JP2013515494A - 核酸溶出の改良 - Google Patents
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Abstract
本発明は、遺伝子材料、特に固体マトリックスに適用する前に精製しておいたＤＮＡの固体マトリックスでの保存に関する。より具体的に、本発明は、植物多糖類イヌリンを含む溶液で処理した、精製ＤＮＡの保存用固体マトリックスに関する。本発明の利点の１つは、より多量のＤＮＡを本発明の固体マトリックスに保存できることである。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
Description
本発明は、固体マトリックス上での遺伝子材料の保存、特に固体マトリックスに適用する前に精製しておいたＤＮＡの保存に関する。
核酸、特にＤＮＡの保存は典型的には溶液中で冷蔵を用いて４℃で数日間又は−２０以下の温度でさらに長期間達成される。これはコストがかかり、静的保存のための大きなスペースを要する。核酸試料を輸送する必要がある場合は大きな問題となり、試料はドライアイス中で出荷されることが多い。
Ｂｕｒｇｏｙｎｅの国際公開第９０／０３９５９号には、生体試料（通常は血液）を固体マトリックスに適用し、固体マトリックスに結合した試薬で細胞を溶解させる方法について記載されている。放出されたＤＮＡは固体マトリックスに保持される。これらの試料は室温で長期間保存することができた。
米国特許第５９３９２５９号及び国際公開第０３／０１６５５２号には、固体マトリックスに結合したＤＮＡをさらに研究するため溶出することができる技術が記載されている。しかし、多くの場合、固体マトリックスに適用した精製ＤＮＡの回収で得られるＤＮＡの回収率は定量的リアルタイムＰＣＲで測定して約４０％である。ＤＮＡを室温で長期間保存することのできる簡単な方法で、しかも適用したＤＮＡの回収率が大きい方法に対するニーズが存在していることは明らかである。
今回、固体マトリックスにイヌリン（植物に存在する多糖類）を添加すると、固体マトリックスから溶出することのできる適用ＤＮＡの割合が大幅に増大するという予想外の知見が得られた。これは、精製ＤＮＡを固体マトリックスに適用したときに特に顕著である。
様々な化学物質を固体マトリックスに添加して、固体マトリックスからのＤＮＡの回収率に対するそれらの効果について研究した。特に、ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ（Ｗｈａｔｍａｎ社製）として知られる固体マトリックスが、本発明の実施に特に有用であることが判明した。ただし、その他の種類の固体マトリックスも本発明で使用できると考えられる。固体マトリックスの多くはセルロース系である。固体マトリックスを、２Ｍグアニジンイソチオシアネートに希釈した試薬溶液で処理した。大半の化学物質は、ＤＮＡの回収率に対してほとんど或いは全く効果がなかった。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は濃度約１０％で、ＤＮＡの回収量が少し増大した。ＰＥＧはエチレングリコール単位の長鎖ポリマーである。ＰＥＧは様々な分子量で調製され、分子量は１分子当たりの平均単位数で決まる。ＭＷ４００、１０００及び３３５０のポリマーについて評価した。ＰＥＧ１０００で、適用ＤＮＡの回収結果（データ示さず）が最良となることが認められ、残りの試験ではＰＥＧ１０００を使用した（以下、ＰＥＧと呼ぶ。）。約２５％のＰＥＧ濃度では結果が実験毎に変動したが、これは、かかる濃度での固体マトリックスのコーティングプロセスに若干のばらつきがあることを示唆している。
固体マトリックスを植物多糖類イヌリンで処理すると、固体マトリックスから溶出されるＤＮＡ量が増大することが認められた。固体マトリックスに濃度２０％以下のイヌリンを添加すると、固体マトリックスからのＤＮＡの回収率が、イヌリンを添加しないときの２５〜４０％から８０％に増大することが判明した。イヌリンの添加と併せて１０％のＰＥＧを添加すると、ＤＮＡの回収率が約８５％まで増大することが認められた。
イヌリンは多くの植物にみられる天然多糖類である。その構造を図１に示す。エステル化のような簡単な修飾が可能であり、適用した精製ＤＮＡの向上した溶出が依然として達成されると考えられる。
精製ＤＮＡは、イヌリンで処理しておいた固体マトリックスに、核酸化学で常用される緩衝液中で適用することができる。適用緩衝液に１０％以下のＰＥＧを配合してもよい。固体マトリックスに適用する前のＤＮＡは、様々な標準実験技術で精製することができる。
考慮すべき重要な点は、高いＤＮＡ回収率が時間を経ても（つまり室温での長期保存で）維持されることである。少なくとも２３日間はＤＮＡを向上した収率で回収できることが判明した。この収率の向上は保存期間をさらに長くした場合にも見込まれる。室温は通常約２０℃〜２５℃であり、典型値は２０℃である。
以下の実施例は例示にすぎず、特許請求の範囲によって定まる本発明を限定するものではない。
実施例１：マトリックスの化学修飾
固体マトリックスはＷｈａｔｍａｎ社製のＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ ９０３マトリックスであった。
１）グアニジンチオシアネートの４Ｍ原液を調製し、様々な濃度の試薬を用いて２Ｍに希釈した。
２）グアニジンチオシアネート／試薬混合物を入れたトレーに９０３マトリックス（２．２５インチ×２．２５インチ）を入れ、１０秒間穏やかに振盪した。
３）２つのヘアドライヤー（Ｓｉｍｐｌｙ Ｂａｓｉｃ ＤＳ−７２７）を用いて、金属製ラック上でマトリックスを１０分間乾燥させた（２つのヘアドライヤーとマトリックスが一直線に並ぶように、一方をマトリックスの１５ｃｍ上に３０°の角度で置き、他方をマトリックスの２５ｃｍ下に３０°の角度で置いた）。さらに、気流なしで２１±２℃で一晩乾燥させた。
４）使用時までマトリックスをデシケーター内で室温で保存した。
固体マトリックスはＷｈａｔｍａｎ社製のＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ ９０３マトリックスであった。
１）グアニジンチオシアネートの４Ｍ原液を調製し、様々な濃度の試薬を用いて２Ｍに希釈した。
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４）使用時までマトリックスをデシケーター内で室温で保存した。
実施例２：試験固体マトリックスへのＤＮＡの適用
ヒトＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）を１６０ｎｇ／μｌの濃度で試験固体マトリックスにスポットした。通常、予めくり抜いておいた直径５ｍｍディスクのマトリックスを使用した。ディスクは室温で最低３時間乾燥させた。
ヒトＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）を１６０ｎｇ／μｌの濃度で試験固体マトリックスにスポットした。通常、予めくり抜いておいた直径５ｍｍディスクのマトリックスを使用した。ディスクは室温で最低３時間乾燥させた。
実施例３：固体マトリックスからのＤＮＡの溶出
１）各乾燥ディスクを１．５ｍｌ滅菌マイクロチューブに入れ、５００μｌのｄＨ２Ｏで計５秒間の３回のパルスボルテックスによって洗浄した。
２）ディスクを、１００μｌのｄＨ２Ｏが入った０．５ｍｌのマイクロチューブに移し、ディスクが完全に水に浸るようにした。
３）マイクロチューブを９８℃のヒートブロックに３０分間置いた。
４）マイクロチューブを６０秒間パルスボルテックスし、短く遠心した。
５）ディスクを残して、溶出液を新たな０．５ｍｌチューブに移した。溶出液は定量までの間４℃で保存した。
１）各乾燥ディスクを１．５ｍｌ滅菌マイクロチューブに入れ、５００μｌのｄＨ２Ｏで計５秒間の３回のパルスボルテックスによって洗浄した。
２）ディスクを、１００μｌのｄＨ２Ｏが入った０．５ｍｌのマイクロチューブに移し、ディスクが完全に水に浸るようにした。
３）マイクロチューブを９８℃のヒートブロックに３０分間置いた。
４）マイクロチューブを６０秒間パルスボルテックスし、短く遠心した。
５）ディスクを残して、溶出液を新たな０．５ｍｌチューブに移した。溶出液は定量までの間４℃で保存した。
実施例４：溶出液中のＤＮＡの定量
７９００ＨＴ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＱＰＣＲによって、溶出液中のＤＮＡの定量を行った。反応は、ＲＮａｓｅ Ｐアッセイ及びＴＡＱＭＡＮ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設定した。実験に用いたものと同じＲｏｃｈｅ社製ＤＮＡの１０〜０．０１ｎｇ／μｌの逐次希釈液を用いて４点標準曲線を作製した。初期ＱＰＣＲ定量は９６ウェルプレートで行い、手動で設定した。液体ハンドリングロボットの導入及び検証後、３８４ウェルプレートを用してその後の定量を行った。９６及び３８４ウェルプレートの両方を検証し、互いに対比して方法間の整合性をチェックした。
７９００ＨＴ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＱＰＣＲによって、溶出液中のＤＮＡの定量を行った。反応は、ＲＮａｓｅ Ｐアッセイ及びＴＡＱＭＡＮ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設定した。実験に用いたものと同じＲｏｃｈｅ社製ＤＮＡの１０〜０．０１ｎｇ／μｌの逐次希釈液を用いて４点標準曲線を作製した。初期ＱＰＣＲ定量は９６ウェルプレートで行い、手動で設定した。液体ハンドリングロボットの導入及び検証後、３８４ウェルプレートを用してその後の定量を行った。９６及び３８４ウェルプレートの両方を検証し、互いに対比して方法間の整合性をチェックした。
結果
結果（表１）は、イヌリン又はＰＥＧを含浸したマトリックスは、ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅだけの場合と比較して、ＤＮＡ回収率が増大していることを示す。さらに、１０％のＰＥＧを含有するスポット用緩衝液を使用すると、ＤＮＡ収率がさらに増大した（ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ＋２０％イヌリンと併用すると８５％）。
結果（表１）は、イヌリン又はＰＥＧを含浸したマトリックスは、ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅだけの場合と比較して、ＤＮＡ回収率が増大していることを示す。さらに、１０％のＰＥＧを含有するスポット用緩衝液を使用すると、ＤＮＡ収率がさらに増大した（ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ＋２０％イヌリンと併用すると８５％）。
精製ＤＮＡを適用したディスクを室温のデシケーター内で保存した実験からも結果を得た。結果は、マトリックスをイヌリンで処理すると、同様の向上したＤＮＡの回収率で、ディスクをＤＮＡ溶出まで２３日間以上保存できることを示していた。
結果は、試験マトリックスへのＤＮＡの適量量及び回収量を１ｎｇ程度の低さから１μｇ（試験した最大値）程度の高さまでとすることができ、イヌリン処理の改善効果が依然として観察されることも示していた。
いずれかの実施形態に関して記載した特徴を単独で用いてもよいし、或いは他の特徴と組合せて用いてもよく、その他の実施形態の又は他の実施形態の組合せの１以上の特徴と組合せて使用してもよいことが明らかであろう。さらに、特許請求の範囲に記載された本発明の技術的範囲から逸脱せずに、明細書に記載されていない均等物及び変更も採用することができる。
Claims (6)
- 精製ＤＮＡの保存に適した固体マトリックスであって、当該マトリックスがイヌリンを含む溶液で処理されている、固体マトリックス。
- ＰＥＧでも処理されている、請求項１記載の固体マトリックス。
- イヌリン処理が２０％以下の濃度である、請求項１又は請求項２記載の固体マトリックス。
- １０％以下のＰＥＧも含む、請求項１乃至請求項３記載の固体マトリックス。
- 核酸の添加前にイヌリンを含む溶液で固体マトリックスを処理することによって、固体マトリックスから溶出される精製ＤＮＡの収率を増大させる方法。
- 固体マトリックスがＰＥＧでも処理されているか、或いはＰＥＧを含む緩衝液中でＤＮＡを適用する、請求項５記載の方法。
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