JP2014513961A5

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Publication number: JP2014513961A5
Application number: JP2014508869A
Authority: JP
Filing date: 2012-05-03
Publication date: 2015-06-25
Anticipated expiration: 2032-05-03

Claims

細菌において抗生物質標的として機能する必須遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）活性化トランスポゾン（Ｔｎ_Ａ）でのトランスポゾン突然変異誘発によって変異細菌のプールを生成するステップであって、Ｔｎ_Ａは、細菌ＤＮＡへのトランスポゾン挿入が挿入部位又はその付近の遺伝子の転写を増大させるようなプロモーターを含む、ステップと、
（ｂ）種々の量の前記抗生物質の存在下で変異体プールから細菌を増殖させて２種以上の試験培養物を得るステップと、
（ｃ）試験培養物間でＴｎ_Ａ挿入の分布を比較して、前記細菌において前記抗生物質の標的として機能する推定必須遺伝子を同定するステップと、
を含む方法。
ステップ（ａ）において、変異細菌のプールを生成するために２種以上の異なる活性化トランスポゾンの組み合わせが使用される、請求項１に記載の方法。
変異細菌のプールは、少なくとも０．５×１０^５個の変異体、例えば、
（ａ）少なくとも１×１０^５個の変異体、
（ｂ）少なくとも５×１０^５個の変異体、
（ｃ）少なくとも１×１０^６個の変異体、
（ｄ）０．５×１０^６〜２×１０^６個の変異体、又は
（ｅ）約１×１０^６個の変異体
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
トランスポゾン突然変異誘発ステップ（ａ）は、
（ａ）細菌ＤＮＡの５０塩基対当たり少なくとも１つのトランスポゾン、
（ｂ）細菌ＤＮＡの３０塩基対当たり少なくとも１つのトランスポゾン、
（ｃ）細菌ＤＮＡの２５塩基対当たり少なくとも１つのトランスポゾン、
（ｄ）細菌ＤＮＡの１５塩基対当たり少なくとも１つのトランスポゾン、又は
（ｅ）細菌ＤＮＡの１０塩基対当たり少なくとも１つのトランスポゾン
の挿入率をもたらす、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ａ）の細菌ＤＮＡは、
（ａ）染色体（ゲノム）ＤＮＡ、
（ｂ）プラスミドＤＮＡ、又は
（ｃ）染色体（ゲノム）ＤＮＡとプラスミドＤＮＡとの混合物
である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ａ）のトランスポゾン突然変異誘発はｉｎｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏで生じる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）細菌はグラム陽性細菌であり、任意選択で、グラム陽性細菌は、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ）、及びナイセリア・ゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）から選択される、又は
（ｂ）細菌はグラム陰性細菌であり、任意選択で、グラム陰性細菌は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｉｉ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ１３１株、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、及びナイセリア・ゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）から選択される、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｂ）において、
（ａ）変異体プールの１０^７〜１０^９ｃｆｕ、例えば約１０^８ｃｆｕを増殖培地に接種することによって変異体プールから細菌を増殖させる、及び／又は
（ｂ）約０．５、約１及び約２×ＭＩＣの濃度の抗生物質の存在下で変異体プールから細菌を増殖させて少なくとも３種の試験培養物を得る、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
試験培養物のＴｎ_Ａ挿入の分布は、Ｔｎ_Ａの挿入部位に隣接した又はその付近のＤＮＡを配列決定することによって比較される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
Ｔｎ_Ａの挿入部位に隣接した又はその付近のＤＮＡの配列決定は、
（ａ）トランスポゾン−細菌ＤＮＡ接合部の選択的増幅、及び／又は
（ｂ）合成による配列決定（ＳＢＳ）の生化学
を含み、任意選択で、
（ａ）Ｔｎ_Ａ挿入部位に隣接した又はその付近のＤＮＡの約２５、５０、７５、１００塩基対又は１００を超える塩基対が配列決定される、及び／又は
（ｂ）配列決定されるＤＮＡはＴｎ_Ａ挿入部位の５’及び／又は３’である、
請求項９に記載の方法。
前記推定必須遺伝子に必須の機能を割り当てるステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、
（ａ）前記推定必須遺伝子への必須の機能の割り当ては、前記細菌の１つ又は複数の必須遺伝子との配列比較によって行われ、任意選択で、挿入の際に不活性化するトランスポゾンを用いたトランスポゾン指向性挿入部位配列決定によって前記必須遺伝子が同定される、又は
（ｂ）前記推定必須遺伝子への必須の機能の割り当ては、前記推定必須遺伝子が抗生物質耐性遺伝子ではないことを決定することによって行われ、任意選択で、決定ステップは、挿入の際に不活性化するトランスポゾンを用いたトランスポゾン指向性挿入部位配列決定によって抗生物質耐性遺伝子を同定するステップを含む、
方法。
前記細菌の抗生物質耐性変異体を、前記抗生物質の存在下での増殖について選択を行って抗生物質耐性変異体クローン（Ａｂ^Ｒ変異体）を得るステップを含む方法によって生成するステップと、
（ｉ）前記細菌の１つ又は複数の必須遺伝子と、（ｉｉ）細菌ＤＮＡを挿入により不活性化するトランスポゾンと、でＡｂ^Ｒ変異体を形質転換して、前記１つ又は複数の必須遺伝子について部分二倍体であるトランスポゾン変異体のプールを得るステップと、
種々の量の前記抗生物質の存在下で部分二倍体プールから細菌を増殖させて２種以上の試験培養物を得るステップと、
試験培養物間でトランスポゾン挿入の分布を比較して、前記細菌において前記抗生物質の標的として機能する推定必須遺伝子を同定するステップと、
をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って、前記抗生物質の標的として機能する必須遺伝子を同定するステップを含む、抗生物質の同定方法。
請求項１３に記載の方法を含む、抗生物質の製造方法。
前記抗生物質を合成するステップをさらに含み、
合成された抗生物質を薬学的に許容される賦形剤と混合して医薬組成物を得るステップを任意選択でさらに含む、
請求項１４に記載の方法。