポート直径、及び2mmの出口ポート直径を有するマイクロ流体チップを使用した。大きな出口ポート直径は、チャネルからの精子の容易な取り出しのために設計した。
精子運動性に対するチャネルの向きの効果を特定するために、水平チャネル方向及び垂直チャネル方向における精子の動きを記録した。チャネルは、7mmの長さ、4mmの幅、及び50μmの高さを有していた。当該チャネルを、10mg/mLのBSAを補った新鮮なHTF媒体で満たした。1μLの精子サンプルを、上記において説明したように、スイムアップカラムの最上部から採取し、ピペットでチャネルの入口ポートに入れた。レンズレスCCDセンサーを使用して、1秒間あたり1フレームの割合で15枚の連続する影像を記録した。CCDセンサーは、チャネル全体を網羅しており、そのため、チャネル内の全ての精子を記録した。Photoshop(Adobe、サンノゼ、CA)を使用して、運動性精子を識別し追跡した。
マイクロ流体チップを使用した精子選別のためのインキュベーション時間を最適化するために、様々なインキュベーション時間に対して、20mm長、4mm幅、及び50μm高のチャネル全体の精子分布を撮像し分析した。
様々な長さのチャネルでの入口ポート及び出口ポートにおける精子の特性を比較することによって、精子選別能力に対するチャネル長の効果を特定した。
様々なチャネル長を使用して選別した後に精子の運動性及び運動性精子の割合を比較することによって、精子選別効率に対するチャネル長の効果を調査した。
15mm長、4mm幅、及び50μm高さのチャネルを有するマイクロ流体チップにより30分のインキュベーション期間において選別された精子の特性を、30分のインキュベーション期間において従来のスイムアップ技術によって選別された精子及び非選別精子のサンプルの特性と比較した。
個々の精子を追跡した後、各精子の平均二乗変位(MSD)を計算した。図12は、MTrackJ Pluginを組み込んだImageJソフトウェアを使用して得たサンプル精子の軌跡を示している(Meijering、Dzyubachyk、Smal. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology、504巻、第9章、2012年2月、183-200ページ)。
〈d2(t)〉=〈(x(t)−x0)2+(y(t)−y0)2〉
によりMSDを得、この場合、x(t)及びy(t)は座標に対応しており、x0及びy0は、各精子の行路の最初の位置である。カッコは、異なる精子の行路の平均を意味する。20のデータセットに対して平均した時間の関数として、結果として得られるMSDを図13に示す。短時間では、個々の精子の動きは、弾道的(およそt2)であり、長時間では拡散的(およそt)である。そのような運動性は、持続的ランダムウォーク(PRW)モデルによって説明される。PRWにおいて、MSDは、
〈d2(t)〉=2S2P[t−P(1−e−t/P)]
によって得られ、この場合、Sは、ランダムウォーク対象の速度を意味し、Pは持続時間に対応する。短時間の極限、t≪Pでは、PRWモデルにおけるMSDは、
〈d2(t)〉≒S2t2
となる。長時間の極限、すなわち、t≫Pでは、MSDは、
〈d2(t)〉≒2S2Pt
によって得られる。
マイクロチャネル中における活動的なマウス精子の動きを、上記において説明したように、持続的ランダムウォーク(PRW)としてモデル化した。当該シミュレーションは、二次元に制限し、これはチャネルの厚さ50μmに相応する。チャネルの寸法は、実験の設定を模倣して、20mm×4mmにした。精子の初期分布を図12に示す。
方向を変えるまで、平均所要時間Pにおいて、速度:
x(t+Δt)=x(t)+Scosθ(t)Δt
y(t+Δt)=y(t)+Ssinθ(t)Δt
である。
本発明をそれらの詳細な説明に関連して説明してきたが、上記の説明は例示を意図するものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されることは理解されるべきである。他の態様、利点、及び変更も、以下の特許請求の範囲内である。
102 マイクロ流体チップ
106 撮像システム
108 光源
110 画像センサー
200 マイクロ流体チャネル
202 精子
204 ピペット
206 入口ポート
208 出口ポート
210 ベース層
212 中間層
214 カバー層
300 精子
302 頭部
Claims (21)
- 運動性細胞の初期集団を、マイクロ流体チャネルの入口ポートに導入するステップであって、該運動性細胞の初期集団が第1の平均運動性を有する、ステップ;
運動性細胞の該集団を該マイクロ流体チャネルにおいてインキュベーションするステップ;及び、
選別された運動性細胞の集団を該マイクロ流体チャネルの出口ポートにおいて収集するステップであって、選別された運動性細胞の該集団が、該第1の平均運動性より高い第2の平均運動性を有する、ステップ
を含む、運動性細胞を選別する方法。 - 前記マイクロ流体チャネルを水平又は垂直に向けるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 運動性細胞の集団をインキュベーションするステップが、流動媒体の非存在下においてインキュベーションするステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 運動性細胞の集団をインキュベーションするステップが、運動性細胞の初期集団の一部がマイクロ流体チャネルに沿って移動することができる十分な時間、例えば、約20〜60分間又は約30分間、該運動性細胞の集団をインキュベーションするステップを含む、請求項1に記載の方法。
- マイクロ流体チャネルの高さが、運動性細胞の寸法の約20倍未満、例えば、運動性細胞の寸法の約3〜10倍である、請求項1に記載の方法。
- 出口ポート付近において、選別された運動性細胞の集団を含む収集可能な運動性細胞の集団の複数の画像、例えば影像を得るステップ;及び
該複数の画像を分析するステップ
を含む第2の平均運動性を特定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 運動性細胞の初期集団を導入するステップが、少なくとも精子約103個/μL、例えば、少なくとも精子約104個/μLの濃度で媒体に精子の初期集団を懸濁させるステップを含み、
媒体中の選別された運動性細胞の集団の濃度が、精子約1.6×103個/μL以下である、請求項1に記載の方法。 - 運動性細胞の初期集団をマイクロ流体チャネルの入口ポートに導入するステップ;
該マイクロ流体チャネルにおいて該運動性細胞の集団をインキュベーションするステップ;
該マイクロ流体チャネル内の該運動性細胞の集団の少なくとも一部の複数の画像を取得するステップ;及び
該複数の画像に基づいて該運動性細胞の集団の少なくとも一部の特性を特定するステップ
を含む、運動性細胞の集団を分析する方法。 - 特定された特性が、運動性、平均経路速度(VAP)、直線速度(VSL)、又は直線性のうちの少なくとも1つを含む、請求項8に記載の方法。
- 特定される特性が、
(1)マイクロ流体チャネルの出口ポート付近に位置している選別された運動性細胞の集団の特性、及び
(2)該マイクロ流体チャネルの長さに沿った該運動性細胞の集団の分布
のうちの少なくとも一方を含む、請求項8に記載の方法。 - 特性を特定するステップが、マイクロ流体チャネルの出口ポート付近に位置している選別された運動性細胞の集団の特性を、
(1)運動性細胞の初期集団の特性、及び
(2)インキュベーション後に入口ポート付近に位置している残留運動性細胞の集団の特性
のどちらか又は両方と比較するステップを含む、請求項8に記載の方法。 - 特定された特性に基づいて、運動性細胞の初期集団の健康を特定するステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 運動性細胞の集団をインキュベーションするステップが、精子の初期集団の一部がマイクロ流体チャネルに沿って移動することができる十分な時間、例えば、約20〜60分間又は約30分間、流動媒体の非存在下でインキュベーションするステップを含む、請求項8に記載の方法。
- マイクロ流体チャネルの高さが、運動性細胞の寸法の約20倍未満、例えば、運動性細胞の寸法の約3〜10倍である、請求項8に記載の方法。
- マイクロ流体チャネルの高さが運動性細胞の寸法の約20倍未満となるように選択されたマイクロチャネルと、
該マイクロ流体チャネルの第1の端部に接続された入口ポートであって、第1の平均運動性を有する運動性細胞の初期集団を受け入れるように構成された入口ポートと、
該マイクロ流体チャネルの第2の端部に接続された出口ポートと
を備え、
該マイクロ流体チャネルが、該マイクロチャネル中において流体の流れを必要とせずに、該第2の端部において、選別された運動性細胞の集団を提供するように構成され、該選別された運動性細胞の集団が、該第1の平均運動性より高い第2の平均運動性を有する、運動性細胞を選別するための装置。 - マイクロ流体チャネルの高さが、運動性細胞の寸法の約3から10倍、例えば、約200μm未満、例えば、約60μm未満、例えば、約3〜20μmとなるように選択される、請求項15に記載の装置。
- マイクロ流体チャネルの長さが、少なくとも部分的に、チャネルでの運動性細胞のインキュベーション時間及び運動性細胞の速度のうちの少なくとも一方に基づいて選択され、例えば、該長さが、約20mm未満、例えば、約12〜15mmである、請求項15に記載の装置。
- マイクロ流体チャネルが、四角形断面、台形断面、三角形断面、円形若しくは楕円形断面、マイクロチャネルの長さに沿って変わる断面、又はリッジを有する断面を有する、請求項15に記載の装置。
- マイクロ流体チャネルが、直線状であるか又は湾曲している、請求項15に記載の装置。
- マイクロ流体チャネルの少なくとも一部の複数の画像をキャプチャするように構成された撮像システムをさらに含み、該撮像システムが、
該マイクロ流体チャネルの少なくとも一部を照らすように構成された光源と、
該マイクロ流体チャネルにおける光が照らされた部分の運動性細胞の画像、例えば影像を検出するように構成された検出器と
を含む、請求項15に記載の装置。 - キャプチャされた画像に基づいて、マイクロ流体チャネルにおける撮像された部分での運動性細胞の特性を特定するように構成された分析モジュールをさらに含む、請求項20に記載の装置。
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