JP2014195411A - 組換えバキュロウイルスおよびその利用 - Google Patents
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- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
Description
(1)GGCX、NQO1およびVKORのそれぞれをコードする遺伝子のサブクローニング
すでに報告されているヒトGGCX遺伝子の塩基配列(NCBI Acc. No. EU847509)、ヒトNQO1遺伝子の塩基配列(NCBI Acc. No. AK312368)およびヒトVKOR遺伝子の塩基配列(NCBI Acc. No. AY521634)に基づいて、各遺伝子をサブクローニングするためのプライマーセットを設計した。各プライマーの塩基配列を以下に示す。なお、各プライマーにはそれぞれ適切な制限酵素サイトの塩基配列が付加されている。
F:5'- GGGGTACCATGGCGGTGTCTGCCGGGTCCGC -3' (配列番号6)
R:5'- GCTCTAGAGAACTCTGAGTGGACAGGATCA -3' (配列番号7)
(ii) NQO1遺伝子用プライマーセット
F:5'- GAAGATCTATGGTCGGCAGAAGAGCACTGATCGTA -3' (配列番号8)
R:5'- GCTCTAGATTTTCTAGCTTTGATCTGGTTGTCAGTT -3' (配列番号9)
(iii) VKOR遺伝子用プライマーセット
F:5'- GGGGTACCATGGGCAGCACCTGGGGGAGCCCT -3' (配列番号10)
R:5'- GCTCTAGATCAGTGCCTCTTAGCCTTGCCCTG -3' (配列番号11)
(2-1)単独発現ウイルスの作製
GGCX、NQO1およびVKORのそれぞれを単独で発現させるための組換えバキュロウイルスを作製した。これらの組換えバキュロウイルスの作製は、Maedaらの方法(InverterbrateCell system and Applications, Vol.1, p.167-181,CRC Press, Boca Raton(1989))を改変して行った。具体的には次のとおりである。まず、上記のPolh部位組換え用トランスファープラスミドをPlasmid purification kit(QIAGEN社)によって精製した。そして、各トランスファープラスミド(0.5μg)と、直鎖化したCPdバキュロウイルス(ATCC VR2500)のDNA(0.2μg)とをリポフェクション試薬(X-tremeGENE 9 DNATransfection Reagent:ロシュ社)を用いて、BmN細胞(Maeda, 1989)にコトランスフェクトした。スクリーニングは96穴プレートを利用した限界希釈法により行い、感染兆候が確認されたウイルスを選抜し、培養上清を回収した。これにより、GGCX遺伝子、NQO1遺伝子およびVKOR遺伝子をそれぞれ組み込んだ組換えバキュロウイルスを得た。得られたウイルスをそれぞれGGCX単独発現ウイルス、NQO1単独発現ウイルスおよびVKOR単独発現ウイルスと呼ぶ。
GGCXおよびNQO1、並びにGGCXおよびVKORのそれぞれの組み合わせを共発現させるための組換えバキュロウイルスを作製した。これらの組換えバキュロウイルスの作製は、上記(2-1)の方法を改変して行った。具体的には次のとおりである。上記のPolh部位組換え用トランスファープラスミドおよびCP部位組換え用トランスファープラスミドをPlasmid purification kit(QIAGEN社)によって精製した。そして、各Polh部位組換え用トランスファープラスミド(0.5μg)と、各CP部位組換え用トランスファープラスミド(0.5μg)と、5cut CPdバキュロウイルス(ATCC VR2500)のDNA(0.2μg)とをリポフェクション試薬(X-tremeGENE 9 DNATransfection Reagent:ロシュ社)を用いて、BmN細胞(Maeda, 1989)にコトランスフェクトした。スクリーニングは96穴プレートを利用した限界希釈法により行い、感染兆候が確認されたウイルスを選抜し、培養上清を回収した。これにより、GGCX遺伝子、NQO1遺伝子およびVKOR遺伝子をそれぞれ組み込んだ組換えバキュロウイルスを得た。得られたウイルスをそれぞれGGCX/NQO1共発現ウイルスおよびGGCX/VKOR共発現ウイルスと呼ぶ。
上清の回収後、BmN細胞のライセートを調製した。得られたライセートについて、SDS-PAGEおよび抗FLAG抗体(和光純薬工業株式会社)を用いたウエスタンブロットで解析した。結果を図1に示す。図1より、BmNライセート中に、GGCX、NQO1およびVKORであると予測される分子量を有するタンパク質が発現していることを確認した。
(1)第X因子およびプロトロンビンのそれぞれをコードする遺伝子のサブクローニング
データベースに公開されているヒト第X因子遺伝子(以下、hFX遺伝子ともいう)の塩基配列(NCBI Acc. No. BC_040125)およびヒトプロトロンビン遺伝子(以下、hPTH遺伝子ともいう)の塩基配列(NCBI Acc. No. NM_000506)に基づいて、各遺伝子をクローニングするためのプライマーセットを設計した。各プライマーの配列を以下に示す。なお、各プライマーにはそれぞれ適切な制限酵素サイトの塩基配列が付加されている。
F:5'- AAGGTACCCGGGGATCCATGGGGCGCCCACTG -3' (配列番号12)
R:5'- AATCTAGATCACTTTAATGGAGAGGACGTTAT -3' (配列番号13)
(ii) hPTH遺伝子用プライマーセット
F:5'- AAGAATTCATGGCCAACACCTTCTTGGAGGAG -3' (配列番号14)
R:5'- AATCTAGACTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTT -3' (配列番号15)
第X因子およびプロトロンビンのそれぞれを単独で発現させるための組換えバキュロウイルスを作製した。これらの組換えバキュロウイルスの作製は、pM-FXおよびpM-PTHを用いて、上記実施例1の(2-1)と同様にして行った。これにより、第X因子遺伝子およびプロトロンビン遺伝子をそれぞれ組み込んだ組換えバキュロウイルスを得た。得られたウイルスをそれぞれFX単独発現ウイルスおよびPTH単独発現ウイルスと呼ぶ。
(3-1)ヒト第X因子
(i)ヒト第X因子の発現およびγ−グルタミルカルボキシル化の検討
FX単独発現ウイルスと、上記の実施例1で作製した各発現ウイルスとをウイルス力価で1:1の比率となるように混合し、これをカイコ幼虫(品種:近秋錦和。上田蚕種社より蚕卵を購入し、シスメックス株式会社にて幼虫まで人工飼育)に接種した。また、対照として、FX単独発現ウイルスのみをカイコ幼虫に接種した。ウイルス接種7日後に、感染幼虫より体液を抽出した。第X因子の発現量を確認するために、得られた体液の一部についてSDS-PAGEおよび抗Factor X抗体(Enzyme research Laboratories社)を用いたウエスタンブロットで解析した。また、γ−グルタミルカルボキシル化された第X因子を検出するために、得られた体液について抗Gla-domain抗体(積水メディカル株式会社)を用いて免疫沈降を行い、得られた沈降物についてSDS-PAGEおよび抗Factor X抗体(Enzyme research Laboratories社)を用いたウエスタンブロットで解析した。結果を図2に示す。なお、図2の各試験区におけるサンプルは、以下のとおりである。
試験区2: GGCX/VKOR共発現ウイルスおよびFX単独発現ウイルス
試験区3: GGCX単独発現ウイルスおよびFX単独発現ウイルス
試験区4: NQO1単独発現ウイルスおよびFX単独発現ウイルス
試験区5: VKOR単独発現ウイルスおよびFX単独発現ウイルス
試験区6: FX単独発現ウイルス
PC : 天然型ヒト第X因子(Haematologic Technologies社)
NC : 未感染カイコ幼虫体液
GGCX/NQO1共発現ウイルスおよびFX単独発現ウイルスを感染させたカイコ幼虫の体液に含まれるヒト第X因子の濃度を、human Factor X ELISA kit(Assaypro社)を用いたサンドイッチELISA法によって測定した。その結果、体液中には500μg/ml程度のヒト第X因子が含まれていることがわかった。カイコ幼虫1頭あたりの体液の回収量は0.4 ml程度であることから、カイコ幼虫1頭あたりの発現量は200μg程度であると予測される。
PTH単独発現ウイルスと、GGCX/NQO1共発現ウイルスとをウイルス力価で1:1の比率となるように混合し、これをカイコ蛹(品種:近秋錦和。上田蚕種社より蚕卵を購入し、シスメックス株式会社にて蛹まで人工飼育)に接種した。また、対照として、PTH単独発現ウイルスのみをカイコ幼虫に接種した。ウイルス接種7日後に感染した蛹を回収し、これを−80℃で凍結した。凍結した蛹をブレンダーで破砕した。得られた破砕液中の蛹残渣を低速遠心処理およびろ過によって除去して、ホモジェネートを得た。プロトロンビンの発現量を確認するために、得られたホモジェネートの一部についてSDS-PAGEおよび抗トロンビン抗体(Novus社)を用いたウエスタンブロットで解析した。また、γ−グルタミルカルボキシル化されたプロトロンビンを検出するために、得られた体液について抗Gla-domain抗体(積水メディカル株式会社)を用いて免疫沈降を行い、得られた沈降物についてSDS-PAGEおよび抗トロンビン抗体(Novus社)を用いたウエスタンブロットで解析した。結果を図3に示す。なお、図3の各試験区におけるサンプルは、以下のとおりである。
試験区2:PTH単独発現ウイルス
PC :天然型ヒトプロトロンビン(ヒト血漿由来、Calbiochem社)
NC :未感染カイコホモジェネート
上記の実施例2で作製したFX単独発現ウイルスと、上記の実施例1で作製した各発現ウイルスとを、ウイルス力価で下記の比率となるように混合し、これをカイコ幼虫(品種:近秋錦和。上田蚕種社より蚕卵を購入し、シスメックス株式会社にて幼虫まで人工飼育)に接種した(試験区1〜4)。また、対照として、FX単独発現ウイルスのみをカイコ幼虫に接種した(試験区5)。
試験区2: GGCX単独発現ウイルス:VKOR単独発現ウイルス:FX単独発現ウイルス=1:1:1
試験区3: GGCX単独発現ウイルス:NQO1単独発現ウイルス:VKOR単独発現ウイルス:FX単独発現ウイルス=1:1:1:1
試験区4: GGCX/NQO1共発現ウイルス:FX単独発現ウイルス=1:1
試験区5: FX単独発現ウイルス
PC : 天然型ヒト第X因子(Haematologic Technologies社)
Claims (15)
- γ−グルタミルカルボキシラーゼ(GGCX)をコードする遺伝子およびDT−ジアホラーゼ(NQO1)をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルス。
- ビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子がさらに組み込まれている請求項1に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記ビタミンK依存性タンパク質が、ビタミンK依存性凝固因子である請求項2に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記ビタミンK依存性凝固因子が、プロトロンビン、第VII因子、第IX因子、第X因子、プロテインC、プロテインSおよびプロテインZからなる群より選択される請求項3に記載の組換えバキュロウイルス。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換えバキュロウイルスを鱗翅目昆虫または鱗翅目昆虫の培養細胞に感染させることにより得られる、宿主細胞。
- GGCXをコードする遺伝子およびNQO1をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスを含む、組換えビタミンK依存性タンパク質の製造用キット。
- ビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれた組換えバキュロウイルスをさらに含む請求項6に記載のキット。
- 前記組換えバキュロウイルスが、ビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子をさらに組み込まれている請求項6に記載のキット。
- GGCXをコードする遺伝子およびNQO1をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスを用いて、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンK依存性タンパク質を鱗翅目昆虫または前記鱗翅目昆虫の培養細胞に発現させる工程を含む、組換え型ビタミンK依存性タンパク質の製造方法。
- 前記発現工程において、ビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれた組換えバキュロウイルスをさらに用いる請求項9に記載の製造方法。
- 前記組換えバキュロウイルスが、ビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子をさらに組み込まれている請求項9に記載の製造方法。
- 前記発現工程が、鱗翅目昆虫においてγ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンK依存性タンパク質を発現させる工程である請求項9〜11のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記発現工程が、鱗翅目昆虫の幼虫または蛹においてγ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンK依存性タンパク質を発現させる工程である請求項12に記載の製造方法。
- 前記鱗翅目昆虫がカイコである請求項9〜13のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項14に記載された製造方法で製造された、組換え型ビタミンK依存性タンパク質。
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