JP2013529081A - 三次元スキャフォールド上へ細胞を播種するためのシステム - Google Patents

Abstract

細胞の簡便な無菌分離、収集、及びスキャフォールド又は組織移植片上への細胞の播種のためのシステムが提供される。システムは閉じられてもよい。細胞の分離、収集及び播種のための開示されたシステムの使用のための方法、及び、培養血管移植片の形成のための方法も提供される。システムは、効率的で迅速な使用のためにキットの状態で供給されてもよい。
【選択図】 図１

Description

政府支援の研究に関する陳述

[001]米国政府は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によりクリストファ・ブロイヤー博士に与えられた以下の認可、すなわち、５Ｋ０８ＨＬ０８３９８０―０５にしたがって本発明において特定の権利を有する。

発明の分野

[002]本発明は、着床のための準備において、細胞源から、例えば個人から、細胞を収集し、分離し、直接に生体適合性スキャフォールド上に播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）するための装置及び方法を含むシステムに関する。

背景情報

[003]血管外科医及び心臓胸郭部外科医は、外傷、又は、動脈瘤、アテローム性動脈硬化症、及び、感染症などの疾患に起因して弱体化され、損傷され、あるいは、閉塞される動脈血管及び静脈血管の一部を修復し、あるいは交換するために血管移植片を使用する。歴史的に、血管移植片は、患者自身の伏在静脈又は内胸動脈などの同種移植片、ポリエステル（例えばＤａｃｒｏｎ）、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、及び、他の複合材料などの合成材料から形成される補綴移植片、又は、新生又は固定生体組織移植片のいずれかであった。

[004]しかしながら、合成移植片は、一般に、多くの用途において生着率が不十分であり、一方、同種移植片の取得は、時間がかかり、費用がかかり、患者に外傷を与える広範囲の手術を必要とする。固定組織移植片は、再形成及び組織維持にとって不可欠な宿主細胞による嵌合及び定着を許容しない。その結果、固定組織移植片は、時間と共に劣化し、最終的に機能しなくなる。

[005]これらの現在利用できる合成移植片及び生体移植片の欠点に起因して、また、同種移植片の高いコスト及び限られた供給に起因して、無菌化されてその後に体外で細胞と共に播種されて培養される培養移植片が開発されてきた。これらの培養移植片は、それらが長期にわたる寸法安定性を示すことができるとともに、正常な生理学的機能を有する天然の動脈及び血管の開通性を示すことができるという点において、代償療法で用いる他の移植片よりも優れている場合がある。

[006]歴史的に、培養移植片の培養に加えた細胞の分離及び播種は、一般に、フード又は専用の設備、例えばＩＳＯクラス７の部屋などの無菌環境の使用を必要とする。しかしながら、そのような環境での組織の播種及び培養には不都合がある。例えば、これらのシステムは、ユーザにとって扱いにくく、不便であるとともに、使用するのに時間がかかり、構築して維持するのが非常に高価となる可能性がある。

[007]したがって、当技術分野においては、培養移植片及び他の人工補装具の簡便な無菌分離、収集及び播種を行なうことができる組成体及び方法の必要性が存在する。

概要

[008]本明細書中には、細胞源、好ましくは被検者からの細胞、例えば単核細胞などの骨髄由来前駆細胞を分離して収集した後に、それらの細胞を生体適合性の三次元スキャフォールド又は組織移植片上へ播種するための装置及び方法を含むシステム、好ましくは密閉無菌システムが記載されている。スキャフォールド又は移植片は、生体内で、試験管内で、又は、生体外で組織を再生する及び／又は修復するために例えば血管移植片などの組織移植片として培養し、輸送し、保存し、検査し、及び／又は、被検者へ着床するためのシステム内で更に培養することができる。

[009]本発明によれば、専用のフード又はクリーンルームを必要としない密閉された無菌システム内で血管移植片を分離し、播種し、培養し、保存し、輸送し、検査するための装置及び方法が提供される。特定の態様において、本発明は、ヒト細胞を用いて血管移植片を播種して培養し、それにより、生存ヒト細胞が住みつく培養血管移植片をもたらす装置及び方法を提供する。

[0010]特定の態様において、本発明は、濾過／溶出技術を使用して所望の細胞種を分離するとともに、真空播種を使用して細胞を三次元生体適合性スキャフォールド上へ播種する密閉された使い捨てできるシステムを提供する。播種されたスキャフォールドは、その後、培養することができるとともに、いつでも使用できる状態にあるときにシステムから取り除かれることができる。

[0011]したがって、１つの態様では、細胞を播種するためのシステムであって、細胞分離株流体容器と、細胞分離株流体容器、収集流体容器、溶出流体容器、及び、播種容器の間に配置されるとともに、入口と、出口と、入口と出口との間のフィルタとを備えるフローチャネルとを備え、フィルタが少なくとも２つの方向で流れを許容するようになっており、フローチャネルが、細胞分離株流体容器、収集流体容器、溶出流体容器、及び、播種容器のそれぞれと選択的に流体的に連通するシステムが提供される。特定の実施形態において、播種容器は、多孔質のあるいは有孔のチューブ、例えば有孔マンドレルと、チューブの少なくとも一部に併置される生体適合性の三次元スキャフォールドとを備える。特定の実施形態において、システムは、播種容器と流体的に連通する残留播種細胞流体容器と、該残留播種細胞流体容器と流体的に連通する真空源とを含む。

[0012]他の態様では、本明細書中に記載される細胞を播種するためのシステムを使用するための方法が提供される。

[0013]本発明は、本明細書中に記載される任意の発明を更に提供する。

[0014]有用性の先行する一般的な領域は、単なる一例として与えられており、本開示及び添付の特許請求の範囲を限定しようとするものではない。本発明の更なる目的及び利点は、この特許請求の範囲、明細書本文、及び、実施例を考慮すれば、当業者により理解され得る。例えば、本発明の様々な態様及び実施形態が多くの組み合わせで利用されてもよく、その全てが本明細書本文によって明確に考慮される。これらの更なる利点、目的、及び、実施形態は、本発明の範囲内に明確に含まれる。

[0015]明細書に組み入れられて明細書の一部を形成する添付図面は、本発明の幾つかの実施形態を示しており、明細書本文と共に本発明の原理を説明するのに役立つものである。図面は、本発明の実施形態を単に例示するためのものにすぎず、本発明を限定するように解釈されるべきでない。本発明の更なる目的、特徴、及び、利点は、本発明の例示的な実施形態を示す添付図面と併せて解釈される以下の詳細な説明から明らかとなろう。

本明細書中に記載される代表的なシステムを示す。簡単に言えば、（ｉ）骨髄穿刺液（例えば、５ｃｃ／ｋｇ体重）が無菌的に収集されて細胞分離株流体容器（３）内へ注入され；（ｉｉ）重力を用いて、骨髄穿刺液がフィルタ媒体の上流側表面からフィルタ媒体の下流側表面を通過するときに骨髄由来単核細胞を捕捉するフィルタを含むフローチャネル（７）に骨髄穿刺液が通され；（ｉｉｉ）骨髄穿刺液の残りの部分（一般的には主に血漿からなるが、赤血球及び／又は血小板を含んでもよい）が収集流体容器（１３）内に収集され；（ｉｖ）溶出流体容器（９）内の溶出溶液がフローチャネル（７）に通され、この場合、溶出溶液がフィルタ媒体の下流側表面から媒体の上流側表面を通って播種容器（１８）に入り、それにより、フィルタが播種容器内に収集される骨髄由来単核細胞を解放し；（ｖ）播種容器（１８）は、有孔マンドレル（２０）上にわたって嵌め付けられるスキャフォールドを収容し；（ｖｉ）有孔マンドレル（２０）上にわたって嵌め付けられるスキャフォールドを完全に覆って骨髄由来単核細胞懸濁液が播種容器（１８）を満たし；（ｖｉｉ）細胞懸濁液の全てがスキャフォールドを通過して少なくとも１つの残留播種細胞流体容器（３５ａ、３５ｂ）内に収集されるまで真空（例えば、−２０ｍｍＨｇ）が印加され；（ｖ）一般に血漿を主に備える濾過された骨髄穿刺液が、重力によって、収集容器（１３）から、播種されたスキャフォールドを収容する播種容器（１８）内に送られ、それにより、播種されたスキャフォールドが浸漬される。 播種容器内の細胞懸濁液を例示する図１に示される播種容器（１８）の斜視図であり、この場合、懸濁液がスキャフォールドと接触する。 本明細書中に記載される代表的なシステムと共に使用するための代表的なマンドレル構造を示す。簡単に言えば、（ｉ）有孔マンドレル（２０）の開放端（１２６）が吸引ロッド（２３）上にわたって嵌め付けられ；（ｉｉ）その後、適切なサイズの結合リング（１２３）が有孔マンドレル上にわたって嵌め付けられ；（ｉｉｉ）その後、適切なサイズのスキャフォールドが装置上にわたって嵌め付けられて固定される。 本発明の実施形態にしたがって使用され得る他の播種容器（１８）を示す。

詳細な説明

[0020]以下は、本発明を実施する際に当業者を助けるために与えられる本発明の詳細な説明である。当業者は、本発明の思想又は範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される実施形態において改変及び変形をなすことができる。他に別に規定されなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野における当業者により共通に理解される意味と同じ意味を有する。この発明の説明で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、発明を限定しようとするものではない。本明細書中で言及される全ての出版物、特許出願、特許、図、他の文献は、参照することによりそれらの全体が本願に明確に組み入れられる。

[0021]本明細書中には、生体適合性の三次元スキャフォールド上に播種されて培養されるとともに、その後に例えば血管移植片などの組織移植片として着床され得る細胞、例えば単核細胞などの骨髄由来前駆細胞を分離して収集するための装置及び方法を含むシステム、好ましくは密閉無菌システムが記載されている。特定の実施形態において、システムは、三次元スキャフォールド上への細胞の無菌分離、播種、及び、培養のための濾過／溶出技術を利用する。生体適合性のスキャフォールドに住みつく無菌分離された細胞は、個人からの細胞を保存し、輸送し、及び／又は、検査する際に培養して使用することができる。あるいは、生体内で、試験管内で、又は、生体外で組織を再生する及び／又は修復するために、生存分離細胞が住みつくスキャフォールドを、着床可能な移植片として、例えば血管移植片として培養して使用することができる。

[0022]したがって、本発明の１つの利点は、ＩＳＯクラス７の部屋などのフード又は専門の設備を必要とすることなく、スキャフォールド上へ、細胞を無菌で分離して播種し、及び、培養するための便利で比較的低コストなシステムを提供するという点である。他の利点は、フード又は専門の設備を使用する従来の方法よりも方法を迅速に実行できるという点である。例えば、数時間で、例えば約５時間以下で、好ましくは約３時間以下で、更に好ましくは約２時間以下で方法を行なうことができ有益である。

[0023]値の範囲が与えられる場合には、言うまでもなく、その範囲の上限と下限との間に入るそれぞれの値、及び、その範囲内の任意の他の述べられている、あるいはその間に入る値は、文脈が他に明確に述べていなければ下限値の単位の１／１０まで、本発明の範囲内に包含される。小さい方の範囲内に単独で含まれてもよいこれらの小さい方の範囲の上限及び下限も、述べられている範囲内の任意の特に排除される限界を条件として、本発明の範囲内に包含される。述べられている範囲が限界の一方又は両方を含む場合には、それらの含まれる限界のいずれか、両方を排除する範囲も本発明に含まれる。

[0024]本明細書中に記載される方法及び材料と類似する、あるいは同等な任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験で使用することもできるが、ここでは、好ましい方法及び材料について記載する。本明細書中で言及される全ての出版物は、引用されるその出版物が関連する方法及び／又は材料を開示して説明するために、参照することにより本願に組み入れられる。

[0025]本明細書中及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「１つの（ａ）」、「及び（ａｎｄ）」、及び、「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に別に明確に定義しなければ複数の参照を含むことに留意されなければならない。本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は同じ意味を有する。

Ｉ．代表的な定義
[0026]別途定義しなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解される意味を有する。その開示の全体が参照することにより本願に組み入れられる以下の文献、すなわち、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版 １９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ａｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及び、Ｈａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）は、この発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に与える。本明細書中で使用される以下の用語は、他に別に明記されなければ、以下の意味に帰される意味を有してもよい。しかしながら、言うまでもなく、当業者によって知られるあるいは理解される他の意味も見込まれ、本発明の範囲内に入る。本明細書中で言及される全ての出版物、特許出願、特許、及び、他の文献は、参照することによりそれらの全体が本願に組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。また、材料、方法、及び、実施例は、単なる例示であり、限定しようとするものではない。

[0027]本発明を容易に理解できるように、最初に特定の用語について規定する。

[0028]用語「マンドレル」は、細胞を播種して成長させるための材料、例えばマトリクススキャフォールドが周囲に流延され、成形され、鍛造され、曲げられ、あるいは、形成されてもよいコアとしての機能を果たす円筒状の器具又はチューブ、例えば金属バーを意味し得るが、これらに何ら限定されない。特定の実施形態では、本明細書中に記載されるマンドレルが少なくとも一端で開放している。更なる実施形態において、本明細書中に記載されるマンドレルは、その軸線に沿って（すなわち、その長さに沿って）穴又は穿孔を含んでもよい。

[0029]用語「バルブ」は、例えば１つ以上のポート（例えば、入口又は出口）あるいは通路を開く、閉じる、あるいは、部分的に塞ぐ可動部分によって液体、ガス、又は、遊離材料の流れを開始させ、停止させ、あるいは、調整してもよい器具又は器具の部品を意味し得るが、これに何ら限定されない。

[0030]用語「生体適合性」は、際立った免疫反応を伴うことなく身体が一般に受け入れる材料であって、過度な線維症又は拒絶反応を引き起こすことなく、例えば組織着床など、生体系中に着床できる材料を意味し得るが、これに何ら限定されない。

[0031]用語「生体分解性」は、生体の作用によって無害物質に分解し得る物質又は材料の能力を意味し得るが、これに何ら限定されない。

[0032]用語「ポリマー」は、モノマーと呼ばれる５つ以上の同一の結合単位の化学結合により形成される巨大分子を意味し得るが、これに何ら限定されない。殆どの場合、モノマーの数は、非常に多いが、大抵は正確に知られていない。合成ポリマーでは、この数が所定の程度まで制御されてもよい。２つ、３つ、あるいは、４つのモノマーの組み合わせはそれぞれ、二量体、三量体、四量体と呼ばれており、総称してオリゴマーとして知られる。ポリマーは、無機（例えば、シロキサン、硫黄鎖、黒リン、ホウ素窒素、シリコン）であってもよく、あるいは、有機（炭素を含むことを意味する）であってもよい。有機ポリマーは、天然（例えば、デンプン、セルロース、ペクチン、海藻ガム、植物ガムなどの多糖類；カゼイン、アルブミン、グロブリン、ケラチン、インスリン、ＤＮＡなどのポリペプチド；及び、炭化水素）であってもよく、合成（例えば、熱可塑性（例えば、未加硫エラストマ、ナイロン、ポリ塩化ビニル、線状ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、アクリレート樹脂）；熱硬化性（例えば、加硫エラストマ、架橋ポリエチレン、フェノール樹脂、アルキド樹脂、ポリエステル）、及び、半合成（例えば、レーヨン、メチルセルロース、セルロースアセテート、及び、改質デンプンなどのセルロース誘導体）など）であってもよい。

[0033]用語「ホモポリマー」は、単一のモノマーから得られる天然ポリマー又は合成ポリマーを意味し得るが、これに何ら限定されない。

[0034]用語「ヘテロポリマー」は、複数のモノマーサブユニット（すなわち、コポリマー）から得られる天然ポリマー又は合成ポリマーを意味し得るが、これに何ら限定されない。他に別に示唆されなければ、用語「ポリマー」は、一般に、本明細書中に記載されるホモポリマー及びヘテロポリマー（すなわち、コポリマー）の両方を示すために使用される。

[0035]用語「水溶性セルロース化合物」は、−ＳＯ３⁻として表わすことができる陰イオン硫酸基と様々な程度まで置換されるグルコース単位の繰り返しの長鎖巨大分子である一群のセルロース化合物を意味し得るが、これに何ら限定されない。本発明によって包含される水溶性セルロース化合物の分子量は、一般に、約５×１０^５〜約３×１０^６ｇ／モルの範囲である。各グルコース単位の水酸基を１〜３つの硫酸基と置換することができる。スルホン化は、他の不溶性セルロースを水溶性にする。置換されない水酸基の利用可能性は、可溶性硫酸セルロースに対して架橋結合のための反応部位を与える。硫酸基の負電荷は、カチオン種、一般的にはアルカリ金属陽イオン、好ましくはナトリウム陽イオンの正電荷によって釣り合わされる。特定の実施形態では、スキャフォールドを形成するポリマーマトリクスが水溶性セルロース化合物、例えばＮａＣＳを更に備えることができる。

[0036]用語「コラーゲン」は、結合組織に強度及び柔軟性を与える結合組織の主成分として生じる一群の細胞外類縁タンパク質のうちのいずれかを意味し得るが、これに何ら限定されない。少なくとも１４個のタイプが存在し、それぞれのタイプは、共通の三重螺旋構造を共有するがタイプ間で組成が幾分変わるトロポコラーゲン単位を備える。この場合、タイプは、異なる組織、段階、又は、機能に限局される。最も一般的なタイプＩを含む幾つかのタイプでは、トロポコラーゲンロッドが原線維又は線維を形成するように関連し、他のタイプでは、ロッドが、線維状コラーゲンではなく、線維状コラーゲンと関連付けられる。一方、他のものにおいて、それらは、非線維性で非周期的であるが構造化された網状組織を形成する。トロポコラーゲン、すなわち、コラーゲンの基本構造単位は、３つのポリペプチド鎖からなる螺旋構造を備え、各鎖は、螺旋を形成するように互いの周囲に巻き付けられて鎖間共有結合又は鎖内共有結合によって安定化される約１千のアミノ酸を備える。トロポコラーゲンは、３つの中からほぼ１つの残留物として生じるグリシンが豊富であり、また、プロリン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジンも豊富であり、他のタンパク質では少なくとも２つが稀に生じる。

[0037]用語「微小繊維」又は「ミクロンサイズの繊維」は、その直径が約１ミクロン（１０^−６ｍ）〜約１０００ミクロンの範囲である繊維を意味し得るが、これに何ら限定されない。

[0038]用語「ナノスケール繊維」又は「ナノサイズ繊維」は、その直径が約１ナノメートル（１０^−９ｍ）〜約１０００ナノメートルの範囲である繊維を意味し得るが、これに何ら限定されない。

[0039]特定の実施形態において、分解性ポリマーは、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（又はポリカプロラクトン、ポリアミド、多糖類、及び、コラーゲンからなるグループから選択される。好ましい実施形態では、ポリマーがポリ（乳酸−グリコール酸）である。

[0040]本明細書中で使用される用語「ポリ（グリコール酸）」、ポリグリコリド、及び、「ＰＧＡ」は、本明細書中では、生体分解性の熱可塑性ポリマー及び最も簡単な線状脂肪族ポリエステルを示すために置き換え可能に使用される。ＰＧＡは、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に得られてもよい。

[0041]「ポリラクチド」は乳酸から得られる生体分解性ポリマーである。ポリ（ラクチド）又はＰＬＡは、右旋性又は左旋性に関してＤ又はＬにより表わされ、あるいはラセミ混合物に関してＤＬにより表わされる２つの立体形状で存在する。用語「ＰＬＬＡ」とは、生体分解性脂肪族ポリエステルホモポリマーポリＬ−乳酸のことである。ＰＬＬＡは、例えばＡｌｋｅｒｍｅｓから商業的に得られてもよい。

[0042]ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃ−グリコシド）、及び、ＰＬＧＡという用語は、ポリ乳酸とグリコール酸とのコポリマーを示すために置き換え可能に使用される。ＰＬＧＡは、例えばＡｌｋｅｒｍｅｓから商業的に得られてもよい。

[0043]本明細書中で使用される用語「多糖類」は、グルコース及び類縁分子などの連鎖する単純な糖（単糖類）から形成される長鎖の天然ポリマー又は合成ポリマーである。２つの単糖類分子は、例えばサッカロースを形成するためのグルコースとフルクトースとの結合の場合のように、グリコシド結合によって結合されて二糖類を形成する。デンプン、グリコーゲン、セルロース、又は、キチンなどの更に複雑な多糖類は、グリコシド結合によって結合される多数の単位からなる。

[0044]本明細書中で使用される用語「多孔質」は、液体及び／又は気体によって満たされ、あるいは灌流されてもよい、又は、液体及び／又は気体の流通を可能にする１つ以上の開口部、孔、穿孔、又は、穴を有することに関連する。

[0045]用語「成長因子」とは、一般に、細胞上の細胞表面受容体（一般に、受容体チロシンキナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ、免疫グロブリン又はＧＰＣＲ）とのそれらの相互作用によって生理学的効果を引き出すことで知られる、サイトカイン及びケモカインを含む生体活性細胞シグナリング分子のことである。その受容体に結合する成長因子の生理学的効果としては、例えば、遺伝子発現、及び／又は、細胞増殖、分化、活性化、静止状態、又は、アポトーシスの変化が挙げられる。特定の場合には、成長因子が多面的である。すなわち、成長因子は、濃度、細胞タイプ、及び／又は、細胞状態に応じて異なる生理学的効果を含んでもよい。本明細書中で与えられる任意の実施形態において、繊維、マトリクス、及び／又は、スキャフォールドは、例えば細胞又は組織の成長、分化、及び／又は、修復を促進するために１つ以上の成長因子を更に含んでもよい。

[0046]用語「生体活性の」及び「生体活性」は、生体組織との相互作用又は生体組織からの応答に対する任意の効果を意味し得るが、これに何ら限定されない。

[0047]本明細書中で使用される用語「流体」は、流れることができる材料及び／又は材料の組み合わせを意味し得るが、これに何ら限定されない。例えば、本明細書中に記載される任意の実施形態で用いる流体は、例えば溶液中の液体成分及び／又は非液体成分（例えば、気体、固体、半固体、微粒子、コロイド）、懸濁液、分散流体、又は、これらの組み合わせを含んでもよい。更なる例として、表現「細胞分離株流体」は、液体成分と細胞材料又は組織由来材料との組み合わせを含む。

[0048]本発明の以下の実施形態は、血管移植片を播種し、培養し、保存し、輸送し、検査するための装置及び方法を含むシステムとの関連で説明されるが、当業者であれば分かるように、開示される方法及び構造は、更に幅広い用途において容易に適合できる。なお、同じ参照符号が異なる図に関して繰り返されるときには常に、その参照符号は、そのような図のそれぞれにおいて対応する構造を示す。

ＩＩ．代表的なシステム
[0049]図１は、細胞及び／又は移植片、例えば組織移植片を播種し、培養し、保存し、輸送し、及び／又は、検査するための本発明によって与えられる代表的な密閉システム１０００を示している。

[0050]特定の実施形態において、システムは、細胞分離株、例えば細胞分離株流体を収容するための手段を含む。特定の実施形態において、その手段は、滅菌され得る及び／又は密閉される媒体バッグ又は任意の柔軟な、あるいは硬質の容器などの容器３である。例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＦＬ１Ｌ媒体バッグを使用できる。特定の実施形態において、細胞分離株流体容器３は、テフロン、ポリカーボネート、ＰＶＣ、又は、ステンレス鋼などの滅菌され得る任意の生体適合性の硬質材料からなってもよい。容器３は、細胞分離株流体を収容するための任意の適した容積を有することができる。

[0051]好ましい実施形態において、容器３は、流体、例えば骨髄穿刺液を無菌充填及び／又は無菌分注するようになっている少なくとも１つのポートを有する。例えば、骨髄穿刺液（例えば、５ｃｃ／ｋｇ体重）が無菌で収集されてポート１又はポート２を介して容器３内へ送り込まれ、例えば注入される。他の好ましい実施形態において、容器３は、少なくとも１つの入口及び１つの出口を有する。更なる他の実施形態において、容器３は、流体又は気体の一方向の流れを可能にするために１つ以上のバルブを有するポートを含む。例えば、参考のために図１に示される実施形態を使用すると、ポート１は、無針アクセスポートなど、拭き取り可能なバルブの形状を含む及び／又はなすことができる。バルブは、当業者に知られる任意の適した結合手段又は締結手段、例えばクランプ、ねじ、又は、ルアーコネクタ、圧力嵌合、摩擦嵌合、カップリング等を使用して、容器３に接続することができ、及び／又は、容器３と連通する流体ラインと関連付けることができる。図１に示されるシステム１０００の実施形態によれば、バルブ５は、容器３と連通する管路、例えば流体ライン５１と関連付けられる。随意的に、容器３は、例えば、例えば約４０〜約１５０ミクロンの範囲の開口部又は細孔構造を有する例えばスクリーン又は織り要素を備えるプレフィルタ要素４を含む。そのようなプレフィルタ要素は、流体が容器から通り過ぎるときに例えば骨粉、凝血塊、及び／又は、脂肪堆積物などの望ましくない材料を除去するために使用できる。

[0052]特定の実施形態において、細胞分離株流体を収容するための手段は、流体又は気体を保持できる無菌及び／又は密閉容器を画定する本体を備え、この場合、本体は、流体を充填及び／又は分注するようになっている１つ以上のポートも形成する。特定の実施形態では、本体が１つ以上のポートを形成し、少なくとも１つのポートがバルブ、例えば一方向バルブを有する。更なる他の実施形態において、本体は、バルブを含む出口ポートを形成する。

[0053]システムで使用されてもよい流体の例としては、滅菌流体、造影剤流体、体液、細胞を含む流体、血液、血清、骨髄穿刺液、又は、培地を含む流体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態における検査中、播種中、及び、培養中、流体が人の体温に有利に維持されてもよく、また、流体が人の血液の粘性に近い流体からなってもよいことは言うまでもない。血液の粘性に近い溶液の１つの例示的な実施例は、グリセロールを伴う生理食塩水である。

[0054]容器３内に収容される流体は、容器から流体ライン５１に通される（図１）。好ましい実施形態では、流体が重力により容器３から離れるように方向付けられる。しかしながら、当業者であれば容易に分かるように、流体ポンプを使用することもできる（例えば、Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒによって製造されるＭａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｄｒｉｖｅ蠕動ポンプを使用できるが、当業者は様々な市販のポンプから選択できる）。

[0055]流体ライン５１及びシステムの他の流体ライン（例えば、ライン５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８ａ−５８ｄ、５９）は、使用中の流体又は気体を移送するのに適する任意のタイプの医療グレードの滅菌可能な耐久性のあるチューブから形成されてもよい。例えば、流体ラインが柔軟な、あるいは硬質のプラスチックとなることができる。

[0056]システムはフローチャネル７も含み、フローチャネル７は、少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの出口と、入口と出口との間にある少なくとも１つのフィルタ媒体（例えばフィルタハウジング内に配置される）を備える少なくとも１つのフィルタとを備える。好ましい実施形態において、フィルタは、フローチャネル７を通じた流れ方向に対して略垂直な角度で配置される（幾つかの実施形態では、例えば接線流濾過を含めて、流れ方向に対して略平行な角度でフィルタを配置することができる）。好ましい実施形態において、フィルタは、少なくとも２つの方向を通じた流れを許容するようになっており、この場合、例えば、第１及び第２の方向はほぼ反対であり、例えば、流体をフィルタの上流側表面から第１の方向で下流側表面に通すことができるとともに、流体をフィルタの下流側表面から第２の方向で上流側表面に通すことができる。この実施形態の例では、細胞分離株流体が適した孔径（又はメッシュサイズ）を有するフィルタに第１の方向で通され、その場合、フィルタ媒体は、大きすぎてフィルタを通過できない細胞及び／又は生体材料をフィルタが保持するように流れ方向に対して略垂直な角度をなす。その後、保持された細胞及び／又は生体材料をフィルタ媒体から洗い落とすことができる第２の流体が、フィルタに第２の方向で通される。フローチャネルで用いるために使用され得るフィルタは、当技術分野において良く知られており、例えば、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを含む。更に他の実施形態において、フィルタ（例えば、少なくとも１つのフィルタ媒体）は、細胞、例えば骨髄由来単核細胞を保持するのに適した多孔率を有する。特定の実施形態において、フィルタは、例えばリガンド受容体相互作用に基づいて対象の細胞を可逆的に結合して保持するようになっているマトリクスを備える。

[0057]更なる他の実施形態では、本明細書中に記載されるシステムで用いるために複数のフィルタを直列に、あるいは並列に組み込むことができる。

[0058]システム及び方法が任意の数の所望の流路及び遮断部を有することができると考えられる。液体又は気体は、少なくとも３つの方法で、すなわち、フィルタに接続されるＩＶ型バッグなど、重力によって、例えばシリンジ、ポンプ、又は、真空源を介した正圧又は負圧によってシステムを通じて供給することができ、これらの方法の全ては本発明により明確に包含されて考慮される。

[0059]フィルタ及び／又はシステムの任意の他の構成要素に対する接続は、当技術分野において良く知られた任意の数の方法で、例えば、無菌接続、ルアーフィッティングなどの取付具に対するねじ込み、スナップ、又は、摩擦嵌合、及び、締結具等によって行なうことができる。このように、様々な標準的な接続技術を用いて接続することができ、また、標準的な接続の任意の組み合わせが可能であると考えられる。

[0060]全ての組み合わせが本発明によって包含されて考慮される。

[0061]特定の実施形態では、システムが収集流体を収容するための手段を含む。特定の実施形態において、その手段は、滅菌され得る及び／又は密閉される媒体バッグ又は任意の柔軟な、あるいは硬質の容器などの容器１３である。例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＦＬ１Ｌ媒体バッグを使用できる。特定の実施形態において、収集容器１３は、テフロン、ポリカーボネート、アクリル、ＰＶＣ、又は、ステンレス鋼などの滅菌され得る任意の生体適合性の硬質材料からなってもよい。容器１３は、収集流体を収容するための任意の適した容積を有することができる。

[0062]好ましい実施形態において、容器１３は、流体、例えば骨髄穿刺液濾液を無菌充填及び／又は無菌分注する、あるいは貫流するようになっている少なくとも１つのポートを有する。例えば、骨髄穿刺液（例えば、５ｃｃ／ｋｇ体重）が、無菌で収集されて容器３内へ送り込まれ、例えば注入され、その後、（例えば、随意的なプレフィルタ４を通じて、及び、流体流れライン５１、５２を介して）フィルタを含むフローチャネル７に通される。フィルタが対象の細胞及び／又は生体材料を保持し、それにより、濾液は、流体ライン５３、５４及び入口ポート１１を通じて容器１３へ流れ込むことができる。他の好ましい実施形態において、容器１３は、少なくとも１つのフローポート、例えば双方向フローポートを有するが、一般に、容器１３は少なくとも２つのポートを有する。特定の実施形態では、容器１３が入口ポート及び／又は出口ポートを備える（図１に示される実施形態では、容器１３が入口ポート１１と出口ポート１４とを備える）。更なる他の実施形態において、容器１３は、流体又は気体の一方向の流れを可能にするために１つ以上のバルブを有するポートを含む。バルブは、当業者に知られる任意の適した結合手段又は締結手段、例えばクランプ、ねじ、又は、ルアーコネクタ、圧力嵌合、摩擦嵌合等を使用して、容器１３に接続することができ、及び／又は、容器１３と連通する流体ラインと関連付けることができる。図１に示される実施形態によれば、システム１０００は、流体ライン５４と関連付けられるバルブ１０を含む。

[0063]特定の実施形態において、収集流体を収容するための手段は、流体又は気体を保持できる無菌及び／又は密閉容器を画定する本体を備え、この場合、本体は、流体を充填及び／又は分注するようになっている１つ以上のポートも形成する。特定の実施形態では、本体が１つ以上のポートを形成し、少なくとも１つのポートがバルブ、例えば一方向バルブを有する。更なる他の実施形態において、本体は、バルブを含む出口ポートを形成する。

[0064]特定の実施形態では（例えば、以下で更に詳しく言及されるように、溶出流体がフローチャネル７に通されて、細胞が播種容器１８内へ送り込まれた後）、容器１３内に収容される収集流体又は濾液が流体ライン５９、５７を通じて播種容器１８内へ送り込まれる（図１）。好ましい実施形態では、流体が重力によって容器１３から離れるように方向付けられる。しかしながら、当業者であれば容易に分かるように、流体ポンプを使用することもできる（例えば、Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒによって製造されるＭａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｄｒｉｖｅ蠕動ポンプを使用できるが、当業者は様々な市販のポンプから選択できる）。特定の実施形態では、システムが溶出流体を収容するための手段を含む。特定の実施形態において、その手段は、滅菌され得る及び／又は密閉される媒体バッグ、シリンジ、又は、任意の柔軟な、あるいは硬質の容器などの容器９である。例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＦＬ１Ｌ媒体バッグを使用できる。特定の実施形態において、溶出流体容器９は、テフロン、ポリカーボネート、アクリル、ＰＶＣ、又は、ステンレス鋼などの滅菌され得る任意の生体適合性の硬質材料からなってもよい。容器９は、溶出流体を収容するための任意の適した容積を有することができる。

[0065]好ましい実施形態において、容器９は、流体、例えば溶出流体又は洗浄流体を無菌充填及び／又は無菌分注するようになっている少なくとも１つのポートを有する。特定の実施形態において、溶出流体は、細胞培地、生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水、デキストランを含む生理食塩水、又は、細胞を取得する、あるいは培養するために当業者に知られる任意の他の適した流体、例えば、乳酸加リンガー溶液、生理食塩水、ダルベッコの修正イーグル培地、国際公開第９８／０４５４１３号及び第０５／０９４９１４号等に開示される流体となることができる。他の好ましい実施形態において、容器９は、少なくとも１つのフローポート、例えば双方向フローポートを有する。特定の実施形態では、容器９が入口及び／又は出口を備える。更なる他の実施形態において、容器９は、流体又は気体の一方向の流れを可能にするために１つ以上のバルブを有するポートを含み、及び／又は、１つ以上のバルブが容器９と連通する流体ラインと関連付けられる。図１に示される実施形態によれば、システム１０００は、流体ライン５５と関連付けられるバルブ８を含む。バルブは、当業者に知られる任意の適した結合手段又は締結手段、例えばクランプ、ねじ、又は、ルアーコネクタ、圧力嵌合、摩擦嵌合等を使用して、容器９に接続することができ、及び／又は、流体ラインと関連付けることができる。溶出流体又は洗浄流体は、バルブ８及び流体ライン５３、フローチャネル７、流体ライン５２、５６、５７を通じて播種容器１８内へ送り込まれる（図１）。

[0066]特定の実施形態において、溶出流体又は洗浄流体を収容するための手段は、流体又は気体を保持できる無菌及び／又は密閉容器を画定する本体を備え、この場合、本体は、流体を充填及び／又は分注するようになっている１つ以上のポートも形成する。特定の実施形態では、本体が１つ以上のポートを形成し、少なくとも１つのポートがバルブ、例えば一方向バルブを有する。更なる他の実施形態において、本体は、バルブを含む出口ポートを形成する。

[0067]１つの実施形態において、容器９は、滅菌溶出流体又は洗浄流体で満たされるシリンジである。溶出流体又は洗浄流体は、フローチャネル７に通されて、バルブ８、流体ライン５３、５２、５６、５７を介して播種容器１８内へ送り込まれる（図１）。この実施形態において、流体は、例えば手動であるいは機械的及び／又は電気器具によってシリンジプランジャを押すことにより流体に及ぼされる圧力に起因して容器９から離れるように方向付けられる。あるいは、例えば、容器９は圧縮され得る柔軟な容器であってもよい。しかしながら、当業者であれば容易に分かるように、流体ポンプを使用することもできる（例えば、Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒによって製造されるＭａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｄｒｉｖｅ蠕動ポンプを使用できるが、当業者は様々な市販のポンプから選択できる）。

[0068]特定の実施形態では、システムが細胞播種アセンブリを収容するための手段を含む。特定の実施形態において、その手段は、滅菌され得る及び／又は密閉される媒体バッグ又は任意の柔軟な、あるいは硬質の容器などの播種容器１８である。例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＦＬ１Ｌ媒体バッグを使用できる。特定の実施形態において、容器１８は、テフロン、ポリカーボネート、アクリル、ＰＶＣ、又は、ステンレス鋼などの滅菌され得る任意の生体適合性の硬質材料からなってもよい。播種容器１８は任意の適した容積を有することができる。

[0069]特定の実施形態において、播種容器１８は、雌ねじ及び雄ねじなどの任意の標準的な手段によってあるいは結合剤の使用によって固定されて漏れ止めされる２つ以上の部分を備えてもよい。例えば、図１に示される実施形態によれば、播種容器１８は、ねじを含む本体部分を備える硬質材料と、ねじ付きのキャップ１７とを備える。あるいは、図１Ａに示される播種容器１８の実施形態によれば、播種容器はバッグなどの柔軟材料を備える。容器１８内のスキャフォールド又は移植片、例えば血管移植片を観察するために、容器の任意のポイント又は場所に観察ポートが配置されてもよく、あるいは、容器は、ポリカーボネート又はＰＶＣなどの光学的に透明な材料から形成されてもよい。

[0070]好ましい実施形態において、播種容器１８は、流体、例えば本明細書中に記載されるような溶出流体又は洗浄流体及び／又は収集流体又は濾液流体を無菌充填及び／又は無菌分注するようになっている少なくとも１つのポートを有する。特定の実施形態では、容器１８が入口及び／又は出口を有する。更なる他の実施形態において、容器１８は少なくとも１つの入口ポート及び出口ポートを有する（図１及び図３に示される実施形態において、播種容器１８は、入口ポート１６、出口ポート２４、サンプリングポート１９（例えば、例えば微生物汚染及び／又は幹細胞計数を決定するために播種容器から流体サンプルを無菌取得するためのポート）、及び、通気ポート２６を備え、キャップ１７（図１のみ）がポートを備える）。参考のために図１及び図３に示される実施形態を使用すると、ポート１９は、無針アクセスポートなど、拭き取り可能なバルブを含むことができる。特に好ましい実施形態において、出口ポートは細胞播種アセンブリ１００と適合される（図３参照）。特定の実施形態において、容器１８は、流体又は気体の一方向の流れを可能にするために１つ以上のバルブを有する入口ポートを備える。これに代えて、あるいはこれに加えて、１つ以上のバルブを播種容器と連通する１つ以上の流体ラインと関連付けることができる。バルブは、当業者に知られる任意の適した結合手段又は締結手段、例えばクランプ、ねじ、又は、ルアーコネクタ、圧力嵌合、摩擦嵌合等を使用して、容器１８に接続することができ、及び／又は、容器１８と連通する流体ラインと関連付けることができる。

[0071]好ましい実施形態において、播種容器１８は、容器内への及び容器を通じた流体の灌流及び／又は循環を可能にする入口ポート１６及び出口ポート２４を備える。入口ポート１６及び出口ポート２４は、容器１８を流体ライン５７、５８ａにそれぞれ取り付けるためにも使用される。流体ライン５８ａは、閉じられたシステムを維持しつつ、播種容器１８を１つ以上の残留播種細胞流体容器３５ａ、３５ｂに接続する。図１には１つの播種容器１８のみが示されているが、複数の播種容器をシステムに対して並列に接続するために流体ライン、例えば流体ライン５７又は５８ａが分岐されてもよいことは言うまでもない。

[0072]随意的に、播種容器１８は、例えば国際公開第９１／０１７８０９号に開示されるように例えば少なくとも１つの疎水性微多孔膜（好ましくは、ハウジングに配置される）を備える少なくとも１つの通気孔を更に備えることができる。例えば、図１及び図３に示される実施形態では、好ましくは細菌遮断細孔率を与える通気孔２６を少なくとも１つの播種容器ポート２５と連通する状態で配置することができる。任意の特定の理論又は機構に拘束されることなく、通気孔は、例えば播種されたスキャフォールドが浸漬される空間のガス交換を可能にしてもよい。

[0073]特定の実施形態において、播種アセンブリを収容するための手段は、流体又は気体を保持できる無菌及び／又は密閉容器を画定する本体を備え、この場合、本体は、流体を充填及び／又は分注するようになっている１つ以上のポート及び播種アセンブリも形成する。特定の実施形態では、本体が１つ以上のポートを形成し、少なくとも１つのポートがバルブ、例えば一方向バルブを有する。更なる他の実施形態では、本体が出口ポートを形成する。

[0074]特定の実施形態において、残留播種細胞流体を収容するための手段は、滅菌され得る及び／又は密閉される媒体バッグ又は任意の柔軟な、あるいは硬質の容器などの少なくとも１つの残留播種細胞流体容器３５ａ、３５ｂである。例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＦＬ１Ｌ媒体バッグを使用できる。特定の実施形態において、容器３５ａ、３５ｂは、テフロン、ポリカーボネート、ＰＶＣ、又は、ステンレス鋼などの滅菌され得る任意の生体適合性の硬質材料からなってもよい。

[0075]好ましい実施形態では、真空源、例えばポンプとレギュレータ２８とを備える真空アセンブリの使用により、流体が、容器１８から、ポート２５及び流体ライン５８ａを通じて、残留播種細胞流体容器３５ａ内へ引き込まれ、この場合、ポンプからの負圧は、残留播種細胞流体容器３５ａ、３５ｂ及び播種容器１８に接続される流体ラインを通じて伝えられる。

[0076]特定の実施形態では、播種容器１８は播種アセンブリ１００を収容し、播種アセンブリ１００は、多孔質チューブ２０と、スキャフォールド２１、例えば血管移植片スキャフォールドなどの細胞又は組織のスキャフォールド又は移植片とを備える。多孔質チューブ２０は、流体を浸透させることができるようにされてもよい、テフロン、ＰＶＣ、ポリカーボネート、プラスチック、金属、例えばステンレス鋼などの任意の適した硬質材料からなってもよい。適した多孔質チューブの１つの例示的な実施例は、Ｐｏｒｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより製造される多孔質プラスチックチューブである。あるいは、多孔質チューブ２０は、伸縮することができ且つ流体を浸透させることができるようにされてもよいＰＥＴ又は血管形成術用バルーンなどの任意の適したエラストマ材料からなってもよい。播種容器１８及びチューブ２０はいずれも、任意の長さ、あるいは直径の血管移植片スキャフォールド２１を保持するために任意の長さ、あるいは直径にされてもよい。これは、任意のサイズの血管移植片を無菌化し、播種し、培養し、保存し、輸送し、及び、検査するためにシステムを使用できるため有利である。播種中、培養中、保存中、輸送中、又は、処置中にスキャフォールドをチューブの所定の位置に保持するために、クリップ、Ｏリング、又は、グロメットなどの１つ以上の保持要素が、チューブ２０に、例えばスキャフォールド２１の両端に配置されてもよい。

[0077]特定の実施形態では、多孔質チューブ２０がマンドレル１２０ａを備える。代表的なマンドレルが図２に示されている。図２を参照すると、マンドレルマニホールド１２０の開放端１２６は吸引ロッド２３上にわたって嵌め付けられ、吸引ロッドはその閉塞端の近傍に開口１２４を有する。その後、マンドレルが例えば適切なサイズの結合リング１２３を用いて取り付けられ、その場合、結合リング１２３は有孔マンドレル上にわたって嵌め付けられ、例示的には、マンドレル１２０ａが１つ以上の（図１に示される）Ｏリング２２によって播種容器１８内に摩擦的に保持される。このアセンブリは、マンドレルマニホールド１２０を通じて開口１２４に入って開口部１２５から出る流体の移動を可能にする。本明細書中に記載されるように、流体は、播種容器１８から、残留播種細胞流体容器３５ａ、３５ｂと連通する真空手段（例えばポンプ）によって、マンドレルを貫通する吸引ロッド２３により、流体ライン５８ａ〜５８ｄを介してマンドレル１２０ａに方向付けられる。

[0078]好ましい実施形態では、マンドレル１２０ａが複数の穴又は穿孔１２１を備える。しかしながら、穿孔は、この説明を考慮して当業者に明らかであり且つ本発明によって包含されて考慮される任意の数の方法で変えられ得る所望のサイズ、形状、及び／又は、構造をなしてもよいことは言うまでもない。また、多孔質チューブ２０が任意の所望の長さ及び／又は直径を有することもできると考えられる。例えば、直径は、本発明によって明確に包含されて考慮される異なる移植片サイズ及び／又は用途に対応するように変えられてもよい。

[0079]特定の実施形態において、播種容器１８は、多孔質チューブ１８とスキャフォールド２１とを備える播種アセンブリ１００を収容する。スキャフォールドは、天然由来の例えば胎盤組織であってもよく、あるいは、合成されてもよい。例えば、合成細胞及び／又は組織スキャフォールドは、当技術分野において知られており、市販されている。スキャフォールドの１つの適した例が国際公開第０９／０１９９９５号に開示されている。特定の実施形態において、使用されるべきスキャフォールドは、無作為には位置合わせされて、織メッシュ又は不織メッシュに組み付けられるポリマー（ホモポリマー及び／又はコポリマー）繊維から形成される三次元マトリクスとなり得る。好ましい実施形態において、スキャフォールドの繊維マトリクスは、細胞が付着して成長し及び／又は分化できるようにするのに適するサイズの孔を備える。細胞の直径は約１０μｍ〜２０μｍであるため、特定の実施形態ではこの範囲内の孔径が望ましい。また、本発明によって提供されるポリマースキャフォールドは、天然の細胞外マトリクスの構造及び組成をより厳密に模倣して、播種細胞の成長及び分化を促進させるとともに、スキャフォールドの移植及び／又は着床又はスキャフォールド上での細胞成長を容易にするように形成され、あるいは製造され得る。スキャフォールドマトリクスを構成する繊維は、任意の所望のサイズを有することができるが、一般的には約１．５ｍｍ〜１ｎｍである。特定の実施形態では、繊維がナノスケール（すなわち、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍ）及び／又はマイクロスケール（約１μｍ〜約１０００μｍ）である。特定の実施形態において、本発明のスキャフォールドは、成長及び／又は分化を促進させることができる１つ以上の成長因子を更に備える。

[0080]本発明で用いるスキャフォールドを作成するために有益なポリマーは、無機（例えば、シロキサン、硫黄鎖、黒リン、ホウ素窒素、シリコン）であってもよく、あるいは、有機（炭素を含むことを意味する）であってもよい。有機ポリマーは、天然（例えば、デンプン、セルロース、ペクチン、海藻ガム、植物ガムなどの多糖類；カゼイン、アルブミン、グロブリン、ケラチン、コラーゲン、インスリン、ＤＮＡなどのポリペプチド；及び、炭化水素）であってもよく、合成（例えば、熱可塑性（未加硫エラストマ、ナイロン、ポリ塩化ビニル、線状ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、アクリレート樹脂）；熱硬化性（例えば、加硫エラストマ、架橋ポリエチレン、フェノール樹脂、アルキド樹脂、ポリエステル）、及び、半合成（例えば、レーヨン、メチルセルロース、セルロースアセテート、及び、改質デンプンなどのセルロース誘導体）など）であってもよい。また、本発明で有用なスキャフォールドは、水溶性又は不水溶性のセルロース化合物から形成されるヒドロゲルを備えてもよい。当業者により容易に理解されるように、スキャフォールドの特定のタイプ及び組成は、所望の用途に応じて異なる。しかしながら、一般的には、スキャフォールドを構成するポリマー材料が生体適合性（すなわち、望ましくない免疫反応を発現しない）であることが好ましい。

[0081]特定の実施形態では、スキャフォールドが生体適合性である。任意の実施形態において、分解性ポリマーは、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（又はポリカプロラクトン、ポリアミド、多糖類、及び、コラーゲンからなるグループから選択される。好ましい実施形態では、ポリマーがポリ（乳酸−グリコール酸）である。

[0082]本明細書中に記載される任意の実施形態において、スキャフォールドは、播種アセンブリ内で、多孔質チューブ、例えば本明細書に記載されるマンドレルに併置され得る。例えば、スキャフォールドが多孔質チューブの一部だけと接触されてもよいと考えられる。あるいは、スキャフォールドが多孔質チューブの一部又は全てを実質的に取り囲んでもよいと考えられる。一般に、流体が可能な限りスキャフォールドの大部分を通過して流れ、可能な限り多くの細胞の播種を促すように、スキャフォールドが多孔質チューブの穿孔部と並置し、あるいは穿孔部に隣接していることが好ましい。

[0083]本発明の実施形態によれば、例えば多孔質チューブ（好ましくは、マンドレル及びスキャフォールド）を備える播種アセンブリを備える複数の播種容器を、例えば異なるサイズの移植片及び／又は異なる用途のために予め組み付けておき、望ましいときにシステムの一部として組み付けることができる。一般に、例えば、播種容器は、予め組み付けられて滅菌され、システムの残りの部分に例えば無菌接続により無菌的に接続することができる。したがって、最適なシステムを必要なときに迅速にセットアップできる。

[0084]他の好ましい実施形態において、フローチャネルは、細胞分離株容器、収集流体容器、溶出流体又は洗浄流体容器、及び、播種容器の間に配置される。この構成が図１により例示されている。更なる他の実施形態では、フローチャネルがこれら容器のそれぞれと選択的に流体的に連通する。一実施形態において、ハウジングは、入口と、出口と、少なくとも１つのフィルタ媒体、例えば多孔質白血球除去媒体を備えるフィルタとを含むフローチャネルを備える（例えば、好ましい実施形態において、フローチャネルは、入口及び出口を有するとともに入口と出口との間に流体流路を形成するハウジングと、流体流路を横切ってハウジング内に配置される少なくとも１つの多孔質フィルタ媒体を備えるフィルタとを備えるフィルタ器具を備える）。他の実施形態において、ハウジングは、フローチャネルと、入口と、出口と、入口と出口との間のフィルタと、バルブとを備える。特定の実施形態において、バルブは、少なくとも１つの開位置と、少なくとも１つの閉位置とを有する。

[0085]任意の好ましい実施形態において、本発明により提供されるシステムは、流体及び／又は気体の流通を許容するフローラインを備える。

[0086]したがって、好ましい実施形態において、本発明は、細胞移植片又は組織移植片の播種、培養、保存、輸送、及び／又は、検査のためのシステムであって、細胞分離株流体容器と、該細胞分離株流体容器、収集流体容器、溶出流体容器、及び、播種容器の間に配置されるフローチャネルとを備え、フローチャネルが、入口と、出口と、入口と出口との間のフィルタとを備え、フィルタが少なくとも２つの方向で流れを許容するようになっており、フローチャネルが、細胞分離株流体容器、収集流体容器、溶出流体容器、及び、播種容器のそれぞれと選択的に流体的に連通し、播種容器が播種アセンブリを備える、システムを提供する。

[0087]１つの実施形態において、播種アセンブリは、穿孔マンドレルと、該マンドレルの少なくとも一部に併置される生体適合性の三次元スキャフォールドとを備える。

[0088]更なる他の実施形態では、システムが少なくとも１つの残留播種細胞流体容器を備え、該残留播種細胞流体容器は播種容器と選択的に流体的に連通する。

[0089]他の実施形態において、システムは、残留播種細胞流体容器と流体的に連通する真空源を備える。

[0090]本明細書に記載される代表的な実施形態のシステム（図１、図２、図３参照）は、無菌システムを維持しつつ、あるいは、密閉滅菌システムを維持し、骨髄由来単核細胞を分離できるとともに、短期間の培養（例えば、約３時間以下、より好ましくは約２時間以下）後に培養血管移植片として使用できる生体適合性の三次元スキャフォールド上へ細胞を播種することができる。

[0091]当業者であれば分かるように、本発明の実施形態によれば、システムを無菌システムを維持しつつ使用することができ、この場合、手術室などの滅菌野で無菌技術を用いて、構成要素を扱うための無菌手袋を使用して、無菌播種容器を（例えば、所望の多孔質チューブ及びスキャフォールドと）組み付けることができる。組み付けられた播種容器をシステムの他の構成要素に接続することができ、例えば、この場合、細胞分離株容器、溶出容器、及び、収集容器は、密閉無菌態様で既に予め組み付けられてしまっている。

[0092]あるいは、好ましくは、システムを密閉無菌システムを維持しつつ使用することができ、その場合、システムは使用前に予め組み付けられて滅菌されてしまっている。

[0093]特定の実施形態では、システムを使い捨てできる。使い捨てできる密閉システムは、前述した方法と比べて同様の播種効率を達成しつつ迅速に行なうことができる培養移植片、例えば血管移植片の構成のための手続きを可能にする。前記方法については、例えば、参照することによりそれらの全体が本願に組み入れられる、Ｍａｔｓｕｍｕｒａ Ｇ，Ｈｉｂｉｎｏ Ｎ，Ｉｋａｄａ Ｙ，Ｋｕｒｏｓａｗａ Ｈ，Ｓｈｉｎｏｋａ Ｔ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ａｕｔｏｇｒａｆｔｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００３；２４：２３０３−８；ａｎｄ ＦＤＡ ＩＤＥ １４１２７を参照されたい。また、本明細書中に記載されるシステムの使用は、ポイント・オブ・ケアでの（すなわち、スキャフォールド輸送の必要性を排除する手術室内で）培養移植片、例えば血管移植片を構成するための機会を与える。

[0094]本明細書中に記載される三次元スキャフォールド上へ細胞を播種するための無菌システム又は密閉システムは、フィルタ細胞分離と、真空播種と、ある点では前述しない再生医療で用いる容器（例えばバッグ）技術とを組み合わせる。この技術の利点としては、滅菌フード又はＩＳＯクラ￥ス７の部屋を必要とすることなくこの技術が培養構成物の組み付けを可能にし、それにより、培養生成物を形成するためのコストが劇的に低減されると同時に、そのような設備又は施設の必要性を排除することにより培養生成物の使用の臨床的有用性が高まるという点が挙げられる。他の利点は、既に利用可能な移植片を僅かな時間で提供するという点である。

ＩＩＩ．代表的な方法
[0095]骨髄由来単核細胞を伴う培養血管移植片は、本開示の代表的な方法にしたがって得られてもよい。

[0096]図１を参照すると、更なる態様では、本発明は、細胞をスキャフォールド上へ播種するための方法において、例えば、前述した方法のいずれかにしたがって細胞播種システムを用意するステップであって、システムでは、細胞分離株流体容器、収集流体容器、溶出流体容器、及び、播種容器のそれぞれとフローチャネルとの間に少なくとも１つのバルブが配置され、フローチャネルが細胞分離株流体容器及び収集流体容器とだけ流体的に連通することにより第１の段階が規定されるステップと、流体の流れを第１の方向で細胞分離株流体容器から収集流体容器に方向付けるステップであって、細胞分離株流体からの細胞がフィルタに保持されるステップと、フローチャネルが収集流体容器又は細胞分離株流体容器と流体的に連通しないように少なくとも１つのバルブを閉じるステップであって、フローチャネルが溶出流体容器及び播種容器とだけ流体的に連通することにより第２の段階が規定されるステップと、溶出流体容器からの溶出溶液の流れを第１の方向とはほぼ反対の方向でフローチャネルフィルタを通過するように方向付け、それにより、細胞がフィルタから実質的に除去されて播種容器内へ流れ込むようにするステップと、流れを生体適合性の三次元スキャフォールド及び有孔マンドレルを通じて残留播種細胞流体容器に方向付けることにより播種容器から流体を除去し、それにより、播種容器内の細胞の少なくとも一部がスキャフォールド上へ播種されるステップとを備える方法を提供する。

[0097]１つの実施形態において、流体は、細胞懸濁液の全てがスキャフォールドを通過して残留播種細胞流体容器３５ａ、３５ｂ内に収集されるまで印加される真空、例えば−２０ｍｍＨｇ（又は、フローチャネル２内のフィルタの泡立ち点よりも低い他の適した値）によって播種容器から除去される。

[0098]他の実施形態において、ハウジングは、入口と、出口と、フィルタとを含むフローチャネルを備える。他の実施形態において、ハウジングは、フローチャネルと、入口と、出口と、入口と出口との間にあるフィルタと、バルブとを備える。特定の実施形態では、バルブは、少なくとも１つの開位置と、少なくとも１つの閉位置とを有する。

[0099]したがって、他の実施形態では、一般的参考のために図１に示される例示的なシステム１０００を使用して（図３に示される播種アセンブリ１８もシステムで使用できる）、方法は、骨髄穿刺液（例えば、５ｃｃ／ｋｇ体重）を容器３内へ無菌で収集するステップであって、少なくともバルブ５１が閉じられる（一般に、バルブ６、７、８、１０、１５のうちの１つ以上も閉じられる）ステップを備える。クランプ５、１０が開放され、また、重力を使用して、骨髄穿刺液が（流体ライン５１、５２を介して）フローチャネル７のフィルタに通され、該フィルタが骨髄由来単核細胞を捕捉する。骨髄穿刺液の残りの部分（一般的には主に血漿からなる）は（流体ライン５３、５４及びポート１１を介して）収集流体容器１３内に収集される。その後、クランプ５、１０が閉じられるとともに、バルブ８、６が開かれ、溶出溶液が、流体ライン５２、５６、５７及びポート１６を通過して播種容器１８内に収集される骨髄由来単核細胞を解放するフィルタ７に（流体ライン５５、５３を介して）通される。播種容器１８は、有孔の多孔質チューブ２０／マンドレル１２０ａ上にわたって嵌め付けられるスキャフォールド２１を含む播種アセンブリ１００を収容する。好ましい実施形態において、骨髄由来単核細胞懸濁液は、有孔マンドレル２０上にわたって嵌め付けられるスキャフォールド２１を完全に覆って播種容器１８を満たす（図１Ａは、スキャフォールドと接触する細胞懸濁液を示す）。その後、バルブ６、１０が閉じられて、バルブ２７が開かれ、レギュレータ２８を含む真空アセンブリを使用する真空（例えば、−２０ｍｍＨｇ）が、細胞懸濁液の全てがスキャフォールドを通過してポート２４及び流体ライン５８ａを介して残留播種細胞流体容器３５ａ内に収集されるまで印加される（過剰な流体が存在する場合には、更なる細胞懸濁液が流体ライン５８ｂを介して残留播種細胞容器３５ｂ内に収集される）。

[00100]真空が停止された後、バルブ２７が好ましくは閉じられて、バルブ１５が開かれ、容器１３内の血清を重力によって流体ライン５９、５７及びポート１６を介して播種容器１８内へ排出することができ、それにより、播種されたスキャフォールドが浸漬される。随意的なバルブ２６が播種容器１８の一部として含まれる場合には、例えば浸漬中にガス交換が行なわれてもよい。必要に応じて、例えば細胞が浸漬されている間の播種容器及び／又は播種容器の構成要素（マンドレル及び／又はスキャフォールドなど）の取り扱いを容易にするため、播種容器１８の上流側の１つ以上のシステム構成要素、例えば、フィルタ７、溶出容器９、収集容器１３、及び／又は、細胞分離株容器３を（例えば、適切な流体ラインをヒートシールした後に）取り除いて廃棄することができる。更なる選択肢として、例えば約１０〜１００％湿度、３５〜３７℃の３〜５％ＣＯ_２を伴う培養器内に装置全体が約２時間にわたって配置され、その後、（例えば、キャップ１７（図１）を除去した後、あるいは、柔軟な容器（図３）を切り開いた後に）播種されたスキャフォールドを無菌で容器から取り除いて培養血管移植片として使用できる。

ＩＶ．代表的なキット
[00101]更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される実施形態のいずれかに係るシステム又は装置を構成する少なくとも１つの容器を備えるキットを提供するとともに、その用法を提供する。

Ｖ．実施例
[00102]言うまでもなく、本発明の代表的な実施形態は、本明細書中に記載される実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本発明の代表的な実施形態は、本明細書中で与えられる任意の全ての用途及び当業者の技能の範囲内の全ての変形を含むように解釈されるべきである。

ＶＩ．参照による組み入れ
[00103]この明細書の全体にわたって引用された全ての文献、特許、係属中の特許出願、公開された特許出願、公開された特許の内容は、参照することにより明確に本願に組み入れられる。

ＶＩＩ．等価物
[00104]当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態と同等の多くの等価物を決まりきった実験を行なうだけで認識し、あるいは確かめることができる。

[00105]言うまでもなく、本明細書中に記載される詳細な実施例及び実施形態は、単なる例示目的のために一例として与えられているにすぎず、決して本発明を限定していると見なされてはならない。本発明に照らした様々な改変又は変更は、当業者へ暗示され、この出願の思想及び範囲内に含まれるとともに、添付の特許請求の範囲内と見なされる。例えば、原料の相対的な量が所望の効果を最適化するように変えられてもよく、更なる原料が加えられてもよく、及び／又は、同様の原料が、記載された原料のうちの１つ以上の代わりに用いられてもよい。本発明のシステム、方法、及び、プロセスと関連付けられる更なる有利な特徴及び機能は、添付の特許請求の範囲から明らかである。また、当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態と同等の多くの等価物を決まりきった実験を行なうだけで認識し、あるいは確かめることができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるべく意図される。

Claims (33)

1. 細胞を播種するためのシステムであって、
   細胞分離株流体容器と、
   前記細胞分離株流体容器、収集流体容器、溶出流体容器及び播種容器の間に配置されるとともに、入口と、出口と、前記入口と前記出口との間のフィルタとを備えるフローチャネルと
   を備え、
   前記フィルタが少なくとも２つの方向での流れを許容するようになっており、
   前記フローチャネルが、前記細胞分離株流体容器、前記収集流体容器、前記溶出流体容器及び前記播種容器のそれぞれと選択的に流体的に連通し、
   前記播種容器が細胞播種アセンブリを備える、システム。
2. ハウジングが、前記フローチャネルと、入口と、出口と、前記入口と前記出口との間のフィルタとを備える、請求項１に記載のシステム。
3. 前記播種容器が通気孔を更に備える、請求項１に記載のシステム。
4. 当該システムが密閉システムを構成し、該システムが、前記播種容器と選択的に流体的に連通する少なくとも１つの残留播種細胞流体容器と、該残留播種細胞流体容器と流体的に連通する真空源とを更に備える、請求項３に記載のシステム。
5. 前記播種容器が、ねじ付きの本体と、ねじ付きのキャップとを備える、請求項１に記載のシステム。
6. 前記播種容器が柔軟なバッグを備える、請求項１に記載のシステム。
7. 密閉システムを構成する、請求項１に記載のシステム。
8. 前記播種容器が、有孔マンドレルと、該有孔マンドレルの少なくとも一部に併置される生体適合性の三次元スキャフォールドとを備える、請求項１に記載のシステム。
9. 生体適合性の前記三次元スキャフォールドが生体分解性である、請求項８に記載のシステム。
10. 生体適合性の前記三次元スキャフォールドがポリマー繊維のマトリクスを備える、請求項９に記載のシステム。
11. 前記繊維が、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（又はポリカプロラクトン）、ポリアミド、ポリビニルポリマー又はコポリマー、多糖類、コラーゲン、及び、これらの組み合わせからなるグループから選択される少なくとも１つのポリマーを備える、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記繊維がポリ−Ｉ−（乳酸）を備える、請求項１１に記載のシステム。
13. 複数の播種容器を備える、請求項１に記載のシステム。
14. 複数の前記播種容器が、前記フローチャネルと選択的に流体的に連通するマニホールドと選択的に流体的に連通するとともに、入口と、バルブと、複数の出口とを備え、前記マニホールドが前記各播種容器に対してほぼ等しく流体及び／又は気体を分配するようになっている、請求項１３に記載のシステム。
15. 前記スキャフォールドが、三次元的な組織成長をその上で促進させることができる組織移植片である、請求項８に記載のシステム。
16. 前記組織移植片が着床可能な血管組織移植片である、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記血管組織移植片が前記有孔マンドレルの少なくとも一部を取り囲む、請求項１に記載６のシステム。
18. 当該システムが密閉システムを構成し、細胞分離株流体が無菌である、請求項１に記載のシステム。
19. 当該システムが密閉システムを構成し、溶出溶液が無菌である、請求項１に記載のシステム。
20. 前記細胞分離株流体容器、前記溶出流体容器、前記収集流体容器、前記播種容器、及び、前記残留細胞流体容器のそれぞれが入口と出口とを備える、請求項４に記載のシステム。
21. 細胞をスキャフォールド上へ播種するための方法であって、
    請求項４に記載のシステムを用意するステップであり、前記システムでは、前記細胞分離株流体容器、前記収集流体容器、前記溶出流体容器、及び、前記播種容器のそれぞれと前記フローチャネルとの間に少なくとも１つのバルブが配置され、前記フローチャネルが前記細胞分離株流体容器及び前記収集流体容器とだけ流体的に連通することにより第１の段階が規定される、ステップと、
    流体の流れを第１の方向で前記細胞分離株流体容器から前記収集流体容器に方向付けるステップであり、前記細胞分離株流体からの細胞が前記フィルタに保持される、ステップと、
    前記フローチャネルが前記収集流体容器又は前記細胞分離株流体容器と流体的に連通しないように少なくとも１つの前記バルブを閉じるステップであり、前記フローチャネルが前記溶出流体容器及び前記播種容器とだけ流体的に連通することにより第２の段階が規定される、ステップと、
    前記溶出流体容器からの溶出溶液の流れを第１の方向とはほぼ反対の方向で前記フローチャネルフィルタを通過するように方向付け、それにより、細胞が前記フィルタから実質的に除去されて前記播種容器内へ流れ込むようにするステップと、
    流れを生体適合性の前記三次元スキャフォールド及び前記有孔マンドレルを通じて前記残留細胞流体容器に方向付けることにより前記播種容器から流体を除去し、それにより、前記播種容器内の細胞の少なくとも一部が前記スキャフォールド上へ播種されるステップと
    を備える方法。
22. 前記播種容器内の流体を除去する前に、
    前記フローチャネルと前記溶出流体容器との間のバルブを閉じるステップであり、前記収集流体容器が前記フローチャネル及び／又は前記播種容器とだけ流体的に連通することにより第３の段階が規定される、ステップと、
    流体の流れを前記収集流体容器から前記播種容器に方向付けるステップと
    を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記第１の段階、前記第２の段階、又は、前記第３の段階のうちの少なくとも１つにおける流体の流れが重力に起因する、請求項２２に記載の方法。
24. 流体が前記播種容器から真空によって除去される、請求項２１に記載の方法。
25. ハウジングが、前記フローチャネルと、入口と、出口と、前記入口と前記出口との間のフィルタとを備える、請求項２１に記載の方法。
26. 細胞を培養するための密閉システムであって、
    細胞分離株を収容するための第１の手段と、
    前記第１の手段間に配置される流体流れを方向付けるための第２の手段と、
    流体を収集するための第３の手段と、
    溶出流体を収容するための第４の手段と、
    細胞播種アセンブリを収容するための第５の手段であり、前記第２の手段がフィルタを備え、前記フィルタが少なくとも２つの方向で流れを許容するようになっており、前記第２の手段が、前記第１の手段、前記第３の手段、前記第４の手段、及び、前記第５の手段のそれぞれと選択的に流体的に連通し、生体適合性の三次元スキャフォールドが第６の手段の少なくとも一部に併置される、第５の手段と、
    前記第５の手段と流体的に連通する残留播種細胞流体を収容するための第７の手段と、
    前記第７の手段と流体的に連通する前記残留播種細胞流体を除去するための第８の手段であり、前記第１の手段、前記第２の手段、前記第３の手段、前記第４の手段、前記第５の手段、前記第６の手段、前記第７の手段、及び、前記第８の手段のそれぞれが、流体の流れを促進させるための第９の手段によって接続される、第８の手段と
    を備える密閉システム。
27. 前記第１の手段、前記第３の手段、前記第４の手段、前記第５の手段、前記第７の手段、前記第８の手段、又は、これらの手段の組み合わせのうちの少なくとも１つが、柔軟な、あるいは硬質のプラスチック容器である、請求項２６に記載の密閉システム。
28. 前記第９の手段が、柔軟な、あるいは硬質の流体ラインと、媒体の選択的な流通を可能にする少なくとも１つのバルブとを備える、請求項２６に記載の密閉システム。
29. 前記第６の手段が有孔マンドレルである、請求項２６に記載の密閉システム。
30. 生体適合性の前記三次元スキャフォールドが生体分解性である、請求項２９に記載の密閉システム。
31. 生体適合性の前記三次元スキャフォールドがポリマー繊維のマトリクスを備える、請求項２８に記載の密閉システム。
32. 前記繊維が、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（又はポリカプロラクトン）、ポリアミド、ポリビニルポリマー又はコポリマー、多糖類、コラーゲン、及び、これらの組み合わせからなるグループから選択される少なくとも１つのポリマーを備える、請求項２９に記載の密閉システム。
33. 前記繊維がポリ−Ｉ−（乳酸）を備える、請求項３２に記載の密閉システム。

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