JP2014503200A - 角膜細胞の作製方法および該角膜細胞を含む細胞集団 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1A−1E
Description
(a)本発明のヒト角膜上皮細胞の単離された集団を解離させて、解離させたヒト角膜上皮細胞の集団を作製すること;および
(b)解離させたヒト角膜上皮細胞を、角膜組織を生じさせる条件下、足場において培養すること
を含む方法が提供される。
(a)ヒト多能性幹細胞を、前記作用因の存在下、角膜線維芽細胞馴化培地において、細胞外マトリックス成分を含む固体表面で培養すること;および
(b)前記ヒト多能性幹細胞の分化状態を分析すること
を含み、前記作用因の非存在下における分化と比較した場合の分化における増大により、角膜上皮系譜への分化を高める作用因が示される、方法が提供される。
(a)ヒト多能性幹細胞を、当該作用因の存在下、角膜線維芽細胞馴化培地において、細胞外マトリックス成分を含む固体表面で培養すること;および
(b)ヒト多能性幹細胞の分化状態を分析すること
を含み、当該作用因の非存在下における分化と比較した場合の分化における増大により、角膜上皮系譜への分化を高める作用因が示される、方法が提供される。
ヒト胚性幹細胞の角膜細胞への分化
I.角膜線維芽細胞馴化上皮培地の調製:馴化培地を調製するために、初代角膜線維芽細胞を、移植に適していないヒト角膜から、角膜をディスパーゼII(2mg/ml)と37℃で一晩インキュベーションすることによって取り出した。上皮シートを除き、線維芽細胞を、10%の新生児ウシ血清が補充されるダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)において培養ディッシュで培養した。線維芽細胞の細胞集団が80%〜100%の密度に達したとき(図2Aを参照のこと)、細胞増殖をマイトマイシンC(8μg/ml)中での約3時間のインキュベーションによって停止させた。馴化培地を得るために、マイトマイシン処理された細胞を上皮培地(DMEM(60%)、HamF12(30%)、FCII(10%)、インスリン(5μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、EGF(10ng/ml)、0.2mMのアデニン、10nMのコレラトキシン)とインキュベーションした。培地を、10日までの期間、毎日回収し、新鮮な培地によって取り換えた。培地をろ過し、使用まで−20℃で貯蔵した。
分化した細胞の形態は、図1Aに示されるように、9日目において比較的均一のようであった。角膜分化を角膜上皮マーカーの定量的リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)によって評価した(図1B)。上昇したレベルの外胚葉マーカーK18(およびK8、これは示されず)およびpax6(眼および角膜の発達における重要な因子)が初期の培養日において記録された。角膜特異的なサイトケラチン、すなわち、K12およびK3のmRNAレベルが後期の培養日において増大した(図1B)。
角膜組織の胚性幹細胞からの作製
材料および方法
馴化培地の存在下におけるコラーゲンIVまたはマトリゲルでの多能性幹細胞の分化を1週間〜2週間行った後、細胞をディスパーゼまたはトリプシンによって集め、3D器官型再構成アッセイにおいて角膜実質同等ゲルに再播種した:初代ヒト角膜線維芽細胞を、マトリゲルおよびコラーゲンIから構成されたゲルに埋め込み、hES由来角膜細胞を上皮培地におけるこれらのゲルの頂部に播種した。角膜の層形成を、図2A〜図2Cに例示されるように、また、Gaggioli他、Nature cell biology、第9巻、第12号(2007)においてさらに例示されるように気液相間によって誘導した。その後、気液境界を、挿入物内部の培地を減らすことによって誘導し、細胞に、1週間〜2週間の層形成を行わせ、その間、培地を毎日取り換えた。あるいは、分化した細胞を、(例えば、Koizumi他、Investigative Ophthalmology&Visual Science、2000(August)、第41巻、第9号に記載されるように)ヒト羊膜に播種し、培養液から引き上げた。
ヒト誘導多能性幹(iPS)細胞の角膜細胞への分化
I.角膜線維芽細胞馴化上皮培地の調製:実施例1に記載される通りである。
最初の3日間におけるBMP−4の添加は、DNp63、K14およびK12の増大した発現によって提示されるように(図4A)、角膜分化を著しく高めた。この影響がLDN(BMP−4の特異的アンタゴニスト)によって阻害された。角膜分化拘束を追跡するために、角膜上皮系譜遺伝子のメッセンジャーRNAレベルをqPCRによってiPSC分化の経過における異なる時点で記録した(図4B)。外胚葉マーカーK18(およびK8、これは示されず)における上昇が、pax6(神経外胚葉細胞の運命の初期マーカーで、眼の発達の重要な調節因子)の発現と一緒に、2日〜4日の培養日のうちに既に現れた(図4B)。初期の上皮分化拘束が、縁マーカーのp63およびK14の発現によって6日目〜8日目に検出され、一方で、成熟した角膜上皮のマーカー(K3、K12)、およびコネキシン43(示されず)が、10日〜14日のうちに現れた(図4B)。初期段階におけるK18およびpax6の同時発現は、E9.5での水晶体板におけるインビボ共発現を繰り返し、その後には、成熟した角膜細胞の顕著な特徴であるpax6およびK3の共発現が続いた。角膜上皮様細胞集団の頑健性をFACS分析によって12日目に評価した。細胞の圧倒的部分がK3を発現し(>90%)、一方で、20%の細胞がK14陽性細胞のままであった。最後に、表皮マーカーのK10がmRNAレベルで増大したが、K10タンパク質を検出することができなかった(示されず)。類似した結果が、ヒト線維芽細胞に由来するiPSC、または、huESCに関して得られた(図4C)。
疾患iPS細胞の角膜運命への分化
EEC患者は、縁部幹細胞欠乏症に伴う損なわれた角膜のために視覚の病的状態に悩まされている。様々なiPSC株を、実施例3に記載されるように角膜運命に誘導した。リアルタイムqRT−PCR分析によって例示されるように、ヒトiPSC株が、4日目には外胚葉前駆体(K8/K18+/Pax6+)に、8日目には縁細胞(K14/K5/Pax6+/p63+)に、そして、14日目には角膜上皮細胞(Pax−6+/K3/K12+)に順次、分化した(図5A)。注目すべきことに、14日目に、細胞のほとんどが、免疫蛍光染色(図5B)およびFACS分析(データは示されず)によって検出されるように、角膜上皮細胞になった。EEC患者は縁部幹細胞欠乏症に悩まされているので、iPSEEC細胞は、iPSCctlと比較した場合、適正な角膜上皮分化拘束を受けるその能力について障害があった。免疫蛍光染色分析を、K18、E−カドヘリンおよびK14に対して惹起された抗体を用いて10日目に行った(図6A)。外胚葉始原体(K18+/E−カドヘリン+)の類似した生成が、iPSCctl、iPSC204WおよびiPSC304Wについて10日目に認められた。しかしながら、K14染色およびK3染色の非存在により、iPSEECは、iPSCctlと比較した場合、縁細胞および角膜細胞を生じさせるためのさらなる分化拘束を受けることができないことがそれぞれ明らかにされた。同時に、公知のp63標的遺伝子の遺伝子発現をリアルタイムqRT−PCRによって分化拘束の10日目に評価した(図6B)。これらの遺伝子のほとんどが、対照細胞と比較した場合、変異細胞ではそれほど発現していなかった。
Claims (31)
- ヒト多能性幹細胞を、角膜線維芽細胞馴化培地において、細胞外マトリックス成分を含む固体表面で培養し、それにより、角膜上皮細胞の集団を作製することを含む、角膜上皮細胞の集団を作製する方法。
- 前記角膜線維芽細胞馴化培地は骨形態形成タンパク質−4(BMP−4)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒト多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞(hESC)またはヒト誘導多能性幹細胞(hIPSC)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記角膜線維芽細胞馴化培地は、インスリン、ヒドロコルチゾンおよび表皮増殖因子(EGF)からなる群から選択される少なくとも1つの薬剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記角膜線維芽細胞馴化培地は、インスリン、ヒドロコルチゾンおよび表皮増殖因子(EGF)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックス成分は、コラーゲンIV、ラミニン、フィブロネクチンおよびMatrigel(登録商標)からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 角膜上皮細胞の集団を、ケラチン3(K3)、ケラチン12(K12)、ペアードボックス遺伝子6(pax6)、ケラチン18(K18)およびコネキシン43からなる群から選択される少なくとも1つのマーカーについて分析することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記角膜線維芽細胞馴化培地は縁線維芽細胞を含んでいない、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法に従って作製されるヒト角膜上皮細胞の単離された集団。
- 皮膚細胞を含まない、請求項9に記載の角膜上皮細胞の単離された集団。
- 集団の細胞の少なくとも70%がK3およびPax6を共発現する、請求項9に記載の角膜上皮細胞の単離された集団。
- 集団の細胞の10%未満がnanogおよびOct4を発現する、請求項9に記載の角膜上皮細胞の単離された集団。
- 眼障害の処置において使用するためのものである、請求項9に記載の角膜上皮細胞の単離された集団。
- 眼障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、前記対象に、請求項1に記載の方法に従って作製される角膜上皮細胞の治療効果的な量を移植し、それにより、前記対象における前記眼障害を処置することを含む方法。
- 請求項9に記載の角膜上皮細胞の単離された集団と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物。
- 角膜組織を作製する方法であって、
(a)請求項9に記載のヒト角膜上皮細胞の単離された集団を解離させて、解離させたヒト角膜上皮細胞の集団を作製すること;および
(b)前記解離させたヒト角膜上皮細胞を、角膜組織を生じさせる条件下、足場において培養すること
を含む方法。 - 前記足場はMatrigel(登録商標)およびコラーゲンIを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記足場はヒト羊膜を含む、請求項16に記載の方法。
- 請求項16に記載の方法に従って作製される単離されたヒト角膜組織。
- 眼障害の処置において使用するための、請求項19に記載のヒト角膜組織。
- 眼障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、前記対象に、請求項16に記載の方法に従って作製される角膜組織の治療効果的な量を移植し、それにより、前記対象における前記眼障害を処置することを含む方法。
- 請求項19に記載の単離された角膜組織と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物。
- 角膜上皮系譜への分化を高める作用因についてスクリーニングする方法であって、
(a)ヒト多能性幹細胞を、前記作用因の存在下、角膜線維芽細胞馴化培地において、細胞外マトリックス成分を含む固体表面で培養すること;および
(b)前記ヒト多能性幹細胞の分化状態を分析すること
を含み、
前記作用因の非存在下における分化と比較した場合の分化における増大により、角膜上皮系譜への分化を高める作用因が示される、方法。 - 前記多能性幹細胞はiPS細胞を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記iPS細胞は、健康な患者に由来する、請求項23に記載の方法。
- 前記iPS細胞は、疾患患者に由来する、請求項23に記載の方法。
- 前記培地はさらに、BMP−4を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記疾患患者は欠指・外胚葉異形成・裂隙(EEC)症候群の患者である、請求項26に記載の方法。
- 前記分析が、前記多能性幹細胞の形態を分析することによって行われる、請求項23に記載の方法。
- 前記分析が、前記多能性幹細胞における角膜細胞マーカーの発現を分析することによって行われる、請求項23に記載の方法。
- 前記角膜細胞マーカーはPax6またはK3/K12である、請求項30に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
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