JP2013522649A - ヒト幹細胞様細胞及びメタボロミクスを使用した医薬のヒト発生毒性の予測 - Google Patents
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Abstract
Description
便宜上、本発明の方法はキットの形態で供することができる。このようなキットは、a)約 3000 ダルトン未満の分子量を有する精製代謝物の特定のセットを固形で含む第一の容器(既知の催奇性化合物の不存在下で培養されたhSLCsに対する、既知の催奇性化合物の存在下で培養されたhSLCsに付随する精製代謝物の特定のセットの違いは、既知の催奇性化合物の不存在下で培養されたhSLCsと比較して、既知の催奇性化合物の存在下で培養されたhSLCsの代謝応答における違いを示す); 及びb)精製代謝物の特定のサブセットの再懸濁に生理的に適した緩衝剤を含む第二の容器、の基本要素を含むパッケージ化された組み合わせである。
本明細書中で報告されるhSLCに基づくアッセイは、他の標準的なアプローチより複数の異なる利点を有する。すなわち、1)毒物に応答した代謝物への変化が、高感度且つ定量的測定であり、より客観的なデータに由来して判断が可能である。2)複数の生化学経路を同時に評価でき、種々の毒性機構を有する薬剤に適用される場合にモデルの頑健性を増強する。3) 代謝エンドポイントが、さらなる経路に基づく検討のための、急速にタンパク質、DNA、及びNA標的と結合され得る機能的生化学経路の尺度である。4) 予測が複数の独立変数に基づくので、代謝パターンの複雑な変化を示す催奇性物質を検出することが可能である。5)アッセイが細胞死成績から独立し、ヒト発生毒性を生じることが知られる循環用量に向けられ、それにより分裂細胞に単に毒性があるのではなく他の毒性も有する発生毒物を発見する可能性が増加する。6) 試験及び分析は、よりハイスループットであり、それほど重労働でなく自動化できる。
ヒト胎子に由来した細胞における発生毒性試験は、hSLCのヒト発生への生理的関連性を考慮すると、動物モデル、又は他のインビトロ(in vitro)の非ヒトアッセイ、例えばゼブラフィッシュモデル等、EST、及び全胚培養 (WEC)の使用を介して今日利用可能な試験より、より信頼性のあるインビトロ(in vitro)の予測エンドポイントを大いに生じ得る。
hES細胞培養
WiCell Research Institute (NIH National Stem Cell Bank, Madison, WI)から得たWA09 hESCsを、Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA)上の6ウェルプレートで、Thermo Electron Forma Series II Water Jacket CO2 Incubatorにおいて5% CO2下で37°CでインキュベートしたmTeSRl培地(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC)中で培養した。hESCsを、ルーチン培養条件のために3日又は4日ごとに、1 :3又は1:6 播種密度で継代した。投薬実験のために、7日間投薬プロトコール中に継代が必要ないようにhESCsを1 :10又は1 :12の低密度で継代した。hES細胞を継代するために、StemPro(登録商標)EZPassage (登録商標)の使い捨て幹細胞継代ツール(Invitrogen, Carlsbad, CA)を、ウェルから細胞を剥離するために使用した。剥離した細胞を、ピペットで除去し新たなMatrigelプレートに分配した。
hES細胞投与
確立された催奇性物質及び非催奇性物質(表2)のトレーニングセットを使用し、hESCsに投与した。トレーニングセットは、発生毒性を予測するための、例えばECVAM agencyによって提案されるEST等の、新規代替物を開発し確認することを目的とする多角的試行で以前に使用されている化合物を含む化学的スタンダードのコレクションである。
hES細胞生存アッセイ
メタボロミクスで分子のエンドポイントによる催奇性を測定することに加えて、相関関係が細胞死と化合物催奇性との間に存在するかを決定するために、薬剤のサブセットを使用して細胞生存率を検査した。特に、抗悪性腫瘍薬シトシンアラビノシド及び5-フルオロウラシルの投薬が多くの代謝物で最も顕著な変化を頻繁に生じたので、代謝エンドポイントが発生毒性よりも細胞死と強く相関し得るという問題に対処するために生存アッセイを行った。
発生毒性学スクリーニング試料調製
実施例1の各ウェルの2.5 mLの使用済み培地を、1.67 mLのアセトニトリルに添加し、40% アセトニトリル溶液を作成した。アセトニトリルは、使用済み培地試料を「クエンチする」ために機能し、多くの代謝工程を遅らせる又は停止させ、且つ細胞タンパク質の沈殿に役立つ。試料をその後の分析のため、又は直後の分析のために-80°Cで保存し、クエンチした溶液の250 μLを、250 μLの水と混合し、最終濃度を20% アセトニトリルとし、続いて3kDaの分子量のカットオフフィルタースピンカラムに添加した (Microcon YM-3 Centrifugal Filter, Millipore, Billerica, MA)。各試料を続いてIEC CL31R Multispeed Centrifuge (Thermo Scientific, Waltham, MA)中で、13,000 x g、4°Cで200分間遠心分離した。遠心分離の後、通過画分を保存し続いてSavant High Capacity Speedvac Plus Concentrator中で数時間乾燥させた。濃縮した試料を続いて0.1%のギ酸50μL中に溶解し、LC-MS分析に供した。
正確な質量MS及びMS/MSの能力があるG6520AA QTOF高分解能質量分析計から構成されるアジレントのQTOF LC/MS システムを使用して、質量分析を行った。広範囲の極性で低分子の分離を促進し、親水性種の保持の増大のために、親水性相互作用液体クロマトグラフィー(Alpert 1990)を利用した。水中の0.1% ギ酸(溶媒A)及びアセトニトリル中の0.1%ギ酸(溶媒B)を使用して、流速0.5 mL/分で表3に示す勾配で、各試料に30分間行った。体内の質量標準液を連続して二重ESIソース中に運ぶアジレントの均一溶媒ポンプをほぼ0.01 mL/分で使用して、二重ESIソースを使用してエレクトロスプレーイオン化を利用した。機器の質量範囲は、100-1700 Daに設定した。寸法3 x 100 mm 3 μmの粒径を有するPhenomenex Luna HILICカラムを使用し、30°Cに維持した。5 μLの各試料を注入した。高分解能の正確な質量条件を使用してAgilentのMassHunterでデータ取得を行った。
LC-MSの後、再現性に関してクロマトグラムを調べた。25%以上まで変化する総イオン数でのLC-MSの実行を、試料を正確に比較できることを保証するため繰り返した。これらの実行を、続いて異なるLC-MSの実行に渡って検出される分子に相当する質量特性を作成するために使用した。質量特性を、MassHunter Qualitative Analysis software (Agilent Technologies)を使用して、LC-MSデータから抽出した。次の判定基準を一般的ガイドラインとして使用したが、一部の柔軟性及び最適化が必要であった。電荷+1又は-1且つ1000以上の質量中心の高さを有する、75-1500の範囲内のm/z値を、「質量特性」を得るために使用した。これらの判定基準を通る質量ピークを、個々の分子に対応する同位元素及び付加物(Na+、K+、及びNH4+)パターンをあてはめ、各質量特性の存在量を確立するために使用した。その存在量は、単一分子の特徴に相当する同位体及び付加物ピークの合計として、MassHunterのソフトウェアで計算する。データ逆重畳積分、少なくとも2つのイオン(例えば、(M+H)+ 及び(M+H)++1又は(M+H)+ 及び(M+Na)+)を示す質量特性及び正イオンモードデータに関して50000以上及び負イオンモードデータにおいて10000以上の存在量値が、質量特性のビニング(binning)のために使用したデータセットに含まれる。
培地は質量スペクトルに対する多くのピークに寄与するため、実験系における主要因子を表す。これは、質量特性瓶に関して選択するためのデータ依存性態様において説明することができ、培地で顕著なレベルで存在する。(培地で検出されない)細胞の存在下で単独で存在する質量特性瓶又は無培養培地と異なる平均存在量レベルの質量特性瓶は、分泌、排出、消費、又は同定された代謝物とみなした。
特異的代謝物のアイデンティティの確認において、3つの判定基準を使用した: 1)代謝物の正確な質量は、化合物の既知の質量の10 ppm以内でなければならない。2)細胞培地で検出される代謝物の保持時間は、同一条件下でMSデータが得られた参照基準の+又は-3秒以内でなければならない。参照基準をmTeSR培地に溶解し、アセトニトリルの添加、Centriconの遠心ろ過、乾燥続いてLC-MS分析前のギ酸への溶解を含む、細胞由来の試料とまさに同一態様(上記)で調製した。3)細胞培地で検出された代謝物のMS-MS断片化スペクトルは、断片イオンの存在量及びm/z値を含む、参照基準と当然適合するに違いない。公表のMS-MSスペクトルが利用可能な場合、MS-MSスペクトルは当然適合するに違いない。
ランダムフォレストモデル
ランダムフォレストモデルに関する催奇性物質分類
以前に発表された発生毒性の動物及び細胞培養モデルにおける催奇性の分類は、大部分は動物モデルで観察された胎仔毒性成績及び発生異常に基づく、3つの異なるクラス、非催奇性物質、弱/中程度の催奇性物質、及び強い催奇性物質を使用して行われた(Marx-Stoelting et al. 2009, Chapin et al. 2008)。発生毒性において多くの種の特異的差異が存在するので、本試験においては化合物分類へのアプローチを修正し、化合物の催奇性分類を各化学薬品と関連して観察されたヒトリスクに積極的に着目する。
ランダムフォレスト (Brieman 2001)を、モデルに含まれる各特徴(変数)に関する、薬剤治療対その実験内対照の中央値変化率を使用して、催奇性及び非催奇性を予測するための分類モデルを作成するために使用した。既知の催奇性物質のトレーニングセットデータ由来の代替の1000個のブートストラップサブセットでの再サンプリングによって、試料の1/3でバギング(Bagging)を行った。盲検薬剤へのRF分類指標からの最終予測は、ツリーのアンサンブルの多数決に基づくものであった。
ランダムフォレストモデリングに利用されるデータセットは、高品質の再現性のある特性サブセットであった。薬剤治療実験(盲検及び既知の薬剤)の少なくとも75%に存在する値を有する場合、斯かる特性を選択した。この特性のリストを、続いて例えばHEPES及びPEG及び非生物学的利益特性を取り除くためのそれらの多数の付加物等の既知の混入分子のリストに対して選別した。最終的に、乏しいビニング又は分類特性を有する特徴を除去した。
ランダムフォレストモデルの結果
実施例5に記載するように、ランダムフォレストモデルを、両ESI極性から再現性よく測定される質量特性から成る選別データセットを使用して行った。各薬剤対その関連実験内対照に関する再現のための質量特性の中央値変化率値を、薬剤の催奇性を予測するための変数として使用した。
発生毒性の機構経路
要するに、hESCsのメタボロミクスは、細胞生理機能及びヒト発生において重要な役割を担う複数の小分子代謝物への統計上顕著な変化を検出した。これらの候補バイオマーカーの一部を、それらの化学的同一性を確認するためにMS-MS質量分析によってさらに確認した。分析の未着目の性質にもかかわらず、これらの顕著に確認された小分子代謝物の多くは、ヒト胎子に由来した細胞中でなくても、以前に発生毒性の根底にあると示唆された経路に顕著に関与する。確認された低分子及びそれらがマッピングする代謝ネットワークを、表8に供する。
発生毒性に関与する代謝ネットワーク
2つの実験システム: 生存率試験及びメタボロミクス試験を化学物質ごとに展開した。これらのアッセイを二段階で行った。メタボロミクス試験に関する用量hES細胞に対して3つの濃度を確立するために、細胞生存率アッセイを行った。まず、hES細胞をそれぞれ8つの濃度で投与し、続いて細胞生存率測定をMultiTox-Fluor 細胞ベースアッセイ (Promega)を使用して行った。各化学物質に関する濃度曲線を、メタボロミクス分析に関する3つの濃度を決定するために計算した。本試験で利用した最終濃度は、可能な場合、細胞死を生じなかった物及び最小の細胞死を生じた物であった。
メタボロミクス実験のための試料から低分子化合物 (<10 kDa)を分離するために、Multiscreen Ultracel-10分子量カットオフプレートを使用した。これらのプレートは、最初に0.1% 水酸化ナトリウム溶液で洗浄し、続いて2度水で洗浄し混入物ポリマー生成物を除去した。4°Cでおよそ240分間 2000xgで遠心分離した、洗浄したフィルターにクエンチした試料を添加し、通過画分を回収し、続いてオーバーナイトでSpeedVac中で乾燥させた。1:1の水中0.1% ギ酸:アセトニトリル中0.1% ギ酸の70uL 中で乾燥試料を再構成し、96ウェルプレートに移した。
アジレントのQTOF機器上でESIポジティブモード及びESIネガティブモードで試料を分析し、高解像度で操作し、ダイナミックレンジモードを拡張した。2つのPhenomenex Luna HILIC カラム; 100 x 3mm; P/N 00D-4449-Y0、S/N 440333-5、及びS/N 512570-3を、分析のために使用した。
試料命名スキーム
統計分析のために使用した試料名は、実験化合物名称(ST003G.74.A, ST003G.75.B, etc.)、用量レベル (High (H)、培地 (M)、又は 低(L))、及び頻度(a-h)でコードする。試料名 「ST003G.74.A_H_b」は、実験化合物74A、用量レベル「高」、頻度bとデコードでき、試料名「ST003G.84.K_L_b」は、実験化合物84K、用量レベル「低」頻度b等とデコードできる。
mzDataファイルの作成
アジレントのMassHunter Qual ソフトウェアバージョン3.0を使用して、アジレントの生データファイルをオープンソースのmzDataファイル型に転換した。転換工程中、deisotoping(脱同位体化)(+1電荷状態のみ)を質量中心データ及び絶対高度400(およそ典型的な平均機器バックグラウンドレベルの2倍)未満のピーク上で行った。生じるmzDataファイルは、数値400以上の絶対高度を有するデイソトープ(deisotoped)の(+1電荷状態のみ)ピークの質量中心データを含む。
オープンソースのソフトウェアライブラリーXCMSを使用して、ピーク選定及び特性作成を行った。質量特性(ピーク)を、centwaveのアルゴリズムを使用して検出した。ピーク選定後、LC-MS試料を並べる非線形クラスタリングアプローチに基づくobiwarpアルゴリズムを使用して、保持時間の偏差を補正した。密度に基づく分類工程アルゴリズムを使用して、質量特性瓶(bin)又はグループを作成した。データを質量特性にグループ化した後、反復性ピーク充填を使用して欠如した特徴を特性瓶の保持時間及び質量範囲に基づいて積分した。特性強度は、特性の抽出されたイオンクロマトグラムのMexican hatの積分値に基づく。
抽出ブランクフィルターは、試料抽出工程及びLC-MSシステムに存在するバックグラウンドイオンに関連したイオンを除去する。実験試料中の平均が抽出ブランク中の平均存在量の5倍未満である場合、特性をメタボロミクスデータセットから除去した。
混入DBフィルターは、例えば前の試験で同定された可塑剤及びPEG化合物等の多くの混入物を含むSteminaの専売データベースのエントリーのために、20ppm内の質量マッチで特性を除去する。特性が混入物又は混入物の通常の電荷特異的付加物に対応する場合、保持時間を考慮せずに特性を除去する。
試料異常値検出及び除去を、実験要因使用NEPALSベースPCAによって、ログベースの2変換paretoスケールの存在量値上で行う。距離測定は、距離測定の0.975分位外である異常値LC-MS試料に信号を出し、除去するために使用される。
統計分析前に、因子(例えば、用量の実験化合物)によって特性を選別し、少なくとも1つの実験化合物(例えば、ST003G.82.I)の少なくとも1つの用量レベル(L、M、H)に関して、LC-MS実行の66%で12,500(ESIネガティブモード)又は50,000(ESIポジティブモード)以上の存在量を示さなかった特性を除去した。このフィルターは、再現性よく測定されない検出レベルでの疑似低存在量の特性、再現性のある検出及び/又は積分の影響を受けやすいピーク形状を有さない可能性のある特性に対して選択する。斯かるフィルターは、典型的にメタボロミクスデータセットの大部分を除去し、分析を最も信頼性があり且つ有用な特性に焦点を合わせる。例えば、用量の組み合わせで、一方の実験化合物は1用量レベルでネガティブモードLC-MS試料の70%で12,500以上の存在量値であり、他方の実験化合物は12,500以上の存在量値がないという特性は、線量率による少なくとも1つの実験化合物はフィルター判定基準を満たすので、フィルターを通過する。
全データは、ログベースの2変換(two transform)を行った。カラム(試料)平均値を減算すること、及び各値に関する列(特性)標準偏差による分割(自動目盛り設定)によって各因子レベルに関する規準化を行った。
実験クラスの平均値間で違いが存在しないという帰無仮説、及び実験クラス間で違いが存在するという対立仮説下で、質量特性を評価した。実験クラスの等分散を仮定しないパラメトリック方法として、ウエルチの2つの試料T検定を行った。各実験化合物上で一元配置ANOVAを行い、3つの用量レベルに亘って平均値の違いを評価した。Tukeys post hoc検定を行い、用量レベル間の顕著な違いを同定した。統計分析の後、ANOVA及びウエルチT検定のp値補正のBenjamini-Hochberg (1995)方法を使用して、偽発見率を複数の試験に関して調節した。
質量特性のm/z質量値を、複数の公開のデータベース、例えばHMDB、KEGG、PubChem化合物、及びMETLIN及びcompany-specific代謝物データ等由来の記録を含むSteminaの体内代謝物データベースと比較することによって、質量特性のアノテーションを行った。各ESIモードの適した付加物に関して特性をアノテートした。全質量特性のアイデンティティは確認せず、よって全アノテーションが推定される。
質量特性のm/z質量値を、複数の公開データベース、例えばHMDB、KEGG、PubChem化合物、及びMETLIN及び企業特有の代謝物データ等由来の記録を含むSteminaの体内代謝物データベースと比較することによって、質量特性のアノテーションを行った。各ESIモードに適した付加物に関して特性をアノテートした。全質量特性のアイデンティティを確認せず、よって全アノテーションを推定する。
KEGG化合物アイデンティティを使用してヒト代謝ネットワークに対して、各実験化合物に関してアノテートした質量特性をマッピングすることによって、pathway enrichment分析を行った。各ネットワークへの統計有意差の定量的規準を割り当てるために、超幾何学的P値及び偽発見率(FDR)を使用した。各実験化合物に関するESIネガティブ及びポジティブモードに由来した特性を、斯かる分析のためにプールした。偽陽性結果は、同一質量由来の経路で複数の「hits」を生じる同重体化合物によって得ることができ、よって特有の化合物idsの代わりに特有の質量をこれらの算出に使用した。各経路に関する超幾何学的P値を計算するために使用した関連パラメータは、特有の質量「hits」数、ネットワークにおける特有の質量数、及びKEGGデータベースのヒトネットワークの全てにおける特有の質量の総数であった。各実験化合物に関して、由来のネットワークに関するP値を、Benjamini and Hochberg (1995) 補正を使用してFDRに転換した。
用量レベル平均値の違いを評価する一元配置分散分析を使用して化合物ごとの基礎に基づき、且つウエルチT検定及びPLS-DA VIPスコアを使用して用量ごとの基礎に基づき、特性選択を行った。特性が少なくとも50%変化率でウエルチFDR<.05又はPLS-DA VIPスコア> 20を有し、対照細胞が対照培地に少なくとも40%の違い(分泌、消費、又は同定)を示す場合、又はAnova FDR <.05及びO.lxとlOx用量との間の違いが少なくとも50%を示す場合、さらなる評価のために特性を選択した。薬剤又は用量レベルの比較に対する関心として特性を選択する場合、続いて倍率変化に広範囲の実験に関して評価した。特性選択後、元来哺乳類として推定的にアノテートされ且つKEGGネットワーク図に存在する顕著な特性のみさらに評価した。続いてpathway enrich分析を選択特性及び統計上顕著なenrichmentを示すネットワークにおける特性において行い、さらに倍率変化に関して評価した。これらの選択判定基準によって、当該分析を生化学経路に着目させた。
細胞培養の上清抽出物のメタボロミクス分析は、統計的有意性及び推定哺乳類アノテーションの選択後に、ESIポジティブモードで324個の特性のセットを、ESIネガティブモードでード307個の特性のセットを生じた。選択後、特性を抽出イオンクロマトグラム(EICs)の品質管理評価に通し、個々の質量特性の妥当性を確認した。品質管理を通過する特性をさらに評価し、推定倍率変化を確認した。質が悪い複製特性を除去した後、残るESIポジティブ及びESIネガティブモード特性を、処理によるpathway enrichmentの評価のための統一データセットに組み合わせた。これらの質量特性を、86個の異なるKEGGネットワークにマッピングし、そのれらの15個は、少なくとも1つの処理においてアノテートした特性の統計上顕著な(FDR <0.1)enrichmentを示した(表9)。最も顕著なenrichmentを示した4個のネットワークにおける全代謝物に関するEICsをプロットし、特性の質及び倍率変化を評価した。
試験化合物の催奇性の予測
実施例8で分析した個々の化合物の潜在的な催奇性を、さらに確認した。
部分最小二乗法判別分析(PLS-DA)モデルを使用して、医薬品が処理されたWA09 ヒト胚性幹(hES)細胞由来の使用済み細胞培養培地(セクレトーム)で観察される代謝変化に基づき、催奇性の予測を行った。既知の催奇性を有する22個の医薬品の治療循環用量が処理されたhES細胞のセクレトームのためのDevTox projectにおいて、PLS-DA分類指標モデルを以前に得られたデータに照準を合わせた(表11)。これらは、11個の既知の催奇性物質及び11個の既知の非催奇性物質を含んだ。電流モデルは、医薬品及び未知の化合物が処理されたhES細胞のセクレトームによくみられる15個の代謝物の平均変化率(処理対その関連の実験内対照)に基づく。DevTox薬剤に関する本モデルの結果は、表11に示す。EPA化合物の本試験に関して、実験は非医薬環境毒物の予測に適用される斯かるPLS-DAモデルの第一の例を表す。
開発した予測モデルは、EPAから提供される化学薬剤ST003G.74.A、ST003G.75.B、ST003G.77.D、ST003G.82.I、ST003G.85.Lを潜在的な催奇性物質として、化学薬剤ST003G.76.C、ST003G.78.E、ST003G.80.G、ST003G.81.H、ST003G.83.J、ST003G.84.Kを潜在的な非催奇性物質として分類する。化学薬剤ST003G.76.Cは、最高用量レベルでのみ催奇性物質として予測される(表12参照)。
経路解釈
アノテートされた質量特性の統計上顕著なenrichmentを有する複数の生化学経路を、さらに評価した。今回の発見で最も興味深いことは、ニコチン酸及びニコチンアミド代謝、パントテン酸及びCoA生合成、グルタチオン代謝、及びアルギニン及びプロリン代謝ネットワークである。これらの経路を検査し、これらの経路と先天異常との関係性を解明した。黒丸でマークした経路内の代謝物は特有の質量を有し、一方灰色丸でマークしたものは同重体であり、同一分子量の他の代謝物とすることができる。
ニコチン酸及びニコチンアミドは、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)の前駆体であり、減少される場合、多くの酸化還元反応で重要な補助因子である。ニコチン酸が欠乏する場合、ペラグラが生じ得る。ニコチンアミドN-メチル転移酵素(NNMT)の変異は二分脊椎のリスクに繋がる可能性が有り得るということが分かり(Lu et al, Mol. Teratology, 52:670-675, 2008)、斯かる経路への変化が先天異常に繋がる可能性が有り、よって、斯かる経路の代謝物の変化率の測定は化合物の催奇性を指示することが可能である。
パントテン酸及びCoA生合成ネットワーク由来の顕著な数の推定代謝物アノテーションは、多数の化合物に亘って統計上顕著な変化を示した。パントテン酸及びCoA生合成ネットワークに関するネットワーク図は、推定アノテーションを示し、黒丸、又は灰色丸でマークされる(灰色丸で強調される代謝物は同重体であり、一方黒丸は特有の質量を有する)。
グルタチオンネットワークは、酸化ストレスで役割を果たす。斯かるネットワークの必須代謝物であるグルタチオンは、低減状態又は酸化状態で存在し得る。その低減状態において、グルタチオンはフリーラジカルをプロトン化する能力を有し、よって、抗酸化剤として機能する。酸化ストレスは、神経変性疾患(Simonian et al, Ann Rev Pharm. Tox., 5(5:83-106, 1996)、肺疾患 (Repine et al, Am. J. Resp. Critical Care Med, 75(5:341-357, 1997)と関連し、子癇前症と関連する(Walsh et al, Semin. Reprod. Med., i (5:93-104, 1998)。グルタチオンレベルを先天異常に関連付けるいくつかの試験が存在する。例えば、Isibashi等は、グルタチオン欠乏及び酸化ストレスが動物で先天異常に強く関係することを発見した(Isibashi et al, Free Rad. Biol. Med., 22:447-454, 1997)。Zhao等もまた、ヒトでのこのような関係、及び神経管欠損妊娠の女性は酸化グルタチオンが対照群より高レベルであるということを発見した(Zhao et al, Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology, 76:230-236, 2006)。このグルタチオンネットワークと先天異常との関連性に起因して、さらに斯かるネットワーク内の代謝物に関する倍率変化を試験し、各化合物を潜在的な催奇性物質又は非催奇性物質として分類することが可能である。
アルギニン及びプロリン代謝ネットワーク内で複数の統計上顕著に変更された低分子が確認された。最も興味深いことは、ジメチルアルギニン、アルギニン、及びシトルリンの存在である。一酸化窒素合成酵素は、L-アルギニンをL-シトルリンに転換する。ジメチルアルギニンは、一酸化窒素合成酵素の阻害剤である。試験は、一酸化窒素合成酵素が神経管閉鎖に必須であり(Nachmany et al, J Neurochem., 96:247-253, 2006)、よってこの反応及びL-シトルリン及びL-アルギニンのレベルへの変更は先天異常を誘発する化合物の能力を示しうることを確認した。
Claims (35)
- 試験化合物の催奇性の予測方法であって、
(a)(i)第一の既知の催奇性化合物の存在下; 及び
(ii)第一の既知の催奇性化合物の不存在下で、
hSLCsを培養する工程、
(b)第一の既知の催奇性化合物に曝露されていないhSLCsと比較して、第一の既知の催奇性化合物に曝露されたhSLCsに関連する約 3000 ダルトン未満の分子量を有する複数の代謝物を検出し、第一の既知の催奇性化合物に曝露されていないhSLCsと比較した、第一の既知の催奇性化合物に曝露されたhSLCsの代謝応答における違いを同定する工程;
(c)代謝応答における違いを分析し、第一の催奇性化合物へのhSLCsの曝露に関連する質量特性のセットを生じる工程;
(d)毎回異なる既知の催奇性化合物で、工程a)〜c)を複数回繰り返す工程;
(e)催奇性化合物への各曝露から生じる質量特性を分類し、質量特性の第一の参照プロファイルを得る工程;
(f)試験化合物へのhSLCsの曝露で生じる質量特性のプロファイルを、第一の参照プロファイルと比較し、試験化合物の催奇性を予測する工程;
(g)試験化合物が催奇性物質であると予測される場合に、質量特性のプロファイルを第一の参照プロファイルへ追加し、第二の参照プロファイルを得る工程であって、第二の参照プロファイルの予測正確性が第一の参照プロファイルの予測正確性より高い工程; 及び
(h)工程f)とg)とを、毎回異なる試験化合物で複数回繰り返し、最終参照プロファイルを得る工程、
を含む、予測方法。 - 工程a)中に既知の非催奇性化合物の存在下で、hSLCsがさらに培養される、請求項1に記載の方法。
- 最終参照プロファイルが、少なくとも約80%の正確性で試験化合物の催奇性を予測する、請求項1に記載の方法。
- 最終参照プロファイルが、少なくとも約90%の正確性で試験化合物の催奇性を予測する、請求項1に記載の方法。
- hSLCsが、ヒト胚性幹細胞(hESCs)、ヒト人工多能性 (iPS)細胞、又はヒト胚様体を含む、請求項1に記載の方法。
- 1又は2以上の測定される代謝物が、hSLCsから分泌される代謝物である、請求項1に記載の方法。
- 1又は2以上の測定される代謝物が、hSLCsから排出される代謝物である、請求項1に記載の方法。
- 1又は2以上の測定される代謝物が、hSLCsによって同定される代謝物である、請求項1に記載の方法。
- 同定された代謝物に関する代謝応答の違いが、hSLCsを介した代謝物のフラックスを測定することによって決定される、請求項1に記載の方法。
- hSLCsの代謝応答が、試験化合物の不存在下より試験化合物の存在下で高い、請求項1に記載の方法。
- hSLCsの代謝応答が、試験化合物の不存在下より試験化合物の存在下で低い、請求項1に記載の方法。
- 代謝物が、物理的分離方法を使用して同定される、請求項1に記載の方法。
- 物理的分離方法が質量分析である、請求項12に記載の方法。
- 同定された代謝物のサブセットが、バイオマーカープロファイルを含む、請求項1に記載の方法。
- 同定された代謝物のサブセットが、毒性又は催奇性化合物へのhSLCの応答のバイオマーカープロファイル特性を含む、請求項14に記載の方法。
- 最終参照プロファイルが、少なくとも約95%の感度で試験化合物の催奇性を予測する、請求項1に記載の方法。
- 最終参照プロファイルが、少なくとも約85%の特異度で試験化合物の催奇性を予測する、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化質量分析である、請求項14に記載の方法。
- 試験化合物を催奇性物質として分類するための方法であって、
(a)(i)試験化合物の存在下; 及び
(ii)試験化合物の不存在下で、
hSLCsを培養する工程、
(b)hSLCsに関連する約3000ダルトン未満の分子量を有する複数の代謝物を測定することによって、試験化合物の不存在下で培養されたhSLCsと比較した、試験化合物の存在下のhSLCsの代謝応答における違いを同定する工程であって、試験化合物の不存在下で培養されたhSLCsに対する、試験化合物の存在下で培養されたhSLCsに関連する複数の代謝物における違いが、代謝応答における違いを示す工程、及び
(c)第一の代謝物を含むhSLCsの代謝応答を、第二の代謝物を含むhSLCsの代謝応答に対して測定する工程であって、
(i) 第一の代謝物が第二の代謝物の前駆体である; 又は
(ii) 第一の代謝物がアミノ酸であり、第二の代謝物がアミノ酸の代謝阻害剤であるとともに、
第二の代謝物を含むhSLCsの代謝応答に対する第一の代謝物を含むhSLCsの代謝応答における違いが、試験化合物が催奇性物質であることを示す工程、
を含む、方法。 - hSLCsが、既知の非催奇性化合物の存在下で工程(a)中にさらに培養される、請求項19に記載の方法。
- 第一及び第二の代謝物が、hSLCsによって分泌される、請求項19に記載の方法。
- 第一及び第二の代謝物が、hSLCsによって排出される、請求項19に記載の方法。
- 第一及び第二の代謝物が、hSLCsによって消費される、請求項19に記載の方法。
- 消費された第一の代謝物と消費された第二の代謝物に関する代謝応答における違いが、hSLCsを介した第一及び第二の代謝物のフラックスを測定することによって決定される、請求項19に記載の方法。
- 試験化合物を催奇性物質又は非催奇性物質として分類するための方法であって、
(a)(i)試験化合物の存在下; 及び
(ii)試験化合物の不存在下で、
hSLCsを培養する工程、
(b)試験化合物の不存在下で培養されたhSLCsと比較して、試験化合物の存在下で培養されたhSLCsに関連するアルギニンの変化率を測定する工程;
(c)試験化合物の不存在下で培養されたhSLCsと比較して、試験化合物の存在下で培養されたhSLCsに関連する非対称性ジメチルアルギニン(ADMA)の変化率を測定する工程;
(d)ADMAにおける変化率に対するアルギニンの変化率の比を測定する工程であって、
(i)少なくとも約0.9未満又は少なくとも約1.1以上の比が、試験化合物の催奇性を示し、
(ii)少なくとも約0.9以上且つ少なくとも約1.1未満の比が、試験化合物の非催奇性を示す工程、
を含む、方法。 - 工程(a)中に既知の非催奇性化合物の存在下で、hSLCsがさらに培養される、請求項25に記載の方法。
- 催奇性物質として試験化合物を確認するための方法であって、
(a)約3000ダルトン未満の分子量を有する代謝物のセットを固形で供する工程であって、催奇性化合物の不存在下で培養されたhSLCsと比較して、1又は2以上の既知の催奇性化合物の存在下で培養されたhSLCsによって、当該代謝物が異なって代謝される工程;
(b)所定の量の生理的に適した緩衝剤に代謝物のセットを再懸濁する工程であって、緩衝剤中の各代謝物の最終濃度が、1又は2以上の既知の催奇性化合物の存在下で培養されたhSLCsに関連する代謝物の濃度と同一である工程;
(c)当該代謝物の参照プロファイルを得る工程; 及び
(d)試験化合物へのhSLCsの曝露で得られた質量特性のプロファイルを代謝物の参照プロファイルと比較し、試験化合物の催奇性を確認する工程、
を含む、方法。 - 催奇性化合物の代謝効果を同定する方法であって、
(a)(i)催奇性化合物の存在下; 及び
(ii)催奇性化合物の不存在下で;
hSLCsを培養する工程、
(b)催奇性化合物に曝露されていないhSLCsと比較して、催奇性化合物に曝露されたhSLCsに関連する約3000ダルトン未満の分子量を有する複数の代謝物を検出し、催奇性化合物に曝露されていないhSLCsと比較した、催奇性化合物に曝露されたhSLCsの代謝応答における違いを同定する工程;
(c)複数の代謝物を1又は2以上の代謝ネットワークへマッピングする工程; 及び
(d)複数の代謝物が、1又は2以上の代謝ネットワークの既知の崩壊により影響を受けた代謝物と同一である場合に、催奇性化合物の代謝効果を同定する工程、
を含む、方法。 - 工程(a)中に既知の非催奇性化合物の存在下で、hSLCsがさらに培養される、請求項28に記載の方法。
- 1又は2以上の代謝ネットワークが、アラニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸代謝ネットワーク、アルギニン及びプロリン代謝ネットワーク、アスコルビン酸及びアルダル酸代謝ネットワーク、クエン酸回路、システイン及びメチオニン代謝ネットワーク、ガラクトース代謝ネットワーク、グルタチオン代謝ネットワーク、グリオキシル酸及びジカルボン酸代謝ネットワーク、ニコチン酸及びニコチンアミド代謝ネットワーク、パントテン酸及び補酵素A生合成経路、ペントース及びグルクロン酸相互変換経路、ペントースリン酸経路、プロピオン酸代謝ネットワーク、ピルビン酸代謝ネットワーク、及びビタミンB6代謝ネットワークから成る群から選択される、請求項28に記載の方法。
- 同定された代謝物のサブセットが、ピルビン酸、L-バリン、ジメチルリンゴ酸、パントイン酸、パントテン酸、ホスホパントテノイル(phospho-patothenoyl)-L-システイン、5,6-ジヒドロウラシル、N-カルバモイル-βアラニン、及び補酵素Aから成る群から選択され、代謝ネットワークがパントテン酸及び補酵素A生合成経路である、請求項28に記載の方法。
- 複数の代謝物が、5-オキソプロリン、L-グルタミン酸、グリシン、L-γ-グルタミルシステイン、グリシン、デヒドロアスコルビン酸、グルタチオニルスペルミン、及びL-オルニチンから成る群から選択され、代謝ネットワークがグルタチオン代謝ネットワークである、請求項28に記載の方法。
- 複数の代謝物が、ピルビン酸、ジメチルアルギニン、L-アルギニン、L-シトルリン、グルタミン、アスパラギン酸、L-アルギニノコハク酸(argosuccinate)、グアニジノ酢酸リン酸、フマル酸、サルコシン、2-オキソアルギニン、ピルビン酸、5-アミノ-ペンタン酸、リナチン、ピロール-2-カルボン酸塩、プトレシン、6-オキソ-l,4,5,6-テトラヒドロニコチン酸、2,6-ジヒドロキシニコチン酸(dihydroxynictinate)、フマル酸、及びGABAから成る群から選択され、代謝ネットワークがアルギニン及びプロリン代謝ネットワークである、請求項28に記載の方法。
- 複数の代謝物が、6-オキソ-l,4,5,6-テトラヒドロニコチン酸、2,6-ジヒドロキシニコチン酸、及びフマル酸から成る群から選択され、代謝ネットワークがニコチン酸及びニコチンアミド代謝ネットワークである、請求項28に記載の方法。
- 複数の代謝物が、シスチン、Nl-アセチルスペルミジン、非対称性ジメチルアルギニン、シスタチオニン、2'-デオキシウリジン、GABA、リンゴ酸、コハク酸、及びアスパラギン酸から成る群から選択される5個又は6個以上の代謝物である、請求項1に記載の方法。
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