JP2014500007A - プロバイオティクス微生物を含有するペットフード調製物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
ビフィドバクテリウム・ロンガムNCC3001: ATCC BAA−999
ビフィドバクテリウム・ロンガムNCC2705: CNCM I−2618
ビフィドバクテリウム・ブレーベNCC2950: CNCM I−3865
ビフィドバクテリウム・ラクティスNCC2818: CNCM I−3446
ラクトバチルス・パラカゼイNCC2461: CNCM I−2116
ラクトバチルス・ラムノサスNCC4007: CGMCC1.3724
ストレプトコッカス・テルモフィルスNCC2019: CNCM I−1422
ストレプトコッカス・テルモフィルスNCC2059: CNCM I−4153
ラクトコッカス・ラクティスNCC2287: CNCM I−4154
ラクトバチルス・カゼイNCC4006: CNCM I−1518
ラクトバチルス・カゼイNCC1825: ACA−DC6002
ラクトバチルス・アシドフィルスNCC3009: ATCC700396
ラクトバチルス・ブルガリクスNCC15: CNCM I−1198
ラクトバチルス・ジョンソニイLa1: CNCM I−1225
ラクトバチルス・ロイテリDSM17983: DSM17983
ラクトバチルス・ロイテリATCC55730: ATCC55730
エシェリヒア・コリ・ニッスル1917: DSM6601
方法:
細菌調製物:
生きたプロバイオティクスにより宿主免疫系に対してもたらされる健康上の利益は、一般に、菌株特異的であると見なされる。in vitroで高レベルのIL−10を誘発する、及び/又は低レベルの炎症誘発性サイトカインを誘発する(PBMCアッセイ)プロバイオティクスは、in vivoで強力な抗炎症性菌株であることが示されてきた(Foligne,B.ら,2007,World J.Gastroenterol.13:236〜243)。
超高温:140℃、15秒;間接スチームインジェクション
高温短時間(HTST):74℃、90℃及び120℃、15秒の間接スチームインジェクション
水浴中で長時間低温(85℃、20分)
により熱処理した。
生菌体調製物及び熱処理菌体調製物の免疫プロファイル(すなわち、in vitroでヒト血球からの特定のサイトカインの分泌を誘発する能力)を評価した。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を血液フィルターから単離した。細胞密度勾配による分離後、単核細胞を回収し、ハンクスの平衡塩類溶液を用いて2回洗浄した。次いで、10%のウシ胎仔血清(Bioconcept,Paris,France)、1%のL−グルタミン(Sigma)、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma)及び0.1%のゲンタマイシン(Sigma)を補充したIscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM,Sigma)に細胞を再懸濁させた。次いで、48ウェルプレートにおいて36時間、PBMC(7×105細胞/ウェル)を生菌体及び熱処理菌体(当量7×106cfu/ウェル)と共にインキュベートした。生菌体及び熱処理菌体の作用を、2つの別個の実験に分けた8人の個々のドナーからのPBMCで試験した。36時間のインキュベーション後、培養プレートを冷凍し、サイトカイン測定まで−20℃で保存した。サイトカインプロファイルは、生菌体及びその熱処理対応物について並行に(すなわち、PBMCでの同じバッチの同じ実験において)実施した。
超高温(UHT)/高温短時間(HTST)様処理により生じた抗炎症性プロファイル:
調査中のプロバイオティクス菌株を、一連の熱処理(超高温(UHT)、高温短時間(HTST)及び85℃、20分)に曝露し、処理菌株の免疫プロファイルをin vitroでの生菌体の免疫プロファイルと比較した。生きた微生物(プロバイオティクス及び/又は乳製品スターター培養物)は、ヒトPBMCと共にインキュベートすると様々なレベルのサイトカイン産生を誘発した(図1、2、3、4及び5)。これらの微生物の熱処理により、PBMCにより産生されるサイトカインのレベルが温度依存的に変更された。「短時間高温」処理(120℃又は140℃、15秒)により、抗炎症性免疫プロファイルを有する非複製性細菌が生じた(図1、2、3及び4)。実際に、UHT様処理をした菌株(140℃、15秒)は、IL−10産生を維持するか、又はさらなるIL−10産生を誘発する一方、誘発した炎症誘発性サイトカイン(TNF−α、IFN−γ、IL−12p40)が(生きた対応物と比較して)少なかった。得られたIL−12p40/IL−10比は、任意のUHT様処理をした菌株について、生菌体と比較して低かった(図1、2、3及び4)。この観測は、HTST様処理により処置した、すなわち、120℃に15秒(図1、2、3及び4)、又は74℃及び90℃に15秒(図5)曝露した菌体についても妥当であった。熱処理(UHT様又はHTST様処理)は、プロバイオティクス菌株(図1、2、3及び5)及び乳製品スターター培養物(図4)のin vitro免疫プロファイルに対して同様の作用を有していた。生きた及び熱処理された(140℃、15秒)プロバイオティクス及び乳製品スターター菌株を用いて生成したPBMCデータの主成分分析により、生菌株はすべてx軸に沿って広がっていることが明らかになった。これは、菌株によって、炎症誘発性サイトカインを誘発する量が少ないもの(左側)から多いもの(右側)まで非常に異なる免疫プロファイルをin vitroで示すことを示している。熱処理菌株群はグラフの左側に存在しており、熱処理菌株により誘発された炎症誘発性サイトカインがずっと少なかったことを示している(図6)。対照的に、85℃で20分熱処理された菌体は、生菌体より多い炎症誘発性サイトカイン及び少ないIL−10を誘発し、その結果、IL−12p40/IL−10比が高くなった(図7)。
− 生きた微生物の抗炎症性プロファイルは、UHT様及びHTST様熱処理により強化することができる(例えば、B.ロンガムNCC2705、B.ロンガムNCC3001、B.ブレーベNCC2950、B.ラクティスNCC2818)。
− 抗炎症性プロファイルは、UHT様及びHTST様熱処理により非抗炎症性の生きた微生物(例えば、L.ラムノサスNCC4007、L.パラカゼイNCC2461、乳製品スターターS.テルモフィルスNCC2019)から生じさせることができる。
− 抗炎症性プロファイルは、プロバイオティクスE.コリ菌株を含む市販の製品から単離された菌株についても証明された(図3A&B)。
方法:
細菌調製物:
5種のプロバイオティクス菌株を使用して、非複製性プロバイオティクス:3種のビフィズス菌(B.ロンガムNCC3001、B.ラクティスNCC2818、B.ブレーベNCC2950)及び2種の乳酸菌(L.パラカゼイNCC2461、L.ラムノサスNCC4007)の追加免疫特性を調査した。
生菌体調製物及び熱処理菌体調製物の免疫プロファイル(すなわち、in vitroでヒト血球からの特定のサイトカインの分泌を誘発する能力)を評価した。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を血液フィルターから単離した。細胞密度勾配による分離後、単核細胞を回収し、ハンクスの平衡塩類溶液を用いて2回洗浄した。次いで、10%のウシ胎仔血清(Bioconcept,Paris,France)、1%のL−グルタミン(Sigma)、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma)及び0.1%のゲンタマイシン(Sigma)を補充したIscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM,Sigma)に細胞を再懸濁させた。次いで、48ウェルプレートにおいて36時間、PBMC(7×105細胞/ウェル)を生菌体及び熱処理菌体(当量7×106cfu/ウェル)と共にインキュベートした。生菌体及び熱処理菌体の作用を、2つの別個の実験に分けた8人の個々のドナーからのPBMCで試験した。36時間のインキュベーション後、培養プレートを冷凍し、サイトカイン測定まで−20℃で保存した。サイトカインプロファイルは、生菌体及びその熱処理対応物について並行に(すなわち、PBMCでの同じバッチの同じ実験において)実施した。
アレルギー性下痢のマウスモデルを使用して、B.ブレーベNCC2950のTh1促進作用を試験した(Brandt E.Bら,JCI 2003, 112(11):1666〜1667)。感作(14日の間隔;0及び14日目でのオボアルブミン(OVA)及び硫酸カリウムアルミニウムの2回の腹腔内注射)後の雄のBalb/cマウスに、OVAを6回(27、29、32、34、36、39日目)経口で曝露すると、一過性の臨床症状(下痢)及び免疫パラメーターの変化(総IgE、OVA特異的IgE、マウス肥満細胞プロテアーゼ1(MMCP−1)の血漿中濃度)が生じた。生きた又は90℃で30分熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベNCC2950を、OVA感作の4日前(−3、−2、−1、0日目及び11、12、13及び14日目)及び曝露期間(23〜39日目)の間に胃管栄養により投与した。マウス1匹当たり1日量で約109コロニー形成単位(cfu)又はこれと同等のcfuの菌体を使用した。
熱処理後の「炎症誘発性」サイトカインの分泌の誘発:
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)によるサイトカイン分泌を刺激する熱処理菌株の能力をin vitroで評価した。熱処理菌体によってPBMCが刺激されたときの4種のサイトカインに基づいた免疫プロファイルを、同じin vitroアッセイにおいて生菌体により誘発された免疫プロファイルと比較した。
下記ペットフード組成物は、本特許出願に記載の標準的技術を使用して調製することができる。
Claims (15)
- 1食当たり約106〜1012cfuに相当する量で非複製性プロバイオティクス微生物を含むペットフード組成物。
- 乾燥重量ベースで約4〜40重量%の脂肪、約12〜70重量%の炭水化物、及び約12〜約50重量%のタンパク質を含む、請求項1に記載のペットフード組成物。
- 乾燥重量ベースで約10〜20重量%の脂肪、約30〜60重量%の炭水化物、及び約20〜約35重量%のタンパク質を含む、請求項2に記載のペットフード組成物。
- 乾燥重量ベースで約0.5〜40重量%、好ましくは約0.5〜30重量%、より好ましくは約1〜20重量%、最も好ましくは約1〜10重量%の食物繊維をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
- ペットフード、ペット用栄養食、ペット用サプリメント、ペット用トリート及びペット用フードトイ(例えば、咀嚼可能で摂取可能な玩具)からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
- プレバイオティクス(例えば、オリゴフルクトース、イヌリン)をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
- 前記プロバイオティクス微生物は、熱処理により、好ましくは少なくとも71.5℃、少なくとも1秒の高温処理により非複製性にされている、請求項1〜6のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
- 前記熱処理は、約71.5〜150℃、約1〜120秒の高温処理であり、好ましくは高温/短時間(HTST)処理又は超高温(UHT)処理である、請求項7に記載のペットフード組成物。
- 炎症性障害の予防又は治療のための、請求項8に記載のペットフード組成物。
- 前記熱処理は、約70〜150℃で約3分〜2時間、好ましくは80〜140℃で5分〜40分実施される、請求項7に記載のペットフード組成物。
- 免疫防御不全に関連する障害の予防又は治療のための、請求項10に記載のペットフード組成物。
- 少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%、理想的には少なくとも99.9%、最も理想的にはすべてのプロバイオティクスが非複製性である、請求項1〜11のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
- 前記プロバイオティクス微生物は、ビフィズス菌、乳酸菌、プロピオン酸菌又はそれらの組み合わせ(例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・フェルメントゥム、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・テルモフィルス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・ジアセチラクティス、ラクトコッカス・クレモリス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、エシェリヒア・コリ及び/又はそれらの混合物)からなる群から選択される、請求項1〜12のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
- 前記プロバイオティクス微生物は、ビフィドバクテリウム・ロンガムNCC3001、ビフィドバクテリウム・ロンガムNCC2705、ビフィドバクテリウム・ブレーベNCC2950、ビフィドバクテリウム・ラクティスNCC2818、ラクトバチルス・ジョンソニイLa1、ラクトバチルス・パラカゼイNCC2461、ラクトバチルス・ラムノサスNCC4007、ラクトバチルス・ロイテリDSM17983、ラクトバチルス・ロイテリATCC55730、ストレプトコッカス・テルモフィルスNCC2019、ストレプトコッカス・テルモフィルスNCC2059、ラクトバチルス・カゼイNCC4006、ラクトバチルス・アシドフィルスNCC3009、ラクトバチルス・カゼイACA−DC6002(NCC1825)、エシェリヒア・コリ・ニッスル、ラクトバチルス・ブルガリクスNCC15、ラクトコッカス・ラクティスNCC2287又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
- 1日量当たり約0.005mg〜1000mgの非複製性微生物を含有する、請求項1〜14のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
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