JP2014115187A - レーザー脱離イオン化質量分析法 - Google Patents
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- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
【解決手段】レーザー脱離イオン化質量分析法において、照射レーザー光を吸収可能な有機基を骨格に有する有機シリカ多孔体に、該有機シリカ多孔体の吸収した光エネルギーが移動可能な測定対象分子を含む試料を均一に担持させた後、レーザー光を照射し、該測定対象分子をイオン化させることを特徴とするレーザー脱離イオン化質量分析法。
【選択図】図2
Description
特に、生体高分子のイオン化には、レーザー脱離イオン化(laser desorption/ionization)(以下、「LDI」と略記することがある)法のひとつであるマトリックス支援レーザー脱離イオン化(matrix−assisted laser desorption/ionization)(以下、「MALDI」と略記することがある)法が用いられている。このイオン化法を用いた質量分析は、NMR等に比べて測定試料の量が少なくても測定が可能であることから、バイオ分野で広く用いられている。
更に、一見同質の混合物に見えても実際には不均一で、特に固体結晶の場合には、結晶が生成した場所すべてから測定対象分子由来のイオンが得られるわけではなく、生成した結晶のごく一部分にレーザー光を照射した場合のみ測定対象分子由来のイオンが得られる。この部分は、「スイートスポット(sweet spot)」と呼ばれ、質の高いよいマススペクトルを得るには、試料が消費されるプレスキャンや、経験によって手動でスイートスポットを探し出し、レーザー光照射を行うといった時間のかかる作業が必要となり、特に測定試料全体の自動分析には適さないのが現状であった。
この方法では、ナノメートルレベルの微細孔を持つ多孔質シリコン基板の表面に試料溶液を塗布し、乾燥させてから、これを質量分析装置のイオン源内に設置し、以降の操作はMALDI−MSと同様に、試料表面にレーザー光を照射することによって、質量分析が行われる。
DIOS−MSにおけるイオン化の詳細な原理は明らかではないが、ナノシリコン構造体がレーザー光を高効率で吸収し、急速に加熱されることによって、測定対象分子の瞬間的な離脱が起こると共に、該多孔質シリコン基板に結合又は吸着していた成分がイオン化して測定対象分子に電荷を受け渡すことによって、測定対象分子のイオン化が達成されるのではないかと考えられている。
しかしながら、DIOS−MSでは、多孔質シリコンのイオン化効率は作成条件に大きく左右されること、同一の多孔質構造をもつ試料基板を再現性よく作成することが困難であること、また、測定できる分子量範囲も限られていること等の問題がある。
しかしながら、これらの方法では、マトリックス由来の妨害ピークは発生しないものの、約1nmolの測定対象分子を検出できるに過ぎず、感度が低いという問題点があった。また、DHBA結晶を用いる通常のMALDIと異なり、固定化されたDHBAはガス相に気化することができないので、測定対象分子のイオン化効率が低下すると考えられた。
従って、試料溶液を基板上に均一に塗布することができ、レーザー光を照射しても、妨害ピークやフラグメンテーションを発生せずに均一なスペクトルが得られ、高感度な測定が可能な脱離イオン化質量分析法の開発が熱望されていた。
[1]レーザー脱離イオン化質量分析法において、照射レーザー光を吸収可能な有機基を骨格に有する有機シリカ多孔体に、該有機シリカ多孔体の吸収した光エネルギーが移動可能な測定対象分子を含む試料を均一に担持させた後、レーザー光を照射し、該測定対象分子をイオン化させることを特徴とするレーザー脱離イオン化質量分析法を提供するものである。
このため、基材や夾雑によるシグナルが抑制され、測定対象分子のみを選択的にイオン化させることが可能であり、また、試料のフラグメンテーションが起こらない。
また、測定対象分子が有機シリカ多孔体に均一に担持されることから、マトリックスを用いる通常のMALDI−MSの測定法と異なりスイートスポットを探す必要がなく、誰でも容易に測定ができ、また、解析を簡便かつ迅速に行うことができる。
また、有機シリカは、通常の有機分子に比べ、レーザー光に対して安定であるため、有機シリカ多孔体の骨格が破壊され難く、バックグランドの低いSN比の高いデータを取得できる。
本発明における有機シリカ多孔体は、有機シリカ化学構造を有し、照射レーザー光を吸収可能な有機基をその化学構造の骨格に有する多孔体である。
有機シリカ多孔体は、エネルギー供与体として作用し、有機シリカ多孔体の吸収した光エネルギーは測定対象分子(エネルギー受容体)に移動する。この、有機シリカ多孔体(エネルギー供与体)から測定対象分子(エネルギー受容体)へのエネルギー移動は、発光を経由しない分子間の励起エネルギー移動や電子移動が考えられるし、有機シリカ多孔体から発せられた光を測定対象分子が吸収するエネルギー移動(発光再吸収によるエネルギー移動)、すなわち、発光を経由するエネルギー移動も考えられる。
このため、発光を経由してもしなくても、分子間のエネルギー移動が容易になり、上記した効果を発揮する。
下記で詳述するが、架橋型有機シリカ多孔体では、架橋しているものは、照射レーザー光を吸収可能な有機基を有する架橋有機基であり、「架橋」されているものは、シロキサン構造、すなわち、−(Si−O)n−構造である。
「有機シリカ多孔体」のうちの「架橋型有機シリカ多孔体」は、好ましくは、鋳型となる界面活性剤の存在下において、前駆体である有機ケイ素化合物を重合させることによって得られる。有機ケイ素化合物は、架橋有機基を有しているので、重合させることによって、架橋型有機シリカ多孔体が得られる。
その後、鋳型となる該界面活性剤を除けば、架橋型有機シリカ多孔体が得られる。
架橋型有機シリカ多孔体の前駆体となる有機ケイ素化合物の例としては、特開2000−219770(特許第3899733号)に記載のものが挙げられる。
また、架橋型有機シリカ多孔体の前駆体となる有機ケイ素化合物の例として、特開2008−084836に記載のものが挙げられる。
また、上記一般式B中のmは、前記有機基(X)に結合しているケイ素原子(Si)の数であり、mは1〜4の整数を示すが、安定なシロキサンネットワークを形成し易いという点から、m=2であることが特に好ましい。
ここで、Aは、一般式Bにおいて、( )mで表される括弧内の基を示し、同一であっても異なっていてもよい。Aに関しては、以下同様である。
また、架橋型有機シリカ多孔体の前駆体となる有機ケイ素化合物の例として、Chem. Mater. 2008; 20: 891-908に記載されている以下の化学式Cで表されるものが挙げられる。
また、架橋型有機シリカ多孔体の前駆体となる有機ケイ素化合物の例として、CREST ナノ界面技術の基盤構築研究領域 第1回公開シンポジウム「ナノ界面が生み出す次世代機能」の予稿集P19-23の「有機ナノ空間材料の創製と光エネルギー変換系への応用」稲垣伸二(豊田中央研究所)に記載されている以下の化学式Dで表されるものが挙げられる。
架橋型有機シリカ多孔体以外で、有機シリカ多孔体の前駆体となる有機シリカ化合物としては、以下の一般式A7、A8で示される化合物が挙げられる。
本発明における有機シリカ多孔体は、光捕集アンテナ機能を有するものであることが好ましい。「光捕集アンテナ機能」とは、上記の公開公報又は文献に定義が記載されている通り、光を照射した場合に光エネルギーを吸収して励起したエネルギーを細孔の内部に集約する機能をいう。
光捕集アンテナ機能を有する有機シリカ多孔体であれば、吸収したレーザー光の光エネルギーを細孔の内部に担持された測定対象分子に効率よく移動させることができ、測定対象分子をイオン化し易くする。
また、有機シリカ多孔体が有する細孔の構造、細孔径、細孔深さ等も特に限定はないが、細孔の平均直径については、測定対象分子が細孔内に導入され易いように、下限は、1nm以上が好ましく、2nm以上がより好ましく、5nm以上が特に好ましく、8nm以上が更に好ましく、20nm以上が最も好ましい。また、細孔の平均直径の上限は、1000nm以下が好ましく、500nm以下がより好ましく、200nm以下が特に好ましく、100nm以下が更に好ましく、80nm以下が最も好ましい。
好ましい「細孔の平均直径」は、測定対象分子の分子量に依存し、測定対象分子の分子量が大きければ、好ましい「細孔の平均直径」は大きくなり、測定対象分子の分子量が小さければ、細孔の平均直径は小さくてもよい。
本発明のLDI質量分析法が適用される測定対象分子は特に限定はないが、生体由来の分子又は生体試料中の分子であることが好ましく、具体的には、糖、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、核酸、糖脂質等であることが、本発明の効果をより発揮できるので好ましい。「測定対象分子」としては、天然物から調製されるもの、天然物を化学的又は酵素学的に一部改変して調製されるものの他、化学的又は酵素学的に調製されるものも好ましい。また、生体に含まれる分子の部分構造を有するものや生体に含まれる分子を模倣して作製されたものも好ましい。
測定対象分子の誘導体化は、上記有機シリカ多孔体の吸収した光エネルギーを受容可能にする標識分子、好ましくは、上記有機シリカ多孔体の発光スペクトルとスペクトルの重なりを有する吸収帯を有する標識分子と共有結合させることにより行うことが好ましい。
(1)有機シリカ多孔体からなる基材と試料を混合して、試料を基材に均一に担持させた後、LDI質量分析に供してもよいし、
(2)有機シリカ多孔体からなる基材の分散液を基板に塗布して乾燥後、その上に試料を載置して、試料を基材に均一に担持させた後、LDI質量分析に供してもよいし、
(3)有機シリカ多孔体からなる基材を薄膜の状態で調製し、その薄膜の上に試料を載置して、試料を基材に均一に担持させた後、LDI質量分析に供してもよい。
イオン化に用いられるレーザーとしては、例えば、窒素レーザー(337nm)、YAGレーザー3倍波(355nm)、NdYAGレーザー(256nm)、炭酸ガスレーザー(9400nm、10600nm)等が挙げられるが、窒素レーザーが好ましい。
イオンの分離検出方法は特に限定はなく、二重収束法、四重極集束法(四重極(Q)フィルター法)、タンデム型四重極(QQ)法、イオントラップ法、飛行時間(TOF)法等を用いて、イオン化した分子を質量/電荷比(m/z)に従って分離し検出する。
<有機シリカ多孔体の合成>
(1)メチルアクリドン基架橋有機シリカ多孔体(MAcd−PMO)薄膜(評価例1と評価例4で使用)の調製
メチルアクリドン基架橋有機シラン(下記式(1)で表される化合物)15mgと、鋳型となる界面活性剤であるポリスチレン−ポリエチレンオキシドジブックポリマー(P4911−SEO(polymer source社製))15mgを、テトラヒドロフランとエタノールの1:1混合溶液(容積比)1mLに溶解させた後、イオン交換水3μL及び2M塩酸2μLを滴下し、室温で24時間撹拌した。
<有機基を含まないシリカ多孔体の合成>
(2)シリカ多孔体薄膜(評価例3で使用)の調製
テトラエトキシシラン30mgと、鋳型となる界面活性剤であるポリスチレン−ポリエチレンオキシドジブックポリマー(P4911−SEO(polymer source社製))10mgを、テトラヒドロフランとエタノールの1:1混合溶液(容積比)1mLに溶解させた後、イオン交換水3μL、2M塩酸2μLを滴下し、室温で24時間撹拌した。
<メチルアクリドン架橋有機シリカ薄膜/NBD−IRNKS>
1mMのIRNKSペプチド水溶液(「IRNKS」とは、1文字アミノ酸の配列で表わしたペプチドを示す。)50μLに0.1Mホウ酸緩衝液(pH 8.0)50μLを加え、更に50mMのNBD−F(4−Fluoro−7−nitrobenzofurazan、下記式(2)で表される化合物)/エタノール溶液100μLを加えた後に、遮光条件下、60℃で1分間反応させた。
<メチルアクリドン架橋有機シリカ薄膜/NBD−IRNKS>
8nmよりも小さい平均直径を有するメチルアクリドン架橋有機シリカよりなる有機シリカ多孔体を用いて、評価例1と同一試料を同様に測定したところ、何れのモードにおいても、シグナルがほとんど検出されなかった。
分子量約1000のペプチドは、例えば、αヘリックス構造をとった場合、1nm×1.5nmの大きさになるとされる。このことから、少なくとも、糖鎖、ペプチド、糖ペプチドについては、有機シリカ多孔体が有する孔の平均直径が8nm以上あるメチルアクリドン架橋有機シリカの方が、試料を担持する能力が大きいと思われる。
すなわち、有機シリカ多孔体の細孔内に測定対象分子が存在することによって本発明の効果が奏されることが確認された。
<シリカ多孔体薄膜/NBD−IRNKS>
調製例1で調製したメチルアクリドン架橋有機シリカ薄膜コートした基板の代わりに、調製例2で調製した有機基を含まないシリカ多孔体薄膜コート基板を用いた以外は、評価例1と同様に、NBD標識されたペプチドのnegative ionを測定した。
<メチルアクリドン架橋有機シリカ薄膜/Fmoc−IRNKS>
1mMのIRNKSペプチド水溶液(「IRNKS」とは、1文字アミノ酸の配列で表わしたペプチドを示す。)50μLに、0.1M炭酸緩衝液(pH11.0)50μLを加え、更に、50mMの「Fmoc−OSu(N−(9−Fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimide、下記式(3)で表される化合物)」のアセトン溶液100μLを加えた後に、遮光条件下、室温で1時間反応させた。
<DHBA/NBD−IRNKS>
メチルアクリドン架橋有機シリカ薄膜を用いず、マトリックスとして、2,5−ジヒドロキシ安息香酸(DHBA)を用いて、評価例1と同一試料を同様の質量分析装置を用いて、MALDI−MS測定をした。
評価例1を評価例5と比較することによって、本発明の優位性が示された。
Claims (8)
- レーザー脱離イオン化質量分析法において、照射レーザー光を吸収可能な有機基を骨格に有する有機シリカ多孔体に、該有機シリカ多孔体の吸収した光エネルギーが移動可能な測定対象分子を含む試料を均一に担持させた後、レーザー光を照射し、該測定対象分子をイオン化させることを特徴とするレーザー脱離イオン化質量分析法。
- 上記有機シリカ多孔体が、照射レーザー光を吸収するものであって、該有機シリカ多孔体の発光スペクトルと、上記測定対象分子の吸収スペクトルとが、少なくともある1つの波長において重なる請求項1に記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
- 上記有機シリカ多孔体が、照射レーザー光を吸収して発光するものであって、該有機シリカ多孔体の発光スペクトルと、上記測定対象分子の吸収スペクトルとが、少なくともある1つの波長において重なる請求項1又は請求項2に記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
- 上記有機シリカ多孔体の発光スペクトルの短波長端の方が、上記測定対象分子の吸収スペクトルの長波長端より短波長側にあることによって、該有機シリカ多孔体の発光スペクトルと、該測定対象分子の吸収スペクトルとが、少なくともある1つの波長において重なる請求項2又は請求項3に記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
- 上記有機シリカ多孔体が、光捕集アンテナ機能を有するものである請求項1ないし請求項4の何れかの請求項に記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
- 上記有機シリカ多孔体が有する孔の平均直径が、1nm以上100nm以下である請求項1ないし請求項4の何れかの請求項に記載のレーザー脱離イオン化分析法。
- 上記有機シリカ多孔体が有する孔の平均直径が、8nm以上80nm以下である請求項6に記載のレーザー脱離イオン化分析法。
- 上記測定対象分子が、分子量160以上のものである請求項1ないし請求項7の何れかの請求項に記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
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