JP2013543847A - アコニターゼ阻害による微生物増殖の阻害 - Google Patents

Abstract

本発明は、個人における真菌細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法を目的とし、本方法は、前記真菌細胞によるアコニターゼ活性を阻害するのに有効な量で、アコニターゼ活性の阻害物質を真菌細胞に投与する工程を含む。

Description

本発明は、個人において真菌細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法を目的とし、本方法は、前記真菌細胞によるアコニターゼ活性を阻害するのに有効な量で、アコニターゼ活性の阻害物質を真菌細胞に投与する工程を含む。

理論に束縛されるものではないが、ピリチオン含有の抗真菌薬の、抗真菌性の作用メカニズムは、アコニターゼ及び他のミトコンドリアの鉄イオウタンパク質の阻害に関与すると考えられる。阻害のメカニズムは、アービング−ウィリアムズ系列に従って、外因性又は内因性の銅のいずれか及びレート交換（transchelation）との関連によって、細胞中の銅ピリチオンの化成に関与すると考えられる。銅ピリチオンは、次いで、ミトコンドリア膜を横断し、アコニターゼなどの鉄イオウタンパク質と相互作用することが可能であり、鉄イオウ活性部位の変化及び結果として生じる活性の阻害をもたらす。

本発明において、ＺＰＴ感度は、高い銅濃度からの保護において欠陥のあるＣＵＰ２欠失菌株で増加することが分かった。この観察結果及び他の観察結果から、銅は増殖阻害を誘発するＺＰＴの効果を増大させるが、メカニズムは未知であったということが理解されるだろう。

本発明を通じて、サッカロマイセス欠失ライブラリー菌株のＺＰＴ感度の結果を含み、ミトコンドリアの鉄イオンタンパク質の成熟がＺＰＴの重要な標的であることが分かる。このことは、最小限の媒質において、ＺＰＴは、ミトコンドリアの鉄イオウタンパク質アコニターゼの活性を必要とするグルタメート及びリジンの合成の阻害によって増殖を阻害するという本発明の実証試験によって確証される。更に、ＺＰＴの存在下での細胞の培養はアコニターゼ阻害をもたらす。本発明は、ＺＰＴの作用メカニズムの理解を重要な標的酵素の識別まで拡大する。

個人における真菌細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法であって、本方法は、前記真菌細胞によるアコニターゼ活性を阻害するのに有効な量で、アコニターゼの阻害物質を真菌細胞に投与する工程を含む。

本明細書は、本発明を特に指摘し明確に請求する特許請求の範囲で完結するが、本発明は、以下の説明により、より良く理解されると考えられる。

本発明は、本明細書に記載した本発明の必須要素及び制限事項、並びに本明細書に記載した追加若しくは任意の成分、構成成分又は制限事項のいずれも含むことができ、これらからなることができ、又はこれらから本質的になることができる。

特に断らない限り、比率、部、及び比はすべて、本発明の組成物の総重量に基づく。提示された成分に関するこのような重量はすべて、活性物質の濃度に基づいており、したがって、市販材料に含まれる可能性があるキャリア又は副生成物は含まない。

本発明の様々な実施形態の構成成分及び／又は工程を、任意に加えてもよいものを含めて、以下で詳細が記載される。

引用されるすべての文献は、その関連部分において参照により本明細書に組み込まれるが、いずれの文献の引用もそれが本発明に関連する先行技術であることの容認として解釈されるべきではない。

特に記載のない限り、すべての比率は重量比である。

特に記載のない限り、すべての温度は摂氏である。

特に指摘される場合を除き、分量、百分率、部分、及び割合を含むすべての量は、「約」という単語により修正されると理解され、量は有効数字を示すことを意図しない。

特に指摘される場合を除き、冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、「１つ以上の」を意味する。

本明細書において「含む」とは、最終結果に影響を与えない他の工程及び他の成分を追加できることを意味する。この用語には、「からなる」及び「から本質的になる」という用語が含まれる。本発明の組成物及び本発明の方法／プロセスは、本明細書に記載した発明の必須要素及び制限事項、並びに本明細書に記載した追加若しくは任意の成分、構成成分、工程、又は制限事項のいずれをも含むことができ、これらからなることができ、及びこれらから本質的になることができる。

本明細書において「有効な」とは、処置する症状の著しく好ましい改善をもたらすのに十分高い対象活性物質の量を意味する。対象活性物質の有効量は、処置する特定の症状、症状の重さ、処置期間、併用している処置の性質及び同様の要因により変化する。

本明細書において「アコニターゼ阻害」とは、溶解細胞から回収され得るアコニターゼ活性の減少を意味する。そのようなアコニターゼ阻害は、酵素の直接的な阻害又は活性アコニターゼの合成の阻止を含んでもよい。活性アコニターゼの合成は、アコニターゼタンパク質の合成の不足、アコニターゼタンパク質の適切な折り畳みの不足、機能的鉄イオウクラスタの、アコニターゼへの取り込みの不足、又はアコニターゼ中のダメージを受けた鉄イオウクラスタの存在に起因するものであってもよい。

本明細書において「パーソナルケア組成物」とは、脱色、着色、染色、コンディショニング、育毛、脱毛、育毛遅延、シャンプー、整髪を含む、毛髪（ヒト、イヌ、及び／又はネコ）の処理のための製品及び／又はそれに関連する方法；デオドラント剤及び制汗剤；パーソナルクレンジング；カラー化粧料；クリーム、ローション、及び他の局所に適用される消費者用製品の適用を含む、皮膚（ヒト、イヌ、及び／又はネコ）の処置に関する製品及び／又は方法；並びに毛髪、皮膚、及び／又は爪（ヒト、イヌ、及び／又はネコ）の外観を向上させるために経口投与される物質に関する製品及び／又は方法、並びにシェービング剤を意味する。

Ａ．ピリチオン又はピリチオンの多価金属塩
一実施形態において、本発明は、ピリチオン又はピリチオンの多価金属塩を含んでもよい。血小板状及び針構造などの、いかなる形態の多価金属のピリチオン塩も用いてよい。更なる実施形態において、本明細書に用いる塩は、多価金属マグネシウム、バリウム、ビスマス、ストロンチウム、銅、亜鉛、カドミウム、ジルコニウム及びこれらの混合物から形成されるものを含み、更なる実施形態においては、亜鉛から形成されるものを含む。また更なる実施形態において、本明細書に用いるのは、１−ヒドロキシ−２−ピリジンチオンの亜鉛塩（「ジンクピリチオン」又は「ＺＰＴ」として既知）であり、別の実施形態においては、血小板状粒子形態のＺＰＴであり、その中で、粒子は最大約２０μｍの平均粒径を有し、一実施形態では、最大約５μｍの平均粒径を有し、また更なる実施形態では、最大約２．５μｍの平均粒径を有する。

ピリジンチオン抗菌剤及び抗ふけ剤は、例えば、米国特許第２，８０９，９７１号、同第３，２３６，７３３号、同第３，７５３，１９６号、同第３，７６１，４１８号、同第４，３４５，０８０号、同第４，３２３，６８３号、同第４，３７９，７５３号、及び同第４，４７０，９８２号に記載されている。

ＺＰＴを本明細書の抗菌組成物中の抗菌粒子として使用すると、付加的な効果である育毛若しくは再生が促進若しくは調節される場合があり、又はその両方である場合があり、又は脱毛が減少若しくは抑制される場合があり、又は毛髪がより濃く見える若しくはより豊かに見える場合があることが更に考えられる。

ジンクピリチオンは、米国特許第２，８０９，９７１号に記載のように、１−ヒドロキシ−２−ピリジンチオン（すなわちピリチオン酸）又はそれらの可溶性の塩と、亜鉛塩（例えば、硫酸亜鉛）とを反応させて、ジンクピリチオン沈殿物を形成させることによって生成できる。

本発明の一実施形態は、約０．０１％〜約５％の、及び更なる実施形態では、約０．１％〜約２％の、ピリチオン又はピリチオンの多価金属塩を含む。

方法
サッカロマイセス・セレヴィシエ菌株ＢＹ４７４１の培養菌を、３０°で一晩、ＹＰＤ（グルコース２０グラム、ペプトン２０グラム、酵母抽出物１リットルあたり１０グラム）ブロス中で増殖させる。培養菌を、光学濃度０．１（６００ｎｍ）で全容積１００ｍＬまでＹＰＤで希釈する。培養菌を、光学濃度０．２に達するまで振盪させながらインキュベートし、それに試験物質を添加する。培養菌を一晩インキュベートし、細胞を遠心分離によって沈殿させる。細胞ペレットを、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリスｐＨ ７．４で洗浄し、１００ｍＭのＮａＣｌ ５ｍＬ、２０ｍＭのトリスｐＨ ７．４中で再懸濁する。ガラスビーズ（０．５ｍｍ）を添加する。試料に、１分間のボルテックスと１分間氷上のインキュベートとを交互にかけ、合計１０回処理する。遠心分離の後、上澄みを収集する。９６ウェルプレート（紫外線透過性Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６７９プレート）中で、３０μＬの細胞可溶化物を１００ｍＭのＮａＣｌ ２０μＬ、２０ｍＭのトリスｐＨ ７．４と混合し、説明書に従ってＢｉｏｘｙｔｅｃｈ Ａｃｏｎｉｔａｓｅ−３４０キット（ＯｘｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用してアッセイする。

アコニターゼアッセイのために、試料は３７°で６分間インキュベートする。反応率は、反応開始１分後に着手して５分間隔で、光学濃度（３４０ｎｍ）の増分に基づいて算出する。処理された試料の可溶化液中のアコニターゼ活性を、未処理の試料の可溶化液中のアコニターゼ活性で割る。反復が試料に実施される場合、報告されるデータは、処理された細胞の個々の可溶化液のアコニターゼ活性の測定値の平均値を、未処理の細胞の個々の可溶化液のアコニターゼ活性の測定値の平均値で割ったものである。処理された細胞の可溶化液中において、アコニターゼ活性がネガティブであるように思われる場合、アコニターゼ活性に対して「０」の値が報告される（表１）。

（１）Ａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．製

望ましい物質は、特定の条件下で７０％以上のアコニターゼ活性を阻害する。（表１における３０％以下の残存活性を意味する）。実証されているように、ジンクピリチオン及び銅ピリチオンの双方が、提唱される作用メカニズムから予期されたとおり、予期された阻害を有する。表１で例示された他の物質は、同様に金属イオンに対する親和性を有し、ピリチオンと同様の方法で、鉄イオウタンパク質活性部位に潜在的に影響を与える。比較として、ＥＤＴＡなど、ある特定の古典的なキレート剤は、おそらく乏しい細胞膜透過のため有効でない。

アコニターゼ阻害は、これまでは真菌類の制御のための標的として認識されていない。したがって、限定されることを意味しないが、以下のリストなどのアコニターゼ阻害物質が、抗真菌薬として含まれる。

フルオロクエン酸−フルオロ酢酸由来
ニトロイソクエン酸（nitroisocitrate）
４−ヒドロキシ−トランス−アコニターゼ
オキサロマラート（oxalomalate）（ＯＭＡ、アルファ−ヒドロキシ−ベータ−オキサロコハク酸）

活性酸素種又は酸化種
過酸化亜硝酸
一酸化窒素
過酸化水素
超酸化物

ある１つの論文に基づく有機分子
１，２，３−Ｄ，Ｌ−トリカルボキシシクロペンテン−１
トリメシン酸（１，３，５−トリカルボキシベンゼン）
トリメリット酸（１，２，４−トリカルボキシベンゼン）
ピロメリット酸（１，２，４，５−テトラカルボキシベンゼン）
１，２，３，４−テトラカルボキシシクロペンタン

クレブス回路物質
オキサロスクシナート（oxalosuccinate）
トランス−アコニターゼ
シス−アコニターゼ
アルファ−ケトグルタル酸
２−オキソグルタレート
オキサロアセテート

その他
アロキサン
１−メチル−４−フェニルピリジン
マンガン
ロンプロテアーゼ
デフェリプロン
ピリチオン又はピリチオンの金属塩
ジンクピリチオン

Ａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．より供給されるようなＮ−ヒドロキシ−６−オクチルオキシピリジン−２（１Ｈ）オン、エタノールアミン塩、（ＨＰ−１０１）は、Ｎ−ヒドロキシピリドンの一部である。Ｎ−ヒドロキシピリドンは、遊離酸として６位にアルキルエーテル置換、エタノールアミン塩、及び亜鉛、Ｎ−ヒドロキシ−６−オクチルオキシピリジン−２（１Ｈ）オン、亜鉛塩などの金属塩を有する。アルキルエーテル置換基は、直鎖又は分枝鎖のいずれかの、長さ２〜２２の炭素である。

本発明の一実施形態において、更なる鉄イオウ酵素は、アコニターゼに見られるのと同様の方法で、有用な標的であり得る。そのような酵素の非限定的な例は、ビオチンシンターゼ、リポ酸シンターゼ、及びホモアコニターゼを含む。

本発明において、アコニターゼ阻害物質は、単独、又は追加のアコニターゼ阻害物質及びこれらの混合物と組み合わせて使用されてもよい。例えば、ジンクピリチオンは、１つ以上の追加のアコニターゼ阻害物質と組み合わせて使用されてもよい。

本発明の一実施形態において、本発明は、真菌細胞又は微生物細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法を含み、本方法は、前記真菌細胞によるアコニターゼ活性を阻害するのに有効な量で、アコニターゼ活性の阻害物質、又はアコニターゼ阻害物質を、個人における真菌又は微生物細胞に投与する工程を含む。

本発明の一実施形態において、本発明は、個人における真菌細胞又は微生物細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法を含み、本方法は、前記真菌細胞によるアコニターゼ活性を阻害するのに有効な量で、アコニターゼ活性の阻害物質、又はアコニターゼ阻害物質を、個人における真菌又は微生物細胞に投与する工程を含む。

更なる実施形態において、本発明は、真菌細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法を含み、個人とはふけ症患者である。

また更なる実施形態において、本発明は、アコニターゼの阻害物質が、フルオロクエン酸塩、４−ヒドロキシ−トランス−アコニターゼ、オキサロマラート、アルファ−ヒドロキシ−ベータ−オキサロコハク酸）、活性酸素種又は酸化種、過酸化亜硝酸、一酸化窒素、過酸化水素、超酸化物、１，２，３−Ｄ，Ｌ−トリカルボキシシクロペンテン−１、トリメシン酸（１，３，５−トリカルボキシベンゼン）、トリメリット酸（１，２，４−トリカルボキシベンゼン）、ピロメリット酸（１，２，４，５−テトラカルボキシベンゼン）、１，２，３，４−テトラカルボキシシクロペンタン、クレブス回路物質、オキサロスクシナート、トランス−アコニターゼ、シス−アコニターゼ、アルファ−ケトグルタル酸、２−オキソグルタレート、オキサロアセテート、アロキサン、１−メチル−４−フェニルピリジン、マンガン、ロンプロテアーゼ、Ｎ−ヒドロキシ−６−オクチルオキシピリジン−２（１Ｈ）オン、エタノールアミン塩、ピリチオン及びピリチオンの金属塩、ジンクピリチオン、並びにこれらの混合物からなる群から選択される、真菌細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法を含む。

更なる実施形態において、本発明は、アコニターゼ活性の阻害物質がジンクピリチオンである、真菌類のアコニターゼ（aconistase）活性を阻害する方法を含む。

一実施形態において、本発明は、アコニターゼの阻害物質が、アコニターゼ活性を少なくとも７０％阻害する、真菌細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法を含む。

更なる実施形態において、本発明は、ａ）細胞を物質に曝露する工程と、ｂ）細胞を開き、アコニターゼ活性を測定する工程と、ｃ）ベースライン又は対照／未処理の試料と比較してアコニターゼ活性の減少を測定する工程とを含む、抗真菌効果のためにアコニターゼ活性を阻害する方法を含む。

更に別の実施形態において、本発明は、真菌細胞の増殖を阻害する方法を開示し、前記方法は、前記真菌細胞を、アコニターゼ活性を少なくとも７０％阻害する物質と接触させる工程を含み、それによって前記真菌細胞の増殖の阻害を引き起こし、及び／又は細胞死を引き起こす。

更なる実施形態において、本発明は、アコニターゼ酵素に対する阻害活性を有する物質のうちの１つ以上を含むパーソナルケア組成物を開示し、この物質は、抗真菌薬が媒介する頭皮の症状など、抗真菌薬が媒介する症状を処置する有効性の増強をもたらすように、アコニターゼ活性を少なくとも７０％阻害する。

本明細書に開示した寸法及び値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきでない。むしろ、特に断らない限り、そのような寸法はそれぞれ、記載された値及びその値周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味するものとする。例えば、「４０ｍｍ」として開示された寸法は、「約４０ｍｍ」を意味するものとする。

本発明の「発明を実施するための形態」で引用したすべての文献は、関連部分において本明細書に援用するが、いずれの文献の引用もそうした文献が本発明に対する先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。本書における用語の任意の意味又は定義が、参照により組み込まれた文献における同一の用語の任意の意味又は定義と相反する限りにおいては、本書においてその用語に与えられた意味又は定義が適用されるものとする。

以上、本発明の特定の実施形態を例示、記載したが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び改変を行いうる点は、当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲に含まれるそのようなすべての変更及び改変を添付の特許請求の範囲において網羅するものとする。

Claims (9)

1. 個人における真菌細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法であって、前記真菌細胞によるアコニターゼの活性を阻害するのに有効な量で、アコニターゼ活性の阻害物質を前記真菌細胞に投与する工程を含む、方法。
2. 前記個人がふけ症患者である、請求項１に記載の真菌細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法。
3. 前記アコニターゼ活性の阻害物質が、フルオロクエン酸塩、４−ヒドロキシ−トランス−アコニターゼ、オキサロマラート、アルファ−ヒドロキシ−ベータ−オキサロコハク酸、活性酸素種又は酸化種、過酸化亜硝酸、一酸化窒素、過酸化水素、超酸化物、１，２，３−Ｄ，Ｌ−トリカルボキシシクロペンテン−１、トリメシン酸（１，３，５−トリカルボキシベンゼン）、トリメリット酸（１，２，４−トリカルボキシベンゼン）、ピロメリット酸（１，２，４，５−テトラカルボキシベンゼン）、１，２，３，４−テトラカルボキシシクロペンタン、クレブス回路物質、オキサロスクシナート、トランス−アコニターゼ、シス−アコニターゼ、アルファ−ケトグルタル酸、２−オキソグルタレート、オキサロアセテート、アロキサン、１−メチル−４−フェニルピリジン、マンガン、ロンプロテアーゼ、Ｎ−ヒドロキシ−６−オクチルオキシピリジン−２（１Ｈ）オン、エタノールアミン塩、ピリチオン及びピリチオンの金属塩、ジンクピリチオン、並びにこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の真菌細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法。
4. 前記アコニターゼ活性の阻害物質が、ジンクピリチオンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の真菌細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法。
5. 前記アコニターゼの阻害物質が、アコニターゼ活性を少なくとも７０％阻害する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の真菌細胞のアコニターゼ活性を阻害する方法。
6. 抗真菌効果のためにアコニターゼ活性を阻害する方法であって、
   ａ）細胞を物質に曝露する工程と、
   ｂ）細胞を開き、アコニターゼ活性を測定する工程と、
   ｃ）ベースライン又は対照／未処理の試料と比較してアコニターゼ活性の減少を測定する工程と、を含む、方法。
7. 真菌細胞の増殖を阻害する方法であって、前記真菌細胞を、アコニターゼ活性を少なくとも７０％阻害する物質と接触させる工程を含み、それによって前記真菌細胞の増殖の阻害を引き起こす、方法。
8. アコニターゼ酵素に対する阻害活性を有する物質のうちの１つ以上を含むパーソナルケア組成物であって、前記物質が、抗真菌薬が媒介する症状を処置する有効性の増強をもたらすように、アコニターゼ活性を少なくとも７０％阻害する、パーソナルケア組成物。
9. 前記物質が、抗真菌薬が媒介する頭皮の症状を処置する有効性の増強をもたらすように、アコニターゼ活性を少なくとも７０％阻害する、請求項８に記載のパーソナルケア組成物。