JP2014064515A - 動的ネットワークバイオマーカーの検出装置、検出方法及び検出プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】健康状態から疾病状態への遷移を示す疾病前状態の診断に用いるることが可能なバイオマーカーの候補を検出する検出装置、検出方法及び検出プログラムを提供する。
【解決手段】測定対象から複数の生体サンプルを異なる時間点で採取し、採取した生体サンプルを測定して得られた測定データを集計して統計データを取得する。そして、ハイスループットデータの取得処理（ｓ１）と、差次的生体分子の選出処理（ｓ２）と、クラスター化処理（ｓ３）と、ＤＮＢの候補の選出処理（ｓ４）と、有意性分析によるＤＮＢの判定処理（ｓ５）とを行う。
【選択図】図３

Description

本発明は、生体に関する測定により得られた複数の因子項目の測定データに基づいて、前記生体の症状の指標となるバイオマーカーの候補を検出する検出装置、検出方法及び検出プログラムに関する。

様々な研究結果によると、多くの疾病、特に複雑な疾病の悪化進行のプロセスは、気候システム、生態システム、経済システム等のシステムと同様に、ある臨界閾値を超えた時点、いわゆる分岐点に達すると、状態遷移が突然発生し、健康状態から急激に疾病状態に変化する（例えば、非特許文献１〜５参照）。このような複雑疾病の動的メカニズムに関する研究において、疾病悪化（例えば、喘息発作、癌の発病）の進行プロセスを、時間に依存した非線形動力学システムとしてモデル化し、モデル化したシステムを観測することによって、分岐点での相転移で病気が急激に悪化することが既に判明している（非特許文献１、６参照）。

図１は、疾病の進行プロセスを概念的に示す説明図である。図１のａは、疾病の進行プロセスを模式的に示している。図１のｂ、ｃ及びｄは、進行プロセスの過程において、前述のモデル化したシステムの安定性をポテンシャル関数として示し、横軸に経過を示す時刻をとり、縦軸にポテンシャル関数の値をとって概念的に示したグラフである。図１のａに示すように、疾病悪化の進行プロセスは、正常状態（健康状態）、疾病前状態、疾病状態として表すことができる。正常状態において、システムは安定して、図１のｂに黒丸の位置として示すように、ポテンシャル関数の値が最小値になっている。疾病前状態において、システムは、図１のｃに黒丸の位置として示すように、ポテンシャル関数の値が高くなっている。したがって、外乱の影響を受けやすい状態であり、小さな外乱を受けるだけで相転移してしまう分岐点の付近、即ち、正常状態の限界に位置している。但し、当該疾病前状態は、適切な処置によって、容易に正常状態に回復することができる。一方、疾病状態において、システムは安定して、図１のｄに黒丸の位置として示すように、ポテンシャル関数の値が大局的最小値になっている。そのため、正常状態から相転移で生じたこの疾病状態が、正常状態へ回復することは困難である。（図中では便宜上、回復不能と表記）

したがって、もし疾病前状態を検知して、疾病状態に遷移する前に、疾病状態に遷移しつつあることを患者に予告することができれば、適切な措置を取ることによって、患者を疾病前状態から正常状態へ回復させることができる可能性が高い。

即ち、分岐点（臨界閾値）を検出することができれば、臨界遷移の予測が可能であり、病気の早期診断を実現することができる。

なお、従来から疾病状態を診断する方法として、バイオマーカーが用いられている。従来から用いられている通常のバイオマーカーは、生体から採取された血清、尿等の体液、更には、組織に含まれる分子レベルのＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、代謝物等であり、生体内の生物学的変化を定量的に把握することができる指標である。従来のバイオマーカーによる疾病の診断方法は、ノーマルサンプル（健康状態で採取したサンプル）から抽出したバイオマーカーと異常サンプル（疾病状態で採取したサンプル）から抽出したバイオマーカーとを比較することにより、病気を診断する方法である。

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しかしながら、複雑疾病の場合、臨界遷移の予測は極めて困難である。その理由は以下の通りである。

第一に、疾病前状態は、正常状態の境界であり、分岐点に達する前に、著しい変化が生じ難い。そのため、従来のバイオマーカー、スナップショット測定等の手法による診断では、正常状態と疾病前状態とを区別することが難しい。

第二に、様々な研究がなされている中で、分岐点を予測するための早期診断用の警告信号を精度高く検出することができる信頼性の高い疾病モデルがまだ開発されていない。特に、同じ疾病でも、個人によって、疾病悪化の進行プロセスが異なるため、モデルベースの診断方法は、成功する確率が低い。

第三に、疾病前状態の検出対象は患者であり、通常、一人の患者から得られるサンプルの数が限られているため、長期間にわたって、予測に必要な十分なサンプルを採取することが困難である。

しかも、従来のバイオマーカーによる疾病の診断方法は、正常状態と疾病状態とを比較することによって診断を行う方法であり、診断された時点では、患者はすでに疾病状態に陥り、以前の正常状態に戻ることは難しい。

それに対して、本発明は、疾病状態へ遷移する前の疾病前状態を検出することができる検出装置、検出方法及び検出プログラムを提供し、さらに、疾病モデルが不要で、数少ない生体サンプルだけで診断を補助することが可能な検出装置等を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明に係る検出装置は、生体に関する測定により得られた複数の因子項目についての測定データに基づいて、測定対象である生体の症状の指標となるバイオマーカーの候補を検出する検出装置であって、前記各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化の相関関係に基づいて複数の因子項目を複数のクラスターに分類する分類手段と、分類した各クラスターから、前記各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化及び各因子項目間の測定データの時系列変化の相関関係に基づいて予め設定された選出条件に該当するクラスターを選出する選出手段と、選出したクラスターに含まれる因子項目をバイオマーカーの候補として検出する検出手段とを備えることを特徴とする。

上記特徴を有する検出装置は、正常状態から疾病状態へ遷移する前の疾病前状態を示す警告信号となるバイオマーカーの候補を検出することができる。また、バイオマーカーを特定することができれば、検出対象から数少ないサンプルを採取するだけで疾病前状態を判別することができる。

また、本発明に係る検出装置において、前記選出手段は、クラスター内の各因子項目間の測定データの相関を示す値の平均値を第１指数として算出する手段と、クラスター内の因子項目の測定データと当該クラスター外の因子項目の測定データとの間の相関を示す値の平均値を第２指数として算出する手段と、クラスター内の各因子項目について測定データの標準偏差の平均値を第３指数として算出する手段とを含み、複数のクラスターのうちから、第１指数、第２指数及び第３指数に基づいて、バイオマーカーとすべき因子項目を含むクラスターを選出することを特徴とする。

したがって、前記第１指数、第２指数、第３指数を用いることにより、各クラスターの特性を定量的評価することができ、バイオマーカーを容易に選出することができる。

また、本発明に係る検出装置において、前記選出手段は、前記第１指数と、前記第２指数と、前記第３指数の逆数との積に基づく総合指数が最大であるクラスターを選択することを特徴とする。

したがって、総合指数に基づいてクラスターを選択することにより、バイオマーカーの候補となる因子項目の信頼性を高めることができる。

また、本発明に係る検出装置は、前記各因子項目のそれぞれの測定データが、有意性をもって経時的に変化しているか否かを検定する差次検定手段を更に備え、前記分類手段は、経時的変化に有意性があると検定された因子項目について分類することを特徴とする。

したがって、経時的に著しい変化を示した因子項目を選出することにより、膨大な測定データから、バイオマーカーの候補を効率的に検出することができる。

また、本発明に係る検出装置は、前記差次検定手段は、各因子項目の測定データ、並びに因子項目及び時系列毎に予め設定されている参照データとの比較結果に基づいて、有意性に係る検定を行うことを特徴とする。

したがって、検出対象となる前記複数の因子項目に係る測定データの他に、参照基準となる生体サンプルを参照データとして取得することによって、測定データと参照データとを比較し、外乱を排除して検出を行うことができる。

また、本発明に係る検出装置は、各因子項目について、対応する参照データの標準偏差の平均値を示す参照標準偏差、及び因子項目間の相関を示す値の平均値を示す参照相関値を算出する手段を更に備え、前記検出手段は、前記第１指数が前記参照標準偏差に比べて有意性をもって増大し、前記第２指数が前記参照相関値に比べて有意性をもって減少し、かつ、前記第３指数が前記参照標準偏差に比べて有意性をもって増大した場合に、当該クラスターに含まれる項目をバイオマーカーの候補として検出することを特徴とする。

したがって、選出された因子項目がバイオマーカーとして適切か否かを判定することができる。

また、本発明に係る検出装置において、前記検出手段は、クラスターに含まれる複数の因子項目の有意性を、測定データの統計値に基づいて検定する手段を含み、有意性がある場合に、クラスターに含まれる項目をバイオマーカーの候補として検出することを特徴とする。

したがって、検定により誤検出の発生を極力防止することができる。

また、本発明に係る検出装置は、前記複数の因子項目のいずれかは、遺伝子に関する測定項目、タンパク質に関する測定項目、代謝物に関する測定項目、又は生体から得られる画像に関する測定項目であることを特徴とする。

したがって、遺伝子、タンパク質、代謝物に関して測定項目を因子項目とすることにより、生体内の生物変化を定量的に把握して、検出結果の信頼性を向上させることができる。

さらに、本発明に係る検出方法は、生体に関する測定により得られた複数の因子項目についての測定データに基づいて、測定対象である生体の症状の指標となるバイオマーカーの候補を検出する検出装置を用いた検出方法であって、前記検出装置は、前記各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化の相関関係に基づいて複数の因子項目を複数のクラスターに分類する分類ステップと、分類した各クラスターから、前記各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化及び各因子項目間の測定データの時系列変化の相関関係に基づいて予め設定された選出条件に該当するクラスターを選出する選出ステップと、選出したクラスターに含まれる因子項目をバイオマーカーの候補として検出する検出ステップとを実行することを特徴とする。

また、本発明に係る検出方法は、生体に関する測定により得られた複数の因子項目についての測定データに基づいて、測定対象である生体の症状の指標となるバイオマーカーの候補を検出する検出方法であって、異なる時間点で採取した複数の生体サンプルのそれぞれから測定したハイスループットデータの中から、差次的生体分子を算出する分子スクリーニングステップと、相関の高い生体分子同士を１つのクラスターとするように、前記分子スクリーニングステップで選出した前記差次的生体分子を複数のクラスターに分類するクラスター化ステップと、前記クラスター化ステップで得られた複数のクラスターの中から、クラスター内の生体分子の間の相関の増大、クラスター内の生体分子の標準偏差の増大、及びクラスター内の生体分子と他の生体分子との間の相関の低減が最も著しいクラスターを、前記バイオマーカーの候補として先取する候補選択ステップと、前記候補選択ステップで選出したバイオマーカーの候補が前記バイオマーカーであるか否かを、有意性検定によって判定する判定ステップとを実行することを特徴とする。

上記特徴を有する検出方法は、正常状態から疾病状態へ遷移する前の疾病前状態を示す警告信号となるバイオマーカーの候補を検出することができる。また、バイオマーカーを特定することができれば、検出対象から数少ないサンプルを採取するだけで疾病前状態を判別することができる。

さらに、本発明に係る検出プログラムは、コンピュータに、生体に関する測定により得られた複数の因子項目についての測定データに基づいて、測定対象である生体の症状の指標となるバイオマーカーの候補を検出する処理を実行させる検出プログラムであって、コンピュータに、前記各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化の相関関係に基づいて複数の因子項目を複数のクラスターに分類する分類ステップと、分類した各クラスターから、前記各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化及び各因子項目間の測定データの時系列変化の相関関係に基づいて予め設定された選出条件に該当するクラスターを選出する選出ステップと、選出したクラスターに含まれる因子項目をバイオマーカーの候補として検出する検出ステップとを実行させることを特徴とする。

上記特徴を有する検出プログラムは、コンピュータにて実行することにより、コンピュータが、本発明に係る検出装置として動作する。したがって、正常状態から疾病状態へ遷移する前の疾病前状態を示す警告信号となるバイオマーカーの候補を検出することができる。また、バイオマーカーを特定することができれば、検出対象から数少ないサンプルを採取するだけで疾病前状態を判別することができる。

本発明によれば、生体サンプルを診断対象から採取し、採取した生体サンプルにおいて、疾病状態になる直前の疾病前状態を示す警告信号となるバイオマーカーが存在するか否かを調べることにより、診断対象が疾病前状態にあるか否かを診断することができる。そのため、疾病悪化のモデルを構築する必要がなく、疾病悪化の駆動要素を特定する必要もなく、疾病になる前の段階で、疾病の早期診断を実現することができる。

図１は、疾病の進行プロセスを説明する模式図である。 図２は、本発明の検出方法に係るＤＮＢの動的特性を例示する模式図である。 図３は、実施の形態におけるＤＮＢの検出方法の一例を示すフローチャートである。 図４は、実施の形態における差次的生体分子の選出処理の一例を示すフローチャートである。 図５は、実施の形態におけるＤＮＢの候補の選出処理の一例を示すフローチャートである。 図６は、実施の形態におけるＤＮＢの判定処理の一例を示すフローチャートである。 図７は、実施の形態におけるＤＮＢによる疾病の早期診断方法による診断スケジュールの一例を示す図である。 図８は、実施の形態におけるＤＮＢによる疾病の早期診断方法の一例を示すフローチャートである。 図９は、総合指数Ｉに比例した疾病リスクを表示する図形の一例である。 図１０は、総合指数Ｉに比例した疾病リスクを表示する図形の一例である。 図１１は、本発明に係る検出装置の構成例を示すブロック図である。 図１２は、本発明に係る検出装置によるＤＮＢの検出処理の一例を示すフローチャートである。 図１３は、第１の検証例における診断用のデータを示すテーブルである。 図１４Ａは、第１の検証例において、検出されたＤＮＢの候補の標準偏差の平均値の時系列変化の例を示すグラフである。 図１４Ｂは、第１の検証例において、検出されたＤＮＢの候補のクラスターのメンバー間のピアソン相関係数の絶対値の平均値の時系列変化の例を示すグラフである。 図１４Ｃは、第１の検証例において、検出されたＤＮＢの候補のクラスターのメンバーと他の遺伝子との間のピアソン相関係数の絶対値の平均値の時系列変化の例を示すグラフである。 図１４Ｄは、第１の検証例において、検出されたＤＮＢの候補の総合指数の平均値の時系列変化の例を示すグラフである。 図１５は、第１の検証例において、ケースグループの遺伝子によって構成されたネットワークにおけるＤＮＢの動的特性の一例を経時的に示すマップである。 図１６は、第２の検証例における診断データのテーブルである。 図１７Ａは、第２の検証例において、検出されたＤＮＢの候補の標準偏差の平均値の時系列変化の例を示すグラフである。 図１７Ｂは、第２の検証例において、検出されたＤＮＢの候補のクラスターのメンバー間のピアソン相関係数の絶対値の平均値の時系列変化の例を示すグラフである。 図１７Ｃは、第２の検証例において、検出されたＤＮＢの候補のクラスターのメンバーと他の遺伝子との間のピアソン相関係数の絶対値の平均値の時系列変化の例を示すグラフである。 図１７Ｄは、第２の検証例において、検出されたＤＮＢの候補の総合指数の平均値の時系列変化の例を示すグラフである。

本発明の発明者らは、１つのサンプルから数千個の情報、即ち高次元データを得ることが可能なゲノムハイスループットテクノロジーを利用して、分岐プロセス理論に基づいて、複雑疾病の時間発展の数理モデルを構築し、分子ネットワークレベルにおける疾病悪化の進行メカニズムの研究を行った。その結果、疾病前状態において、臨界遷移発生前の直前分岐（突然悪化）状態を検出することができる動的ネットワークバイオマーカー（ＤＮＢ：Dynamical Network Biomarker ）の存在を解明した。当該動的ネットワークバイオマーカーを疾病前状態の警告信号として利用すれば、疾病モデルが不要で、数少ないサンプルだけで複雑疾病の早期診断を実現することができる。以下に、動的ネットワークバイオマーカーに基づく本発明を実施するための形態について説明する。

＜理論根拠＞
先ず、本発明の基となる理論根拠について説明する。通常、疾病の進行プロセスに係るシステム（以下、システム（１）という）を次の式（１）で表すことができる。

Ｚ（ｋ＋１）＝ｆ（Ｚ（ｋ）；Ｐ） …式（１）

ここで、Ｚ（ｋ）＝（ｚ１（ｋ）、... 、ｚｎ（ｋ））は、時刻ｋ（ｋ＝０、１、... ）で観測されたシステム（１）の動的状態を表す変数であり、遺伝子発現量、タンパク質発現量、代謝物発現量等の情報とすることができる。詳細には、遺伝子、タンパク質等の分子に係る濃度、個数等の情報である。Ｐは、システム（１）の状態遷移を駆動する緩やかに変化するパラメータであり、例えば、ＳＢＰ，ＣＮＶ等の遺伝的要因、メチル化、アセチル化等の非遺伝的要因等の情報とすることができる。ｆ＝（ｆ１、... 、ｆｎ）はＺ（ｋ）の非線形関数である。

正常状態、疾病状態はそれぞれ、状態方程式Ｚ（ｋ＋１）＝ｆ（Ｚ（ｋ）；Ｐ）のアトラクタで表すことができる。複雑疾病の進行プロセスは、非常に複雑な動的特性を有するため、関数ｆは、数千個の変数を有する非線形関数である。しかも、システム（１）を駆動する要素Ｐは特定しにくいものである。そのため、正常状態及び疾病状態のシステムモデルを構築し解析することは大変困難である。

それに対して、本発明の発明者らが着目したのは、正常状態から疾病状態へ遷移する直前のシステムの臨界遷移状態、即ち疾病前状態である。一般的に、システム（１）には、次の特性を有する平衡点が存在する。

１． Ｚ^* は、システム（１）の固定点とすれば、Ｚ^* ＝ｆ（Ｚ^* ；Ｐ）、
２． Ｐｃをシステムが分岐する閾値とすれば、Ｐ＝Ｐｃの時、ヤコビ行列∂ｆ（Ｚ；Ｐｃ）／∂Ｚ|Ｚ＝Ｚ^*の１つの実数固有値又は１対の複素共役の固有値の絶対値が１になる、
３． Ｐ≠Ｐｃの時、一般的に、システム（１）の固有値の絶対値が１ではない。

発明者らは、上記特性から、システム（１）が臨界遷移状態になると、次のような特異な特性が現れることを理論的に解明した。即ち、システム（１）が臨界遷移状態になると、システム（１）の各変数ｚ１，... ，ｚｎのそれぞれをノードとして構成したネットワーク（１）において、一部のノードからなる支配グループ（サブネットワーク）が現れる。臨界遷移状態に現れる支配グループは、理想的には、次のような得意な特性を有する。

（Ｉ） ｚｉとｚjは支配グループに属するノードである場合、
ＰＣＣ（ｚi ，ｚj）→±１；
ＳＤ（ｚi）→∞；
ＳＤ（ｚj）→∞．
（ＩＩ） ｚｉは支配グループに属するノードであるが、ｚjは支配グループに属するノードではない場合、
ＰＣＣ（ｚi ，ｚj）→０；
ＳＤ（ｚi）→∞；
ＳＤ（ｚj）→境界値．
（ＩＩＩ） ｚiとｚjは支配グループに属するノードではない場合
ＰＣＣ（ｚi ，ｚj）→α、α∈（-１，１）？｛０｝；
ＳＤ（ｚi）→境界値；
ＳＤ（ｚj）→境界値．

ここで、ＰＣＣ（ｚi ，ｚj）はｚiとｚjとの間のピアソン相関係数であり、ＳＤ（ｚi）、ＳＤ（ｚj）はｚiとｚjとの標準偏差である。

即ち、ネットワーク（１）において、上記特異な特性（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を有する支配グループの出現は、システム（１）が臨界遷移状態（疾病前状態）に遷移していることの兆候として捉えることができる。したがって、当該支配グループを検出することにより、システム（１）の臨界遷移を検出することができる。即ち、当該支配グループを臨界遷移、即ち、疾病悪化直前の疾病前状態を示す警告信号とすることができる。そうすれば、システム（１）がいくら複雑であっても、駆動要素が不明であっても、警告信号となる支配グループだけを検出すれば、システム（１）の数理モデルを直接扱うことなく、疾病前状態であることを特定することができる。疾病前状態であることを特定することにより、疾病に対する事前対策及び早期治療を実現することが可能となる。

本発明において、疾病前状態を示す警告信号となる当該支配グループを動的ネットワークバイオマーカー（以下、ＤＮＢと略称する）と称する。

＜ＤＮＢの特性及び判定条件＞
上述したように、ＤＮＢは、特異な特性（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を有する支配グループであって、複数のノードからなるサブネットワークとして、システム（１）が疾病前状態になるときに、ネットワーク（１）に現れるものである。ネットワーク（１）において、各ノード（ｚ１，... ，ｚｎ）を、遺伝子、タンパク質、代謝物等の生体分子について測定の対象となる因子項目とすれば、ＤＮＢは、上記特異な特性（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を満たした一部の生体分子に係る因子項目からなるグループ（サブネットワーク）である。

さらに、上記特異な特性（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に基づいて、ＤＮＢを判定する条件を以下の通り定めることができる。

・条件（Ｉ）：ネットワーク（１）に存在する一部の生体分子（遺伝子、タンパク質又は代謝物）からなるグループであって、当該グループ内の生体分子の間のピアソン相関係数ＰＣＣの絶対値の平均値が著しく増大する。
・条件（ＩＩ）：当該グループ内の生体分子と他の生体分子との間のピアソン相関係数ＯＰＣＣの絶対値の平均値が著しく低減する。
・条件（ＩＩＩ）：当該グループ内の生体分子の標準偏差ＳＤの平均値が著しく増加する。

上記条件（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を同時に満たした生体分子からなるグループをＤＮＢと認定する。

ＤＮＢの特性を直観的に説明するために、次に、６つのノードを有するネットワークを例として、当該ネットワークにおけるＤＮＢの動的特性を説明する。図２は、本発明の検出方法に係るＤＮＢの動的特性を例示する模式図である。図２のａは、疾病の進行プロセスとして、正常状態、疾病前状態及び疾病状態を示している。図２のｂ、ｃ及びｄは、進行プロセスの過程につき、正常状態、疾病前状態及び疾病状態において、モデル化したシステム（１）の安定性を、ポテンシャル関数として示し、横軸に経過を示す時刻をとり、縦軸にポテンシャル関数の値をとって概念的に示したグラフである。また、図２のｅ、ｆ及びｇは、正常状態、疾病前状態及び疾病状態のそれぞれに対応したシステム（１）のネットワーク状態の一例を概念的に示している。さらに、図２のｈは、疾病前状態におけるＤＮＢの因子項目となる分子濃度の時間変化の一例を示している。

ノードｚ１〜ｚ６は、遺伝子、タンパク質、代謝物等の異なる種類の生体分子に係る因子項目を表すものであり、ノードｚ１〜ｚ６の間の接続ラインは、ノード間の相関を示し、ラインの太さは、ピアソン相関係数ＰＣＣの大きさを示し、ｚ１〜ｚ６を囲む丸印の描画方法は、各ノードの標準偏差ＳＤの大きさを示している。接続ラインの描画方法として、丸印内が空白の場合に標準偏差ＳＤは最も小さく、一方向の斜線、二方向の斜線となるにつれて標準偏差ＳＤが大きいことを示している。

正常状態において、図２のｅに示すように、各ノードは、相互の相関及びそれぞれの標準偏差がいずれも均等で、中レベルになっている。しかしながら、疾病前状態になると、他のノードに比べて、著しい特異な特性を示すグループ（ｚ１〜ｚ３）が現れる。当該グループ内のノードｚ１〜ｚ３は、図２のｆに示すように、相互間のピアソン相関係数が著しく増大し、他のノードｚ４〜ｚ６との間のピアソン相関係数が著しく低下している。また、当該グループ内のノードｚ１〜ｚ３の標準偏差は大きくなっている。その理由は、当該グループ内のノードｚ１〜ｚ３は、図２のｈに示すように、異なる時刻（ｔ＝１、ｔ＝２、ｔ＝３）における濃度の変化が激しいからである。

しかしながら、疾病状態へ遷移した後は、図２のｇに示すように、当該グループ内の各ノードｚ１〜ｚ３の標準偏差はすこし大きくなっているが、各ノード間のピアソン相関係数は均等に中レベルに戻っている。即ち、当該グループ（ｚ１〜ｚ３）の上記の特異な特性が消失している。

図２に概念的に示すように、疾病前状態において、得意な特性を有する一部のノードを含む支配グループが出現する。本願において、ＤＭＢと称するこのような支配グループは、疾病前状態にあることを示し、疾病状態への遷移を予告することができる警告信号として、疾病の早期診断のためのバイオマーカーとして使用することができる。また、ＤＮＢは、通常の疾病診断に使われている静的バイオマーカーと異なり、特性が変化しているネットワークにおいて現れるサブネットワークである。そこで、本願においては、当該支配グループをＤＮＢ（動的ネットワークバイオマーカー）と呼ぶこととした。

＜警告信号＞
上述したように、ＤＮＢは、疾病前状態を示す警告信号として、疾病の早期診断に使用することができる。当該警告信号の強度を測るものとして、上述したＤＮＢ内のノード間のピアソン相関係数ＰＣＣの絶対値の平均値、ＤＮＢ内のノードと他のノードとの間のピアソン相関係数ＯＰＣＣの絶対値の平均値、及びＤＮＢの標準偏差ＳＤを用いることができる。さらに、ＤＮＢの特性を総合的に反映することができる総合指数Ｉを導入することができる。本発明において、一例として、次の式（２）で表す総合指数Ｉを導入する。

Ｉ＝ＳＤｄ×ＰＣＣｄ／ＯＰＣＣｄ …式（２）

式（２）において、ＰＣＣｄはＤＮＢ内のノード間のピアソン相関関数の絶対値の平均値を示し、ＯＰＣＣｄはＤＮＢ内のノードと他のノードとのピアソン相関係数の絶対値の平均値を示し、ＳＤｄはＤＮＢ内のノードの標準偏差の平均値を示す。当該式（２）から分かるように、ＳＤｄ及びＰＣＣｄが増大し、かつ、ＯＰＣＣｄが減少すると、当該総合指数Ｉは大幅に増大する。そのため、ＤＮＢの特性を高い感度で検出することができる。さらに、当該総合指数Ｉの値から、疾病状態との距離をある程度把握することができる。

＜ＤＮＢの検出方法＞
図３は、実施の形態におけるＤＮＢの検出方法の一例を示すフローチャートである。本発明の検出方法においては、先ず、生体に関する測定により測定データを得ることが必要である。ＤＮＡチップなどのハイスループット技術を利用すれば、１つの生体サンプルから２万個以上の遺伝子を測定することができる。統計的に分析するために、本発明において、測定対象から複数（６個以上）の生体サンプルを異なる時間点で採取し、採取した生体サンプルを測定して得られた測定データを集計して統計データを取得する。本発明におけるＤＮＢの検出方法は、主に、図３に示すように、ハイスループットデータの取得処理（ｓ１）と、差次的生体分子の選出処理（ｓ２）と、クラスター化処理（ｓ３）と、ＤＮＢの候補の選出処理（ｓ４）と、有意性分析によるＤＮＢの判定処理（ｓ５）とを含む。次に、これらの各処理について詳細に説明する。

ステップｓ１のハイスループットデータの取得処理は、検出対象となるサンプルをケースサンプルとし、参照用サンプルをコントロールサンプルとし、各サンプルから、それぞれのハイスループット生理学的データ、即ち、生体分子の発現量の測定データ（例えば、マイクロアレイデータ）を取得する処理である。参照用サンプルとは、検査の対象となる患者から事前に採取したサンプル、採取時に最初に採取したサンプル等のサンプルであり、測定装置の校正等の目的を有するコントロールサンプルとして用いられる。コントロールサンプルは、必ずしも必要ではないが、誤差要因を排除し、測定の信頼性を向上させるために有用である。

ステップｓ２の差次的生体分子の選出処理は、発現量に著しい変化を示した生体分子を選択する処理である。図４は、実施の形態における差次的生体分子の選出処理の一例を示すフローチャートである。図４は、図３に示したステップｓ２の差次的生体分子の生体処理を詳細に示したものである。

図４に示すように、まず、ｎ個のケースサンプルからそれぞれ測定したハイスループットデータ（生体分子の発現量）に基づく統計データをＤ１ｃとし、コントロールサンプルから測定したデータをＤｒとする（ｓ２１）。次に、各ケースサンプル生体分子Ｄ１ｃに対して、スチューデントのｔ検定を行い、コントロールサンプルのハイスループットデータＤｒに比べて発現量に著しい変化を示した生体分子Ｄ２ｃを選出する（ｓ２２）。ステップｓ２２では、発現量に著しい変化を示した生体分子Ｄ２ｃを選出する方法として、スチューデントのｔ検定を例示しているが、特に手法を限定するものではない。例えば、マン・ホイットニーのＵ検定等の他の検定方法を適用することも可能であり、このようなノンパラメトリック手法による検定は、母集団となるＤ１ｃが正規分布に従わない場合に、特に有効である。また、スチューデントのｔ検定をする場合においても、有意水準αの値は、０．０５、０．０１等の値を適宜設定することができる。

次に、誤発現率ＦＤＲを用いて、各ケースサンプル生体分子Ｄ２ｃに対して、複数の比較（multiple comparisons）又は複数のスチューデントのｔ検定を補正し、補正後の各ケースサンプル遺伝子又はタンパクデータＤ３ｃを選出する（ｓ２３）。次に、２倍変更方法（The two-fold change method）を用いて、補正後の各ケースサンプル遺伝子又はタンパクデータＤ３ｃから標準偏差ＳＤが比較的著しく変化するＤｃを差次的生体分子として選出する。ここで選出された差次的生体分子Ｄｃは、コントロールサンプルの生体分子Ｄｒに比べて、著しい差異を示すだけではなく、自分の平均値からも大きく逸脱している。ステップｓ２３においても、検定方法はスチューデントのｔ検定に限るものではない。

次に、クラスター化処理（図３のｓ３）を行う。ここでいうクラスター化処理とは、複数の生体分子を、互いに相関の高いグループにそれぞれ分類する処理であり、生体分子が分類されたそれぞれのグループをクラスターと称する。即ち、互いに相関の高い生体分子を１つのクラスターにするように、図４に示すステップｓ２４で選択した差次的生体分子Ｄｃを、ｎ個のクラスターに分類する。得られた全てのクラスターは、潜在的な支配グループ、即ち、検出すべきＤＮＢの候補となる。

次に、図３に示すＤＮＢの候補の選出処理（ｓ４）を行う。図５は、実施の形態におけるＤＮＢの候補の選出処理の一例を示すフローチャートである。図５は、図３に示したステップｓ４のＤＮＢの候補の選出処理を詳細に示したものである。即ち、ＤＮＢの候補の選出処理は、図５に示すＤＮＢの候補の選出処理のフローチャートに基づいて処理を行う。図５に示す循環ループで、すべてのクラスター（ｋ）（ｋ＝１，... ，ｎ）について、クラスター内のノードの間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＰＣＣｄ（ｋ）、クラスター内のノードと他のノードとの間のピアソン相関関数の絶対値の平均値ＯＰＣＣｄ（ｋ）、クラスター内のノードの標準偏差の平均値ＳＤｄ（ｋ）、及び総合指数Ｉ（ｋ）を計算する（ｓ４１〜ｓ４６）。そして、すべてのクラスターから、総合指数Ｉの値が一番大きいクラスターをＤＮＢの候補として選出する（ｓ４７）。

次に、図３に示す有意性分析によるＤＮＢの判定処理（図３のｓ５）を行う。図６は、実施の形態におけるＤＮＢの判定処理の一例を示すフローチャートである。図６は、図３に示したステップｓ５の優位性分析によるＤＮＢの判定処理を詳細に示したものである。即ち、上述したＤＮＢの判定条件（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に基づいて、ステップｓ４７でＤＮＢの候補として選出されたクラスター（ｍ）はＤＮＢであるか否かを判定する。様々な有意性分析によって判定することができるが、一例として、図６に示すＤＮＢの判定処理のフローチャートに基づいて処理を行う。

図６に示すように、まず、コントロールサンプルから取得したデータの各ノード間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＰＣＣｄｒ、及び各ノードの標準偏差の平均値ＳＤｄｒをそれぞれ計算する（ｓ５１、ｓ５２）。そして、コントロールサンプルのピアソン相関係数の平均値ＰＣＣｄｒに比べて、ステップｓ４７で選出したクラスター（ｍ）内の各ノード間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＰＣＣｄ（ｍ）が有意に増大したか否かを判断する（ｓ５３）。有意に増大していないと判断した場合（ＮＯ）、ＤＮＢが存在しないとの結果を出力し、処理を終了する（ｓ５７）。他方、有意に増大したと判断した場合（ＹＥＳ）、次のステップｓ５４に進む。ステップｓ５４において、コントロールサンプルのピアソン相関係数の平均値ＰＣＣｄｒに比べて、クラスター（ｍ）内の各ノードと他のノードとのピアソン相関係数の平均値ＯＰＣＣｄ（ｍ）が有意に低減したか否かを判断する（ｓ５４）。有意に低減していないと判断した場合（ＮＯ）、ＤＮＢが存在しないとの結果を出力し（ｓ５７）、処理を終了する。他方、有意に低減したと判断した場合（ＹＥＳ）、次のステップｓ５５に進む。ステップｓ５５において、コントロールサンプルの標準偏差平均値ＳＤｒに比べて、クラスター（ｍ）内のノードの標準偏差平均値ＳＤｄ（ｍ）が有意に増大したか否かを判断する。有意に増大していないと判断した場合（ＮＯ）、ＤＮＢが存在しないと判断して（ｓ５７）、処理を終了させる。他方、有意に増大したと判断した場合、クラスター（ｍ）をＤＮＢと認定して（ｓ５６）、処理を終了させる。

＜ＤＮＢによる疾病の早期診断方法＞
診断スケジュールとしては、一定な間隔を開けて、複数回診断を行い、毎回の診断で数個のサンプルを取ることが望ましい。図７は、実施の形態におけるＤＮＢを用いた疾病の早期診断の診断スケジュールの一例を示す図である。図７に示すように、複数の段階（段階１、段階２、…、段階Ｔ）で、サンプルを採取する。各段階で採取するサンプルの数は、データの精度を確保するために、通常、１つの段階において、６個以上のサンプルを採取することが望ましい。２つの連続した段階の間の間隔は、疾病の状況によって、数日、数週間、数カ月、又は数年と長く設定することができるが、各段階では、短い期間において異なる時間点でサンプルを採取することが望ましい。例えば、６個のサンプルを１日のうちの６つの時間点で採取する。各時間点の間の間隔は、状況に応じて、例えば、数分間、数時間とすることができる。

図８は、実施の形態におけるＤＮＢによる疾病の早期診断方法の一例を示すフローチャートである。図８に示すように、ＤＮＢによる疾病の早期診断方法は、主に、サンプル採取処理（ｓ１００）と、差次的生体分子の選出（ｓ２００）と、ＤＮＢの候補の選出処理（ｓ３００）と、有意性分析によるＤＮＢの判定処理（ｓ４００）と、診断結果の出力処理（ｓ５００）とを含む。次に、これらの処理内容について詳細に説明する。

サンプル採取処理（ｓ１００）：一般の疾病診断方法と同じように、診断する疾病に応じて、必要な生理データを取るためのサンプルを採取する。例えば、肝臓障害の場合、血液、肝臓の組織などのサンプルを採取する。

また、診断する際に診断対象から採取したサンプルをケースサンプルとする他に、参照用のサンプルとして、診断対象以外の健康な人から採取したサンプル、又は診断対象から最初に採取したサンプルをコントロールサンプルとすることができる。

差次的生体分子の選出（ｓ２００）：図４に示した差次的生体分子の選出処理フローチャートにしたがって、上記ステップｓ１００で採取したサンプルから、差次的生体分子を選出する。

ＤＮＢの候補の選出処理（ｓ３００）：図５に示したＤＮＢの候補の選出フローチャートにしたがって、上記ステップｓ２００で選出した差次的生体分子から、ＤＮＢの候補となる支配グループを選出する。

有意性分析によるＤＮＢの判定処理（ｓ４００）：図６に示した有意性分析によるＤＮＢの判定方法を示すフローチャートにしたがって、上記ステップｓ３００で選出したＤＮＢの候補がＤＮＢであるか否かを判定する。

診断結果の出力（ｓ５００）：上記ステップｓ４００において、ＤＮＢが存在しないと判断した場合、上記ステップｓ３００で選出したＤＮＢの候補のデータを次回の診断の参照データとして記憶装置に保存し、異常が認めない旨の診断結果を出力する。一方、上記ステップｓ４００において、ＤＮＢと認定されたクラスターが存在すると判断した場合、認定されたクラスターの生体分子データをＤＮＢのメンバーとして記憶し、疾病前状態にある旨の診断結果を出力する。また、検出したＤＮＢに関連づけた診断結果を出力することもできる。なお、ここでは、診断結果として示しているが、詳細には、例えば、医師による診断の参考となる結果であり、ステップｓ５００にて出力される診断結果は、医師による診断そのものではなく、医師の診断の補助となり、診断を支援すべく診断の参考となる出力データである。

例えば、ＤＮＢの特性を総合的に反映する総合指数Ｉを出力することができる。当該総合指数Ｉが大きければ大きいほど、分岐点に近いので、総合指数Ｉに比例した疾病リスクを直観的に見ることができる図形又は画像の形で出力すると、ワーンニング効果が高くなる。

図９及び図１０は、総合指数Ｉに比例した疾病リスクを表示する図形の一例である。図９において、矢印全体は疾病前状態（発病前期）を示し、矢印により示される方向の流れが疾病状態（発病）の経時変化を指しており、矢印内の左側に位置するひし形マークは診断で得られた総合指数Ｉの値に応じて位置が変化する発病リスクポインターである。総合指数Ｉの値が大きければ大きいほどひし形マークが矢印の右側に近づくように設定する。

また、以前にもＤＮＢを用いて疾病の早期診断を受けたことがある場合、前回診断で得られた総合指数と一緒に、図１０のように、総合指数Ｉに比例した疾病リスクを表示することができる。図１０において、点線のひし形マークが２０１１年７月１日の診断で得られた総合指数を示し、実線のひし形マークが２０１１年９月１日の診断で得られた総合指数を示している。ひし形マークの位置変動から、疾病状態に近づいていくことを直観的に判断することができる。

また、ＤＮＢに関連づけた情報として、検出したＤＮＢを含んだ全ネットワーク、又は当該ＤＮＢを含んだ一部のネットワークのマップ（例えば、後述の図１５）を出力することができる。

さらに、ＤＮＢのメンバーである生体分子のリストを出力することもできる。上述したように、ＤＮＢは、正常状態から疾病状態へ遷移する疾病前状態に現れるものであるが、ＤＮＢとして検出された生体分子、即ち遺伝子、タンパク質又は代謝物自身が、必ずしも疾病を悪化させる要因となる病的遺伝子、タンパク質又は代謝物とは限らない。ただし、ＤＮＢメンバーの一部が疾病と関連していることが判明している。

そのため、検出したＤＮＢのメンバーに含まれた、特定の疾病と関連性のあるもの（遺伝子、タンパク質又は代謝物）を抽出すると、例えば、医師の診断により、検診者等の診断対象が発症する可能性のある疾病をある程度把握することができる。

したがって、上述した「診断結果の出力」（図８のｓ５００）に続いて、遺伝子、タンパク質又は代謝物と疾病との対応関係を記憶したデータベースを利用して、検出したＤＮＢから疾病と関連性のある遺伝子、タンパク質又は代謝物を抽出して、診断の参考となる診断結果として出力することができる。

そうすれば、健康診断を受ける人から例えば血液を採取して、その血液から得た遺伝子、タンパク質又は代謝物のデータからＤＮＢを検出した場合、当該ＤＮＢに含まれている遺伝子、タンパク質又は代謝物と関連性がある疾病をある程度特定することができ、検診者が持つ潜在的疾病を早期段階で診断することができる。

＜検出装置＞
以上詳述したＤＮＢの検出方法は、コンピュータを用いた検出装置として本発明を具現化することができる。図１１は、本発明に係る検出装置の構成例を示すブロック図である。図１１に示す検出装置１は、パーソナルコンピュータ、サーバコンピュータに接続されるクライアントコンピュータ、その他各種コンピュータを用いて実現される。検出装置１は、制御部１０、記録部１１、記憶部１２、入力部１３、出力部１４、取得部１５等の各種機構を備えている。

制御部１０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit ）等の回路を用いて構成され、検出装置１全体を制御する機構である。

記録部１１は、ＨＤＤ（Hard Disk Drive）等の磁気記録機構、ＳＳＤ（Solid State Disk）等の不揮発性半導体記録機構等の不揮発性の補助記録機構である。記録部１１には、本発明に係る検出プログラム１１ａ等の各種プログラム及びデータが記録されている。

記憶部１２は、ＳＤＲＡＭ（Synchronous Dynamic Random Access Memory）、ＳＲＡＭ（Static Random Access Memory）等の揮発性の主記憶機構である。

入力部１３は、キーボード、マウス等のハードウェア、及びドライバ等のソフトウェアを備える入力機構である。

出力部１４は、モニタ、プリンタ等のハードウェア、及びドライバ等のソフトウェアを備える出力機構である。

取得部１５は、外部から各種データを取得する機構である。具体的には、通信網を介してデータを取り込むＬＡＮ（Local Area Network）ポート、測定機器に接続可能なパラレルケーブル等の専用線に接続するポート等の各種ハードウェア、及びドライバ等のソフトウェアである。

そして、記録部１１に記録されている検出プログラム１１ａを、記憶部１２に記憶し、制御部１０の制御に基づき実行することにより、コンピュータは、検出プログラム１１ａに係る各種手順を実行し、本発明の検出装置１として機能する。なお、便宜上、記録部１１及び記憶部１２として分けているが、両者とも各種情報の記録という同様の機能を有するものであり、装置の仕様、運用形態等に応じていずれの機構に記録させるかは、適宜決定することが可能である。

図１２は、本発明に係る検出装置１によるＤＮＢの検出処理の一例を示すフローチャートである。本発明に係る検出装置１の処理は、前述のＤＮＢの検出処理を実行するものである。検出装置１の制御部１０は、取得部１５により、生体に関する測定により得られた複数の因子項目についての測定データを取得する（Ｓｃ１）。ステップＳｃ１は、図３のステップｓ１として示したハイスループットデータの取得処理に対応する。なお、ここではコンピュータ処理の対象として表現するため、因子項目として表現しているが、ここでいう因子項目とは、前述のＤＮＢのノードとなり得る遺伝子に関する測定項目、タンパク質に関する測定項目、代謝物に関する測定項目等の測定項目を示している。なお、ＣＴスキャン等の測定装置にて出力される体内画像から得られる画像に関する測定項目を用いることも可能である。

制御部１０は、取得した因子項目のそれぞれの測定データが、有意性をもって経時的に変化しているか否かを検定し、検定した結果に基づいて差次的生体分子を選出する（Ｓｃ２）。ステップＳｃ２は、図３のステップｓ２として示した差次的生体分子の選出処理に対応する。

したがって、ステップＳｃ２の処理は、制御部１０が、各因子項目の測定データ、並びに因子項目及び時系列毎に予め設定されている参照データとの比較結果に基づいて、有意性に関する検定を行い（Ｓｃ２１）、経時変化に有意性があると検定された因子項目を選出する処理（Ｓｃ２２）を含む。即ち、図４に示した各種処理を実行する。なお、検出装置１が参照データとして処理するデータとは、コントロールサンプルであり、例えば、最初に取得したサンプルをコントロールサンプルとする等の設定に基づき、検出装置１は、当該サンプルに対して参照データとしての取り扱いを行う。

制御部１０は、選出した各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化の相関関係に基づいて複数の因子項目を複数のクラスターに分類する（Ｓｃ３）。ステップＳｃ３は、図３のステップｓ３として示したクラスター化処理に対応する。

制御部１０は、分類した各クラスターから、各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化及び各因子項目間の測定データの時系列変化の相関関係に基づいて予め設定された選出条件に該当するクラスターを選出する（Ｓｃ４）。ステップＳｃ４は、図３のステップｓ４として示したＤＮＢの候補の選出処理に対応する。

したがって、ステップＳｃ４の処理は、制御部１０が、それぞれのクラスターに対し、クラスター内の各因子項目の測定データの相関を示す値の平均値を第１指数として算出し（Ｓｃ４１）、クラスター内の因子項目の測定データと当該クラスター外の因子項目の測定データとの間の相関を示す値の平均値を第２指数として算出し（Ｓｃ４２）、クラスター内の各因子項目について測定データの標準偏差の平均値を第３指数として算出する処理（Ｓｃ４３）を含む。さらに、ステップＳｃ４の処理は、制御部１０が、第１指数と、第２指数と、第３指数の逆数との積に基づく総合指数を算出し（Ｓｃ４４）、算出した総合指数が最大であるクラスターを選出する処理（Ｓｃ４５）を含む。即ち、図５に示した各種処理を実行する。なお、第１指数、第２指数、第３指数及び総合指数としては、例えば、クラスター内のノードの間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＰＣＣｄ（ｋ）、クラスター内のノードと他のノードとの間のピアソン相関関数の絶対値の平均値ＯＰＰＣｄ（ｋ）、クラスター内のノードの標準偏差の平均値ＳＤｄ（ｋ）、及び総合指数Ｉ（ｋ）がそれぞれ用いられる。

制御部１０は、選出したクラスターに含まれる因子項目をバイオマーカーの候補として検出する（Ｓｃ５）。ステップＳｃ５は、図３のステップｓ５として示したＤＮＢの判定処理に対応する。

したがって、ステップＳｃ５の処理は、制御部１０が、各因子項目について、対応する参照データの標準偏差の平均値を示す参照標準偏差を算出し（Ｓｃ５１）、因子項目間の相関を示す値の平均値を示す参照相関値を算出する（Ｓｃ５２）。そして、第１指数が参照標準偏差に比べて有意性をもって増大し、第２指数が前記参照相関値に比べて有意性をもって減少し、かつ、第３指数が参照標準偏差に比べて有意性をもって増大した場合に、当該クラスターに含まれる項目をバイオマーカーとして検出する処理（Ｓｃ５３）を含む。即ち、図６に示した各種処理を実行する。なお、参照標準偏差及び参照相関値としては、例えば、各ノード間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＰＣＣｄｒ及び各ノードの標準偏差の平均値ＳＤｄｒがそれぞれ用いられる。

そして、制御部１０は、バイオマーカーの候補として検出した因子項目を出力部１４から出力し（Ｓｃ６）、処理を終了する。

＜第１の検証例＞
本発明のＤＮＢによる疾病の早期診断方法の診断精度を検証するために、肺障害が引き起こされたマウスの実験データを用いて、本発明の診断方法で診断を行い、その診断結果を実際の病状進行状況と比較して、本発明の診断方法の有効性を検証した。次に、当該検証例を詳細に説明する。実験データは、複数の実験用ＣＤ-１雄マウスをケースグループと、コントロールグループとに分けて、ケースグループを通常の空気環境に、コントロールグループを有毒ガスであるホスゲンが含まれている空気環境に置き、そして、両グループのマウスの健康状況を観察し、ホスゲンの吸入による急性肺損傷の分子レベルのメカニズムを調べるという実験から得られたものである。当該実験データを用いて、本発明の診断方法を用いて、ホスゲン曝露されているケースグループのマウスの健康状況を診断した。通常、マウスは一定量のホスゲンを吸入すると、ホスゲン誘発性肺障害を発症する。

図１３は、第１の検証例における診断用のデータを示すテーブルである。図１３に示すように、診断対象は、ホスゲン誘発性肺障害にかかったマウス（ＣＤ-１雄マウス）であり、サンプル採取対象は、診断対象となるケースグループ及び参照対象となるコントロールグループのマウスの肺組織であり、サンプリングポイントは、実験開始後の０、０．５、１、４、８、１２、２４、４８、７２時間が経過した時間点であり、ＤＮＢの検出に用いた遺伝子の数は２２６９０個である。

本発明の診断方法を用いて、具体的に、次の処理を行った。

まず、それぞれのサンプルから測定したハイスループット遺伝子データから差次的発現遺伝子を選択する。各々のサンプリングポイントにおいて、６つのケースサンプルと６つコントロールサンプルが提供されている。最初のサンプリングポイント（０ｈ）において、ケースサンプルのデータはコントロールサンプルのデータと同じである。

各々のサンプリングポイントにおいて、有意水準ｐ＜０．０５のスチューデントのｔ検定を用いて、それぞれ、Ａ＝［０、５３、１８４、１３２５、１３２７、７３８、９８０、１２６３、９１５］の差次的遺伝子を選出した。

そして、選出した差次的遺伝子のセットＡに対して、誤発現率（ＦＤＲ）及び２倍変更スクリーニングを用いることにより、各サンプリングポイントに対して、それぞれ、Ｂ＝［０、２９、７２、１９５、２６９、１６３、１７３、１８８、１７６］の遺伝子を選出した。

選出した遺伝子セットＢに対して、各サンプリングポイントにおいて、相関の高いものを１つのクラスターにまとめるクラスター化を行い、それぞれ、４０個のクラスターを得た。

さらに、各サンプリングポイントにおいて、得られた４０個のクラスター内の全ての遺伝子に対して、データの正規化を行う。そして、各サンプリングポイントにおいて、正規化されたコントロールグループ及びケースグループにおける各クラスターのそれぞれの標準偏差の平均値ＳＤｄ（第３指数）、クラスターのメンバー間のピアソンの相関係数の絶対値の平均値ＰＣＣｄ（第２指数）、クラスターのメンバーと他の遺伝子との間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＯＰＣＣｄ（第１指数）、及び総合指数Ｉを計算する。

そして、各サンプリングポイントにおいて、計算したケースグループにおける各クラスターから、総合指数Ｉが一番大きいクラスターをＤＮＢの候補として選出し、さらに、当該ＤＮＢの候補に対して、コントロールグループの標準偏差の平均値ＳＤｃ、遺伝子間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＰＣＣｃを基準に、有意性分析により、ＤＮＢであるか否かを判断する。その結果、各サンプリングポイントにおいて、ＤＮＢとなるクラスターの数は、［０、０、０、０、１、０、０、０、０］であった。

即ち、第５のサンプリングポイント（８ｈ）でＤＮＢが検出された、当該ＤＮＢは２２０個の遺伝子を有する第１１１番目のクラスターである。

図１４Ａは、第１の検証例において、検出されたＤＮＢの候補の標準偏差の平均値ＳＤｄの時系列変化の例を示すグラフである。図１４Ｂは、第１の検証例において、検出されたＤＮＢの候補のクラスターのメンバー間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＰＣＣｄの時系列変化の例を示すグラフである。図１４Ｃは、第１の検証例において、検出されたＤＮＢの候補のクラスターのメンバーと他の遺伝子との間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＯＰＣＣｄの時系列変化の例を示すグラフである。図１４Ｄは、第１の検証例において、検出されたＤＮＢの候補の総合指数Ｉの時系列変化の例を示すグラフである。図１４Ａ〜図１４Ｄにおいて、横軸は時間段階ｔを表し、縦軸は、それぞれ、標準偏差の平均値ＳＤｄ（図１４Ａ）、クラスターのメンバー間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＰＣＣｄ（図１４Ｂ）、クラスターのメンバーと他の遺伝子との間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＯＰＣＣｄ（図１４Ｃ）、及び総合指数Ｉを示している（図１４Ｄ）。破線は、ケースグループから検出したＤＮＢの候補の各種指数の経時変化を示し、実線は、コントロールグループから選んだ１クラスターの各種指数の経時変化を示している。

図１４Ａ〜図１４Ｄから分かるように、第４の時間段階 （即ち、4時間経過）から、ＤＮＢの候補の第１指数ＰＣＣｄ、第３指数ＳＤｄ及び総合指数Ｉは大きく増加し始め、第５の時間段階 （即ち、８時間経過）でピークに達している。一方、ＤＮＢの候補の第３指数ＯＰＣＣｄは第２の時間段階から低減し、同じ第５の時間段階 （即ち、８時間経過）で極小値を示している。

また、ＤＮＢの動的特性を直観的に示すために、ＤＮＢを含む全遺伝子ネットワークの動的特性を図１５に示す。図１５は、第１の検証例において、ケースグループの遺伝子によって構成されたネットワークにおけるＤＮＢの動的特性の一例を経時的に示すマップである。図１５には、順に０．５、１、４、８、１２、２４、４８、７２ｈの各サンプリングポイントで、ケースグループの遺伝子ネットワーク（３４５２個の遺伝子、９２３８個のリンク）が表示されており、「〇」で表示しているノードはＤＮＢの候補に属する遺伝子であり、「□」で表示しているノードはＤＮＢの候補のノード付近の他の遺伝子であり、ノードとノードとの間のラインは両ノードの相関性を示している。また、「〇」の色の濃さが遺伝子の標準偏差ＳＤの大きさを示し、両ノードを接続ラインの濃さが両ノードの相関係数ＰＣＣの絶対値の大きさを示している。全てのマップはCytoscape （http://www.cytoscape.org/）を用いて構成されたものである。

図１５に示すように、ＤＮＢの候補の特性（ＳＤ、ＰＣＣ）が時間の経過とともに変化し、他の遺伝子と同じ振る舞いをする通常のクラスターから、次第にＤＮＢへと進化していく。図１５のｅに示す第５の段階（８ｈが経過した時）で、ＤＮＢとしての特徴が最も著しく、疾病前状態 （８ｈ）である警告信号をはっきり示している。しかしながら、疾病状態へ遷移した後（２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ）、ＤＮＢのメンバーは、再び他の遺伝子と同じ振る舞いをするようになっている。

当該結果から、疾病前状態は第５の時間段階の近くに存在し、第５の時間段階の後、システムは疾病状態へ遷移するということが判明される。

したがって、本発明のＤＮＢによる疾病の早期診断方法で診断する場合、第４の時間段階での診断で、疾病になる警告信号が少し見えているため、近いうち疾病が悪化するとの診断結果を出すことができる。そして、第５の時間段階での診断では、疾病になる警告信号をはっきり見えているため、間もなく疾病になるとの診断結果を出すことができる。

一方、実際のマウス実験の結果では、ケースグループのマウスは、ホスゲンを吸入してから８時間後に、肺水腫が起こし、１２時間後に５０％〜６０％が死亡し、２４時間後に、さらに６０％〜７０％ が死亡した。

したがって、本発明のＤＮＢによる早期診断の診断結果は、マウスの実際の病気悪化状況と完全に一致しているということができる。

＜第２の検証例＞
上述した第１の検証例において、動物実験のデータを用いて、本発明のＤＮＢによる疾病の早期診断方法の有効性を検証した。本検証例では、Ｂ細胞リンパ腫の臨床データを用いて、さらに、本発明のＤＮＢによる疾病の早期診断方法の診断精度を検証する。

図１６は、第２の検証例における診断データをリストしたテーブルである。図１６に示すように、臨床像、病変及びフローサイトメトリーに基づいて、サンプルは、安静期（Ｐ１）、活性期（Ｐ２）、限界期（Ｐ３）、転移期（Ｐ４）、侵攻期（Ｐ５）の５つの段階のグループに分けられている。各段階において、サンプルの数は、それぞれ、５、３、６、５、７である。各段階において、脾腫は、それぞれ、「Ｎｏｎｅ」、「Ｎｏｎｅ」、「＋／−」、「＋」、「＋＋＋」である。各段階において、フローサイトメトリーは、それぞれ、「正常安静」、「正常活性」、「異常」、「ミックスト」、「Ｂ−１クローン」である。また、安静期（Ｐ１）で採取したサンプルをコントロールサンプルとし、他の段階（Ｐ２〜Ｐ５）で採取したサンプルをケースサンプルとする。

上記２６個のサンプルから測定した遺伝子発現データから１３７１２個の遺伝子を対象に、上述したＤＮＢによる疾病の早期診断方法で診断を行った。その結果として、図１７Ａ〜図１７Ｄに、ケースグループの遺伝子から検出したＤＮＢの候補の各指数を示す。図１７Ａは、第２の検証例において、検出されたＤＮＢの候補の標準偏差の平均値ＳＤｄの時系列変化の例を示すグラフである。図１７Ｂは、第２の検証例において、検出されたＤＮＢの候補のクラスターのメンバー間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＰＣＣｄの時系列変化の例を示すグラフである。図１７Ｃは、第２の検証例において、検出されたＤＮＢの候補のクラスターのメンバーと他の遺伝子との間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＯＰＣＣｄの時系列変化の例を示すグラフである。図１７Ｄは、第２の検証例において、検出されたＤＮＢの候補の総合指数Ｉの時系列変化の例を示すグラフである。

図１７Ａ〜図１７Ｄにおいて、横軸は段階（Ｐ１〜Ｐ４）の番号を示しており、縦軸は、それぞれ、標準偏差の平均値ＳＤｄ（図１７Ａ）、クラスターのメンバー間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＰＣＣｄ（図１７Ｂ）、クラスターのメンバーと他の遺伝子との間のピアソン相関係数の絶対値の平均値ＯＰＣＣｄ（図１７Ｃ）、及び総合指数Ｉを示している（図１７Ｄ）。

図１７Ａ〜図１７Ｄから明らかなように、第２の段階（Ｐ２）、即ち活性期において、ＤＮＢの候補の総合指数Ｉがピークに達しており、疾病状態を示す警告信号が最も強くなっている。この診断結果は、実際の病変と完全に一致している。実際の臨床データでも、活性期の直後の限界期から病状が悪化して、脾腫が「＋／−」となり、フローサイトメトリーが「異常」になっている。したがって、本検証例におけるＤＮＢ特定の解析結果と実際の臨床データと完全に一致している。

また、通常の診断では、図１６に示すように、活性期における脾腫が「Ｎｏｎｅ」、フローサイトメトリーが「正常活性」となっているため、異常が認めないとの診断結果になる。それに対して、本発明のＤＮＢによる疾病の早期診断方法で診断する場合、活性期において、疾病前状態を示す警告信号（ＤＮＢ）を検出したため、「異常の兆候が見られる」との診断結果を患者に伝えることができる。そのため、患者は早期段階で治療措置を取ることにより、病状の悪化を止める。

したがって、本発明のＤＮＢによる疾病の早期診断は、リンパ腫のような複雑疾病の早期診断に大変有効であることが検証されている。

また、本検証例におけて検出されたＤＮＢの中に、２２個の遺伝子とＴＦｓが含まれており、そのうち、１３個の遺伝子が明らかにＢ細胞リンパ腫と関連しており、さらに、当該１３個の遺伝子のうちの８個が増殖のマスタレギューレターであることが判明されている。したがって、本発明におけるＤＮＢは、疾病前状態を示す警告信号として、早期段階で異常の兆候を患者に伝えることができるだけではなく、疾病と関連している遺伝子も具体的に特定することができるため、複雑疾病の治療、製薬に非常に役に立つと思われる。

前記実施の形態は、本発明の無数に存在する実施例の一部を開示したに過ぎず、疾病の種類、検出すべき目的等の様々な要因を加味して適宜設計変更することが可能である。特に、因子項目としては、生体に関する測定により得られた情報であれば、様々な測定データを用いることができる。例えば、前述の遺伝子、タンパク質、代謝物に関する測定データに限らず、ＣＴスキャン等の測定装置にて出力される体内画像に基づいて、各部位の様々な状況を数値化することにより、測定データとして用いることが可能である。更には、画像以外にも、声又は体内から発せられる音を測定し、数値化した上で測定データとして用いることも可能である。

１ 検出装置
１０ 制御部
１１ 記録部
１２ 記憶部
１３ 入力部
１４ 出力部
１５ 取得部
１１ａ 検出プログラム

Claims (11)

1. 生体に関する測定により得られた複数の因子項目についての測定データに基づいて、測定対象である生体の症状の指標となるバイオマーカーの候補を検出する検出装置であって、
   前記各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化の相関関係に基づいて複数の因子項目を複数のクラスターに分類する分類手段と、
   分類した各クラスターから、前記各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化及び各因子項目間の測定データの時系列変化の相関関係に基づいて予め設定された選出条件に該当するクラスターを選出する選出手段と、
   選出したクラスターに含まれる因子項目をバイオマーカーの候補として検出する検出手段と
   を備えることを特徴とする検出装置。
2. 請求項１に記載の検出装置であって、
   前記選出手段は、
   クラスター内の各因子項目間の測定データの相関を示す値の平均値を第１指数として算出する手段と、
   クラスター内の因子項目の測定データと当該クラスター外の因子項目の測定データとの間の相関を示す値の平均値を第２指数として算出する手段と、
   クラスター内の各因子項目について測定データの標準偏差の平均値を第３指数として算出する手段と
   を含み、
   複数のクラスターのうちから、第１指数、第２指数及び第３指数に基づいて、バイオマーカーとすべき因子項目を含むクラスターを選出する
   ことを特徴とする検出装置。
3. 請求項２に記載の検出装置であって、
   前記選出手段は、前記第１指数と、前記第２指数と、前記第３指数の逆数との積に基づく総合指数が最大であるクラスターを選択する
   ことを特徴とする検出装置。
4. 請求項２又は請求項３に記載の検出装置であって、
   前記各因子項目のそれぞれの測定データが、有意性をもって経時的に変化しているか否かを検定する差次検定手段を更に備え、
   前記分類手段は、経時的変化に有意性があると検定された因子項目について分類する
   ことを特徴とする検出装置。
5. 請求項４に記載の検出装置であって、
   前記差次検定手段は、各因子項目の測定データ、並びに因子項目及び時系列毎に予め設定されている参照データとの比較結果に基づいて、有意性に係る検定を行う
   ことを特徴とする検出装置。
6. 請求項５に記載の検出装置であって、
   各因子項目について、対応する参照データの標準偏差の平均値を示す参照標準偏差、及び因子項目間の相関を示す値の平均値を示す参照相関値を算出する手段を更に備え、
   前記検出手段は、前記第１指数が前記参照標準偏差に比べて有意性をもって増大し、前記第２指数が前記参照相関値に比べて有意性をもって減少し、かつ、前記第３指数が前記参照標準偏差に比べて有意性をもって増大した場合に、当該クラスターに含まれる項目をバイオマーカーの候補として検出する
   ことを特徴とする検出装置。
7. 請求項１乃至請求項６のいずれかに記載の検出装置であって、
   前記検出手段は、
   クラスターに含まれる複数の因子項目の有意性を、測定データの統計値に基づいて検定する手段を含み、
   有意性がある場合に、クラスターに含まれる項目をバイオマーカーの候補として検出する
   ことを特徴とする検出装置。
8. 請求項１乃至請求項７のいずれかに記載の検出装置であって、
   前記複数の因子項目のいずれかは、遺伝子に関する測定項目、タンパク質に関する測定項目、代謝物に関する測定項目、又は生体から得られる画像に関する測定項目である
   ことを特徴とする検出装置。
9. 生体に関する測定により得られた複数の因子項目についての測定データに基づいて、測定対象である生体の症状の指標となるバイオマーカーの候補を検出する検出装置を用いた検出方法であって、
   前記検出装置は、
   前記各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化の相関関係に基づいて複数の因子項目を複数のクラスターに分類する分類ステップと、
   分類した各クラスターから、前記各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化及び各因子項目間の測定データの時系列変化の相関関係に基づいて予め設定された選出条件に該当するクラスターを選出する選出ステップと、
   選出したクラスターに含まれる因子項目をバイオマーカーの候補として検出する検出ステップと
   を実行することを特徴とする検出方法。
10. 生体に関する測定により得られた複数の因子項目についての測定データに基づいて、測定対象である生体の症状の指標となるバイオマーカーの候補を検出する検出方法であって、
    異なる時間点で採取した複数の生体サンプルのそれぞれから測定したハイスループットデータの中から、差次的生体分子を算出する分子スクリーニングステップと、
    相関の高い生体分子同士を１つのクラスターとするように、前記分子スクリーニングステップで選出した前記差次的生体分子を複数のクラスターに分類するクラスター化ステップと、
    前記クラスター化ステップで得られた複数のクラスターの中から、クラスター内の生体分子の間の相関の増大、クラスター内の生体分子の標準偏差の増大、及びクラスター内の生体分子と他の生体分子との間の相関の低減が最も著しいクラスターを、前記バイオマーカーの候補として先取する候補選択ステップと、
    前記候補選択ステップで選出したバイオマーカーの候補が前記バイオマーカーであるか否かを、有意性検定によって判定する判定ステップと
    を実行することを特徴とする検出方法。
11. コンピュータに、生体に関する測定により得られた複数の因子項目についての測定データに基づいて、測定対象である生体の症状の指標となるバイオマーカーの候補を検出する処理を実行させる検出プログラムであって、
    コンピュータに、
    前記各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化の相関関係に基づいて複数の因子項目を複数のクラスターに分類する分類ステップと、
    分類した各クラスターから、前記各因子項目のそれぞれの測定データの時系列変化及び各因子項目間の測定データの時系列変化の相関関係に基づいて予め設定された選出条件に該当するクラスターを選出する選出ステップと、
    選出したクラスターに含まれる因子項目をバイオマーカーの候補として検出する検出ステップと
    を実行させることを特徴とする検出プログラム。