JP2014162734A - ペプチド含有ソフトカプセルの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ペプチド含有ソフトカプセルにおけるペプチドの生体内における溶解度および保存安定性を向上させることを目的とする。
【解決手段】ペプチドおよび水を含む水相を油相に分散させたＷ／Ｏエマルションを加熱脱水または真空脱水することにより、平均粒子径２０ｎｍ〜１０μｍの粒子としてペプチドが油相に分散したＳ／Ｏサスペンションを製造する工程と、前記Ｓ／Ｏサスペンションをカプセル皮膜に充填する工程を含む、ペプチド含有ソフトカプセルの製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明はペプチド含有ソフトカプセルの製造方法に関する。さらに、本発明は前記の方法により得られるペプチド含有ソフトカプセルにも関する。

ペプチドは、生体において様々な薬理作用を示すことが知られており、医薬品、化粧品、食品などに幅広く利用されている。ペプチドを油と共に医薬品、化粧品、食品などに配合する場合、Ｗ／Ｏエマルションとしたり、または、固体ペプチドを親油性界面活性剤で被覆し、油中に分散させたＳ／Ｏサスペンションとして利用されることが知られている。

また、最近、水溶性固体物質が油相中に封入されているＳ／Ｏサスペンションが、皮膚からの吸収を高めたり、これをさらにＯ／Ｗエマルションとするなどして利用することができるという観点から注目されている。例えば、特許文献１には、生理活性ポリペプチド水溶液に、水混和性の有機溶媒および／または揮発性の塩類を添加後、凍結乾燥して得られる生理活性ポリペプチド粉体を、生体内分解性ポリマーの有機溶媒液に分散させた後、有機溶媒を除去することを特徴とする徐放性製剤の製造方法が記載されている。

また、水溶性固体物質のＳ／Ｏサスペンションの製造方法として、特許文献２には、Ｗ／Ｏエマルションを加熱脱水または真空脱水することにより、平均粒子径２０ｎｍ〜１０μｍの粒子として水溶性固体物質が油相中に分散したＳ／Ｏサスペンションを製造することを特徴とするＳ／Ｏサスペンションの製造方法が記載されている。

前記の水溶性固体物質のＳ／Ｏサスペンションは、Ｓ／Ｏサスペンションにさらに水相を加えて乳化してＳ／Ｏ／Ｗエマルションを得ること（特許文献２）や、Ｓ／Ｏサスペンションを噴霧冷却することによって、固体油に水溶性固体物質が封入されたＳ／Ｏ型マイクロカプセルを得るなどしてさらに利用できる（特許文献３）ことも知られている。

一方で、ペプチドを製剤に配合して利用する場合、ペプチドは、一般に、生体内での半減期が短いために、頻回投与が必要であり、さらに、その投与経路も注射に限定される場合があり、患者の肉体的負担が大きい。また、ペプチドの中には、構造上、低ｐＨや高濃度条件下で自己凝集を起こすものもあり、製剤中における安定性に問題があるものもある。従って、製剤中における安定性の改善および経口投与可能な製剤が望まれている。

特開平１１−３２２６３１号公報 特許第４３４９６３９号公報 特開２０１０−２６０００５号公報

本発明の課題は、ペプチド含有ソフトカプセルにおけるペプチドの生体内における溶解度および保存安定性を向上させることを目的とする。

本発明は以下の発明を包含する。
（１）ペプチドおよび水を含む水相を油相に分散させたＷ／Ｏエマルションを加熱脱水または真空脱水することにより、平均粒子径２０ｎｍ〜１０μｍの粒子としてペプチドが油相に分散したＳ／Ｏサスペンションを製造する工程と、前記Ｓ／Ｏサスペンションをカプセル皮膜に充填する工程を含む、ペプチド含有ソフトカプセルの製造方法。
（２）ペプチドがグルタチオン、リュープロレリンもしくはグルカゴンまたはその塩である、（１）に記載の製造方法。
（３）Ｓ／Ｏサスペンションの水分含有量が１重量％以下である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の方法で得られたソフトカプセル。
（５）ペプチドおよび水を含む水相を油相に分散させたＷ／Ｏエマルションを水分含有量１重量％まで加熱脱水または真空脱水することにより、平均粒子径２０ｎｍ〜１０μｍの粒子としてペプチドが油相中に分散したＳ／Ｏサスペンションを製造する工程を含む、ペプチド含有Ｓ／Ｏサスペンションの製造方法。

本発明の方法により提供されるペプチド含有ソフトカプセルは、ペプチドを生体内で速やかに溶解させることができ、また、高い保存安定性を有する。

図１はペプチド製剤１を投与したラットの血中グルタチオン濃度推移を示す図である。 図２（Ａ）はペプチド製剤１を投与したラットの血中ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）活性を示す図である。図２（Ｂ）はペプチド製剤１を投与したラットの血中ＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）活性を示す図である。 図３はペプチド製剤３を投与したラットの血糖値推移を示す図である。

本発明は、ペプチドおよび水を含む水相を油相に分散させたＷ／Ｏエマルションを加熱脱水または真空脱水することにより、平均粒子径２０ｎｍ〜１０μｍの粒子としてペプチドが油相に分散したＳ／Ｏサスペンションを製造する工程と、前記Ｓ／Ｏサスペンションをカプセル皮膜に充填する工程を含む、ペプチド含有ソフトカプセルの製造方法に関する。本発明の方法によると、ペプチドの経口吸収性および安定性に優れたペプチド含有ソフトカプセルを得ることができる。

本発明において、Ｓ／Ｏサスペンションとは、油相中に固体状のペプチドが均一に分散した懸濁状態をいう。従って、ペプチドおよび水を含む分散水相を油相中に分散した乳化状態であるＷ／Ｏエマルションとは異なる。また、本発明では、油相中にペプチドの分散粒子と分散水相が共存する状態、あるいは分散水相中にペプチドが析出している状態はＳ／Ｏサスペンションに含まれる。

本発明において、Ｗ／Ｏエマルションは、ペプチドおよび水を含む水相、油剤を含む油相および乳化剤を含む。

Ｉ．材料
１．ペプチド
本発明で用いられるペプチドは、好ましくは水溶性であって、常温（２５℃）で固体のものであれば特に限定されずに用いることができる。本発明で用いられるペプチドは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合して生じる化合物であれば特に限定されず、例えば、２〜１０個程度のアミノ酸由来のオリゴペプチドであってもよいし、１０個以上のアミノ酸由来のポリペプチドであってもよい。また、ペプチドは、それ自身であっても、薬理学的に許容されるその塩であってもよい。ペプチドの薬理学的に許容され塩としては、例えば、酸塩（例、塩酸、炭酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩等）、塩基塩（例、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等）、金属錯体化合物（例、銅錯体、亜鉛錯体等）が挙げられる。

本発明で用いられるペプチドとして、例えば、分子量約２００〜約４００００、好ましくは約３００〜約３００００、さらに好ましくは約３００〜約２００００のペプチドを挙げることができる。ペプチドは、天然由来ペプチド、例えば、動物由来、植物由来もしくは微生物由来ペプチドまたは合成ペプチドのいずれでもよい。

ペプチドとしては、特に限定されずに、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、インスリン、ソマトスタチン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨ−ＲＨ）、プロラクチン、エリスロポエチン、副腎皮質ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、バソプレシン、オキシトシン、カルシトニン、ガストリン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤ラクトーゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、エンケファリン、エンドルフィン、キョウトルフィン、タフトシン、サイモポイエチン、サイモシン、サイモチムリン、胸腺液性因子、血中胸腺因子、腫瘍壊死因子、コロニー誘導因子、モチリン、デイノルフィン、ボンベシン、ニューロテンシン、セルレイン、ブラジキニン、グルタチオン、イミダゾールジペプチド類（カルノシン、アンセリン、ホモアンセリン、バレニン、アスパルテームなど）、グルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２または他のＧＬＰアナログ、グルカゴン様ペプチドの誘導体またはアゴニスト等のグルカゴン様ペプチド、心房性ナトリウム排泄増加因子、神経成長因子、細胞増殖因子、神経栄養因子、エンドセリン拮抗作用を有するペプチド類などやその誘導体、さらにはこれらのフラグメントまたはフラグメントの誘導体等が挙げられる。

ＬＨ−ＲＨ誘導体として、ＬＨ−ＲＨアゴニストまたはＬＨ−ＲＨアンタゴニストが挙げられる。ＬＨ−ＲＨアゴニストとしては、リュープロレリン、ゴナドレリン、ブセレリン、トリプトレリン、ゴセレリン、ナファレリン、ヒストレリン、デスロレリン、メテレリン、レシレリンが挙げられ、特に、リュープロレリンまたはその塩、特に酢酸塩が好ましい。

好ましくは、本発明に用いられるペプチドは、グルタチオン、リュープロレリンもしくはグルカゴンまたはその塩である。

２．油剤
本発明において、油剤は、ペプチドを含む水相を分散させる連続相である油相の成分である。本発明で用いられる油剤は、特に限定されるものではなく、医薬品あるいは食品として使用され、または将来使用されるものが含まれる。油剤としては、常温で、液体の油剤（脂肪油）および固体の油剤（脂肪）が挙げられる。

前記液体の油剤としては、例えば中鎖脂肪酸トリグリセリド、中鎖脂肪酸プロピレングリコール、ソルビタン中鎖脂肪酸エステル、中鎖脂肪酸グリセリン、中鎖脂肪酸ポリグリセリド、オリーブ油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、ヒマシ油、アボカド油、月見草油、タートル油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、ゴマ油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、シナギリ油、日本キリ油、ホホバ油、胚芽油、トリグリセリン、トリオクタン酸グリセリン、トリイソパルチミン酸グリセリン、サラダ油、サフラワー油（ベニバナ油）、パーム油、ココナッツ油、ピーナッツ油、アーモンド油、ヘーゼルナッツ油、ウォルナッツ油、グレープシード油、スクワレン、スクワランなどが挙げられる。

また、前記固体の油剤としては、牛脂、硬化牛脂、ミンク油、卵黄油、豚脂、馬脂、羊脂、カカオ脂、ヤシ油、硬化ヤシ油、パーム油、パーム硬化油、モクロウ、モクロウ核油、硬化ヒマシ油などが挙げられる。

前記の油剤の中で、組成物のエマルション形成時の粒子径、安定性の観点から、中鎖脂肪酸トリグリセリドが好ましく用いられる。「中鎖脂肪酸トリグリセリド」とは、３分子の中鎖脂肪酸と１分子のグリセロールとがエステル結合したものである。「中鎖脂肪酸プロピレングリコール」とは、1もしくは2分子の中鎖脂肪酸と１分子のプロピレングリコールとがエステル結合したものである。「ソルビタン中鎖脂肪酸エステル」とは1分子以上の中鎖脂肪酸とソルビタンがエステル結合したものである。「中鎖脂肪酸グリセリン」とは1分子以上の中鎖脂肪酸と１分子のグリセリンとがエステル結合したものである。「中鎖脂肪酸ポリグリセリド」とは1分子以上の中鎖脂肪酸が1分子のポリグリセリンにエステル結合したものである。「中鎖脂肪酸」とは、一般に炭素数が８〜１２程度の脂肪酸をいう。ここでいう「ポリグリセリン」とは重合数が2〜4程度のポリグリセリンである。

３．乳化剤
本発明において、乳化剤は、水相を連続相である油相に分散させるために用いる。本発明で用いることができる乳化剤は、Ｗ／Ｏエマルションを安定に保つことができるものであれば親水性乳化剤および親油性乳化剤のいずれであってもよいが、好ましくは、親油性乳化剤が用いられる。

本発明において好ましく用いられる親油性乳化剤としては、特に限定されず、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（硬化）ヒマシ油、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、レシチン、リゾレシチンなどを挙げることができる。特に、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルが好ましい。さらに、これらは単独で、または２種以上を混合して用いることができる。

ＩＩ．ソフトカプセルの製造方法
本発明のペプチド含有ソフトカプセルの製造方法は、ペプチドおよび水を含む水相を油相に分散させたＷ／Ｏエマルションを製造する工程（工程１）、得られたＷ／Ｏエマルションを加熱脱水または真空脱水して、平均粒子径２０ｎｍ〜１０μｍの粒子としてペプチドが油相中に分散したＳ／Ｏサスペンションを製造する工程（工程２）、および、得られたＳ／Ｏサスペンションをカプセル皮膜に充填する工程（工程３）を含む。

１．工程１について
本発明のペプチド含有ソフトカプセルの製造方法の工程１において、ペプチドおよび水を含む水相、油剤を含む油相および乳化剤を混合することにより、水相を油相に乳化分散させたＷ／Ｏエマルションを製造する。

本発明において、水相は前記のペプチドおよび水を含む。水相におけるペプチドの溶解量は、ペプチドの種類に応じて適宜選択することができ、例えば、水相の重量に対して０．００１〜３０重量％である。

本発明において、Ｗ／Ｏエマルションや後述するＳ／Ｏサスペンションの安定性が損なわれない限り、Ｗ／Ｏエマルションは他の成分を含有することもできる。他の成分は、医薬品、食品、化粧品などの最終的な形態において許容される成分であれば特に限定されず、例えば、析出した固体粒子を強固にするためのキトサンやアルギン酸等の多糖類、固体粒子の結晶調整のためのシリカ微粒子等の結晶種、抗酸化剤、保存料、増粘剤、香料、着色剤、顔料、抗菌剤、安定剤などを挙げることができる。他の成分は、その性質により、前記の水相または油相のいずれかに添加することができる。

水相と油相の重量比は、特に限定されず、例えば、水相：油相＝０．１：１００〜７０：３０、好ましくは５：１００〜５０：５０の範囲であり得る。乳化剤の含有量は、Ｗ／Ｏエマルションの安定化に適した濃度であれば特に限定されず、例えば、Ｗ／Ｏエマルションの全重量に対して０．１〜５０重量％、好ましくは５〜４０重量％である。

Ｗ／Ｏエマルションの乳化方法は、安定なＷ／Ｏエマルションが調製できるものであれは特に限定されず、例えば、攪拌による方法、高圧ホモジナイザー、高速ホモミキサーを用いる方法など、一般的な乳化操作によりＷ／Ｏエマルションを調製することができる。例えば、ホモミキサーを用いる場合、特に限定されるものではないが、通常、６００〜５００００ｒｐｍ、好ましくは２０００〜２４０００ｒｐｍで、例えば、０．５〜６０分間、好ましくは１〜３０分間の条件で乳化する。

２．工程２について
次に、工程１で得られたＷ／Ｏエマルションを加熱脱水または真空脱水してＳ／Ｏサスペンションを得る。本発明の方法により得られるペプチド含有Ｓ／Ｏサスペンションは、ペプチドの経口吸収性および安定性に優れており、このＳ／Ｏサスペンションから経口吸収性および安定性に優れるソフトカプセルを製造することができる。

本発明では、Ｗ／Ｏエマルションの脱水操作は、加熱脱水または真空脱水などの通常の方法で行うことができるが、水相粒子が合一、分離あるいは分裂しなければ特に限定されずに他の方法を用いることもできる。

加熱脱水する場合は、油剤の沸点や分解温度、乳化剤の曇点（乳化力がなくなる上限温度）、ペプチドの分解温度を考慮し、それらを越えない温度に加熱して脱水することができる。

真空脱水する場合は、水が沸騰しない真空度で脱気する。温度と真空度を調節しながら脱水できるエバポレーターのような市販の装置を使用することもできる。この場合の温度の上限は、通常９５℃程度である。また、０℃以下の温度で油相が液体である場合は、凍結した水相を真空脱気することにより、昇華によって脱水することもできる。その場合の温度の下限は、特に限定されないが、通常−２０℃程度である。

前記の脱水操作は、得られるＳ／Ｏサスペンションの水分含有量が、Ｓ／Ｏサスペンションの全重量に対して、好ましくは１重量％以下となるまで行う。Ｓ／Ｏサスペンションの水分含有量が１重量％以下であると、Ｓ／Ｏサスペンションの安定性が向上するためである。

本発明には、前記のペプチド含有Ｓ／Ｏサスペンションの製造方法およびこの方法により得られるＳ／Ｏサスペンションも含まれる。本発明には、特に、ペプチドおよび水を含む水相を油相に分散させたＷ／Ｏエマルションを水分含有量１重量％まで加熱脱水または真空脱水することにより、平均粒子径２０ｎｍ〜１０μｍの粒子としてペプチドが油相中に分散したＳ／Ｏサスペンションを製造する工程を含む、ペプチド含有Ｓ／Ｏサスペンションの製造方法およびこの方法で得られたＳ／Ｏサスペンションも含まれる。

工程２で得られたＳ／Ｏサスペンション中には、Ｗ／Ｏエマルションの水相に溶解させた量のペプチドが微細粒子として分散している。本発明のＳ／Ｏサスペンションにおける動的光散乱法により測定されるペプチド分散粒子の平均粒子径は、特に限定されるものではなく、通常、１０ｎｍ〜５０μｍ程度、好ましくは２０ｎｍ〜１０μｍ程度である。

また、いったん得られたＳ／Ｏサスペンションに再度水相を加え、乳化すると、油相中に水相とペプチド分散粒子が共存した状態になり、これを脱水すると、再度加えた水相に溶解していたペプチドから新たなペプチド分散粒子が生成され、最初に存在していたペプチド分散粒子と合わせると、ペプチドの量が増加することになる。すなわち、Ｓ／Ｏサスペンションに水相を添加し、乳化し、脱水する工程を、例えば、２〜１０回程度、繰り返すことにより、Ｓ／Ｏサスペンション中に分散するペプチドの量を所望の濃度まで増加させることができる。

３．工程３について
次に、得られたＳ／Ｏサスペンションをカプセル皮膜に充填してペプチド含有ソフトカプセルを得る。本発明の方法により、経口吸収性および安定性の高いソフトカプセルを得ることができる。また、前記のように、Ｓ／Ｏサスペンションの水分含有量をＳ／Ｏサスペンションの全重量に対して好ましくは１重量％以下とすることにより、Ｓ／Ｏサスペンションをカプセルに充填した際に、カプセル皮膜の安定性を損なうことなく、カプセル皮膜の強度を保持することができる。

ソフトカプセル皮膜の成分は、特に限定されず、高分子成分、保湿剤などを挙げることができる。高分子成分としては、特に限定されず、例えば、ゼラチン、デンプン、カラギーナンなどが挙げられる。また、保湿剤としては、特に限定されず、例えば、グルコースなどの糖類、グリセリンなどのアルコール類、ソルビトールなどの糖アルコール類などが挙げられる。カプセル皮膜は、例えば防腐剤、着色剤、不透明化剤、香料、矯味剤なども適宜、含有することができる。

本発明のソフトカプセルは、その用途に応じて、本発明のＳ／Ｏサスペンションに加えて、食品、医薬品または化粧品に許容される成分を含むこともできる。本発明のＳ／Ｏサスペンションと一緒に添加される食品に許容される成分は、例えば、ビタミン類、ミネラル類、キレート剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、香料などであることができる。本発明のＳ／Ｏサスペンションと一緒に添加される医薬品に許容される成分は、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、矯味剤、矯臭剤、界面活性剤、香料、着色剤、抗酸化剤、隠蔽剤、静電気防止剤、流動化剤、湿潤剤、溶出補助剤などであることができる。本発明のＳ／Ｏサスペンションと一緒に添加される化粧品に許容される成分は、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、乳化剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤などであることができる。

ソフトカプセル中の各成分の配合割合は、特に制限されず、適宜設定可能である。

本発明のソフトカプセルの製造方法は、例えば、打ち抜き法、滴下法などの従来公知の方法を採用可能であり、特に制限されない。前者の場合、本発明のソフトカプセル剤は、例えば、金型内に２枚のソフトカプセル皮膜シートを挿入し、このシート間に、本発明のＳ／Ｏサスペンションを充填後、ヒートシールし、金型形状に打ち抜く、ロータリーダイ法により製造しても良い。

本発明のソフトカプセルは、医薬品以外の例えば、健康食品、特定栄養食品であっても良い。

本発明には、本発明の方法により得られるソフトカプセルも含まれる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
１．１ グルタチオン含有Ｓ／Ｏサスペンションの調製
ペプチドとしてグルタチオン（和光純薬工業製、ＧＳＨ）、乳化剤としてポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル（阪本薬品工業製、ＣＲＳ−７５）（グリセリン平均重合度：６）、油剤として中鎖脂肪酸トリグリセリド（花王製、ココナード ＭＴ）を用いた。

まず、グルタチオン５．０ｇをイオン交換水３５．０ｇに加え、４０℃に加温し完全に溶解したことを確認した（水相）。一方、ＣＲＳ−７５ １０．０ｇをココナードＭＴ ５０．０ｇに加え４０℃に加温し、完全に溶解したことを確認した（油相）。油相をＴＫ Ｈｏｍｏｍｉｘｅｒ（プライミクス製）で回転数３０００ｒｐｍで５分撹拌後、徐々に水相を加え、全量投入した時点で回転数を９０００ｒｐｍにして１５分間乳化してＧＳＨ Ｗ／Ｏエマルションを得た。

得られたＧＳＨ Ｗ／Ｏエマルションをナス型フラスコに移し、圧力制御型エバポレーター（日本ビュッヒ製）を用いてエマルション中の内水相を留去した。エマルションの色相が乳濁状から半透明になった段階で、試料１（水分含有量６．２％）を採取した。エマルションをさらに脱水し、完全に内水相を留去することで最終的に乳濁状のグルタチオン含有Ｓ／Ｏサスペンション（水分含有量０．６％）（製剤１）が得られた。

ＧＳＨ Ｗ／Ｏエマルション、試料１および製剤１をココナードＭＴで１重量％となるように希釈し、動的光散乱式粒度分布計（島津製作所製、ＥＬＳ−Ｚ）により平均粒子径を測定した結果を表１に示す。

１．２ グルタチオン含有Ｓ／Ｏサスペンションの安定性
前記１．１で得られた試料１とグルタチオン含有Ｓ／Ｏサスペンション（製剤１）の水分含有量をカールフィッシャー法にて測定したところ、それぞれ６．２％、０．６％の水分含有量を示した。試料１と製剤１を３５℃の恒温槽にて約３週間保存し、その後、ＨＰＬＣにて製剤中のペプチドの純度を測定した。その結果、試料１では約７％の不純物の生成を認めたのに対し、製剤１では不純物の生成は約０．４％であった。試料１において認められた不純物はその多くが酸化型グルタチオンであり、水分含有量が高いために安定性が低下したものと考えられる。この結果から、低水分含有量のペプチド含有Ｓ／Ｏサスペンションは安定性に優れ、有用であることが示された。

１．３ グルタチオン含有Ｓ／Ｏサスペンションの経口吸収性
前記１．１で得られたグルタチオン含有Ｓ／Ｏサスペンション（製剤１）とグルタチオンをそれぞれココナード ＭＴに懸濁し、７週齢の雄性 ＳＤ系ラットにグルタチオン量として５０ｍｇ／ｋｇになるよう経口投与した。尾静脈より経時的に採血し、ＤＴＮＢ法によって血中グルタチオン量を測定した結果を図１および表２に示す。図１はラットにおける製剤１およびグルタチオンの投与後の血中グルタチオン濃度推移を示す。図１中、□はグルタチオン（５０ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットの血中グルタチオン濃度推移を表し、○は製剤１（グルタチオン５０ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットの血中グルタチオン濃度推移を表す。また、各薬物動態学的パラメーターを表２に示す。図１および表２において、グルタチオン（５０ｍｇ／ｋｇ）投与時には極めて限定的な血中移行を認めたが、製剤１を投与した際には著しい血中グルタチオン濃度上昇を示し、グルタチオンと比較して、最大血中濃度は約１１倍、ＡＵＣは約２５倍向上した。この結果から、本発明により得られるペプチド含有Ｓ／Ｏサスペンションは経口吸収性に優れることが示された。

１．４ グルタチオン含有Ｓ／Ｏサスペンションの肝保護作用
四塩化炭素 ０．７ｍＬをコーンオイル ０．８ｍＬに加え、７週齢のＳＤ系ラットに経口投与した。１２時間後に尾静脈より採血し、血中肝障害バイオマーカー（ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）およびＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）活性）を測定したところ、ＡＬＴおよびＡＳＴ活性共に優位な上昇を認めた。ペプチド含有Ｓ／Ｏサスペンションの薬理効果を評価するために、四塩化炭素投与１時間前にグルタチオン（ＧＳＨ）ならびにグルタチオン含有Ｓ／Ｏサスペンション（製剤１）を５０ｍｇ／ｋｇになるよう経口投与し、さらに３時間毎に投与をくり返した。四塩化炭素投与１２時間後に血中バイオマーカーを測定した結果を図２Ａおよび図２Ｂに示す。グルタチオン（ＧＳＨ）と比較して製剤１では著しいバイオマーカーの低下を示した。この結果から、本発明の方法により得られるＳ／Ｏサスペンションの顕著な薬理効果向上が示された。

１．５ グルタチオン含有ソフトカプセルの調製
コハク化ゼラチン、グリセリン、酸化チタン、エチルパラベン、プロピルパラベンを水に溶解してカプセル被膜とし、カプセル充填機（三生医薬社製 10 号機）を用いて中空ソフトカプセルを得た。この中空ソフトカプセルにシリンジでグルタチオン含有Ｓ／Ｏサスペンションを３００μＬ加え、加熱して融解させたコハク化ゼラチンにて封入し、グルタチオン含有ソフトカプセルを得た。３５℃にて約３週間保管後にソフトカプセル内容物を取り出してＨＰＬＣにて分析したところ、特に顕著な分解物を認めなかった。

実施例２
ペプチドとしてリュープロレリン酢酸塩（ＩＬＳ製）、乳化剤としてポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル（阪本薬品工業製、ＣＲＳ−７５）、油剤として中鎖脂肪酸トリグリセリド（花王製、ココナード ＭＴ）を用いた。

２．１ リュープロレリン酢酸塩含有Ｓ／Ｏサスペンションの調製
リュープロレリン酢酸塩０．４ｇをイオン交換水３９．６ｇに加え、４０℃に加温し完全に溶解したことを確認した（水相）。一方、ＣＲＳ−７５ １０．０ｇをココナードＭＴ ５０．０ｇに加え４０℃に加温し完全に溶解したことを確認した（油相）。油相をＴＫ Ｈｏｍｏｍｉｘｅｒ（プライミクス製）で回転数３０００ｒｐｍで５分撹拌後、徐々に水相を加え、全量投入した時点で回転数を９０００ｒｐｍにして１５分間乳化してリュープロレリン酢酸塩 Ｗ／Ｏエマルションを得た。

得られたリュープロレリン酢酸塩 Ｗ／Ｏエマルションをナス型フラスコに移し、圧力制御型エバポレーター（日本ビュッヒ製）を用いてエマルション中の内水相をＳ／Ｏサスペンションに対する水分含有量が０．１重量％になるまで留去した。この水分含有量まで内水相を留去した時点で、エマルションの色相が乳濁状から半透明になり、リュープロレリン酢酸塩含有Ｓ／Ｏサスペンションが得られた。

２．２ リュープロレリン酢酸塩含有ソフトカプセルの調製
グルタチオン含有Ｓ／Ｏサスペンションに代えてリュープロレリン酢酸塩含有Ｓ／Ｏサスペンションを用いる以外は実施例１．５と同様にした。３５℃にて約３週間保管後にソフトカプセル内容物を取り出してＨＰＬＣにて分析したところ、特に顕著な分解物を認めなかった。

実施例３
ペプチドとしてグルカゴン（ＩＬＳ製、Ｇｌｕｃａｇｏｎ）、グルカゴンをイオン交換水に溶解させるために約３５％の塩酸（和光純薬工業製（特級）、ＨＣｌ）、乳化剤としてポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル（阪本薬品工業製、ＣＲＳ−７５）、油剤として中鎖脂肪酸トリグリセリド（花王製，ココナード ＭＴ）を用いた。

３．１ グルカゴン含有Ｓ／Ｏサスペンションの調製
イオン交換水３９．５ｇにＨＣｌを０．４ｇ加え、均一に攪拌した後、グルカゴン０．１ｇを加え、４０℃に加温し完全に溶解したことを確認した（水相）。一方、ＣＲＳ−７５ ５．０ｇをココナードＭＴ ５５．０ｇに加え４０℃に加温し完全に溶解したことを確認した（油相）。油相をＴＫ Ｈｏｍｏｍｉｘｅｒ（プライミクス製）で回転数３０００ｒｐｍで５分撹拌後、徐々に水相を加え、全量投入した時点で回転数を９０００ｒｐｍにして１５分間乳化してグルカゴン Ｗ／Ｏエマルションを得た。

得られたグルカゴン Ｗ／Ｏエマルションをナス型フラスコに移し、圧力制御型エバポレーター（日本ビュッヒ製）を用いてエマルション中の内水相を留去した。Ｓ／Ｏサスペンションに対する水分含有量が０．１重量％となるまで内水相を留去した時点でエマルションの色相が乳濁状から半透明になり、グルカゴン含有Ｓ／Ｏサスペンションが得られた。

グルカゴン Ｗ／Ｏエマルションおよびグルカゴン含有Ｓ／Ｏサスペンション（製剤３）をココナードＭＴで１重量％となるように希釈し、動的光散乱式粒度分布計（島津製作所製、ＥＬＳ−Ｚ）により平均粒子径を測定した結果を表３に示す。

３．２ グルカゴン含有Ｓ／Ｏサスペンションの安定性
グルカゴン含有Ｓ／Ｏサスペンション（製剤３）とグルカゴン水溶液（０．１Ｎ ＨＣｌ中３ｍｇ／ｍＬ）を３７℃の恒温槽に２日間保存し、その後、Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄを用いてフィブリル形成能を評価した。その結果、グルカゴン水溶液では約８μＭのフィブリルを認めたのに対し、製剤３では特に検出されなかった。この結果は、本発明の方法によるグルカゴン含有Ｓ／Ｏサスペンションは、グルカゴンの高次構造変化を抑制可能であることを示し、本発明の方法により、安定性の高いペプチド含有Ｓ／Ｏサスペンションを提供可能であること示した。

３．３ グルカゴン含有Ｓ／Ｏサスペンションの経口吸収性
グルカゴン含有Ｓ／Ｏサスペンション（製剤３）とグルカゴンをそれぞれココナード ＭＴに懸濁し、７−８週齢の雄性 ＳＤ系ラットにグルカゴン量として２００μｇ／ｋｇになるよう経口投与した。尾静脈より経時的に採血し、血糖値を測定した結果を図３に示す。図３中、□はグルカゴン（２００μｇ／ｋｇ）を投与したラットの血糖値の推移を表し、○は製剤３（グルカゴン２００μｇ／ｋｇ）を投与したラットの血糖値の推移を表す。グルカゴン（２００μｇ／ｋｇ）投与時には殆ど血糖値の変動を認めなかったが、製剤３を投与した際には著しい血糖値の上昇を示した。すなわち、本発明の製造方法により得られたグルカゴン含有Ｓ／Ｏサスペンションはグルカゴンの経口吸収性が顕著に改善されたことが示された。

３．４ グルカゴン含有ソフトカプセルの調製
グルタチオン含有Ｓ／Ｏサスペンションに代えてグルカゴン含有Ｓ／Ｏサスペンションを用いる以外は実施例１．５と同様にした。３５℃にて約３週間保管後にソフトカプセル内容物を取り出してＨＰＬＣにて分析したところ、特に顕著な分解物を認めなかった。

Claims (5)

1. ペプチドおよび水を含む水相を油相に分散させたＷ／Ｏエマルションを加熱脱水または真空脱水することにより、平均粒子径２０ｎｍ〜１０μｍの粒子としてペプチドが油相に分散したＳ／Ｏサスペンションを製造する工程と、前記Ｓ／Ｏサスペンションをカプセル皮膜に充填する工程を含む、ペプチド含有ソフトカプセルの製造方法。
2. ペプチドがグルタチオン、リュープロレリンもしくはグルカゴンまたはその塩である、請求項１に記載の製造方法。
3. Ｓ／Ｏサスペンションの水分含有量が１重量％以下である、請求項１または２に記載の方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法で製造されたソフトカプセル。
5. ペプチドおよび水を含む水相を油相に分散させたＷ／Ｏエマルションを水分含有量１重量％まで加熱脱水または真空脱水することにより、平均粒子径２０ｎｍ〜１０μｍの粒子としてペプチドが油相中に分散したＳ／Ｏサスペンションを製造する工程を含む、ペプチド含有Ｓ／Ｏサスペンションの製造方法。
   

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