JP2014083053A - 増幅中の高分子量生成物を防止する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、アンプリコンを生成するためのプライマー対(ここで少なくとも1種のプライマーは、5’末端が標的配列に非相補的なポリN配列で修飾される)、及び該アンプリコンに特異的な検出可能なプローブ又はDNA結合色素を含んでなる、生物学的試料中に存在する可能性のある核酸標的を増幅し検出するための改良された方法に関する。本発明はさらに、適切に修飾されたプライマーと、増幅中の高分子量生成物の形成を防止又は抑制するための及び核酸標的を検出するための該プライマーを含むキットとの、使用を提供する。
【選択図】図1
Description
a)上記試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、アンプリコンを生成するための伸長フォワードプライマー又は伸長リバースプライマーと、上記アンプリコンに特異的な検出可能プローブ又はDNA結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、上記伸長フォワードプライマー又は伸長リバースプライマーの少なくとも1種は、プライマーの5’末端に付加されるアデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリN配列を含むことを特徴とする、工程;
b)上記核酸を上記増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な時間かつ条件下でインキュベートする工程;及び
c)上記検出可能プローブ又はDNA結合色素を介して上記アンプリコンを検出する工程、とを含む。
a)上記試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、アンプリコンを生成するための伸長フォワードプライマー及び伸長リバースプライマーと、上記アンプリコンに特異的な検出可能プローブ又はDNA結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、上記伸長フォワードプライマーと伸長リバースプライマーはそれぞれ、プライマーの5’末端に付加されるアデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリN配列を含むことを特徴とする、工程;
b)上記核酸を上記増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な時間かつ条件下でインキュベートする工程;及び
c)上記検出可能プローブ又はDNA結合色素を介して上記アンプリコンを検出する工程、とを含む。
PCR増幅中の高分子量生成物の形成を妨害又は抑制するための方法であって、この方法は、
a)生物学的試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、アンプリコンを生成するための伸長フォワードプライマー及び/又は伸長リバースプライマーと、上記アンプリコンに特異的な検出可能プローブ又はDNA結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、上記伸長フォワードプライマー及び/又は伸長リバースプライマーの少なくとも1種は、プライマーの5’末端に付加される、アデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリN配列を含むことを特徴とする、工程;
b)上記核酸を上記増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な時間かつ条件下でインキュベートする工程;及び
c)上記検出可能プローブ又はDNA結合色素を介して上記アンプリコンを検出する工程、とを含む。
a)上記試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、アンプリコンを生成するための伸長フォワードプライマー及び/又は伸長リバースプライマーと、上記アンプリコンに特異的な検出可能プローブ又はDNA結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、上記伸長フォワードプライマーは第1のHCV特異的オリゴヌクレオチドであり、上記リバースプライマーは第2のHCV特異的オリゴヌクレオチドであり、上記プライマーの少なくとも1種は、プライマーの5’末端に付加される、アデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、かつ標的配列に非相補的である、ポリN配列を含むことを特徴とする、工程;
b)上記核酸を上記増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な時間かつ条件下でインキュベートする工程;及び
c)上記検出可能プローブ又はDNA結合色素を介して上記アンプリコンを検出する工程、とを含む。
a)生物学的試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、アンプリコンを生成するための伸長フォワードプライマー及び/又は伸長リバースプライマーと、上記アンプリコンに特異的な検出可能プローブ又はDNA結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、上記伸長フォワードプライマー及び上記リバースプライマーの両方は、測定すべき核酸標的(例えばHCV)に特異的であり、上記プライマーの少なくとも1種は、プライマーの5’末端に付加される、アデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、かつ標的配列に非相補的である、ポリN配列を含むことを特徴とする、工程;
b)上記核酸を上記増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な時間かつ条件下でインキュベートする工程;及び
c)上記検出可能プローブ又はDNA結合色素を介して上記アンプリコンを検出する工程、とを含む。
AAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号3)とAAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号4)、
AAAAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号5)とAAAAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号6)、
AAAAAAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号7)とAAAAAAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号8)、
TTTTGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号9)とTTTTGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号10)、
TTTTTTGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号11)とTTTTTTGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号12)、
GGGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号13)とGGGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号14)、
ATATGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号15)とATATGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号16)、
AAAAAACCCACTCTATGTCCGGTC(配列番号19)とAAATGGCGTCTCCCACGCGGCTGG(配列番号20)、
ATATATGTACGCCGGAATTGCCGGAAA(配列番号21)とATATATCTTTCCCCAGGACCTGCCGGT(配列番号22)、
及び、上記フォワードプライマーのいずれか(配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、19、又は21)と、上記リバースプライマーのいずれか(配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、20、又は22)との任意の組合せ、からなる群から選択される。
実験に使用されたHPC(高陽性対照)は、陰性ヒト血漿中に外装(aremored)HCV RNA材料を含む約5E+06IU/mLの高力価試料から構成された。外装RNAは、MS2バクテリオファージコートタンパク質(ベンダー、すなわちAmbion)に封入された標的領域の非感染性のインビトロ転写されたHCV RNAからなり、HCVプライマーとプローブ結合領域とを含む。このヒト血漿は、HCV RNA、HIV−1 RNA、及びHBV DNAに対して非反応性である。高力価のHCV陽性患者試料が使用された場合、同様の結果が得られる。
1反応当たり、核酸抽出のために1mLの試料材料が使用された。一般に、図で特に明記しない場合は、実験条件について5重の試料材料が試験された。核酸抽出法は最新であり、当業者に公知である[例えば、Sambrookら,第2版、1989,Part 1−3,「分子クローニング:実験室マニュアル」(Molecular Cloning−A Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州;Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編,1984)を参照]。あるいは市販の核酸抽出キット、すなわち高純粋ウイルス核酸キット(High Pure Viral Nucleic Acid Kit)(Roche Diagnostics)又はCOBAS(登録商標)AmpliPrep総核酸単離キット(Total Nucleic Acid Isolation Kit)(TNAI)(Roche Diagnostics)を使用することができる。
マスターミックス中で、参照プライマーは、本発明の修飾プライマーにより置換された。フォワードプライマー及びリバースプライマーの無いマスターミックスが、大きなバッチで調製された。各実験について、この不完全なマスターミックスは、図1〜8に特定された伸長プライマー又は参照プライマーで補足された。
アガロースゲル分析は、当業者に公知により行われた[例えば、Sambrookら,第2版、1989,Part 1−3,「分子クローニング:実験室マニュアル」(Molecular Cloning−A Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州;Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編,1984)を参照]。5μlのアンプリコンが、5μlのアガロースゲルローディング緩衝液と混合され、4%アガロースゲルに適用された。DNAは、臭化エチジウム染色後にUV下で視覚化された。得られた写真は、以下の図1〜8に示される。
Claims (19)
- 増幅の間において高分子量生成物の形成が妨害されるか又は抑制される、試料中の核酸標的を増幅及び検出するための方法であって、当該方法が、以下の:
a)当該試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、少なくとも1種のアンプリコンを生成するための少なくとも1種の伸長フォワードプライマー及び/又は少なくとも1種の伸長リバースプライマーと、該アンプリコンに特異的な少なくとも1種の検出可能プローブ又はDNA結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、該伸長フォワードプライマー及び/又はリバースプライマーの少なくとも1種は、当該プライマーの5’末端に付加されるアデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリN配列を含むことを特徴とする、工程;
b)該核酸を該増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な条件下で一定の時間インキュベートする工程であって、該増幅反応は50サイクルより前には停止されない工程;及び
c)該検出可能プローブ又はDNA結合色素を介して該アンプリコンを検出する工程、とを含んでなる方法。 - 該ポリN配列は、ポリA、ポリT、ポリAT、ポリU、ポリC、もしくはポリG配列、又はこれらの混合物からなり、かつ2〜10ヌクレオチドの長さである、請求項1に記載の方法。
- 該ポリN配列は、4〜6ヌクレオチドの長さからなる、請求項1又は2に記載の方法。
- 該標的核酸はウイルス核酸である、請求項1に記載の方法。
- 該ウイルス核酸はHCVの核酸である、請求項1に記載の方法。
- 工程b)は、ウラシル−DNAグリコシラーゼ活性を含む酵素の存在下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 該ポリN配列は、プライマーの5’末端に付加されるアデノシン(A)又はチミジン(T)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、かつ標的配列に非相補的であり、インキュベーション工程b)は、ウラシル−DNAグリコシラーゼ活性を含む酵素の存在下で行われる、請求項1〜6に記載の方法。
- 請求項1〜7に記載の方法であって、少なくとも1種の該伸長フォワードプライマーは、
AAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号3)、
AAAAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号5)、
AAAAAAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号7)、
TTTTGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号9)、
TTTTTTGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号11)、
GGGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号13)、
ATATGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号15)、
AAAAAACCCACTCTATGTCCGGTC(配列番号19)、
ATATATGTACGCCGGAATTGCCGGAAA(配列番号21)、及び
AAACCCACTCTATGTCCGGTC(配列番号23)、からなる群の1つの配列を含み、及び/又は、少なくとも1種の該伸長リバースプライマーは、
AAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号4)、
AAAAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号6)、
AAAAAAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号8)、
TTTTGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号10)、
TTTTTTGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号12)、
GGGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号14)、
ATATGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号16)、
AAATGGCGTCTCCCACGCGGCTGG(配列番号20)、及び
ATATATCTTTCCCCAGGACCTGCCGGT(配列番号22)、からなる群の1つの配列を含んでなる方法。 - 少なくとも1種の該検出可能なプローブは、
(配列番号27)、(配列番号28)、(配列番号29)、(配列番号30)、及びこれらの配列のそれぞれの相補配列又はサブ配列、からなる群の1つの配列を含んでなる、請求項1〜8に記載の方法。 - PCR増幅中の高分子量生成物の形成を妨害又は抑制するための方法であって、該方法は、
a)試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、少なくとも1種のアンプリコンを生成するための少なくとも1種の伸長フォワードプライマー及び/又は少なくとも1種の伸長リバースプライマーと、該アンプリコンに特異的な少なくとも1種の検出可能プローブ又はDNA結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、該伸長フォワードプライマー及び/又はリバースプライマーは、プライマーの5’末端に付加されるアデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリN配列を含む、工程;
b)該核酸を該増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な条件下で所定の時間インキュベートする工程であって、該増幅反応は50サイクルより前には停止されないことを特徴とする、工程;及び
c)該検出可能プローブ又はDNA結合色素を介して該アンプリコンを検出する工程、とを含んでなる方法。 - 該ポリN配列は、ポリA、ポリT、ポリAT、ポリU、ポリC、もしくはポリG配列、又はこれらの混合物からなり、かつ2〜10ヌクレオチドの長さである、請求項10に記載の方法。
- 該ポリN配列は、4〜6ヌクレオチドの長さからなる、請求項10又は11に記載の方法。
- 該標的核酸はウイルス核酸である、請求項11〜12のいずれかに記載の方法。
- 該ウイルス核酸はHCVの核酸である、請求項11〜13のいずれかに記載の方法。
- 工程b)は、ウラシル−DNAグリコシラーゼ活性を含む酵素の存在下で行われる、請求項11〜14のいずれかに記載の方法。
- 請求項11〜15のいずれかに記載の方法であって、少なくとも1種の該伸長フォワードプライマーは、
AAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号3)、
AAAAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号5)、
AAAAAAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号7)、
TTTTGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号9)、
TTTTTTGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号11)、
GGGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号13)、
ATATGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号15)、
AAAAAACCCACTCTATGTCCGGTC(配列番号19)、
ATATATGTACGCCGGAATTGCCGGAAA(配列番号21)、及び
AAACCCACTCTATGTCCGGTC(配列番号23)、からなる群の1つの配列を含み、及び/又は、少なくとも1種の該伸長リバースプライマーは、
AAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号4)、
AAAAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号6)、
AAAAAAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号8)、
TTTTGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号10)、
TTTTTTGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号12)、
GGGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号14)、
ATATGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号16)、
AAATGGCGTCTCCCACGCGGCTGG(配列番号20)、及び
ATATATCTTTCCCCAGGACCTGCCGGT(配列番号22)、からなる群の1つの配列を含んでなる方法。 - 少なくとも1種の該検出可能なプローブは、
(配列番号27)、(配列番号28)、(配列番号29)、(配列番号30)、及びこれらの配列のそれぞれの相補配列又はサブ配列、からなる群の1つの配列を含んでなる、請求項11〜16のいずれかに記載の方法。 - 50サイクルより前には停止されないPCR増幅中に、高分子量生成物の形成を防止又は抑制するための、各プライマーの5’末端に付加されるアデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなるポリN配列を、それぞれが含んでなる、少なくとも1種の伸長フォワードプライマー及び/又は少なくとも1つの伸長リバースプライマーの使用。
- 増幅中の高分子量生成物の形成が防止又は抑制される、試料中の標的核酸を増幅し検出するためのキットであって、
(a)DNAポリメラーゼ活性を含む少なくとも1種の酵素と、
(b)ウラシル−DNAグリコシラーゼ活性を含む少なくとも1種の酵素と、
(c)ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、
(d)少なくとも1種のアンプリコンを生成するための、少なくとも1種の伸長フォワードプライマー及び/又は少なくとも1つの伸長リバースプライマーと、及び
(e)該アンプリコンに特異的な少なくとも1種の検出可能プローブ、又はDNA結合色素とを含んでなり、
少なくとも1種の該伸長フォワードプライマー及び/又はリバースプライマーは、プライマーの5’末端に付加される4〜10ヌクレオチドの長さの、アデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的なポリN配列を含むことを特徴とするキット。
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