JP2014518074A - 生体分子の単離におけるフィルターモジュール - Google Patents
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Abstract
本発明は、標的分子を細胞溶解物および粒子状物質を含む他の液体混合物から迅速に単離するためのデバイス、前記デバイスを使用して標的分子、特に核酸を単離する方法、ならびに前記デバイスを含む、前記方法を実行するためのキットに関する。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
本発明は、標的分子を細胞溶解物および粒子状物質を含む他の液体混合物から迅速に単離するためのデバイス、前記デバイスを使用して標的分子、特に核酸を単離する方法、ならびに前記デバイスを含む、前記方法を実行するためのキットに関する。
生化学的手順および生物学的手順では、多くの場合、粒子状物質または凝集物質を含む液体混合物または試料から特定の種類の分子を単離し、収集することが望ましい。これは、例えば、混合物を濾過し、その結果、固体物質または凝集物質をフィルター材料上/中に保持することによって実現することができる。フロースルーを所望の分子と選択的に結合する材料と接触させ、その結果、濾過された液体から所望の分子を捕捉することができる。次いで、所望の分子を結合性材料から溶出させ、収集することができる。
例えば、細菌からのプラスミドの精製は、一般には、可溶性のプラスミド物質ならびに不溶性の細胞壊死組織片、タンパク質およびゲノムDNA粒子を含有する細胞溶解物の生成を伴う。
一般には、遠心分離によって、または濾過デバイスによって不溶性の粒子状物質を除去することにより、溶解物を清澄化する。次いで、清澄化された溶解物を、所望のプラスミドDNAと結合する核酸結合性固体材料に移す。任意選択の洗浄ステップの後に、標的DNAを結合性材料から溶出させ、収集する。
細胞溶解物の清澄化およびプラスミドDNAの溶出は広く用いられており、当技術分野において記載されており、多数の異なる実施形態における濾過ステップは、DNA結合性カラムと組み合わせた濾過デバイスによって行う。そのような解は、例えば、特許文献1〜7に記載されている。
1つのカラムに沈殿物を保持するためのフィルターとDNA結合性材料とが含有され、したがって、フィルターを取り出すことができない場合の別の解が記載されている。そのような実施形態は、例えば特許文献8に示されている。
先行技術デバイスのいくつかには、固体、粒子または凝集剤を保持するための2つの異なる種類のフィルター、すなわちプレフィルターおよびデプスフィルターが含有される。プレフィルターは、一般に、例えば、溶解していない細胞、細胞壊死組織片および別の粒子を保持する粗いフィルターであり、一方、デプスフィルターは、より微細な沈殿物または凝集剤を保持する。プレフィルターは、一般に、焼結した多孔質のポリエチレンまたはポリプロピレンのような剛性材料(例えば、特許文献9〜12)、ガラス(特許文献13)、金属網(特許文献14)またはゼオライト(特許文文献15)で作製される。デプスフィルターは、最も一般的には、紙を含めた膜または層の形態の繊維材料から調製され、材料は、セルロース、酢酸セルロースのような多糖、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン(登録商標)(PTFE)、ポリアクリレート、ポリアミドまたはフッ化ポリビニリデン、またはポリフェニルスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリアリールスルホン(polyarylsulfone)もしくはポリフェニルスルホンのようなスルホン基を含むポリマーのようなプラスチックから選択される。
固体、沈殿物および凝集塊を保持するための、記載されている別の材料は、ガラス、金属またはプラスチックのビーズまたは網である。
2つの先行技術文書において、壊死組織片および沈殿物を保持するためのヒドロゲルカラムの使用が考察されている(特許文献16および17)。使用される材料はアガロースであり、これにより、核酸は通過させるが、溶解物の汚染物質の大部分は保持することが可能になる。
細胞溶解物は、せん断力に対して非常に感受性が高い高分子量の生体分子を表すゲノムDNAを含む。先行技術において使用されているフィルター材料の大部分は非常に剛性である。したがって、例として、高速遠心分離の間にゲノムDNAに高い力が適用されると、そのような剛性材料により、ゲノムDNAがせん断される。次いで、ゲノムDNAの断片がフィルターを通過し、DNA結合性マトリックスと結合する可能性があり、その結果、所望のプラスミドDNAのコンタミネーションが生じる。
他方では、アガロースまたは別のヒドロゲルをフィルター材料として使用する場合、材料自体が外力に対して非常に感受性が高い。国際公開第2009/157680(A1)号パンフレットにおいて考察されている通り、フィルターとしてアガロースを含有するカラムは使用する直前に調製しなければならないが、その後、カラムは遠心分離機において1000rpm〜3000rpmの範囲でしか回転させることができない。それよりも低いrpmを使用すると、DNAはアガロースカラムを通り抜けず、それよりも高いrpmを使用すると、アガロースが傷つく。
したがって、せん断力に対して感受性が高い少なくとも1つの種類の分子を含む液体混合物を清澄化し、その後、混合物の所望の分子を選択的に結合させ、結合した物質を収集する方法およびデバイスであって、所望の分子のコンタミネーションが最小限になる方法およびデバイスを開発することが本発明の目的であった。
弾性フィルター材料を含むフィルターモジュールを含む清澄化/結合デバイス、標的を単離する方法における前記デバイスの使用、およびそのようなデバイスを含有する、標的を単離するためのキットがこの目的に適う。
本発明による清澄化/結合デバイスとは、液相と、固体粒子、沈殿物および/または凝集塊とを含む懸濁液を、例えば濾過によって、粒子、沈殿物および/または凝集塊を液相から分離し、かつ/または保持することによって清澄化することができ、さらに、清澄化手段(例えばフィルター)を通過した液相の成分の少なくとも1種の標的分子と結合し、それにより、前記標的を残りの液相から分離することができるデバイスを表す。
好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも1種の標的分子を試料から単離するための、フィルターモジュールおよび標的結合性カラムを含む清澄化/結合デバイスを提供する。清澄化/結合デバイスは、フィルターモジュールが標的結合性材料をさらに含むカラムに含有される単一カラム清澄化/結合デバイスであってよい。フィルターモジュールは、前記カラムから取り出し可能であることが好ましい。別の実施形態では、清澄化/結合デバイスは、フィルターモジュールが結合性カラムに挿入された別のカラムの形態である、二重カラム清澄化/結合デバイスである。フィルター材料を含有するカラムの形態のフィルターモジュールは、溶解物を受け入れるように構成されていることが好ましい。
フィルターモジュールは、フィルターの遮断が本質的に回避される「深層濾過」材料である少なくとも1つのフィルター材料を含む。前記材料は、例えば、手で変形可能である、好ましくは、軟らかく曲げやすいという意味で弾性であることが好ましい。材料は、開放気孔(連続気泡)を有する任意の発泡体(発泡材料)またはスポンジから選択されることが好ましい。そのような材料の例は、発泡したポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン(ポリエステルベースのポリウレタンを含む)、ポリエステル、ポリエーテル、ポリスチレン、メラミン、もしくは連続気泡を有する他のプラスチックポリマー、または海綿動物、動物繊維スポンジもしくは植物繊維スポンジなどの天然のスポンジである。前記材料は、例えば、エアフィルターに関して、例えば、医療機器、包帯用クッション、クリーニング用途、または同様のものに関して当技術分野で公知である。
弾性材料、好ましくは発泡体またはスポンジの孔は、好ましくは、10μm〜1000μmの範囲内、より好ましくは、25〜500μmの範囲内、最も好ましくは50〜200μmの範囲内にあるべきである。発泡体の気泡数は1センチメートル当たり5〜50個であることが好ましく、1cm当たり気泡20〜40個であることが好ましい。
発泡体またはスポンジは、「自己支持型」の発泡体またはスポンジであることが好ましい。これは、発泡体またはスポンジが、圧力によって変形可能であるが、適用された圧力を取り除くと本質的にその元の形状に戻る弾性材料であることを意味する。特に好ましい実施形態では、弾性材料は、ヒトの手指の力で容易に変形し得る弾性の材料である。
この弾性は、同様に、例えばDIN EN ISO3386によって測定される、いわゆる圧縮硬さ(または発泡体の圧縮強さ)によって決定することができる。弾性は、発泡体の標準サイズの小片を所定量(一般に40%)まで圧縮し、その圧縮を得るために必要な力をkPaまたはN/m2単位で測定することによって決定することができる。好ましい材料の圧縮硬さ(40%まで)は、0.5〜50kPaの範囲内であり、1〜30kPaの範囲内であることが好ましく、1〜20kPaであることがより好ましく、2〜10kPaであることが特に好ましい。
使用されるフィルター材料の弾性および曲げやすい特性に起因して、例えばゲノムDNAのようなせん断感受性分子のせん断が減少し、溶出液中のゲノムDNA断片の量は非常に少なく、例えば遠心分離のようなフィルターの使用を伴わない方法に匹敵する。
フィルターモジュールは、第2のフィルターの1つまたは2つの層を、好ましくは弾性フィルターよりも下にさらに含むことが好ましい。好ましくは、第2のフィルターも同様に、高速遠心分離の間にゲノムDNAのような感受性分子をせん断する剛性材料からは調製するべきではない。前記第2のフィルターは、一般に使用されるデプスフィルターを表すことができ、繊維材料から調製されることが好ましい。前記第2のフィルターは、膜または層の形態であってよく、材料は、紙を含めたセルロース、酢酸セルロースのような多糖、ポリエチレン、ポリプロピレン、Teflon(登録商標)(PTFE)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリアクリレート、ポリアミド、具体的にはNylon(登録商標)、フッ化ポリビニリデン、ポリフェニルスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリアリールスルホン(polyarylsulfone)またはポリフェニルスルホンのようなスルホン基を含むポリマーのようなプラスチックまたはDNA非結合性シリカ(not DNA binding silica)から選択することができる。
第2のフィルターの孔は弾性フィルターの孔よりも小さく、0.1〜50μmの範囲内であることが好ましく、0.5〜30μmの範囲内であることが好ましく、1〜10μmの範囲内であることが最も好ましい。本明細書に記載の弾性フィルターおよび第2のフィルターの孔サイズの記載されている範囲が重複していることに関する限りは、第2のフィルターの孔サイズが弾性フィルターの孔サイズよりも小さいことが明白でなければならない。
弾性フィルターの厚さおよび第2のフィルター(複数可)の厚さは本発明を限定するものではないが、弾性フィルターの厚さは、例えば、1mm〜10mmの間、好ましくは2mm〜8mm、より好ましくは3mm〜5mmであることが好ましい。第2のフィルター(複数可)は弾性フィルターよりも小さい物質を保持することが意図されているので、第2のフィルター(複数可)の厚さは弾性フィルターの厚さを下回ることが好ましい。したがって、第2のフィルター(複数可)の厚さは、例えば、それぞれ0.1mm〜1mmまでの範囲であってよい。
フィルター(複数可)により、液相を通過させ、固体/粒子状/凝集物質の本質的に全てを保持することが可能になる。フィルター(複数可)は、フィルターモジュール内に、溶解物がフィルター(複数可)を必ず通過し、迂回することができないように取り付ける。したがって、例えば、フィルターカラムを使用する場合、フィルター(複数可)は、前記カラムの側面壁と接触していなければならない、または、前記側面壁と接触した保持器内に配置しなければならない。例えば、弾性フィルターは、例えば、フィルターをカラムの内径と比較して「大きなサイズにすること」によって、特に、湿った際にカラムの側面壁と接触してカラムの内側に合うようなサイズにすることができる。この場合、フィルターは、カラムの内側を「つかむ」。さらに、フィルターを、前記フィルターの下または上のリングによって定位置に保持することができる。リングをフィルターの上に配置する場合、これには、液体溶解物が弾性フィルターを通るように向けられ、液体溶解物がカラムの壁を流れ落ちることによってフィルターを迂回することが妨げられるという追加的な利点がある。
本発明のフィルターモジュールを提供するために、弾性フィルター、例えば発泡体またはスポンジを、例えば、チューブ、カラム、シリンジまたは同様のもののような入口と出口とを有する容器の内側に配置する。前記容器は、プラスチック、金属、複合材料、ガラス、またはそれらの任意の組み合わせから、任意の他の適切な非反応性材料または生体適合性材料から作製することができる。容器は、遠心分離機により創出される力または中程度の真空圧力に抵抗することができる射出成形可能な材料を使用して製作することができる。所望であれば、第2のフィルターも同様に、前記容器の内側、好ましくは弾性フィルターよりも下に配置する。フィルターの少なくとも1つは、例えば、容器を、低端部が、例えば、網、柵、または交差、車輪または同様のもののような任意の同様の支持構造のような液体浸透性支持構造を示すように設計することによって容器の内側に支持することもでき、面またはフィルターを含めたチャネルが、支持体手段、例えば、保持器、リング、網、柵、または交差、車輪または同様のもののような任意の同様の支持構造、または面を含めたチャネルによって容器の内側に支持することもでき、例えば、にかわ、ゴム、シールまたは同様の接着剤によって容器の壁に接着することもできる。あるいは、支持要素は、結合性カラムの内面の修飾、例えば、内部空洞の内面上に形成された環状隆起などであってよい。好ましい実施形態では、第2のフィルターをカラム内の発泡体またはスポンジの下に配置し、第2のフィルターを支持することができる。そして、第2のフィルター自体は弾性フィルターの支持体として機能し得る。そのように調製したカラムの形態のフィルターモジュールを、中に所望の標的に対する結合性材料を有する別のカラムに挿入して、二重カラムデバイスを得ることができる。
結合性カラムは、フィルターモジュールから濾過された試料を受け入れるように構成されていることが好ましい。結合性カラムは、少なくとも1種の標的分子を結合させるための結合性材料を含む。前記結合性カラムは、弾性フィルターまたはフィルターモジュールを通過した所望の標的、具体的にはプラスミドDNAもしくはRNAのような核酸またはタンパク質を結合させるための任意の当技術分野で公知のカラムで表すことができる。別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使用される命名法は周知であり、当技術分野において一般に使用されている。方向に関する用語、例えば、「上に(up)」および「下に(down)」、「上部(top)」および「底部(bottom)」、「よりも上に(above)」および「よりも下に(below)」または「上部の(upper)」もしくは「下部の(lower)」などは、デバイスを使用している間の部品の方向を指す。用語が単数で提供される場合、その用語の複数も意図されている。
「ミニプレパレーション」または「ミニプレップ」という用語は、本明細書で使用される場合、およそ0.5〜5mlの出発培養体積からの精製の規模を指す。ミニプレップ精製において使用されるカラムおよび他のデバイスも、およそ0.5mlからおよそ5mlまでの範囲内にあってよい。「ミディ/マキシプレパレーション」または「ミディ/マキシプレップ」という用語は、5〜100mlの培養体積で開始される精製の規模を指す。ミディプレップ精製において使用されるカラムおよび他のデバイスは、およそ5mlからおよそ15mlまで、または、およそ5mlからおよそ25mlまでの範囲内にあってよく、マキシプレップ精製において使用されるカラムおよび他のデバイスは、およそ25mlからおよそ100mlまでの範囲内にあってよい。
「カラム(column)」および「カラム(columns)」という用語は、本明細書で使用される場合、入口と出口とを有し、液体を保持することができるデバイスまたは容器を指す。カラムとは、一般に、ほぼ円柱状の形状を有するデバイスおよび容器を指すが、「カラム」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の形状、具体的には、これだけに限定されないが、主に球状、錘体路、長方、不規則な形状およびそれらの組み合わせを含めた円錐形状、または他の形状を有するデバイスまたは容器を指す場合があることが理解される。
「標的生体分子」または「標的分子」という用語は、核酸、タンパク質、脂質、糖脂質、経路の産物または糖を包含してよく、好ましい標的分子は核酸またはタンパク質であり、核酸が特に好ましい。
「タンパク質(protein)」または「タンパク質(proteins)」という用語は、本明細書で使用される場合、全長タンパク質、タンパク質断片、ネイティブな状態にあるタンパク質または変性したタンパク質を包含する。タンパク質の混合物とは、全長タンパク質の混合物、タンパク質断片の混合物、または全長タンパク質とタンパク質断片との混合物であってよい。
「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、分子量または供給源に関係なく、DNAとRNAの両方を包含する。核酸とは、塩基対を形成することができ、他の核酸と連結可能であり、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによって切断可能であることが当技術分野で公知の化学修飾されたヌクレオチドを含めた一本鎖または二本鎖ヌクレオチドのポリマーの全域を包含する。核酸は、任意の天然の供給源から得ることもでき、修飾することができる。DNA分子とは、ウイルス由来のDNA、原核生物由来のDNAおよび真核生物由来のDNA、ならびに合成DNA、およびその変異体、誘導体および類似体を含めた、任意の供給源由来の任意のサイズの任意のDNA分子である。DNAは、ゲノムDNAであっても染色体外DNAであってもよい。RNA分子とは、ウイルス由来のRNA、原核生物由来のRNAおよび真核生物由来のRNA、ならびに、合成RNAおよびその変異体、誘導体および類似体を含めた、任意の供給源由来の任意のサイズの任意のRNA分子である。RNAおよびDNAは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖状であっても環状であってもよく、スーパーコイルであってもよい。好ましい核酸は、「標的核酸」と称される。
本発明によると、「標的核酸」とは、染色体外DNA、例えば、プラスミドおよびそれらの断片、ベクターおよびそれらの断片、ファージミド、コスミド、BAC、PAC、YAC、ミトコンドリア核酸分子、葉緑体核酸分子、またはそれらの組み合わせを包含することが好ましい。特に、あらゆるベクターおよび/またはプラスミドが好ましい。標的核酸は、市販品、または合成されたもの、または工学的に作製されたもの、またはその誘導体であってよい。そのようなベクターおよび/またはプラスミドは、対象の核酸分子をクローニングまたはサブクローニングするために使用すること、またはそれから得ることができ、したがって、本発明に従って挿入断片、核酸断片または遺伝子を含有する組換えベクターを単離することもできる。特に興味深いベクターの一般的なクラスとしては、原核生物の、および/または真核生物のクローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、2ハイブリッドまたは逆2ハイブリッドベクター、異なる宿主において使用するためのシャトルベクター、突然変異誘発ベクター、転写ベクター、短いヘアピンベクター、大きな挿入断片を受け入れるためのベクター(酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)およびP1人工染色体(PAC))などが挙げられる。他の対象のベクターとしては、ウイルス起源ベクター(M13ベクター、細菌ファージベクター、バキュロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター)、コピー数が高いベクター、コピー数が低いベクター、およびコピー数が調整可能なベクター、単一の宿主の組み合わせにおいて使用するための適合性レプリコンを有するベクター(例えば、pACYC184およびpBR322)、ならびに真核生物のエピソーム複製ベクター(例えば、pCDM8)が挙げられる。本発明によって意図されているベクターとしては、挿入されたまたは追加的な核酸断片または配列を含有するベクター(例えば、組換えベクター)、ならびに本明細書に記載のベクターのいずれかの誘導体または変異体が挙げられる。本発明に従って有用な発現ベクターとしては、染色体由来のベクター、エピソーム由来のベクターおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミドまたはバクテリオファージに由来するベクター、およびそれらの組み合わせに由来するベクター、例えば、コスミドおよびファージミドなどが挙げられる。
単離しようとする標的分子の供給源として任意の細胞、組織、または生物体を使用することができ、したがって、細胞、組織、または生物学的供給源(またはその部分)に含有される標的分子が細胞、組織、または生物体から放出される。細胞は、原核であっても真核であってもよい。生物体とは、原核生物であっても、真核生物であっても、ウイルスなどで得あってもよく、一般に、標的分子、例えば、対象の核酸を含有する任意の細胞を指す。「宿主」または「宿主細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。そのような宿主の例については、マニアティス(Maniatis)ら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」 Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.(1982)を参照されたい。好ましい原核生物宿主としては、これだけに限定されないが、Escherichia(例えば、E.coli)、Bacillus、Staphylococcus、Agrobacter(例えば、A.tumefaciens)、Streptomyces、Pseudomonas、Salmonella、Serratia、Caryophanonなどの属の細菌が挙げられる。最も好ましい原核生物宿主はE.coliである。本発明において特に興味深い細菌宿主としては、E.coli株K12、DH10B、DH5アルファ、HB101、JM109、XI1 blue、Top10、Top10FおよびQIAGEN EZが挙げられる。好ましい真核生物宿主としては、これだけに限定されないが、真菌、魚類細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞、特に昆虫細胞、およびヒト細胞、CHO細胞、VERO細胞、Bowesメラノーマ細胞、HepG2細胞などを含めた哺乳動物細胞が挙げられる。細胞は、形質転換された細胞、樹立細胞系、癌細胞、または正常細胞であってよい。例示的な動物細胞は、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ細胞、Spodoptera Sf9、Sf21細胞およびTrichoplusa High−Five細胞など、線形動物細胞、例えば、C.elegans細胞など、および哺乳動物の細胞、例えば、COS細胞、CHO細胞、VERO細胞、293細胞、PERC6細胞、BHK細胞およびヒト細胞などである。任意のウイルスも、本発明による生物学的巨大分子、具体的には核酸分子の細胞性供給源として使用することができる。血液または哺乳動物の器官の組織、例えば、脳、腎臓、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器、循環、リンパ系、胃腸および結合組織性の供給源などに由来するもの、ならびに哺乳動物(ヒトを含めた)の胚または胎児に由来するものも、生物学的巨大分子の供給源として使用するために適している。これらの細胞、組織および器官は正常細胞系、形質転換された細胞系、または樹立細胞系であってもよく、病理学的なもの、例えば、感染症(細菌、真菌もしくは酵母、ウイルス(AIDSを含めた)もしくは寄生生物によって引き起こされる)、遺伝学的もしくは生化学的病状(例えば、嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、統合失調症、筋ジストロフィーもしくは多発性硬化症)、または癌および癌性のプロセスに関与するものなどであってもよい。当業者によく知られている他の細胞、組織、ウイルス、器官および生物体も、本発明による生物学的巨大分子を調製するための生物学的巨大分子の供給源として使用することができる。本発明によると、宿主または宿主細胞は単離しようとする所望の巨大分子の細胞性供給源として機能し得る。
本明細書で使用される場合、「細胞破壊」または「細胞溶解」とは、単離しようとする生物学的巨大分子の供給源として使用する細胞、組織、または生物体の溶解、破裂、または穿孔(poration)に影響を及ぼす組成物または組成物の構成成分を使用して細胞を開き、したがって、細胞、組織、または生物学的供給源(またはその部分)に含有される巨大分子が細胞、組織、または生物体から放出されることを指す。本発明によると、細胞、組織、または生物体を完全に溶解、破裂または穿孔する必要はなく、供給源細胞、組織または生物体に含有される対象の巨大分子の全てがそれらから放出される必要はない。細胞破壊性または細胞溶解化合物または組成物は、細胞、組織、または生物体に含有される対象の生物学的巨大分子の総計の少なくとも25パーセント、50パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、97パーセント、99パーセント、またはそれ以上の放出に影響を及ぼすことが好ましい。
本発明によると、細胞は、細胞の溶解または破壊を引き起こすまたはそれを補助する組成物または化合物と接触させることによって溶解または破壊することができるが、機械的または物理的な力(例えば、圧力、超音波処理、温度(加熱、凍結)、および/または凍結融解など)を本発明に従って用いることができる。さらに、その方法により対象の生物学的巨大分子が実質的に傷つかない限りは、機械な力、物理的な力または溶解組成物/化合物の任意の組み合わせを用いて細胞を破壊/溶解することができる。
使用される細胞破壊性または細胞溶解性の化合物または組成物は本発明を限定するものではない。溶解性組成物中に含まれる構成成分は、単離または精製しようとする所望の標的生体分子に適合させることが好ましい。どの構成成分がどの種類の所望の生体分子に含まれることが好ましいかは当業者に公知であり、また、本発明を限定するものではない。これは、1種または複数種の界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、サルコシル、トリトンX100、ツイーン20、NP−40、N−アルキルグルコシド、N−アルキルマルトシド、グルカミド、ジギトニン、デオキシコール酸、3−[(3−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]−1−プロパン−スルホン酸塩(CHAPS)、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、またはBrij35などを含んでよい。濃度は、任意の適切な濃度、例えば、約0.01パーセント〜10パーセント(w/v)、より好ましくは約0.1パーセント〜5パーセントであってよい。1種または複数種のカオトロピック剤、例えば、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、グアニジンもしくはその塩または尿素などが存在してよい。さらに、1種または複数種の酵素、例えば、リゾチーム、リチカーゼ(lyticase)、ザイモリアーゼ、ノイラミニダーゼ、Novozym234、ストレプトリジン、セルリシン、ムタノリシン(mutanolysin)またはリソスタフィンなどが存在してよい。1種または複数種の無機塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化リチウム、または塩化プラセオジムなどが、例えば、約1mM〜5Mの濃度で存在してよい。1種または複数種の有機溶媒、例えば、トルエン、フェノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、イソアミルアルコール、エタノール、エーテル(例えば、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、もしくはエチルメチルエーテル)、またはクロロホルムなどが、本発明に従って使用されるフィルターのいずれに対しても負の影響を有さない限りは存在してよい。生物学的巨大分子の細胞性供給源の膜および/または細胞壁の完全性を破壊する(すなわち、溶解させるまたは内部に孔の形成を引き起こす)任意の他の化合物(例えば、ポリミキシンB)、または前述のもののいずれかの組み合わせが存在してよい。組成物は、他の構成成分、例えば、キレート化剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(Na EDTA)、EGTA、CDTA)、1種または複数種のプロテアーゼ(プロテイナーゼK、プロナーゼ、ペプシン、トリプシン、パパイン、スブチリシン)または前述のものの任意の組み合わせなども含んでよい。所望の濃度および溶解/破壊組成物の活性成分の組み合わせは本発明を限定するものではなく、当業者が常套的な実験を用いて容易に決定することができる。
「清澄化」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、細胞の壊死組織片および/または大きな不溶性の分子のような望ましくない固体物質、沈殿物質または凝集物質を、液体混合物、例えば細胞溶解物から除去するプロセスを指す。細胞溶解物を清澄化する一般的な方法としては遠心分離および濾過が挙げられる。望ましくない壊死組織片は、本質的にフィルターモジュールに保持され、それにより、本質的に清澄化された溶解物が結合性材料を含有する結合性カラムを通過することが可能になることが好ましい。
「溶出」という用語は、本明細書で使用される場合、結合性マトリックスと結合した所望の標的分子を溶媒によって放出させることを指す。「溶離液」、「溶出緩衝液」、および「溶出溶液」という用語は、分子を物質から放出させるために使用する溶媒を指す。「溶出液」という用語は、溶出の結果生じた、所望の分子を含有する溶液を指す。
「溶出液」は、「単離された」とみなすことができる核酸を含有してよい。本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は(「単離された生物学的巨大分子」の場合と同様に)、単離された物質、構成成分、または組成物の一部ではない他の物質、汚染物質などから少なくとも部分的に離して精製された単離された物質、構成成分、または組成物を意味する。例えば、「単離された生物学的巨大分子」とは、細胞、組織、器官または生物体と関連する可能性がある他の巨大分子および細胞構成成分の少なくとも一部が除去されるように処理された巨大分子である。特に、「単離された生物学的巨大分子」、「単離された核酸分子」、または「単離されたプラスミド」という句は、対象の生物学的巨大分子の約10パーセント、20パーセント、30パーセント、40パーセント、50パーセント、55パーセント、60パーセント、65パーセント、70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、および93パーセント、好ましくは95パーセント超、97.5パーセント、および98パーセント、最も好ましくは99パーセント超、99.5パーセント、および99.9パーセント(重量百分率)を含有する巨大分子調製物またはプラスミド調製物を指す。しかし、当業者には理解される通り、単離された巨大分子を含む溶液は、別の成分、例えば、1種または複数種の緩衝塩および/または溶媒、例えば、水または有機溶媒などを含んでよく、それでも、巨大分子を、その出発物質に関して「単離された」巨大分子とみなすことができる。
本発明のデバイス、方法およびキットによって単離される核酸分子は、例えば、増幅、クローニング、配列決定、標識付け、トランスフェクション、形質転換、in vitro転写、in vitro翻訳、核酸合成、エンドヌクレアーゼ消化、他の酵素による修飾など、当業者に常套的に用いられている方法によってさらに特徴付けることまたは操作することができる。
本発明により、せん断感受性巨大分子を含む液体混合物または試料を清澄化または濾過し、その後、清澄化または濾過された液体または試料から所望の分子を結合性材料に結合させるために適したデバイスおよび方法が提供される。所望の分子の単離は、その後に結合性材料から所望の分子を溶出させることをさらに含んでよい。好ましい実施形態では、本発明は、濾過モジュール(filtering module)を、少なくとも部分的に結合性カラムに挿入された清澄化/濾過カラムの形態で含む二重デバイスであって、清澄化カラムには液体混合物から固体物質、沈殿物質または凝集物質が保持され、結合性カラムには、濾過された液体から所望の標的分子または分子が結合する二重デバイスを提供する。所望であれば、次いで、結合した標的分子を結合性材料から溶出させることができる。
本発明の別の実施形態では、フィルターモジュールは同じカラム内に結合性材料として挿入されている。そのような実施形態では、フィルターモジュールはカラムではないが、例えば、結合性カラムの内側の意図された位置に配置することができる、弾性フィルター、および場合によって上記の第2のフィルターを含むディスクである。そのような場合では、結合性カラムを、フィルターモジュールがその意図された位置に上記の手段によって保持されるように設計することが好ましい。本発明によると、試料がフィルターを通過した後に、フィルターモジュールを取り出すことが好ましい。したがって、フィルターモジュールは、結合性カラムから取り出すことが可能であることが好ましい。
清澄化/結合デバイスは、試料を清澄化するため、およびその後に少なくとも1種の標的分子を試料から単離するために使用することができ、その場合、せん断感受性分子の断片のコンタミネーションは最小限である。試料は液体試料であっても、液体に懸濁させた乾燥試料であってもよい。例えば、本明細書に記載のデバイスにより、細胞溶解物試料を清澄化し、清澄化された溶解物から核酸分子を単離することができる。試料、例えば、溶解物を濾過し、標的分子(複数可)を結合性材料によって捕捉した後、内部のフィルターモジュールを(望ましくない壊死組織片と一緒に)取り出し、廃棄することができる。次いで、場合によって、結合性材料に結合した核酸または他の標的分子(複数可)を洗浄し、溶出させることができる。
上記の二重カラムの実施形態では、フィルターモジュールが清澄化/濾過カラムに対応する。内部の清澄化/濾過カラムと結合性カラムはどちらも、プラスチック、金属、複合材料、ガラス、またはそれらの任意の組み合わせから、デバイスと一緒に使用される遠心分離機により創出される力に抵抗することができる任意の他の適切な非反応性材料または生体適合性材料から作製することができる。
フィルターモジュールが、結合性カラム内に挿入することができるカラムの形態である好ましい実施形態では、フィルターモジュール/清澄化カラムの入口または上部の開放端は結合性カラムの入口または上部の開放端と同じ方向に向き付けられており、フィルターモジュール/清澄化カラムの出口は結合性カラムの出口と同じ方向に向き付けられている。フィルターモジュール/清澄化カラムを内部空洞の全体に伸長させて、フィルターモジュール/清澄化カラムの出口が結合性カラム内の結合性材料と近接するようにすることができる。あるいは、フィルターモジュール/清澄化カラムを内部空洞の一部にのみ伸長させて、フィルターモジュール/清澄化カラムの出口と結合性材料との間に間隙が存在するようにすることができる。
フィルターモジュールは、フィルターモジュールを、結合性カラムに挿入された際に、遠心分離の間でさえも、その意図された位置に保持するための任意の手段を含むことが好ましい。前記手段は、例えば、リング、クランク、ショルダーまたは同様のものであってよく、フィルターモジュールの周辺長を結合性カラムの周辺長よりも大きくし、その結果、フィルターモジュールを結合性カラムに深く挿入することができないようにするものであるか、フィルターモジュールが配置される結合性カラムの内側のクランクまたはショルダーに対応するものであることが好ましい。
両方のカラムがショルダーを有する二重カラムデバイスの例が図1に示されている(外側のカラムの結合性材料は示されていない)。前記図では、結合性カラム(結合性材料は示されていない)が(1)と示されており、結合性カラム内に挿入されたフィルターモジュールが(2)と示されている。弾性フィルター(3)は第2のフィルター(4)よりも上に配置されている。
さらに、フィルターモジュール、例えば、清澄化カラムの形態のフィルターモジュールを、結合性カラム(カラムを定位置に保持するための任意の手段を伴わない)に挿入することができるが、濾過ステップの後に取り出すことができるように設計することができる。
所望であれば、結合性カラムの内径を、清澄化カラムのサイズに適応するサイズにし、したがって、清澄化カラムの外面の少なくとも一部が結合性カラムの内面の一部と接触し、清澄化カラムと結合性カラムとの間に密接な嵌め合いをもたらすことができる。そのような密接な嵌め合いは、表面を互いに接触させた後の摩擦によって実現することができる2つの表面間の接合であってよい。密接な嵌め合いは、清澄化カラムおよび結合性カラムを、どちらか(または両方)のサイズが名目上の寸法からわずかに外れるように構成することによって、または、両方のカラムの円錐形状によって実現することもできる。さらに、密接な嵌め合いは、清澄化カラムを定位置に保持する機能を果たすカラムのクランクまたはショルダーを、ショルダーまたはクランク同士が互いに密接に接触するように構成することによって得ることができる。清澄化カラムと結合性カラムとの間の嵌め合いは、結合性カラムの出口に適用される陰圧により二重カラム系内に真空が創出されるように十分に気密であってよい。一般に、結合性カラム内に位置づける場合、清澄化カラムは、清澄化カラムの外面の少なくとも一部が結合性カラムの内面の少なくとも一部と接触し、陰圧を適用した際に結合性カラムとの真空シールが形成されるような寸法のものになる。外側のカラムと清澄化カラムとの間の嵌め合いは、陰圧が適用されていない時に清澄化カラムを結合性カラムから取り出す妨げにはならない。
結合性カラムは、所望の標的を結合させるための結合性材料を含む。結合性材料は、これだけに限定されないが、繊維、マトリックス、樹脂、膜、ディスクまたはフィルター、もしくは任意の他の適切な材料またはその組み合わせを含めた標的分子を捕捉するための任意の適切な材料であってよい。結合性材料は、これだけに限定されないが、核酸を含めた少なくとも1つの種類の標的分子を捕捉することができる。好ましい実施形態では、結合性材料はDNA結合性材料またはRNA結合性材料、具体的には、プラスミドDNAと結合することができる材料である。適切なDNA結合性材料としては、シリカDNA結合性材料および非シリカDNA結合性材料またはそれらの組み合わせが挙げられる。DNA結合性材料は、さらに、これだけに限定されないが、シリカゲル、酸化アルミニウム、二酸化チタン、多孔質ガラス、ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含めた任意の適切なクロマトグラフィー材料であってよい。さらに、結合性材料は、ガラス線維もしくはニトロセルロースを含めた電荷転換膜(charge switch menbrane)、または、誘導体化ガラス線維を含めた陰イオン交換マトリックスであってよい。結合性材料は、さらに、前記材料のいくつかの種類、例えば、異なる層での組み合わせであってよい。結合性材料は、結合性カラムの内側の出口またはその付近に位置してよい。結合性材料は、結合性カラムを通過し、出口の開口部を通って出てくる試料が結合性材料を必ず通過するように、任意の適切な場所に位置づけることができる。
結合性材料は、デバイスを通る流体または清澄化された試料の適切な流れをもたらすと同時に、分子が結合することができる高表面積をもたらし、それにより、少なくとも1種の標的分子の好収率をもたらすために、適切なサイズの孔を含むことが好ましい。孔サイズは、少なくとも1種の標的分子の結合を可能にするための任意の適切なサイズ、例えば、およそ0.5μm〜およそ5μmの間の範囲内であってよい。
結合性カラムは、結合性材料の支持要素の1つまたは複数を含んでもよく、または、それは、容器の壁に、例えば、にかわ、ゴム、シールまたは同様の接着剤によって接着されていてもよい。支持要素により、結合性材料の位置をカラムの内側に維持することができる。支持要素(複数可)は、結合性材料の移動を物理的に制限する任意の構造のものであってよい。適切な支持要素としては、これだけに限定されないが、保持器、リング、網またはフリットが挙げられる。あるいは、支持要素は、結合性カラムの内面の修飾、例えば、内部空洞の内面に形成された環状隆起などであってよい。
本発明は、少なくとも1種の標的分子と、固体粒子、沈殿物および/または凝集塊とを含み、せん断感受性分子をさらに含んでよい懸濁液を清澄化する方法であって、前記固体粒子、沈殿物および/または凝集塊を標的分子から分離し、標的分子は溶液中に残すための上で定義されたフィルターモジュールを伴う濾過ステップを含む方法をさらに提供する。具体的には、前記方法は、高分子量の分子のようなせん断感受性分子をさらに含んでよいそのような懸濁液から所望の標的分子を単離し、かつ/または精製するために適しており、上記のフィルターモジュールを伴う濾過ステップを含む。得られたフロースルーは、固体、沈殿物および凝集塊のような粒子状物質を本質的に含まない溶液中に所望の標的分子を含有する。さらに、得られた溶液は、せん断感受性巨大分子の断片またはその断片を本質的に含まないことが好ましい。フロースルーを標的結合性材料と接触させて、前記フロースルーから標的を単離/分離することができる。
本発明による好ましい方法では、核酸は、単離または精製された、好ましくはDNA、最も好ましくはプラスミドDNAである。
核酸の単離および/または精製は、核酸を、好ましくは結合性カラム内の核酸結合性材料に結合させるステップを含むことが好ましい。
特定の好ましい実施形態では、本発明は、核酸を単離し、かつ/または精製する方法であって、
(i)核酸を含む試料を、上記の弾性材料で作製されたフィルターを少なくとも1つ含むフィルターモジュールと接触させるステップと、
(ii)試料に外力を適用して、試料を、前記フィルターモジュールを通過させるステップと、
を含む方法を提供する。
(i)核酸を含む試料を、上記の弾性材料で作製されたフィルターを少なくとも1つ含むフィルターモジュールと接触させるステップと、
(ii)試料に外力を適用して、試料を、前記フィルターモジュールを通過させるステップと、
を含む方法を提供する。
前記方法は、
(iii)ステップ(ii)のフロースルーを核酸結合性材料と接触させるステップと、
(iv)場合によって、結合した核酸を洗浄するステップと、
(v)結合性材料から核酸を溶出させるステップと
をさらに含むことが好ましい。
(iii)ステップ(ii)のフロースルーを核酸結合性材料と接触させるステップと、
(iv)場合によって、結合した核酸を洗浄するステップと、
(v)結合性材料から核酸を溶出させるステップと
をさらに含むことが好ましい。
試料は、細胞溶解物、特に、ゲノムDNAおよび標的生体分子を含む細胞溶解物であることが好ましい。好ましい標的生体分子は、標的核酸またはタンパク質、特にプラスミドDNAである。
所望の分子を含有する試料を、フィルターモジュールを含むカラムに加えることができる。フィルターモジュールが、上記の清澄化カラムの形態である場合、試料は、清澄化カラムの開放端を通じて清澄化カラム内に適用する。
遠心力または陰圧(真空)を適用することにより、試料がフィルターモジュール/清澄化カラムを通過することが好ましい。
フロースルーは結合性カラムに入ることが好ましい。試料が清澄化カラムを通過するにつれ、大きな不溶性の分子は、備えられたフィルター(複数可)により、清澄化カラムの出口を通過することを妨げられ得る。弾性フィルター、好ましくは発泡体またはスポンジは弾性であるので、例えば、ゲノムDNAのようなせん断感受性分子は、試料に高スピードの遠心分離を適用した場合でさえも本質的にせん断されない。したがって、せん断感受性分子の断片の量は最小限になる。
濾過された試料は、結合性カラムに設置された結合性材料と接触することが好ましい。結合性材料により所望の1つまたは複数の分子を結合させることができ、一方では、遠心力または真空により、残りの液体が結合性カラムの出口を通じてデバイスから出てくる。次いで、フィルターモジュール/清澄化カラムを取り出すことができる。場合によって、1つまたは複数の洗浄溶液を加え、遠心分離または真空によって結合性材料を通過させ、デバイスの外に出すことができる。洗浄により、結合していない分子、不純物、または他の壊死組織片が結合性材料から除去されることによって、所望の分子の精製が強まる。次いで、溶離液を結合性カラムに加えて、所望の分子を結合性材料から溶出させる。溶出液を収集することが好ましい。多数の溶離液の一定分量を使用することができる。
該方法の好ましい実施形態では、懸濁液または液体混合物は、細胞溶解物であり、フィルターモジュールは清澄化カラムの形態で作動する。清澄化された溶解物を、対象の核酸、好ましくはプラスミドDNAと結合する結合性材料を通過させる。次いで、清澄化カラムを取り出し、結合したプラスミドDNAを溶出させ、収集することができる。本発明の二重カラムデバイスにより、単一の短い(1〜3分)遠心分離または真空ステップで清澄化し、結合させることが可能になる。
特定の好ましい実施形態では、本発明は、プラスミドDNAを単離し、かつ/または精製する方法であって、
(i)ゲノムDNAおよびプラスミドDNAを含む細胞溶解物を、自己支持型の発泡体またはスポンジで作製されたフィルターを少なくとも1つ含むフィルターモジュールと接触させるステップと、
(ii)試料に外力を適用して、試料を、前記フィルターモジュールを通過させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のフロースルーをDNA結合性材料と接触させるステップと、
(iv)場合によって、結合したDNAを洗浄するステップと、
(v)DNAを結合性材料から溶出させるステップと
を含む方法を提供する。
(i)ゲノムDNAおよびプラスミドDNAを含む細胞溶解物を、自己支持型の発泡体またはスポンジで作製されたフィルターを少なくとも1つ含むフィルターモジュールと接触させるステップと、
(ii)試料に外力を適用して、試料を、前記フィルターモジュールを通過させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のフロースルーをDNA結合性材料と接触させるステップと、
(iv)場合によって、結合したDNAを洗浄するステップと、
(v)DNAを結合性材料から溶出させるステップと
を含む方法を提供する。
本明細書では、さらに、対象の標的分子を試料から単離するためのキットが提供される。対象の標的分子を単離するためのキットは、少なくとも本明細書に記載のフィルターモジュールを含む。
キットは、試料から少なくとも1種の標的分子を単離するための清澄化/結合デバイスであって、試料を受け入れるように構成されたフィルターモジュール/清澄化カラムと、少なくとも1つの非標的分子を試料から濾過するように構成された、上記の弾性フィルター材料、好ましくは自己支持型の発泡体またはスポンジで作製されたフィルターを少なくとも1つ含む清澄化カラムと、フィルターモジュール/清澄化カラムから濾過された試料を受け入れるように構成された結合性カラムであって、少なくとも1種の標的分子を結合させるための結合性材料を含む結合性カラムとを含む清澄化/結合デバイスを含むことが好ましい。
代替の好ましい実施形態では、キットは、上記の弾性材料、好ましくは発泡体またはスポンジで作製されたフィルターを少なくとも1つ含むフィルターモジュールを含むカラムと、結合性材料とを含み、フィルターモジュールはカラムから取り出し可能であることが好ましい。
キットは、少なくとも1種の溶解緩衝液、少なくとも1種のRNA分解酵素原液、少なくとも1種の再懸濁緩衝液、少なくとも1種の中和緩衝液、少なくとも1種の洗浄緩衝液、少なくとも1種の溶出緩衝液、標的の単離/精製方法を実行するための説明書から選択される少なくとも1つの別の成分をさらに含んでよい。
実施例1
以下のプロトコールに従って、プラスミドDNAを細菌細胞から単離した。細胞を細菌細胞培養物から、遠心分離により、細胞をペレットにすることによって1.5mlのエッペンドルフカップ中に回収した。使用した緩衝液、溶液およびDNA結合性カラムは、プラスミドDNAを単離するために設計された市販のQIAprep Kit(Qiagen;Hilden、Germany)からのものであった。
遠心分離プロトコール
以下のプロトコールに従って、プラスミドDNAを細菌細胞から単離した。細胞を細菌細胞培養物から、遠心分離により、細胞をペレットにすることによって1.5mlのエッペンドルフカップ中に回収した。使用した緩衝液、溶液およびDNA結合性カラムは、プラスミドDNAを単離するために設計された市販のQIAprep Kit(Qiagen;Hilden、Germany)からのものであった。
遠心分離プロトコール
遠心分離ステップは全て13,000rpmで行う。
1.ペレットにした細菌細胞を250μlの緩衝液P1に再懸濁させ、微量遠心チューブに移した。
2.250μlの緩衝液P2を加え、チューブを4〜6回反転させることによって徹底的に混合した。
3.350μlの緩衝液N3を加え、すぐにチューブを4〜6回反転させることによって徹底的に混合した。
4.ステップ4からの沈殿物を含む全試料体積を、QIAprepスピンカラム(Spin Column)に挿入されたカラムの形態のフィルターモジュールに、デカンティングまたはピペッティングによって適用した。フィルターモジュールはポリウレタン発泡体および非結合性シリカ膜(すなわち核酸と結合しないシリカ膜)で構成された。
5.全集合体を1分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。
6.フィルターモジュールをQIAprepスピンカラムから取り出し、廃棄した。
7.QIAprepスピンカラムを、0.5mlの緩衝液PBを加え、30〜60秒遠心分離することによって洗浄した。フロースルーを廃棄した。
8.QIAprepスピンカラムを、0.75mlの緩衝液PEを加え、30〜60秒遠心分離することによって洗浄した。
9.フロースルーを廃棄し、カラムをさらに1分間遠心分離して、残りの洗浄緩衝液を除去した。
10.QIAprepカラムを清潔な1.5mlの微量遠心チューブに入れた。DNAを溶出するために、50μlの緩衝液EB(10mMのトリスCl、pH8.5)を各QIAprepスピンカラムの中央に加え、1分間静置し、1分間遠心分離した。溶出液を収集した。
1.ペレットにした細菌細胞を250μlの緩衝液P1に再懸濁させ、微量遠心チューブに移した。
2.250μlの緩衝液P2を加え、チューブを4〜6回反転させることによって徹底的に混合した。
3.350μlの緩衝液N3を加え、すぐにチューブを4〜6回反転させることによって徹底的に混合した。
4.ステップ4からの沈殿物を含む全試料体積を、QIAprepスピンカラム(Spin Column)に挿入されたカラムの形態のフィルターモジュールに、デカンティングまたはピペッティングによって適用した。フィルターモジュールはポリウレタン発泡体および非結合性シリカ膜(すなわち核酸と結合しないシリカ膜)で構成された。
5.全集合体を1分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。
6.フィルターモジュールをQIAprepスピンカラムから取り出し、廃棄した。
7.QIAprepスピンカラムを、0.5mlの緩衝液PBを加え、30〜60秒遠心分離することによって洗浄した。フロースルーを廃棄した。
8.QIAprepスピンカラムを、0.75mlの緩衝液PEを加え、30〜60秒遠心分離することによって洗浄した。
9.フロースルーを廃棄し、カラムをさらに1分間遠心分離して、残りの洗浄緩衝液を除去した。
10.QIAprepカラムを清潔な1.5mlの微量遠心チューブに入れた。DNAを溶出するために、50μlの緩衝液EB(10mMのトリスCl、pH8.5)を各QIAprepスピンカラムの中央に加え、1分間静置し、1分間遠心分離した。溶出液を収集した。
真空プロトコール
1.真空多岐管およびQIAprepスピンカラムを、QIAprep Miniprepハンドブックの詳細に従って調製した。
2.ペレットにした細菌細胞を250μlの緩衝液P1に再懸濁させ、微量遠心チューブに移した。
3.250μlの緩衝液P2を加え、チューブを4〜6回反転させることによって徹底的に混合した。
4.350μlの緩衝液N3を加え、すぐにチューブを4〜6回反転させることによって徹底的に混合した。
5.ステップ4からの沈殿物を含む全試料体積を、真空多岐管上のQIAprepSpin Columnに挿入されたカラムの形態のフィルターモジュールに、デカンティングまたはピペッティングによって適用した。フィルターモジュールはポリウレタン発泡体および非結合性シリカ膜で構成された。
6.真空供給源のスイッチを入れて、溶液をフィルターモジュールおよびQIAprepスピンカラムを通して引き出し、次いで、真空供給源のスイッチを切った。
7.フィルターモジュールをQIAprepスピンカラムから取り出し、廃棄した。
8.QIAprepスピンカラムを、0.5mlの緩衝液PBを加えることによって洗浄した。真空供給源のスイッチを入れて、洗浄溶液を、カラムを通して引き出し、次いで真空供給源のスイッチを切った。
9.QIAprepスピンカラムを、0.75mlの緩衝液PEを加えることによって洗浄した。真空供給源のスイッチを入れて、洗浄溶液を、カラムを通して引き出し、次いで真空供給源のスイッチを切った。
10.QIAprepスピンカラムを2mlの収集チューブに入れ、微量遠心チューブに移した。残りの洗浄緩衝液を除去するために13,000rpmで1分間の遠心分離を行った。
11.QIAprepカラムを清潔な1.5mlの微量遠心チューブに入れた。DNAを溶出するために、50μlの緩衝液EB(10mMのトリスCl、pH8.5)を各QIAprepスピンカラムの中央に加え、1分間静置し、13,000rpmで1分間遠心分離した。溶出液を収集した。
1.真空多岐管およびQIAprepスピンカラムを、QIAprep Miniprepハンドブックの詳細に従って調製した。
2.ペレットにした細菌細胞を250μlの緩衝液P1に再懸濁させ、微量遠心チューブに移した。
3.250μlの緩衝液P2を加え、チューブを4〜6回反転させることによって徹底的に混合した。
4.350μlの緩衝液N3を加え、すぐにチューブを4〜6回反転させることによって徹底的に混合した。
5.ステップ4からの沈殿物を含む全試料体積を、真空多岐管上のQIAprepSpin Columnに挿入されたカラムの形態のフィルターモジュールに、デカンティングまたはピペッティングによって適用した。フィルターモジュールはポリウレタン発泡体および非結合性シリカ膜で構成された。
6.真空供給源のスイッチを入れて、溶液をフィルターモジュールおよびQIAprepスピンカラムを通して引き出し、次いで、真空供給源のスイッチを切った。
7.フィルターモジュールをQIAprepスピンカラムから取り出し、廃棄した。
8.QIAprepスピンカラムを、0.5mlの緩衝液PBを加えることによって洗浄した。真空供給源のスイッチを入れて、洗浄溶液を、カラムを通して引き出し、次いで真空供給源のスイッチを切った。
9.QIAprepスピンカラムを、0.75mlの緩衝液PEを加えることによって洗浄した。真空供給源のスイッチを入れて、洗浄溶液を、カラムを通して引き出し、次いで真空供給源のスイッチを切った。
10.QIAprepスピンカラムを2mlの収集チューブに入れ、微量遠心チューブに移した。残りの洗浄緩衝液を除去するために13,000rpmで1分間の遠心分離を行った。
11.QIAprepカラムを清潔な1.5mlの微量遠心チューブに入れた。DNAを溶出するために、50μlの緩衝液EB(10mMのトリスCl、pH8.5)を各QIAprepスピンカラムの中央に加え、1分間静置し、13,000rpmで1分間遠心分離した。溶出液を収集した。
QIAprep Miniprep ハンドブック(2005年6月)の22〜23頁に記載の参照についてのプロトコール
1.ペレットにした細菌細胞を250μlの緩衝液P1に再懸濁させ、微量遠心チューブに移した。
2.250μlの緩衝液P2を加え、チューブを4〜6回反転させることによって徹底的に混合した。
3.350μlの緩衝液N3を加え、すぐにチューブを4〜6回反転させることによって徹底的に混合した。
4.試料を卓上微量遠心機において13,000rpmで10分間遠心分離した。
5.ステップ4からの上清をQIAprepスピンカラムに移した。
6.QIAprepスピンカラムを60秒遠心分離した。フロースルーを廃棄した。
7.QIAprepスピンカラムを、0.5mlの緩衝液PBを加え、30〜60秒遠心分離することによって洗浄した。フロースルーを廃棄した。
8.QIAprepスピンカラムを、0.75mlの緩衝液PEを加え、30〜60秒遠心分離することによって洗浄した。
9.フロースルーを廃棄し、カラムをさらに1分間遠心分離して、残りの洗浄緩衝液を除去した。
10.QIAprepカラムを清潔な1.5mlの微量遠心チューブに入れた。DNAを溶出するために、50μlの緩衝液EB(10mMのトリスCl、pH8.5)または水を各QIAprepスピンカラムの中央に加え、1分間静置し、1分間遠心分離した。溶出液を収集した。
1.ペレットにした細菌細胞を250μlの緩衝液P1に再懸濁させ、微量遠心チューブに移した。
2.250μlの緩衝液P2を加え、チューブを4〜6回反転させることによって徹底的に混合した。
3.350μlの緩衝液N3を加え、すぐにチューブを4〜6回反転させることによって徹底的に混合した。
4.試料を卓上微量遠心機において13,000rpmで10分間遠心分離した。
5.ステップ4からの上清をQIAprepスピンカラムに移した。
6.QIAprepスピンカラムを60秒遠心分離した。フロースルーを廃棄した。
7.QIAprepスピンカラムを、0.5mlの緩衝液PBを加え、30〜60秒遠心分離することによって洗浄した。フロースルーを廃棄した。
8.QIAprepスピンカラムを、0.75mlの緩衝液PEを加え、30〜60秒遠心分離することによって洗浄した。
9.フロースルーを廃棄し、カラムをさらに1分間遠心分離して、残りの洗浄緩衝液を除去した。
10.QIAprepカラムを清潔な1.5mlの微量遠心チューブに入れた。DNAを溶出するために、50μlの緩衝液EB(10mMのトリスCl、pH8.5)または水を各QIAprepスピンカラムの中央に加え、1分間静置し、1分間遠心分離した。溶出液を収集した。
「参照」として、試料を、それぞれ、濾過ステップの代わりに、固体、沈殿物および凝集塊を遠心分離(10分、13,000rpm)によってペレットにすることによって除去すること、および上清を新しいチューブに移し、さらに処理するという例外を伴って同じ方法で処理した。
実施例2
溶解物のクリーニングのために濾過(剛性の上部のフィルター材料を含有するフィルターモジュール)、または参照として遠心分離(ペレット化)を用いて実施したプラスミドミニプレパレーションの比較
溶解物のクリーニングのために濾過(剛性の上部のフィルター材料を含有するフィルターモジュール)、または参照として遠心分離(ペレット化)を用いて実施したプラスミドミニプレパレーションの比較
実施例1に記載の遠心分離のプロトコールに従って、プラスミドpUC19をE.coli TOP10F細胞のLB培養物5mlから単離した。4つの異なる種類のフィルター材料を、フィルターモジュール内の上部のフィルターとして使用した。
1 下部のフィルター材料として非結合性シリカ、および上部のフィルター材料として多孔質フリット、PE、10μmを伴うフィルター
2 下部のフィルター材料として多孔質フリットPE、7〜12μm、および上部のフィルター材料としてGaze PET、20μmを伴うフィルター
3 下部のフィルター材料として非結合性シリカ、および上部のフィルター材料として多孔質フリット、PE、20〜60μmを伴うフィルター
4 下部のフィルター材料として非結合性シリカ、および上部のフィルター材料として多孔質フリット、PE、10〜20μmを伴うフィルター。
1 下部のフィルター材料として非結合性シリカ、および上部のフィルター材料として多孔質フリット、PE、10μmを伴うフィルター
2 下部のフィルター材料として多孔質フリットPE、7〜12μm、および上部のフィルター材料としてGaze PET、20μmを伴うフィルター
3 下部のフィルター材料として非結合性シリカ、および上部のフィルター材料として多孔質フリット、PE、20〜60μmを伴うフィルター
4 下部のフィルター材料として非結合性シリカ、および上部のフィルター材料として多孔質フリット、PE、10〜20μmを伴うフィルター。
全ての試料をアガロースゲル上で分析した。図3にゲルが示されている。それぞれのプラスミドDNAを含む溶出液のそれぞれのOD260に応じて150ngのDNAをアガロースゲルに流した。見て取れるように、全ての焼結材料(1〜4)が、粗溶解物の遠心分離による沈殿物(5)よりも明白に高く所望のプラスミドDNAのgDNAコンタミネーションを生じている。
実施例3
剛性の上部のフィルター材料を用いた濾過と参照としてのペレット化との比較:図4
剛性の上部のフィルター材料を用いた濾過と参照としてのペレット化との比較:図4
それぞれ実施例1に記載の遠心分離のプロトコールに従って、プラスミドpUC19をE.coli DH10B細胞のLB培養物5mlから単離した、またはプラスミドpCMNβをE.coli DH5アルファ細胞のLB培養物5mlから単離した。参照(2)との比較でフィルターモジュール内の上部のフィルター材料として、針で穴をあけたフェルト(1)(剛性フィルター材料)を使用した。全ての試料を3連で分析した。それぞれのプラスミドDNAを含む溶出液のそれぞれのOD260に応じて150ngのDNAをアガロースゲルに流した。ゲルにより、針で穴をあけたフェルトを用いて濾過した試料が、ペレット化によって浄化した試料よりも明確に多い(断片化した)ゲノムDNAを含んだことが示された。
実施例4
弾性/軟性の上部のフィルター材料を用いた濾過と参照としてのペレット化との比較:図5
弾性/軟性の上部のフィルター材料を用いた濾過と参照としてのペレット化との比較:図5
それぞれ実施例1に記載の遠心分離のプロトコールに従って、プラスミドpUC19をE.coli DH10B細胞のLB培養物5mlから単離した、またはプラスミドpCMVβをE.coli DH5アルファ細胞のLB培養物5mlから単離した。参照の沈殿物のペレット化との比較で、フィルターモジュール内の上部のフィルターとして、ポリウレタン発泡体、ポリエチレン発泡体またはポリスチレン発泡体を使用した。全ての試料を3連で分析した。それぞれのプラスミドDNAを含む溶出液のそれぞれのOD260に応じて150ngのDNAをアガロースゲルに流した。図5に示されているゲル分析によると、どちらの種類の試料についても目に見えるゲノムDNAはない。
実施例5
ゲノムDNAコンタミネーションの数量化
試料中のゲノムDNAコンタミネーションの差異を数量化するために、再度、実施例1のプロトコールに従ってプラスミドを単離した。TOP10f細胞LB培養物5mlからpUC19、およびDH5α細胞のLB培養物5mlからpBRCMVβ。上部のフィルター材料として、実施例4の場合と同様にポリウレタン発泡体、または実施例3の場合と同様に針で穴をあけたフェルトのいずれかを使用した。プラスミドDNAを溶出させた後、125ngのプラスミドDNAをリアルタイムPCRにおいて鋳型として使用した。ゲノムDNAコンタミネーションの量を決定するために、染色体ピルビン酸キナーゼ遺伝子とアニーリングするプライマーおよびDNAプローブを使用した。プライマーおよびプローブの配列は以下の通りであった。
ゲノムDNAコンタミネーションの数量化
試料中のゲノムDNAコンタミネーションの差異を数量化するために、再度、実施例1のプロトコールに従ってプラスミドを単離した。TOP10f細胞LB培養物5mlからpUC19、およびDH5α細胞のLB培養物5mlからpBRCMVβ。上部のフィルター材料として、実施例4の場合と同様にポリウレタン発泡体、または実施例3の場合と同様に針で穴をあけたフェルトのいずれかを使用した。プラスミドDNAを溶出させた後、125ngのプラスミドDNAをリアルタイムPCRにおいて鋳型として使用した。ゲノムDNAコンタミネーションの量を決定するために、染色体ピルビン酸キナーゼ遺伝子とアニーリングするプライマーおよびDNAプローブを使用した。プライマーおよびプローブの配列は以下の通りであった。
コンタミネーションしているゲノムDNAの量を既知量の標準の一連のゲノムDNAによって数量化した。
図6および図7に示されているように、剛性材料を用いて濾過した試料中のゲノムDNAのコンタミネーションは、本発明による発泡体を用いて濾過した試料中のゲノムDNAのコンタミネーションよりもはるかに高かった。参照として、溶解物中の沈殿物のペレット化を用いたプラスミド調製物を鋳型として使用した。図6および図7では、それぞれ、試料(1)は、沈殿物をペレットにするために10分間遠心分離した参照を示し、試料(2)は上部のフィルター材料として発泡体、および下部のフィルターとして非結合性シリカを含有するフィルターモジュールを使用して単離したプラスミドであり、試料(3)は、上部のフィルター材料として針で穴をあけたフェルト(より剛性の材料)、および下部のフィルターとして非結合性シリカを含むフィルターモジュールを使用して単離したプラスミドである。
Claims (15)
- フィルターモジュールを含む清澄化/結合デバイスであって、前記フィルターモジュールが弾性フィルター材料を含むデバイス。
- 核酸を単離する方法における、弾性フィルター材料を含むフィルターモジュールの使用。
- 前記弾性フィルター材料が連続気泡発泡体またはスポンジである、請求項1に記載の清澄化/結合デバイスまたは請求項2に記載の使用。
- 前記フィルターが、発泡したポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリスチレン、メラミン、天然のスポンジ、動物繊維スポンジまたは植物繊維スポンジ製である、請求項3に記載の清澄化/結合デバイスまたは使用。
- 前記フィルターモジュールが、繊維材料で作製された第2のフィルターをさらに含む、請求項1から4のいずれかに記載の清澄化/結合デバイスまたは使用。
- 前記第2のフィルターが、流れ方向で前記弾性フィルターの下または後ろに配置され、前記第2のフィルターの孔サイズが前記弾性フィルターの孔サイズよりも小さい、請求項1から5のいずれかに記載の清澄化/結合デバイスまたは使用。
- 前記デバイスが、標的結合性材料をさらに含むカラムに入った前記フィルターモジュールを含有する単一カラム清澄化/結合デバイスである、または前記デバイスが、前記フィルターモジュールが前記結合性カラムに挿入された別のカラムの形態で存在する二重カラム清澄化/結合デバイスである、請求項1から6までのいずれかに記載の清澄化/結合デバイスまたは使用。
- 前記フィルターモジュールを前記結合性カラムから取り出すことが可能である、請求項1から7までのいずれかに記載の清澄化/結合デバイスまたは使用。
- 少なくとも1種の標的分子と、固体粒子、沈殿物および/または凝集塊とを含み、場合によってせん断感受性分子をさらに含んでよい懸濁液を清澄化する方法であって、前記固体粒子、沈殿物および/または凝集塊を前記標的分子から分離し、前記標的分子を溶液中に残すための、請求項1から8のいずれかに記載のフィルターモジュールを伴う濾過ステップを含む、方法。
- 前記標的分子として核酸を単離し、かつ/または精製するための請求項9に記載の方法であって、
(i)核酸を含む試料懸濁液を、請求項1から8のいずれかに記載のフィルターモジュールと接触させるステップと、
(ii)前記試料に外力を適用し、試料を、前記フィルターモジュールを通過させるステップと
を含む、方法。 - (iii)ステップ(ii)のフロースルーを核酸結合性材料と接触させるステップと、
(iv)場合によって、結合した核酸を洗浄するステップと、
(v)前記核酸を前記結合性材料から溶出させるステップと
をさらに含む、請求項10に記載の方法。 - 前記標的分子がプラスミドDNAまたはRNAである、請求項9から11までのいずれかに記載の方法。
- ステップ(ii)において適用される外力が遠心力または真空である、請求項9から12までのいずれかに記載の方法。
- 二重カラムデバイスを使用することによってステップ(iii)のフロースルーを核酸結合性材料と接触させる、請求項11から13までのいずれかに記載の方法。
- 請求項9から14のいずれかに記載の方法を実行するためのキットであって、請求項1から8のいずれかに記載のフィルターモジュールまたは清澄化/結合デバイスと、場合によって、少なくとも1種の溶解緩衝液、少なくとも1種のRNA分解酵素原液、少なくとも1種の再懸濁緩衝液、少なくとも1種の中和緩衝液、少なくとも1種の洗浄緩衝液、少なくとも1種の溶出緩衝液、および/または前記標的の単離/精製方法を実行するための説明書から選択される任意の別の成分とを含むキット。
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