CN108026573A - 用于分析物检测的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于分析物检测的方法和试剂盒。更准确地说，本发明涉及检测分析物的方法，其包括在环境温度下，在固体载体上存储短单链核酸(10‑100 nt)，例如适配体和微RNA；并且随后扩增用于检测一种或多种分析物的所述核酸。

Description

用于分析物检测的方法和试剂盒
发明领域
本发明涉及用于分析物检测的方法和试剂盒。更准确地说，本发明涉及检测分析物的方法，其包括在环境温度下，在固体载体上存储短单链核酸(10-100 nt)，例如适配体和微RNA；并且随后扩增用于检测分析物的所述核酸。
发明背景
生物样品存储和保存是合乎需要的，因为保存的样品可用于各种应用，例如分析物检测、传感、法医和诊断应用，基因组测序，全基因组扩增等。
目前使用的在纸基材上保存样品的一些装置是可以获得的。多孔或无孔的基材通常用于保存生物样品，例如纸卡片或膜。纸卡片或膜的实例包括用于保存核酸样品的化学处理的FTA®和FTA®Elute纸(GE Healthcare)，和用于保存血液样品的FTA®DMPK卡片和903®卡片(GE Healthcare)。基材采用吸收和干燥布置在基材上的湿润生物样品，例如血液、口腔内药签或浸渍的组织的方法。
滚环扩增(RCA)是由DNA聚合酶介导的等温DNA扩增过程，其中ssDNA经由圆形模板合成。它被用于超敏DNA检测分析中的信号扩大。RCA已经适应了扩增编码DNA适配体和DNA/RNAzymes的序列。[滚环扩增：在纳米技术和具有功能性核酸的生物检测中的应用(Rollingcircle amplification: Applications in Nanotechnology and Bio-detection withfunctional nucleic acids). Zhao W等人，2008. Angew Chem Int Ed 47, 6330-6337]。
适配体是能够结合一系列不同的化学和生物化学部分如蛋白、小分子量化合物、代谢物、化学化合物等的单链核酸(ssDNA或ssRNA)分子。这种结合事件是适配体和分析物特异性的且可被加工为高度特异性的，具有高亲和力。因此适配体与单克隆抗体分享许多可比较的特性且现在被认为是其中习惯使用抗体的许多过程中的可行的备选物。
适配体可被设计以结合相同目标分子上的不同的表位，促进可与基于免疫学的ELISA比较的检测系统的产生。将荧光团结合到扩增的适配体中或通过生成适配体基DNAzymes (转化报告体染料的催化酶)和核糖酶来生成检测系统。结合不同的分析物和非重叠检测试剂的适配体的使用将支持被设计以检测在相同反应容器中的不同试剂的多路分析。
指数富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment) (SELEX)是在分子生物学中生产单链DNA或RNA的寡核苷酸的组合化学技术，所述寡核苷酸特异性地结合到一个或多个目标配体。该过程用非常大的寡核苷酸库的合成开始，所述寡核苷酸库由通过用作引物的恒定5'和3'末端侧接的随机生成的固定长度的序列组成。对于随机生成的长度n的区域，在所述库中的可能的序列的数目是4n(在每个位置具有4种可能性(A、T、C、G)的n个位置)。在所述库中的序列被暴露于目标配体(其可以是蛋白或小的有机化合物)和不结合靶标的那些通常通过亲和色谱除去。洗脱结合的序列并通过核酸扩增富集以准备后续的选择循环，其中洗脱条件的严格性增加以鉴定最紧密结合的序列。
然而，使用短的核酸如特异性适配体和适配体库存在稳定性的问题，且迫切希望有一个解决方案，即在SELEX富集、选择和检测过程之前和期间使得适配体在环境温度下长期稳定。
发明概述
本发明通过提供作为长期环境温度存储介质的固体载体用于编码ssDNA和ssRNA适配体的长度在10-100个核苷酸(nt)之间的短的核酸序列的用途来解决适配体的稳定性问题。
载体可以是基质、纸、纤维网、膜或泡沫。载体可包含纤维，例如纤维素或玻璃纤维，和任选的其它组分，例如颗粒填料、湿强度添加剂或干强度添加剂或助留剂。载体优选是固体纸载体，例如FTA®或RSM (RNA稳定基质；Tao等人2014；用于从全血收集和环境温度存储RNA的固体基质的评价(Evaluation of a solid matrix for collection andambient temperature storage of RNA from whole blood). BMC Clinical Pathology,14, 22；pp 1-9)。
在第一方面，本发明提供一种检测一种或多种分析物的方法，其包括在固体载体上存储低分子量单链核酸(10-100 nt)，例如适配体和微RNA；并扩增所述核酸。通过将包含核酸的溶液沉积在固体载体上并干燥载体上的溶液，使所述核酸存储在固体载体上。
本发明人已发现低分子量单链核酸，例如10-100 nt可在环境温度下，在存储和随后的扩增反应之间，在固体载体上长时间稳定。低分子量核酸优选地是特异性ssDNA或ssRNA适配体或适配体库，且该方法包括在分析物检测之前，使一种或多种分析物与所述扩增的适配体结合用于分析物检测或适配体选择的步骤。
固体载体包括：纤维素基纸、编织或非编织纤维材料，包括人造，或天然存在的聚合物纤维、基于矿物纤维的材料例如玻璃纤维材料，或表面处理的固体材料，例如化学或机械处理的材料，包括激光蚀刻的表面，全部提供有主要保持DNA RNA和蛋白分子的足够粗糙度的表面粗糙度，或凝胶，例如藻酸盐，全部任选用稳定剂或试剂混合物化学处理。优选的载体是基于纤维素的聚合物、纤维和化学涂布的纸例如RSM、FTATM、FTA elute TM未涂布的纸例如903TM 31-ETF纤维素纸。试剂或试剂混合物包含：弱碱、抗氧化剂和螯合剂，和任选的阴离子表面活性剂，或包含：离液序列高的物质例如离液序列高的盐。实例是SDS、EDTA、抗氧化剂(尿酸TCEP (磷酸三(2-羧基乙基)酯)、THQ (甲基氢醌(toluhydroquinone))、胍HCl、硫氰酸胍。
在该方法的一个实施方案中，固体载体，或其部分，例如提供有存储的适配体的穿孔(punch)被切除并放入已经提供有或将提供有扩增试剂的反应孔或管中。任选地，所述切下的固体载体可被洗涤且任选地，所述适配体从固体载体提取并作为溶液加入到随后的扩增步骤中。
在其它实施方案中，所述具有存储的适配体的部分或穿孔被放在反应板的反应孔中并且所述孔提供有扩增试剂，且其中存储的适配体在反应孔中扩增。任选地，切下的固体载体被洗涤。
反应板的所有孔优选地提供有冻干形式的扩增试剂，如由GE Healthcare例举的可随时待用的形式(RTG)且所有的孔可提供有穿孔，而穿孔可提供有相同或不同的适配体。
在其它实施方案中，反应板的孔用初次适配体涂布且自穿孔扩增的适配体在分析物的检测反应中用作二次适配体。在该反应中，初次适配体针对第一表位或分析物上的结合位点，而二次适配体针对分析物上的第二表位。在该实施方案中，特异性适配体被共价连接到反应容器例如96-孔板的特定区域。这些初次适配体使用传统束缚剂，例如N-丙酸琥珀酰亚胺酯束缚到固体载体上。施加生物样品，接着加入具有稳定的适配体的穿孔(如上所述生成)到包含用于扩增二次适配体的扩增试剂的反应容器中。这些被束缚且可溶的适配体被设计以结合相同目标分子的不同表位，从而有利于基于类似于ELISA型反应的适配体的固体载体系统。合适的核酸扩增试剂和检测系统优选地结合到RTG (随时可用的形式。
用于本发明的扩增方法优选地为RCA，滚环扩增。这是优选的扩增反应，尽管其它扩增反应也可使用，例如PCR。PCR、等温扩增，例如解旋酶依赖性扩增、RNA扩增；NASBA (核酸序列基扩增-一种用于扩增RNA的一步等温方法)、RNA依赖性RNA聚合酶。任选地，扩增可在环糊精的存在下执行。环糊精从溶液隔离游离SDS。SDS是蛋白变性剂且如果存在将抑制下游基于酶的应用，例如PCR。环糊精结合SDS，且因此有效地移除它。
为了检测，提供具有报告体分子，例如荧光团的扩增的适配体。显示与适配体和分析物结合分析相容的任何比色法检测系统可被使用。这些的范围是从荧光团结合至扩增的适配体到生成基于适配体的DNAzymes，后者能够模拟对报告体染料起作用的催化酶，从而生成彩色信号。本发明的方法和试剂盒也可用于微流体或使用阻抗测量的生物传感器形式。
在第二个方面，本发明涉及包含存储在固体纸载体上的适配体和提供有包含扩增试剂的反应孔的反应板的试剂盒。可提供具有适配体的固体载体作为准备插入反应板中的纸片或其穿孔/片。或者，穿孔可能已经插入反应孔中。优选地，反应孔提供有随时可用的(RTG)扩增试剂。
在试剂盒中，反应板的孔可用初次适配体涂布。在这种情况下，固体载体上的适配体将用作反应中的二次适配体，用于以类似于ELISA反应的方式检测分析物。
在本发明的优选的实施方案中，稳定的适配体被直接扩增以从直接加入到扩增反应中的存储介质的单一穿孔生成大量的适配体。稳定的适配体与RCA或其它扩增反应的组合生成用于检测一系列分子靶标，例如蛋白、蛋白质组、诊断和生物传感中的代谢物的结合分析。
在第三方面，本发明涉及固体纸载体存储低分子量核酸(10-100 nt)，优选特异性适配体或适配体库的用途。这种用途能够在环境温度下方便地长时间存储适配体。固体纸载体具有如上所述的相同的种类并且与溶液中的适配体比较，特别适合于运输。
施加到固体载体的适配体被用来选择i) 对先前筛选适配体具有较高的结合亲和力的特异性适配体，或ii) 选择针对特异性分析物的新适配体。SELEX被用来生产和选择针对靶标分子的适配体。这涉及多轮筛选和随后的扩增。固体载体提供一种基质，其在下一轮扩增和选择之前，允许核酸分子的方便的环境温度存储。优选地，所述适配体是RNA适配体和固体载体优选地是RSM。
由本发明提供的方法和试剂盒具有超过目前使用的方法的显著优点，因为固体载体i) 在环境温度下存储适配体，而抗体或其它结合剂需要特殊的冷藏和ii) 与相关/适宜的扩增RTG (随时可用的)试剂组合，其可用来生成大量的特异性适配体。如在实施例中所述的，已生成的数据显示，将含有生物样品的穿孔施加到反应混合物不会抑制核酸扩增、免疫学蛋白结合或检测事件。
附图简述
图1是从在纸载体上存储特异性适配体并冲切纸圈进入反应孔到与存储的适配体反应扩增特异性分析物的过程的示意图：
图2显示使用QRTPCR的微RNA表达检测的结果。对于每一柱，n=4；误差柱(error bars)代表标准偏差。
图3显示如通过QRTPCR对每一分析的miRNA测定的Ct值。总RNA从血液提取且施加到每一固体载体并在使用Illustra RNAspin试剂盒提取前干燥3 hr。微RNA表达使用0.45ng总RNA每逆转录反应检测。对于每一柱，n=4；误差柱代表标准偏差。
发明详述
实施例1 - 从化学涂布的基于纤维素的固体载体存储和回收小分子RNA
这个实施例显示，点样到化学涂布的基于纤维素的固体载体基质上的生物样品可在分离和纯化单链小分子量RNA分子(长度~20 nt)之前，在环境条件下存储，如通过RNA适配体和微RNAs例举的。
在通过静脉穿刺在EDTA中收集全血后，即刻将40 μl等分液点样到基于纤维素的固体载体中并允许干燥。随后使用Illustra RNAspin微RNA分离试剂盒(GE Healthcare)和Illustra TriplePrep试剂盒(GE Healthcare)，从固体载体分离总RNA。检测小分子量微RNAs的存在并使用具有微RNA特异性引物和探针的两步骤定量逆转录PCR (QRTPCR)定量。
illustra随时可用的产品(GE Healthcare)是在标准实验室技术例如核酸扩增，例如PCR、RT-PCR等中呈稳健和可再现性能的形式的预先配制和预先分配、冻干的试剂混合物。也可配制随时可用的形式以稳定蛋白、酶、抗体等。Illustra PuReTaq随时可用的PCR珠是针对执行标准PCR扩增优化的预先混合、预先分配，单剂量反应。使用重组PuReTaq DNA聚合酶和其它高纯度试剂确保在两个端点和基于实时荧光的PCR扩增中的可靠和稳健性能。puReTaq随时可用的PCR试剂被预先配制以确保在反应之间的更高的可再现性，最小化移液步骤，并减少移液的错误和污染的可能性。仅仅需要的额外试剂是水、引物，和模板DNA。随时可用的产品在室温下是稳定的并被设计用于执行单管一步逆转录-PCR。每个室温稳定的产品含有M-MuLV逆转录酶、RNase抑制剂、缓冲剂、核苷酸，和Taq DNA聚合酶。仅仅需要的额外试剂是水、模板RNA，和引物。试剂针对全长cDNA合成优化至>7.5 kb和来自PCR的最佳灵敏度。
使用具有Illustra RNAspin微RNA分离试剂盒的固体载体基质
1. 在EDTA中收集后，将血液施加到在40μl等分液中的纸基固体载体基质并在室温下干燥最少3 hr。
2. 使用无菌Harris 5 mm一次性微穿孔器(GE Healthcare)和穿孔垫，从干燥的样品斑块中心移除圆片并置于干净的无RNase的1.5 ml微量离心管中。
3. 将缓冲剂RA1 (350μl，来自Illustra试剂盒)加入到各管中，接着加入3.5μlβ-巯基乙醇；然后使用20号针均质化各圆片。
4. 将均质化物转移到供应有Illustra试剂盒的滤柱并遵循供应有IllustraRNAspin微RNA分离试剂盒的方案。RNA洗脱在50 μl无RNase的水中执行。
使用具有Illustra TriplePrep试剂盒的固体载体基质
1. 在EDTA中收集后，将血液施加到在40μl等分液中的基于纤维素的固体载体基质(载体1是FTA®和载体2是FTA Elute®)并在室温下干燥最少3 hr。
2. 使用Harris 5 mm一次性微穿孔器和穿孔垫，从干燥的样品斑块中心移除圆片并置于干净的无RNase的1.5 ml微量离心管中。
3. 将缓冲剂RA1 (350 μl，来自Illustra TriplePrep试剂盒)加入到各管中，接着加入3.5μl β-巯基乙醇；使用20号针均质化各圆片。
4. 将均质化物转移到供应有TriplePrep试剂盒的DNA微型柱中。然后将这些以11,000 x g离心1 min。弃去DNA柱并遵循在Illustra TriplePrep试剂盒中描述的方案。RNA洗脱在50 μl无RNase的水中执行。
使用Trizol从全血分离总RNA
1. 将TRIZOL®试剂(1 ml)加入到在1.5 ml微量离心管中的500μl全血中并短暂涡旋。
2. 使均质化的样品在30℃下孵育5 min。
3. 加入氯仿(0.2 ml每1 ml Trizol)。样品管被牢固密封并用手剧烈震荡15秒，然后在30℃下孵育2-3min。
4. 在8℃下，以12,000 × g离心样品15 min。注意：离心后，将该混合物分离成较低的红色的苯酚-氯仿相，中间相，和无色的含RNA的上层水相。
5. 将含水相转移至一个新鲜的1.5 ml管中。通过与0.5 ml异丙醇每1 ml Trizol(用于最初的均质化)混合，从含水相沉淀RNA，接着在30℃下将样品孵育10 min。沉淀的RNA通过在8℃下，以12,000 × g离心10 min成小粒。
6. 除去上清液，而RNA小粒通过用1 ml 75 %乙醇涡旋洗涤一次，然后在2-8℃下以7,500 × g离心5 min。
7. 将小粒风干，然后再悬浮于50μl无RNase的水中。为了对存储在基于纤维素的固体载体基质上的血液进行比较，用于Trizol提取的血液的等分液在4℃下存储，且然后在第1天或第2天分离之前在室温下摇动1 hr。
miRNA分析 – 在miRNA分析之前，对使用Illustra RNAspin试剂盒、TriplePrep试剂盒洗脱，或trizol提取的样品分析总RNA含量。洗脱的总RNA通过QRTPCR，使用7900HT热循环仪(Applied Bio-systems)进行定量，以使用于随后的微RNA定量反应的模板RNA的量可被标准化。使用具有GAPDH对照试剂(Applied Biosystems)的TaqMan EZ-RT PCR试剂盒(Applied Bio-systems)进行反应。用于RNA定量的标准曲线使用从5 ng/μl至0.5 pg/μl的用试剂盒供应的对照RNA的5点系列稀释来制定。包含用于RNA分析的TaqMan EZ-RT PCR试剂盒的引物被设计跨内含子以确保只有cDNA可被扩增。
在洗脱液中存在的microRNA通过QRTPCR，使用7900HT热循环仪测定。
反应使用两步骤TaqMan方案(Applied Bio-systems)进行。TaqMan RT微RNA试剂试剂盒(#4366596)被用来在运行TaqMan QPCR之前，分别使用以下的Applied Bio-system试剂盒hsa-miR-223 (产品代码4395209)、hsa-miR-191 (产品代码4395410)和hsa-miR-26a-1 (产品代码4395166)，从具有对micro-RNAs miR-223、miR-191和miR-26a特异性的引物的5 μl总RNA转录cDNA。如在Applied Bio-system手册中所描述遵循方案。与这的仅有的偏差是使用96孔块(96 well block)。
结果 – 初始实验聚焦于微RNAs是否可使用Illustra RNAspin和TriplePrep试剂盒，从基于纤维素的固体载体分离。此外，实验也使用已在基质上存储24和48 hr的血液，评估微RNA在基质上的稳定性。作为对照，通过Trizol提取从全血分离总RNA。
结果(图2)显示，小分子量RNA分子例如微RNA可使用GE Healthcare IllustraRNAspin和TriplePrep试剂盒二者成功地存储和从化学涂布的基于纤维素的固体载体分离。
检测的源自固体载体的微RNA的量在测试的整个时间范围，即3、24和48 hr是可比较的，表明微RNA在测试的两种固体载体上是稳定的。总RNA的定量显示，使用TriplePrep试剂盒，从两种基质洗脱的产率是使用RNAspin试剂盒获得的产率的大约十分之一(1/10th)。然而这并不奇怪，因为前者被设计来分离DNA、RNA和蛋白，而后者是RNA-特异性的。
应该注意到，用于Applied Bio-systems microRNA TaqMan分析所建议的总RNA的最小量是用于各反应的1 ng/5 μl总RNA。在这些实验中，我们能够在16 pg/5 μl总RNA每次反应中定量microRNAs。
没有微RNA标准，不可能绝对定量测试的单独的微RNA。然而通过QRTPCR获得的Ct值提供一个相对表达水平的有价值的指标。须注意较低的Ct值指示较高的表达，而较高的Ct值指示较低的表达水平。各个微RNA的表达水平之间的比率不因所用的固体载体，提取试剂盒或存储时间而改变。
为了理解存在于预先纯化的总RNA中的微RNA部分是否在基于纤维素的固体载体上是稳定的，使用Trizol提取过程从全血分离总RNA。然后将分离的总RNA样品施加到固体载体并允许在使用Illustra RNAspin试剂盒提取前干燥3 hrs。使用Trizol试剂从血液提取的总RNA被用作对照物。随后的分析如上所述执行。从固体载体和直接从Trizol提取的血液提取的总RNA使用GAPDH QRTPCR定量，而0.45 ng总RNA被用于微RNA QPCR。
所有3种单独的微RNA的存在在施加到固体载体的总RNA中检测(图3)。如从来自施加到固体载体的样品的Ct值估算的，微RNA相对产率与使用Trizol从全血的那些产率的比较(图3)表明，一些微RNA可在基于纤维素的固体载体的干燥或加工期间失去。这是明显的，因为虽然总RNA量在QRTPCR之前被标准化，对于Trizol样品获得的较低的Ct值表明，使用这种方法提取的样品含有更大量的微RNA。
总之，化学涂布的固体载体有利于小分子量RNA分子的存储、纯化和检测，如由用于该实施例的3种microRNAs所例示的。使用所述的系统，对于各个microRNAs的检测限值低至16pg每反应。该实验清楚地表明，小分子量RNA分子可长时间段存储于化学涂布的基于纤维素的固体载体上。
实施例2 - 从施加到化学涂布的RSM固体载体的生物样品提取和分析mRNA分子
大鼠血液收集和干燥的血液斑块提取 – 雄性Sprague–Dawley大鼠(180-250 g)购自Charles River Laboratories。经由吸液管直接从置于麻醉大鼠的尾静脉的26号导管收集全血。转移50微升无抗凝剂的等分液并点样到化学处理的和未处理的滤纸上。干燥血液斑块并在一个干燥器柜(~20%相对湿度)中，在环境实验室温度中维持11天。使用7 mm HarrisUni-Core穿孔器(Fisher Scientific)，从每个干燥的血液斑块冲切两个样品圆片(用15 μl PK溶液(4 mg/ml蛋白酶K +0.5%SDS)每穿孔来处理)。将样品圆片转移至含有350 μl提取溶液(具有1% β-巯基乙醇的RLT缓冲液，Qiagen)的1.5 ml微量离心管并在40℃下，在热混合器(Eppendorf)中以700 rpm温育20 min。在温育后，使用QIAamp RNA血液Mini试剂盒(Qiagen)，从350 μl洗脱液纯化RNA并以40 μl无核酸酶的水洗脱。
人血液收集并施加到RSM纸 - 经由静脉切开术将静脉血液样品收集到EDTA或肝素涂布的血液管(Fisher Scientific)中。抽血并混合后即刻将50 μl血液从血样管移出并通过在斑块圆圈内以环形运动分配，施加到一片RSM纸上。使样品在室温下干燥~2小时，然后放回到具有新鲜干燥剂的原始Mylar袋中并在3种不同的条件下存储：在室温(~25℃)下过夜(18小时)，在室温下6天或在37℃下过夜(18小时)。
从RSM纸提取RNA - 通过使用6 mm Harris Uni-Core穿孔器(FisherScientific)，从每个干燥的血斑制备4-5个6 mm样品圆片。样品圆片被置于保险膜上，且将15 μl PK溶液(4 mg/ml蛋白酶K +0.5% SDS)加入到每个圆片中并在室温下温育15分钟。来自2个血液斑块的圆片被置于含有800 μl提取液(具有1% β-巯基乙醇的RLT缓冲液，Qiagen)的1.5 ml微量离心管中并在37℃下在热混合器中以600 rpm温育30 min。温育后，将700 μl洗脱液转移至一个新的微量离心管中并与400 μl异丙醇和来自AgencourtRNAdvance血液试剂盒(Beckman Coulter Genomics)的10 μl SPRI珠混合。然后按照生产商的指示提取RNA；使用Ambion DNase I试剂盒(Ambion)在37℃下经10 min除去基因组DNA。
PAXgene RNA血液收集和RNA提取。
根据生产商的指示(PreAnalytix)，在PAXgene® RNA血液管中收集人全血样品。通过一种基于磁珠的方法，使用Agencourt RNAdvance血液试剂盒的改进版本(BeckmanCoulter Genomics)和Hamilton STAR自动化液体处理器(Hamilton)分离RNA。在含有400 μl全血每孔的96-孔板中进行提取；使用Ambion DNase I试剂盒(Ambion)在37℃下经10 min除去基因组DNA。
内部PAX池血液对照 – 从应允的献血者(Western IRB Protocol #20090362)将大约2.5 mL血液收集到PAXgene® RNA真空采血管中。将来自供血管的血液/PAXgene试剂混合物合并在一起。合并和混合后，每一池被分配到1.5 ml等分液中并在-20℃下存储。
RNA分析 – 使用NanoDrop 8000 (Thermo Scientific)，通过在260 nm处的吸光度定量纯化的RNA。使用真核细胞总RNA 6000 Pico测定试剂盒，根据生产商的指示(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)，通过Agilent 2100生物分析仪评价RNA的完整性。RNA的完整性数(RIN)使用Agilent 2100 Expert软件计算(RIN = 1；对RIN的最低RNA质量 = 10；最高RNA质量)。
逆转录 – 使用高容量逆转录试剂盒(Life Technologies)，将RNA逆转录至cDNA。从PAXgene管提取的RNA被调整至6 ng/μl并将cDNA样品稀释至1 ng/μl的RNA当量，用于下游处理。从RSM纸(估计~200 ng)提取的所有可获得的RNA在未质量标准化的情况下被用于cDNA反应，。
通过加入2 μl cDNA样品至GES板中执行RT-qPCR反应。所有RT-qPCR反应使用Light Cycler 480 II (Roche)，使用以下循环条件运行：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟和95℃15秒和60℃ 1分钟的45个循环。各交叉点(Cp)值使用LC480 II软件(Roche)计算。基因组DNA污染通过比较剪接点跨度和基因间TFCP2分析的表达值评价。
结果 - 该研究的基线臂(baseline arm)利用25位健康受试者并由点样在RSM和31-ETF纸上的全血样品组成或收集在PAXgene管中并在室温下存储18小时(基线条件，RT；~25℃)。对于从PAXgene管获得的RNA的RIN评分稍高于从RSM获得的那些(平均RIN ±95%CI：分别为7.98 ± 0.54 vs. 6.92 ± 0.24，p < 0.001；来自PAXgene管(分别为6.58 ng/μl vs. 4.79 ng/μl全血, p < 0.001)的平均产率较高，从未处理的31-ETF纸分离的RNA显示显著的降解(2.87 ± 0.11)。
RT-qPCR – 为用功能测试评价在各种条件下分离的RNA，用于临床验证的、针对阻塞性冠状动脉疾病的基于基因表达的诊断测试的23个基因通过RT-qPCR分析。总的来说，从在37℃下存储或经6天的RSM纸仅观察到与基线臂比较的基因表达水平的稍微改变，对两种比较观察到0.15的中值增量交叉点(Cp)。测试的23个基因中的15个显示在3个臂之间的表达水平(Cp值)没有显著差异。2个基因(CD3D、TLR4)显示在37℃臂中Cp值的明显偏移，而7个基因(CD3D、IL18RAP、KLRC4、NCF4、RPL28、TNFAIP6、TNFRSF10C)显示在6-天臂的明显偏移，只有CD3D在两个臂中显著受到影响。相比之下，PAXgene样品的基线臂和37℃之间的中值增量Cp相对于RSM稍大一些(分别为0.53 vs. 0.15 Cp；而对于PAXgene而言，当与6-天臂比较时显著更大(1.97 vs. 0.15 Cp)。因此，对于分析的23个基因，来自RSM纸的平均基因表达与PAXgene稳定的RNA比较对升高的温度或延长的存储不太敏感。

Claims (16)

1. 一种检测一种或多种分析物的方法，其包括在固体载体上存储低分子量单链核酸(10-100 nt)；并扩增所述核酸。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述低分子量核酸是特异性的ss DNA或ss RNA适配体或适配体库，且所述方法包括在分析物检测之前，使一种或多种分析物与用于分析物检测或适配体选择的所述扩增的适配体结合的步骤。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述固体载体包含：纤维素基纸、编织或非编织纤维材料，包括人造，或天然存在的聚合物纤维、基于矿物纤维的材料例如玻璃纤维材料，或表面处理的固体材料，例如化学或机械处理的材料，包括激光蚀刻的表面，全部提供有主要保持DNA、RNA和蛋白分子的足够粗糙度的表面粗糙度，或凝胶，例如藻酸盐，全部任选用稳定剂或试剂混合物化学处理。
4.根据权利要求3的方法，其中所述试剂或试剂混合物包含：弱碱、抗氧化剂和螯合剂，和任选的阴离子表面活性剂，或包含：离液序列高的物质例如离液序列高的盐。
5.根据上述权利要求的一项或多项的方法，其中所述固体载体，或其部分，例如提供有存储的适配体的穿孔被切除并放入已经提供有或将提供有扩增试剂的反应孔或管中。
6.根据权利要求5的方法，其中所述适配体从所述固体载体提取并作为溶液加入到随后的扩增步骤中。
7.根据权利要求5的方法，其中具有存储的适配体的所述穿孔被放置在反应板的反应孔中，且所述孔提供有扩增试剂，且其中所述存储的适配体在反应孔中扩增。
8.根据权利要求5、6或7的方法，其中所述扩增试剂作为冻干的材料存在于反应孔中。
9.根据权利要求5、6、7或8的方法，其中所述反应板的孔用初次适配体涂布，而自穿孔扩增的适配体在分析物的检测反应中用作二次适配体。
10.根据上述权利要求的一项或多项的方法，其中所述固体载体包含纤维素基纸且适配体的扩增通过RCA、滚环扩增进行。
11.根据上述权利要求的一项或多项的方法，其中所述扩增的适配体提供有报告体分子，例如荧光团、催化的适配体(核糖酶和DNAzymes)。
12.一种试剂盒，其包含存储于固体载体，优选纤维素基纸上的适配体，和提供有包含扩增试剂的反应孔的反应板。
13.根据权利要求12的试剂盒，其中所述反应板的孔用初次适配体涂布。
14. 固体纸载体存储低分子量核酸(10-100 nt)，优选特异性适配体或适配体库的用途。
15. 根据权利要求14的用途，其中施加到固体载体的适配体被用来选择i) 对先前筛选适配体具有较高的结合亲和力的特异性适配体或ii) 选择针对特异性分析物的新适配体。
16.根据权利要求14或15的用途，其中所述适配体是RNA适配体和所述固体载体优选地是RSM。
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