JP2013246187A - 顕微鏡システム、標本画像生成方法及びプログラム - Google Patents

顕微鏡システム、標本画像生成方法及びプログラム Download PDF

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Abstract

【課題】病理診断に必要な画像を、通常の病理診断業務のワークフローを大きく変更することなく、短時間で処理することができ、且つ、画像ファイル容量の低減を図ることができる顕微鏡システム等を提供する。
【解決手段】包埋ブロックから薄切された第１の切片に対して明視野による形態観察可能な染色を施して作成された第１の標本について、第１のＶＳ画像を作成する第１ＶＳ画像作成部５７２と、第１のＶＳ画像における注目領域を設定する注目領域設定部５７４と、包埋ブロックから薄切され、第１の切片とは異なる第２の切片に対して、標的分子の発現確認用の標識を施して作成された第２の標本のうち、注目領域に対応する領域である観察領域について、第２のＶＳ画像を作成する第２ＶＳ画像作成部５７５とを備える。
【選択図】図３

Description

本発明は、複数枚の顕微鏡画像を繋ぎ合わせて広視野且つ高解像度の画像を生成する顕微鏡システム、標本画像生成方法、及び標本画像生成プログラムに関する。
顕微鏡によって標本を一度に観察できる範囲は、主に対物レンズの倍率によって決まる。例えば、対物レンズの倍率を高くすると、高精細な画像が得られる反面、観察範囲が狭くなる。
近年では、電動ステージ等を利用して視野を移動させながら複数枚の画像を撮像し、それらの画像を繋ぎ合わせることで、広視野かつ高精細な（高解像度の）顕微鏡画像を作成するシステムが知られている。例えば特許文献１〜４には、標本の範囲を複数の小区画に分割し、各小区画に対応する標本の部分を高解像度の対物レンズで撮像して得られた画像を繋ぎ合わせることにより、高精細且つ広画角な顕微鏡画像を形成する顕微鏡システムが開示されている。このようなシステムは、バーチャル顕微鏡システムと呼ばれており、病理診断等において活用されている。また、複数枚の画像を繋ぎ合わせた画像は、バーチャルスライド画像（以下、ＶＳ画像と略す）と呼ばれる。なお、ＶＳ画像は、ホール・スライド・イメージング（Whole Slide Imaging）とも呼ばれる。
このように標本全体をＶＳ画像として高精細に画像化しておくことにより、例えばパソコンとネットワーク環境があれば、ＶＳ画像の閲覧により、場所や時間を問わずに当該標本を観察することが可能となる。そのため、バーチャル顕微鏡システムは、医学生の病理学実習や、病理医間の遠隔コンサルテーション等にも利用され始めている。
ところで、病理診断においては、観察対象や目的に応じて種々の染色手法や観察法が用いられる。例えば、組織や細胞の形態を観察するための形態観察染色として、ヘマトキシリン及びエオジンの２つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色とも呼ばれる）が病理組織診断に一般的に用いられる。このような形態観察染色が施された標本に対しては、光学顕微鏡による明視野観察が行われる。
また、病理診断においては、形態情報に基づく形態診断を補完する目的で、標本に分子情報の発現を確認するための染色を施し、標的分子（特定の遺伝子やタンパク）の発現異常といった機能異常を診断する分子学的病理検査が行われることもある。例えば、ＩＨＣ（immunohistochemistry：免疫組織化学）法、ＩＳＨ（in situ hybridization）法等により標本に蛍光標識（染色）を施して蛍光観察を行ったり、酵素標識を施して明視野観察を行ったりする。以下、ＩＨＣ法及びＩＳＨ法による標的分子の染色を行うことを標的分子染色と記す。
近年では、癌等の治療として、特定の分子を標的として作用する治療薬を用いた治療（分子標的治療と呼ばれる）が行われており、治療効果の向上と副作用の軽減とが期待されている。分子標的治療においては、癌細胞に特異的に発現する分子（抗原タンパク）を標的とする治療薬が用いられる。このような分子標的治療を行う場合、治療に先立って、例えば、細胞の表面（即ち細胞膜）上に抗体治療薬の標的分子となる抗原が発現しているか否かをＩＨＣ法等で観察し、適応患者の選択が行われる。
例えば、乳癌治療においては、標的分子の発現状況に応じたターゲット治療が進んでいる。ターゲット治療においては、腫瘍部における複数の標的分子の発現パターンに応じて病型（細胞亜型）が「Ｌｕｍｉｎａｌ Ｂ」「Ｌｕｍｉｎａｌ Ａ」「ＨＥＲ２ ｄｉｓｅａｓｅ」「Ｂａｓａｌ ｌｉｋｅ」と称す４つの型に分類され、この分類に基づいて治療法の基本的な選択がなされる。具体的には、ホルモン受容体であるエストロゲン受容体（以下、「ＥＲ」と略記する）やプロゲステロン受容体（以下、「ＰｇＲ」と略記する）の細胞核上での発現の有無によってホルモン依存性に増殖する癌か否かを判断し、内分泌療法（ホルモン療法）の適用可否を選択する。また、ＨＥＲ２受容体（以下、「ＨＥＲ２」と略記する）の細胞膜上での発現の有無に応じて抗ＨＥＲ２抗体製剤であるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））の適用可否を選択する。そして、ＥＲ、ＰｇＲ、ＨＥＲ２のいずれも発現していない所謂トリプルネガティブ乳癌（Triple Negative Breast Cancer：ＴＮＢＣ）と呼ばれるタイプでは、化学療法を中心に治療を行う。また、最近ではＬｕｍｉｎａｌ型の乳癌において、細胞増殖能を示す核内タンパクであるＫｉ−６７の発現状況に応じてホルモン療法に化学療法を加えるか否かを判断することも行われている。
特開平９−２８１４０５号公報 特開平１０−３３３０５６号公報 特開２００６−３４３５７３号公報 特表２００２−５１４３１９号公報
このように、病理診断における標的分子の発現解析は、治療法の選択において重要である。ところが、標的分子の発現解析のためには、標的分子の発現が陽性である細胞数をカウントする等、非常に手間のかかる作業を行わなくてはならない。このため、画像解析により細胞数を自動でカウントする技術も開発されている。しかしながら、従来の自動カウント技術においては以下の問題があった。
まず、細胞数を自動カウントするためには、標的分子が染色された標本を高精細に画像化する必要がある。しかしながら、標本全体という広範囲の領域に対してＶＳ画像を作成することは、非腫瘍部のように、発現解析に不必要な部分も高精細に画像化することになる。このため、画像取得時間の増大と画像ファイル容量の増大を招いていた。
ファイル容量の増大を防ぐためには、標的分子が染色された標本全体を低倍で撮像し、病理医がその標的分子染色画像を観察して、腫瘍部等の必要な領域を抽出し、抽出された領域のみを高精細に画像化することも考えられる。しかしながら、この場合、画像取得の途中で病理医が介在する必要が生じる。このため、病理医にとっては、本来の業務には関係のない標本の画像化という業務が加わり、通常の病理診断業務のワークフローが大きく変更され、負担が増えてしまう。また、このような変更は、多数の標本を扱う場合、病理診断業務のワークフローとしても非効率である。さらに、低解像の標的分子染色画像では、病理医であっても腫瘍部位を適切に選択することが困難となる場合がある。
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、病理診断に必要な画像を、通常の病理診断業務のワークフローを大きく変更することなく、短時間で処理することができ、且つ、画像ファイル容量の低減を図ることができる顕微鏡システム、標本画像生成方法、及び標本画像生成プログラムを提供することを目的とする。
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る顕微鏡システムは、顕微鏡が備える対物レンズに対して標本を前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させ、前記標本を部分的に撮像することにより複数の顕微鏡画像を取得し、該複数の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせてなるバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムにおいて、包埋ブロックから薄切された第１の切片に対して明視野による形態観察可能な染色を施して作成された第１の標本について、第１のバーチャルスライド画像を作成する第１バーチャルスライド画像作成手段と、前記第１のバーチャルスライド画像における注目領域を設定する注目領域設定手段と、前記包埋ブロックから薄切され、前記第１の切片とは異なる第２の切片に対して、標的分子の発現確認用の標識を施して作成された第２の標本のうち、前記注目領域に対応する領域である観察領域について、第２のバーチャルスライド画像を作成する第２バーチャルスライド画像作成手段と、を備えることを特徴とする。
上記顕微鏡システムにおいて、前記形態観察可能な染色は、ヘマトキシリン・エオジン染色であることを特徴とする。
上記顕微鏡システムにおいて、前記標的分子の発現確認用の標識は、ＩＳＨ（In situ hybridization）法、ＦＩＳＨ（蛍光 In situ hybridization）法、若しくはＣＩＳＨ（Chromogenic In situ hybridization）法による検出プローブ、又は免疫染色であることを特徴とする。
上記顕微鏡システムにおいて、前記標的分子の発現確認用の標識は、蛍光染色であることを特徴とする。
上記顕微鏡システムは、前記観察領域の形状に応じて合焦位置を算出する合焦位置算出手段をさらに備えることを特徴とする。
上記顕微鏡システムは、前記観察領域内を部分的に撮像することにより取得された顕微鏡画像に対し、合焦が不良か否かを判定する判定手段をさらに備え、前記第２バーチャルスライド画像作成手段は、前記観察領域における合焦が不良と判定された部分について、顕微鏡画像を再取得することを特徴とする。
上記顕微鏡システムは、前記第２のバーチャルスライド画像における標的分子の発現量を算出する発現量算出手段をさらに備えることを特徴とする。
上記顕微鏡システムにおいて、前記第１及び第２の標本の各々に、少なくとも切片を薄切した包埋ブロックに関する情報及び染色の種類を含む標本情報が付与されており、前記標本情報を取得する標本情報取得手段と、前記第１の標本から取得された前記標本情報に基づいて、前記第２の標本を選択する標本選択手段と、をさらに備えることを特徴とする。
上記顕微鏡システムは、複数の標本を収容可能であり、且つ、該複数の標本の各々を前記対物レンズの視野範囲に順次搬送且つ搬出可能なスライド搬送手段をさらに備え、前記スライド搬送手段が搬送した前記複数の標本に対して連続的に処理を行うことを特徴とする。
上記顕微鏡システムは、前記注目領域設定手段によって設定された前記注目領域内に存在する細胞数をカウントする細胞数カウント手段と、細胞数が所定値に満たない場合にユーザに対して警告する警告手段と、をさらに備えることを特徴とする。
本発明に係る標本画像生成方法は、顕微鏡が備える対物レンズに対して標本を前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させ、前記標本を部分的に撮像することにより複数の顕微鏡画像を取得し、該複数の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせてなるバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムが実行する標本画像生成方法において、包埋ブロックから薄切された第１の切片に対して明視野による形態観察可能な染色を施して作成された第１の標本について、第１のバーチャルスライド画像を作成する第１バーチャルスライド画像作成ステップと、前記第１のバーチャルスライド画像における注目領域を設定する注目領域設定ステップと、前記包埋ブロックから薄切され、前記第１の切片とは異なる第２の切片に対して、標的分子の発現確認用の標識を施して作成された第２の標本のうち、前記注目領域に対応する領域である観察領域について、第２のバーチャルスライド画像を作成する第２バーチャルスライド画像作成ステップと、を含むことを特徴とする。
本発明に係る標本画像生成プログラムは、顕微鏡が備える対物レンズに対して標本を前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させ、前記標本を部分的に撮像することにより複数の顕微鏡画像を取得し、該複数の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせてなるバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムが実行する標本画像生成プログラムにおいて、包埋ブロックから薄切された第１の切片に対して明視野による形態観察可能な染色を施して作成された第１の標本について、第１のバーチャルスライド画像を作成する第１バーチャルスライド画像作成ステップと、前記第１のバーチャルスライド画像における注目領域を設定する注目領域設定ステップと、前記包埋ブロックから薄切され、前記第１の切片とは異なる第２の切片に対して、標的分子の発現確認用の標識を施して作成された第２の標本のうち、前記注目領域に対応する領域である観察領域について、第２のバーチャルスライド画像を作成する第２バーチャルスライド画像作成ステップと、を前記顕微鏡システムに実行させることを特徴とする。
本発明によれば、第１の標本のバーチャルスライド画像において注目領域が設定された後は、第２の標本のうち、当該注目領域に対応する領域のみについての高精細なバーチャルスライド画像が自動で生成されるので、病理診断に必要な画像の生成処理を、通常の病理診断業務のワークフローを大きく変更することなく、短時間で実行することが可能になると共に、画像ファイル容量の低減を図ることが可能になる。
図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡システムの構成例を示す模式図である。 図２は、標本が固定されたスライドガラスの一例を示す模式図である。 図３は、図１に示すホストシステムの構成例を示すブロック図である。 図４は、図３に示す画像データ記録部に格納される画像ファイルのデータ構成例を示す模式図である。 図５は、本発明の実施の形態１に係る標本画像生成方法を示すフローチャートである。 図６は、ＨＥ染色標本の高解像画像における注目領域の指定例を示す図である。 図７は、図５に示すＨＥ染色標本のＶＳ画像を作成する処理を示すフローチャートである。 図８は、図２に示す標本存在領域に対応する画像を示す模式図である。 図９は、フォーカスマップのデータ構成例を示す表である。 図１０は、ＶＳ画像リストのデータ構成例を示す表である。 図１１は、免疫染色標本のＶＳ画像を作成する処理を示すフローチャートである。 図１２は、免疫染色標本において決定されたスキャン範囲を示す模式図である。 図１３は、注目領域内に設定される発現解析対象領域を示す模式図である。 図１４は、本発明の実施の形態２に係るホストシステムの構成を示すブロック図である。 図１５は、実施の形態２におけるスキャン範囲の高解像画像を作成する処理の詳細を示すフローチャートである。 図１６は、本発明の実施の形態３に係るホストシステムの構成を示すブロック図である。
以下、本発明に係る実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、これらの実施の形態により本発明が限定されるものではない。また、図面の記載において、同一部分には同一の符号を付して示している。
（実施の形態１）
図１は、実施の形態１に係る顕微鏡システム全体の構成例を示す図である。
図１に示すように、実施の形態１に係る顕微鏡システム１は、顕微鏡装置１０と、顕微鏡装置１０の各部を制御する顕微鏡コントローラ２０と、顕微鏡装置１０に取り付けられたテレビ（ＴＶ）カメラ３０と、ＴＶカメラ３０の動作を制御するテレビ（ＴＶ）カメラコントローラ４０と、これらの各部とデータ送受可能に接続され、顕微鏡システム１全体の動作を統括的に制御するホストシステム５０−１と、標本を固定した複数のスライドガラスを収容可能であると共に、観察対象の標本が固定されたスライドガラス（以下、スライドガラス標本２ともいう）を顕微鏡装置１０に１枚ずつ搬送するスライド搬送装置６０と、スライドガラス標本２に貼付されたバーコードを読み取るバーコードリーダ７０とを備える。この顕微鏡システム１は、顕微鏡装置１０が備える対物レンズに対して標本を対物レンズの光軸と直交する方向に移動させて、撮像視野をずらしながら標本を部分ごとに撮像し、それによって取得した複数の画像を互いに繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像（以下、ＶＳ画像と略す）の生成が可能な顕微鏡システムである。
図２は、スライドガラス標本２の一例を示す模式図である。図２に示すように、スライドガラス標本２は、スライドガラスＳと、スライドガラスＳ上に固定された切片標本ＳＰとを含む。また、スライドガラスＳ上には、切片標本ＳＰに関する標本情報が記載されたラベルＬＢが貼付されている。
切片標本ＳＰは、生体から採取されたブロック状の標本（包埋ブロックとも呼ばれる）を薄切した切片に対して所定の染色を施したものである。切片標本ＳＰは、スライドガラス標本２上の予め設定された領域である標本サーチ範囲Ａ１内に固定される。標本サーチ範囲Ａ１は、例えば、縦：２５ｍｍ×横：５０ｍｍ程度の大きさである。
また、スライドガラス標本２には、切片標本ＳＰに関する情報（以下、標本情報という）が記載されたラベルＬＢが貼付されている。標本情報は、スライドガラスに固定された標本の検査ＩＤ、包埋ブロック番号、切片番号、染色情報等を含む。この染色情報は、当該切片標本ＳＰを染色した色素の種類等の情報を含む。これらの標本情報は、例えば２次元バーコードのように、自動読み取りが可能な形態でラベルＬＢに印刷等されている。
顕微鏡装置１０は、透過観察用光学系１１として、透過照明用光源１１０と、透過照明用光源１１０の照明光を集光するコレクタレンズ１１１と、透過用フィルタユニット１１２と、透過シャッタ１１３と、透過視野絞り１１４と、透過開口絞り１１５と、照明光の光路を折り曲げる反射ミラー１１６と、コンデンサ光学素子ユニット１１７と、トップレンズユニット１１８とを有する。また、顕微鏡装置１０は、落射観察用光学系１２として、落射照明用光源１２０と、コレクタレンズ１２１と、落射用フィルタユニット１２２と、落射シャッタ１２３と、落射視野絞り１２４と、落射開口絞り１２５とを有する。
これらの透過観察用光学系１１の光路Ｌ１と落射観察用光学系１２の光路Ｌ２との双方と重なる観察光路Ｌ上には、スライドガラス標本２が載置される電動ステージ１３が設けられている。この電動ステージ１３は、観察光路Ｌに挿入された対物レンズ１４ａの光軸と直交する面（ＸＹ面）内、及び該光軸と平行な方向（Ｚ方向）に沿って移動可能に設けられている。電動ステージ１３の移動制御は、顕微鏡コントローラ２０の制御の下で動作するステージＸ−Ｙ駆動制御部２１及びステージＺ駆動制御部２２により、モータ１３１、１３２をそれぞれ介して行われる。また、電動ステージ１３は、原点センサによる原点位置検出機能（図示せず）を有しており、電動ステージ１３に載置されるスライドガラス標本２上の各位置に対して座標を設定することができる。
電動ステージ１３の上方には、互いに倍率が異なる複数（図１においては２つ）の対物レンズ１４ａ、１４ｂを保持可能なレボルバ１４が設けられている。対物レンズ１４ａ、１４ｂ、…としては、少なくとも、倍率が比較的低い低倍率（例えば２倍、４倍）の対物レンズ（以下、低倍対物レンズという）と、倍率が低倍対物レンズよりも高い高倍率（例えば、１０倍、２０倍、４０倍）の対物レンズ（以下、高倍対物レンズという）とがあれば良い。なお、低倍及び高倍とした倍率は一例であり、少なくとも一方の倍率が他方の倍率に対して高ければ良い。レボルバ１４は、そのときの観察に使用される対物レンズを回転動作により観察光路Ｌに選択的に挿入する。図１においては、対物レンズ１４ａが観察光路Ｌに挿入された状態を示している。
観察光路Ｌ上には、複数（図１においては２つ）の光学キューブ１５ａ、１５ｂと、これらの光学キューブ１５ａ、１５ｂを保持する光学キューブユニット１５とが設けられている。光学キューブユニット１５は、そのときの検鏡法に応じた光学キューブを観察光路Ｌに選択的に挿入する。図１においては、光学キューブ１５ａが観察光路Ｌに挿入された状態を示している。
これらのレボルバ１４及び光学キューブユニット１５は電動化されており、その動作は顕微鏡コントローラ２０によって制御される。
さらに、観察光路Ｌ上には、対物レンズ１４ａを通過した観察光を接眼レンズ１７側とＴＶカメラ３０側とに分岐するビームスプリッタ１６とが備えられている。
顕微鏡コントローラ２０は、顕微鏡装置１０全体の動作を制御する機能を有し、ホストシステム５０−１からの制御信号に応じて、検鏡法の変更や、透過照明用光源１１０及び落射照明用光源１２０の調光といった各ユニットの制御を行うと共に、各ユニットの現在の状態を検出して、検出信号をホストシステム５０−１に送出する。また、顕微鏡コントローラ２０は、ホストシステム５０−１からの制御信号に応じて、ステージＸ−Ｙ駆動制御部２１及びステージＺ駆動制御部２２を介して、電動ステージ１３の移動制御を行う。
ＴＶカメラ３０は、各画素位置においてＲ（赤）、Ｇ（緑）、Ｂ（青）の各色成分（波長成分）に対して、例えば２５６階調の画素レベル（画素値）を持つカラー画像の生成が可能な撮像装置である。ＴＶカメラ３０には、受光した観察光を電気信号に変換して画像データを生成するＣＣＤ等の撮像素子が設けられている。ＴＶカメラ３０において生成された画像データは、後述するビデオボード５１を介してホストシステム５０−１に取り込まれる。また、ＴＶカメラ３０に対する自動ゲイン制御のＯＮ／ＯＦＦ、ゲイン設定、自動露出制御のＯＮ／ＯＦＦ、及び露光時間の設定といった各種設定は、カメラコントローラ４０を介してホストシステム５０−１の制御の下で行われる。
ホストシステム５０−１は、ＣＰＵやビデオボード、メインメモリ等の主記憶装置、ハードディスクや各種記憶媒体等の外部記憶装置、通信装置、表示装置や印刷装置等の出力装置、入力装置、各部を接続し、あるいは外部入力を接続するインタフェース装置等を備えた公知のハードウェア構成（例えば、ワークステーションやパソコン等の汎用コンピュータ）によって実現される。
図３は、ホストシステム５０−１の構成を示すブロック図である。図３に示すように、ホストシステム５０−１は、ＴＶカメラ３０から入力されるビデオ信号を処理するビデオボード５１と、入力部５２と、モニタ５３と、画像データ記録部５４と、撮像座標記録部５５と、プログラム記録部５６と、これらの各部及び顕微鏡システム１全体の動作を制御する制御部５７とを備える。この他、ホストシステム５０−１は、制御部５７がワークメモリとして使用するメインメモリや、図１に示す顕微鏡システムを構成する各部との間で各種データの授受を管理するインタフェースユニット等（いずれも図示せず）を備える。
入力部５２は、ユーザが各種情報や命令を当該ホストシステム５０−１に入力する際に用いられるマウスやキーボード等の入力デバイスを含み、これらの入力デバイスを介して入力された入力信号を制御部５７に入力する。
モニタ５３は、ＬＣＤやＥＬディスプレイ等の表示装置によって実現され、顕微鏡装置１０を操作するための操作画面や、顕微鏡装置１０によって撮像された顕微鏡画像や、複数の顕微鏡画像を繋ぎ合わせたＶＳ画像や、これらの画像の関連情報等を表示する。
画像データ記録部５４、撮像座標記録部５５、及びプログラム記録部５６は、例えば、更新記録可能なフラッシュメモリ等のＲＯＭやＲＡＭといった各種ＩＣメモリ、内蔵若しくは外付けハードディスク、又は、ＣＤ−ＲＯＭ等の情報記録媒体及びその読取装置によって実現される。特に、画像データ記録部５４は、ハードディスクや大容量メモリ等によって実現することが好ましい。
画像データ記録部５４は、ビデオボード５１を介して入力された画像データを記録する。画像データ記録部５４に記録された画像データは、例えば、任意のときに（例えばユーザによる入力部５２への操作に応じて）制御部５７によって読み出され、モニタ５３に出力される。それにより、当該画像データによって表される顕微鏡画像がモニタ５３に表示される。
撮像座標記録部５５は、スライドガラス標本２を撮像する際のＸＹＺ座標（合焦位置座標）を記録する。
プログラム記録部５６は、顕微鏡システム１の動作を制御するための各種制御プログラムや、これらの制御プログラムの実行中に用いられるデータ等を記録する。
制御部５７は、例えばＣＰＵ等のハードウェアによって実現され、プログラム記録部５６に記録されている制御プログラムを読み込むことにより、顕微鏡システム１の制御や顕微鏡画像の画像処理をはじめとする各種機能を実行する。制御部５７は、合焦位置算出部５７１と、第１ＶＳ画像作成部５７２と、標本選択部５７３と、注目領域設定部５７４と、第２ＶＳ画像作成部５７５と、発現量算出部５７６とを有する。
合焦位置算出部５７１は、ＴＶカメラ３０を介して入力される画像のコントラストに基づき、顕微鏡装置１０に合焦動作（所謂、ビデオＡＦ機能）を実行させて、合焦位置座標を算出し、算出した合焦位置座標を撮像座標記録部５５に格納されたフォーカスマップ（後述）に記録する。
第１ＶＳ画像作成部５７２は、明視野による形態観察可能な染色が施された第１のスライドガラス標本のＶＳ画像を作成する。
標本選択部５７３は、各スライドガラス標本に附された標本情報に基づいて、標的分子の発現確認用の標識が施された第２のスライドガラス標本のうちから、ＶＳ画像が作成された第１のスライドガラス標本に対応する第２のスライドガラス標本を選択する。標本情報は、後述するように、バーコードリーダ７０を介して取得される。
注目領域設定部５７４は、ユーザ操作により入力された信号に従って、第１のスライドガラス標本のＶＳ画像内において選択された領域を注目領域として設定する。
第２ＶＳ画像作成部５７５は、標本選択部５７３により選択された第２のスライドガラス標本のうち、注目領域設定部５７４により設定された注目領域に対応する領域（観察領域）のＶＳ画像を作成する。
発現量算出部５７６は、第２のスライドガラス標本のＶＳ画像から、標的分子の発現量を算出する。
この他、制御部５７は、各スライドガラス標本の画像を取得する際に、顕微鏡コントローラ２０の制御信号を送信して、顕微鏡装置１０の各部に対する制御（電動ステージ１３の移動制御、検鏡法の変更等）を行う。また、制御部５７は、顕微鏡コントローラ２０を介して顕微鏡装置１０の各部の状態検出等を行う。なお、以下の説明においては、この様な制御や状態検出については逐一説明しないものとする。
ホストシステム５０−１には、ＵＳＢ又はＬＡＮといった汎用インタフェース（図示せず）が設けられており、これらの汎用インタフェースを介してスライド搬送装置６０及びバーコードリーダ７０と接続されている。
スライド搬送装置６０は、例えば数百枚といった大量のスライドガラス標本の収容が可能であり、ホストシステム５０−１の制御の下で、収容するスライドガラス標本を、１枚ずつ、人手を介さずに電動ステージ１３との間で自動搬送及び自動搬出する。
バーコードリーダ７０は、スライドガラス標本に貼付されたラベルに印刷された２次元バーコードを読み取ってホストシステム５０−１に入力する。それにより、ホストシステム５０−１は、スライドガラス標本の標本情報を自動で取り込むことができる。
次に、画像データ記録部５４に記録されるＶＳ画像のファイル書式について説明する。本実施の形態１において、ＴＶカメラ３０により生成された画像データは、スライドガラス標本ごとに作成されたＶＳ画像の単位で格納される。なお、ＶＳ画像の画像データは、ＪＰＥＧ、ＪＰＥＧ２０００といった公知の圧縮アルゴリズムにより圧縮して画像データ記録部５４に記録しても良い。
図４は、画像データ記録部５４に格納される画像ファイルのデータ構成例を示す模式図である。図４に示すように、画像ファイルＤは、付帯情報データ部Ｄ１と、標本サーチ範囲画像データ部Ｄ２と、広視野・高精細画像データ部Ｄ３と、注目領域設定情報部Ｄ４と、標的分子の発現解析データ部Ｄ５とを含む。
付帯情報データ部Ｄ１には、スライドガラス標本の観察法情報（明視野観察、蛍光観察等）Ｄ１１、上述した標本情報Ｄ１２、及び標本サーチ範囲Ａ１全体の画像を撮像した際の倍率情報（標本サーチ範囲画像データ撮像倍率情報）Ｄ１３といったデータが記録される。
標本サーチ範囲画像データ部Ｄ２には、標本サーチ範囲Ａ１全体が写った画像の画像データが記録される。
広視野・高精細画像データ部Ｄ３には、ＶＳ画像を構成する複数の領域の数（即ち、繋ぎ合わせた顕微鏡画像の数）ｎの情報Ｄ３０、及び各領域に関する情報（領域＃１情報Ｄ３１〜領域＃ｎ情報Ｄ３ｎ）が記録される。各領域に関する情報は、撮像情報Ｄ３２１、フォーカスマップデータＤ３２２、及び当該領域を撮像して取得した顕微鏡画像の画像データＤ３２３を含む。このうち、撮像情報は、撮像倍率、スキャン開始ステージＸ座標、スキャン開始ステージＹ座標、Ｘ方向のピクセル数、及びＹ方向のピクセル数といった情報を含む。なお、スキャン開始時には、スキャン対象領域に向かって左上の領域（区画）のＸＹ座標が設定される。また、フォーカスマップデータＤ３２２は、各領域における合焦位置座標が記録される。フォーカスマップについては後で詳述する。
注目領域設定情報部Ｄ４には、形態観察可能な染色が施されたスライドガラス標本のＶＳ画像に対して設定された注目領域に関する情報として、注目領域の個数（ｍ）情報Ｄ４０、及び各注目領域に関する情報（注目領域＃１情報Ｄ４０〜注目領域＃ｍ情報Ｄ４ｍ）が記録される。
標的分子の発現解析データ部Ｄ５には、標的分子染色が施されたスライドガラス標本のＶＳ画像から検出された標的分子の発現解析結果が記録される。
次に、実施の形態１に係る標本画像生成方法について説明する。図５は、実施の形態１に係る標本画像生成方法を示すフローチャートである。
まず、ステップＳ１において、検査技師等のオペレータは、ＨＥ染色標本をスライド搬送装置６０に収容する。ＨＥ染色標本は、包埋ブロックから薄切した切片に、明視野による形態観察可能な染色としてヘマトキシリン・エオジン染色（以下、ＨＥ染色と記す）を施し、これをスライドガラスに固定した標本である。なお、通常の病理検査業務では、染色法に応じてバッチ処理的にスライドガラス標本の作製が行われるため、本ステップＳ１において、複数の包埋ブロックからそれぞれ作成された複数のＨＥ染色標本をスライド搬送装置６０内に収容しても良い。
なお、ＨＥ染色においては、ヘマトキシリン（以下、Ｈ色素とも記す）により細胞核が青紫色に染色され、エオジン（以下、Ｅ色素とも記す）により細胞質や結合組織が薄赤色に染色される。
続くステップＳ２において、顕微鏡システム１は、スライド搬送装置６０に収容されたＨＥ染色標本を顕微鏡装置１０に搬送して、標本サーチ範囲Ａ１から切片標本ＳＰを含む矩形の領域（標本存在領域Ａ２）を検出し、該領域全体が写った広視野且つ高精細なＶＳ画像を作成する。このＶＳ画像は、標本情報と関連付けてＶＳ画像ファイルとして画像データ記録部５４に記録される。スライド搬送装置６０に複数のＨＥ染色標本が収容されている場合には、これらのＨＥ染色標本について順次ＶＳ画像が作成され、ＶＳ画像ファイルが記録される。なお、ＶＳ画像を作成する処理については、後で詳述する。
続くステップＳ３において、顕微鏡システム１は、ＨＥ染色標本のＶＳ画像上で注目領域を設定する。
より詳細には、ホストシステム５０は、ユーザ（例えば病理医）の操作に従って、画像データ記録部５４に記録されたＨＥ染色標本のＶＳ画像をモニタ５３に順次表示させる。図６は、モニタ５３に表示されたＨＥ染色標本のＶＳ画像の表示例を示す。病理医は、モニタ５３上でＶＳ画像を観察し、形態情報に基づく診断及び所見を作成して、病理診断報告を行う。具体的には、ＶＳ画像に見られる腫瘍は良性腫瘍か悪性腫瘍か、組織型は何か、腫瘍径はどれくらいか、といった診断を行う。そして、治療法の選択や診断確定目的で、標的分子の発現の確認が必要であると判断する領域を選択する。この選択は、ＶＳ画像に対するマウス等の入力デバイスを用いて、例えば、腫瘍部位を多角形等の閉じた図形で囲むことにより行う。或いは、マウスのドラッグ操作により自由曲線で領域を選択しても良い。
ホストシステム５０−１は、モニタ５３に表示されたＶＳ画像に対するポインタ操作に応じて、例えば多角形の頂点座標（自由曲線の場合には、曲線上の座標）を、注目領域設定情報部Ｄ４（図４参照）に記録する。これにより、注目領域Ａ３が設定される。なお、図６に示すように、注目領域Ａ３を複数箇所選択することも可能であり、この場合、複数の注目領域情報（注目領域＃１情報Ｄ４１、注目領域＃２情報Ｄ４２、…）が記録される。
続くステップＳ４において、検査技師等のオペレータは、免疫染色標本をスライド搬送装置６０に収容する。免疫染色標本は、ＨＥ染色標本を作成したものと同一の包埋ブロックから切片を薄切し、この切片に標的分子の発現確認用の標識として免疫染色を施してスライドガラスに固定した標本である。この際、ＨＥ染色標本と免疫染色標本とで、互いに連続する、又は近傍の切片を用いることが好ましい。これにより、切片内の各部分（組織や細胞内の構成要素の態様や、病変部位の出現の仕方等）がＨＥ染色標本の切片と概ね対応する免疫染色標本を作成することができる。
免疫染色標本においては、一例として、免疫染色として標識酵素にペルオキシダーゼ、発色基質にジアミノベンジジン（以下、ＤＡＢと記す）をそれぞれ用いて標的分子の存在を茶褐色で表色し、対比染色として細胞核をヘマトキシリンにより青紫色に染色する。
なお、バッチ処理により複数枚の免疫染色標本がスライド搬送装置６０に収容され得ることは、ステップＳ１と同様である。この場合、注目領域Ａ３が設定されたＨＥ染色標本に対して、それぞれ同一の包埋ブロックから免疫染色標本を作成することとする。
続くステップＳ５において、顕微鏡システム１は、スライド搬送装置６０に収容された免疫染色標本を顕微鏡装置１０に搬送して、ＶＳ画像を作成する。この際、顕微鏡システム１は、免疫染色標本に貼付されたバーコードを読み取って標本情報（検査ＩＤ及び包埋ブロック番号）を取得し、この標本情報によって識別される同一包埋ブロックのＨＥ染色標本のＶＳ画像ファイルを参照する。そして、注目領域設定情報部Ｄ４に記録されている注目領域Ａ３に対応する免疫染色標本上の領域に対して、広視野且つ高精細なＶＳ画像を作成する。
続くステップＳ６において、制御部５７は、免疫染色標本のＶＳ画像を自動解析し、標的分子の発現が陽性である細胞の数をカウントし、全細胞数における陽性の細胞の割合を算出することにより、標的分子の発現量を算出する。
その後、処理は完了する。
次に、ＨＥ染色標本のＶＳ画像を作成するステップＳ２について詳しく説明する。なお、ＶＳ画像の作成処理については、特開平９−２８１４０５号公報及び特開２００６−３４３５７３号公報も参照されたい。
図７は、ＨＥ染色標本のＶＳ画像の作成処理を示すフローチャートである。
オペレータがモニタ５３に表示された操作画面において処理開始操作を行うと、ステップＳ１０において、スライド搬送装置６０は、内部に収容されているＨＥ染色標本を１枚、電動ステージ１３上に搬送する。
続くステップＳ１１において、バーコードリーダ７０は、搬送されたＨＥ染色標本に貼付されたラベルＬＢのバーコード（例えば２次元バーコード）を読み取り、当該スライドガラス標本２の標本情報を取得してホストシステム５０−１に送信する。この標本情報は、ＶＳ画像ファイル（図４参照）内の付帯情報データ部に標本情報６１２として記録される。なお、ラベルＬＢに上述した標本情報が文字情報として印字されている場合は、別途マクロ照明及びマクロカメラ等によりラベルＬＢの画像データを取得し、ラベルＬＢの画像を文字認識することにより標本情報を取得しても良い。
続くステップＳ１２において、ホストシステム５０−１は、顕微鏡装置１０における観察法を明視野観察（透過明視野観察）に設定する。これに応じて、顕微鏡コントローラ２０は、顕微鏡装置１０の各光路に対し、各種光学部材を装脱する制御を行う。具体的には、顕微鏡装置１０は、落射シャッタ１２３を光路Ｌ２に挿入し、光学キューブユニット１５において明視野観察用の光学キューブを光路に挿入し、透過照明用光源１１０を点灯する。これにより、顕微鏡装置１０において、透過明視野観察を実行可能な状態が構築される。
続くステップＳ１３において、顕微鏡コントローラ２０は、ホストシステム５０−１の制御の下で、顕微鏡装置１０において使用する対物レンズを、例えば２倍の低倍対物レンズに変更させる。これによりレボルバ１４が回転し、低倍対物レンズが光路Ｌに挿入される。
続くステップＳ１４において、顕微鏡システム１は、ＨＥ染色標本全体の低解像画像を作成する。より詳細には、ホストシステム５０−１は、ＨＥ染色標本上の標本サーチ範囲Ａ１（図２参照）を、ＴＶカメラ３０に投影される撮像領域の幅に応じて（言い換えると、光路Ｌに挿入された低倍対物レンズの倍率に応じて）、撮像領域を複数の区画に分割する。そして、顕微鏡コントローラ２０は、電動ステージ１３をＸＹ方向に操作して、分割された各区画を顕微鏡装置１０の撮像視野に順次移動させる。ＴＶカメラ３０は、撮像視野に入った区画を順次撮像して画像データを生成し、ホストシステム５０−１に入力する。ホストシステム５０−１は、入力された画像データに基づき、各区画の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせることで、ＨＥ染色標本の標本サーチ範囲Ａ１全体が写った低解像画像を作成する。作成された低解像画像の画像データは、ＶＳ画像ファイル６に、標本サーチ範囲画像データ（図４参照）として記録される。
続くステップＳ１５において、顕微鏡コントローラ２０は、ホストシステム５０−１の制御の下で、顕微鏡装置１０において使用する対物レンズを、例えば２０倍の高倍対物レンズに交換させる。これによりレボルバ１４が回転し、高倍対物レンズが光路Ｌに挿入される。その結果、顕微鏡装置１０において、ＨＥ染色標本の高解像画像を取得可能な状態となる。
ステップＳ１６において、制御部５７は、ステップＳ１４において取得した標本サーチ範囲Ａ１全体の低解像画像を基に、ＨＥ染色標本上の標本存在領域Ａ２（図２参照）を自動抽出し、該領域においてフォーカス位置を実測するポイント（フォーカス位置抽出ポイント）を決定する。
より詳細には、制御部５７は、まず、カラー（ＲＧＢ）画像である低解像画像の各画素における輝度情報を求める。具体的には、Ｇ成分を輝度情報として抽出しても良いし、次式（１）で算出される輝度値Ｙを輝度情報として採用しても良い。
輝度値Ｙ＝０．２９９×Ｒ＋０．５８７×Ｇ＋０．１１４×Ｂ …（１）
続いて、制御部５７は、各画素の輝度情報を所定の上限閾値及び下限閾値の範囲内に入るか否かで２値化した２値化画像を作成する。輝度情報が当該閾値の範囲に入る画素は切片標本ＳＰの像（標本像）が写った画素であり、輝度情報が当該閾値の範囲に入らない画素は標本像が写っていない画素である。そして、制御部５７は、上記２値化画像を各辺縁部から中心に向かって探索し、標本像に外接する矩形領域を求める。この矩形領域が標本存在領域Ａ２として決定される。
なお、ＨＥ染色標本等のスライドガラス標本には、切片標本ＳＰが存在しない領域であっても、ゴミ等の切片標本ＳＰ以外の物体が辺縁部に付着している場合がある。このため、標本存在領域Ａ２の探索途中で上記閾値の範囲内の輝度情報を有する画素が見つかった場合、染色状況により当該画素位置に写った物体が標本像であるかゴミの像であるかを判断する。ここで、ゴミは染色されていないため、画像内ではグレーとなり、ＲＧＢの各値が近接する。従って、例えば、色比であるＲ／Ｇ値及びＢ／Ｇ値が１．０を中心とする所定の範囲内であれば、当該画素にゴミが写っているものとして判断して、標本像の探索を継続する。また、ＲＧＢ画素値をＨＳＶ色空間に変換して彩度（Ｓ）を求め、彩度が所定の閾値よりも低い場合に、当該画素にゴミが写っているものと判断しても良い。
また、ＨＥ染色標本等のスライドガラス標本上に、微小な孤立領域が存在する場合がある。しかしながら、このような孤立領域は、染色されていたとしても診断にとっては不要な領域であり、且つ、後述する免疫染色標本との位置ズレ判定の精度劣化につながるおそれがある。従って、上記閾値の範囲内の輝度情報を有する画素の領域が所定の面積を有しない場合、ゴミが写っているものと判断して、当該画素の領域を標本像から除外する。なお、本除外処理は、処理時間短縮のために、標本サーチ範囲Ａ１全体が写った低解像画像を適切な倍率（解像度）まで縮小してから行っても良い。
図８は、そのようにしてＨＥ染色標本の低解像画像から抽出された標本存在領域を示す模式図である。図８に示す標本存在領域Ｍ１は、図２に示すスライドガラス標本２上の標本存在領域Ａ２に対応している。
続いて、制御部５７は、標本存在領域Ｍ１内を格子状の複数の小区画Ｃ１に分割する。なお、各小区画Ｃ１の領域サイズは、ステップＳ１５において光路Ｌに挿入された高倍対物レンズを介してＴＶカメラ３０に投影される撮像領域に対応している。そして、制御部５７は、標本存在領域Ｍ１（又は標本サーチ範囲Ａ１に対応する低解像画像）における各小区画Ｃ１のｘｙ座標（具体的には、小区画Ｃ１の中心座標）を算出し、このｘｙ座標を、撮像倍率や撮像素子情報（画素数、画素サイズ）等に基づいて、電動ステージ１３の位置座標（ＸＹ座標）に変換する（例えば、特開平９−２８１４０５号公報参照）。なお、図８に示す標本存在領域Ｍ１においては、図の左上コーナーの小区画Ｃ１を原点としている。
さらに、制御部５７は、複数の小区画Ｃ１のうちから、合焦位置（Ｚ座標）をサンプリングで実測する小区画Ｃ１（フォーカス位置抽出ポイントＦＰ）を自動抽出する。これは、各小区画Ｃ１の合焦位置を求める際に、標本存在領域Ｍ１内の小区画Ｃ１の数が多い場合、全ての小区画Ｃ１に対し実測により合焦位置を求めようとすると、非常に時間がかかるからである。フォーカス位置抽出ポイントＦＰの抽出方法は、ランダム抽出であっても良いし、規則的に（例えば、６区画おきに）抽出するものであっても良い。また、フォーカス位置抽出ポイントＦＰの抽出数は、標本存在領域Ｍ１の大きさに応じて、例えば所定数以下となるように予め決定しておいても良い。つまり、自動抽出する処理内容は任意に決めてよい。なお、標本存在領域Ｍ１内で、切片標本ＳＰに対応する像（標本像）ＳＰ’が存在しない背景部や空洞部と認められる小区画Ｃ１は、当然ながら、フォーカス位置抽出ポイントとしては除外される。なお、図８においては、フォーカス位置抽出ポイントＦＰとして抽出された小区画Ｃ１を斜線で示している。
ステップＳ１７において、制御部５７は、標本存在領域Ｍ１上の各ポイントにおける合焦位置（Ｚ座標）を記録されたフォーカスマップを作成する。
詳細には、制御部５７は、顕微鏡コントローラ２０を介して、電動ステージ１３をＸＹ方向に操作し、ステップＳ１６において抽出されたフォーカス位置抽出ポイントＦＰを対物レンズの光軸位置に順次移動させる。続いて、制御部５７は、各フォーカス位置抽出ポイントＦＰに対し、電動ステージ１３をＺ軸方向に移動させながら、ＴＶカメラ３０を介して標本像ＳＰ’を入力させ、合焦評価演算（コントラスト評価）を行うことで、実測による合焦位置を求める。
ここで、合焦評価演算においては、例えば、焦点が合っている場合にはエッジ部の立ち上がりが急峻に立ち上がるという原理に基づき、一次微分フィルタ処理（例えばｓｏｂｅｌフィルタ）が利用される。このため、輝度の変化が乏しいにもかかわらず、フィルタ処理によって抽出されてしまった微細なエッジ部を除去するために、所定の閾値以下のエッジ強度を削除する。このようにして求められたエッジ検出データの総和を合焦評価値として算出し、合焦評価値が最大となるときのＺ座標を合焦位置として決定する。
なお、合焦評価演算を行う領域は、ＴＶカメラ３０を介して入力された標本像ＳＰ’でも良いし、標本像ＳＰ’の中央部のみ、或いは、中央部又は周辺部の複数領域を対象にしても良く、特に限定されない。
次いで、ステップＳ１６において、制御部５７は、フォーカス位置抽出ポイントＦＰとして抽出されなかった小区画Ｃ１について、近傍のフォーカス位置抽出ポイントＦＰにおける実測合焦位置に基づき、補間演算により合焦位置を算出する。
図９は、フォーカスマップの一例を示す図である。図９に示すように、フォーカスマップＭ２は、標本存在領域Ｍ１を分割した各小区画Ｃ１に割り当てられた座標番号（００１，００１）、（００２，００１）、…と、電動ステージ１３の座標情報（ステージ座標）と、合焦評価値とを含む。座標情報は、各小区画Ｃ１に対応するＨＥ染色標本上の領域を、光路Ｌに挿入された高倍対物レンズの撮像視野に合わせたときの電動ステージ１３のＸ軸及びＹ軸方向の座標、並びに、合焦位置を表すＺ軸方向の座標とを含む。このようなフォーカスマップＭ２は、撮像座標記録部５５に格納される。
続くステップＳ１８において、顕微鏡システム１は、標本存在領域Ａ２が写った高解像画像（ＶＳ画像）を作成する。詳細には、顕微鏡コントローラ２０は、フォーカスマップＭ２に登録されているステージ座標（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に電動ステージ１３を順次移動させる。ＴＶカメラ３０は、電動ステージ１３が移動するごとに、各小区画Ｃ１に対応するＨＥ染色標本上の領域を撮像して、画像データをホストシステム５０−１に入力する。ホストシステム５０−１において、制御部５７は、入力された画像データに基づき、互いに隣接する小区画Ｃ１同士の顕微鏡画像を繋ぎ合わせる連結処理を行う。このような電動ステージ１３の移動、画像データの入力、及び顕微鏡画像の連結処理という一連の動作を、フォーカスマップＭ２に登録された全ての小区画Ｃ１に対して繰り返すことで、標本存在領域Ａ２全体が写った広視野で高精細のＶＳ画像が作成される。このようにして作成されたＶＳ画像の画像データは、ＶＳ画像ファイル（図４参照）に格納される。
また、この際に、制御部５７は、図１０に示すように、切片標本ＳＰに関する情報とＶＳ画像ファイルとの対応関係を表すＶＳ画像リスト（ファイル一覧）を作成し、画像データ記録部５４に格納する。ＶＳ画像リストには、切片標本ＳＰの検査ＩＤ、当該切片標本ＳＰを採取した包埋ブロック番号（Ｎｏ．）、染色情報、ＶＳ画像ファイル名等の情報が記録される。このＶＳ画像リストは、後述するように、同一の包埋ブロックから作成されたＶＳ画像を検索する際に使用される。
さらに、ステップＳ１９において、スライド搬送装置６０は、電動ステージ１３上に載置されているスライドガラス標本２を搬出して、該スライド搬送装置６０に返却する。それにより、ＨＥ染色標本のＶＳ画像の作成処理が完了する。
これらのステップＳ１０〜Ｓ１９の一連の動作は、スライド搬送装置６０内に収容されているＨＥ染色標本の全てに対して繰り返される。その後、処理はメインルーチンに戻る。
なお、ＶＳ画像における不連続領域の発生を防ぐために、互いに隣接する小区画Ｃ１の間にオーバーラップ領域（特開平９−２８１４０５号公報参照）を設け、オーバーラップ領域同士を重ねるようにして連結処理（ステップＳ１８）を行っても良い。この場合、ステップＳ１６においては、各小区画Ｃ１のサイズが、高倍対物レンズを介してＴＶカメラ３０に投影される撮像領域からオーバーラップ領域を除いたサイズとなるように、標本存在領域Ｍ１を分割すれば良い。
次に、免疫染色標本のＶＳ画像を作成するステップＳ５について詳しく説明する。図１１は、免疫染色標本のＶＳ画像の作成処理を示すフローチャートである。
ステップＳ４（図５参照）に続くステップＳ２０において、スライド搬送装置６０は、内部に収容されている免疫染色標本を１枚、電動ステージ１３上に搬送する。
続くステップＳ２１〜Ｓ２５における処理は、図７に示すステップＳ１１〜Ｓ１５と対応している。ただし、ステップＳ２１〜Ｓ２５においては、観察対象が免疫染色標本である点がステップＳ１１〜Ｓ１５とは異なっている。
ステップＳ２５に続くステップＳ２６において、制御部５７は、現在観察中の免疫染色標本と同一の包埋ブロックから作成されたＨＥ染色標本と当該免疫染色標本との間で、標本領域の位置ズレ量を算出する。
より詳細には、制御部５７は、ＶＳ画像リスト（図１０参照）を参照し、ステップＳ１１において取得した免疫染色標本の標本情報（検査ＩＤ及び包埋ブロック番号）と同一の標本情報を有するＨＥ染色標本のファイル名を検索し、当該ＨＥ染色標本のＶＳ画像ファイルを取得する。そして、取得したＶＳ画像ファイル内の標本サーチ範囲画像データ部Ｄ２（図４参照）に記録された画像データ（ＨＥ染色標本全体データという）と、観察中の免疫染色標本の標本サーチ範囲内の画像データ（以下、免疫染色標本全体データという）とを比較して、標本位置のズレ量（平行移動量及び回転量）を算出する。
ズレ量は、例えば次のようにして算出される。まず、上記２つの標本全体データの各々を２値化して輪郭抽出を行い、輪郭内の領域を標本領域として、全て塗りつぶす。そして、各標本領域の重心を求め、これら２つの重心座標の差を求める。次に、免疫染色標本全体データにおける標本領域の重心とＨＥ染色標本全体データにおける標本領域の重心とを一致させた状態で、例えば免疫標本全体データの標本領域を、重心を中心にして所定角度単位で時計廻り又は反時計廻りに回転させ、ＨＥ染色標本全体データの標本領域との差分の絶対値が最小になる角度（回転量）を求める。このようにして求めた重心座標の差及び回転量（回転方向を含む）が、電動ステージ１３上における免疫染色標本とＨＥ染色標本との間の位置ズレの関係を表す。
なお、各標本全体データに対して輪郭抽出を行う際には、上述したステップＳ１６と同様に、輝度値や色比（Ｒ／Ｇ、Ｂ／Ｇ）、或いは面積が所定の閾値の範囲外である領域をゴミと判断して除去するとよい。
続くステップＳ２７〜Ｓ３０において、顕微鏡システム１は、ＨＥ染色標本のＶＳ画像ファイルに記録されている注目領域設定情報に従って、各注目領域Ａ３（図６参照）に対応する免疫染色標本上の領域（観察領域）の広視野且つ高精細の顕微鏡画像を取得する。
そのために、まずステップＳ２７において、制御部５７は、ステップＳ２６において求めた位置ズレ量に基づいて、ＨＥ染色標本のＶＳ画像ファイルに記録されている注目領域Ａ３の座標にアフィン変換（平行移動及び回転移動）を施し、注目領域Ａ３の座標値を補正する。この補正後の注目領域を免疫染色標本における観察領域とし、観察領域を含む矩形の領域をスキャン範囲として決定する。
続くステップＳ２８において、制御部５７は、決定されたスキャン範囲内からフォーカス位置抽出ポイントを決定する。図１２は、観察領域を含むスキャン範囲を示す模式図である。制御部５７は、スキャン範囲Ｍ３を格子状の複数の小区画Ｃ２に分割し、これらの小区画Ｃ２のうちから、観察領域Ａ４の形状に応じて抽出した小区画Ｃ２をフォーカス位置抽出ポイントＦＰとして決定する。なお、各小区画Ｃ２の領域サイズは、ステップＳ２５において光路Ｌに挿入された高倍対物レンズを介してＴＶカメラ３０に投影される撮像領域に対応している。また、図１２においては、フォーカス位置抽出ポイントＦＰとして抽出された小区画Ｃ２を斜線で示している。
ここで、一般に、観察領域Ａ４においてフォーカス不良が発生し易い領域としては、観察領域Ａ４の輪郭部が挙げられる。これは、観察領域Ａ４以外の領域（非観察領域Ａ５）における合焦位置（Ｚ座標）の実測値をもとに、合焦位置を予測していることが原因である。このため、本実施の形態１においては、観察領域Ａ４の形状に応じて、フォーカス位置抽出ポイントＦＰを決定している。
具体的には、図１２に示すように、フォーカス演算領域（例えば、ＴＶカメラ３０の撮像領域に対応する小区画Ｃ２の中央３０％の領域）が観察領域Ａ４内に入る条件で、切片標本ＳＰの輪郭部に沿ってフォーカス位置抽出ポイントＦＰを選択する。そして、観察領域Ａ４の内部に向かって、フォーカス位置抽出ポイントＦＰを抽出しながら追加していく。なお、追加されるフォーカス位置抽出ポイントＦＰの抽出方法については、ランダム抽出であっても良いし、規則的に（例えば、６区画おきに）抽出するものであっても良い。また、図１２においては、切片標本ＳＰの輪郭部に沿ってフォーカス位置抽出ポイントＦＰが隣接する場合を例示しているが、観察領域Ａ４が大きく、多数のフォーカス位置抽出ポイントＦＰが必要となる場合には、一旦抽出したフォーカス位置抽出ポイントＦＰを間引くことにより、フォーカス位置抽出ポイントを適切な個数まで削減しても良い。
また、非観察領域Ａ５については、非観察領域Ａ５のうちからフォーカス位置抽出ポイントＦＰを抽出してフォーカス精度を上げるか、或いは、フォーカス位置抽出ポイントＦＰを選択せずに、処理時間の短縮を図るか、いずれを選択しても良い。前者の場合には、フォーカス位置抽出ポイントＦＰの間隔を、観察領域Ａ４内における間隔よりも広く設定することにより、処理時間を短縮しても良い。
続くステップＳ２９において、顕微鏡システム１は、スキャン範囲Ｍ３内のフォーカス位置抽出ポイントＦＰにおける合焦位置（Ｚ座標）を実測する。そして、これらの実測値を用いて、小区画Ｃ２における合焦位置を補間演算することにより、スキャン範囲Ｍ３に関するフォーカスマップ（図９参照）を作成する。フォーカスマップ作成処理の詳細は、ステップＳ２の場合と同様である。ただし、注目領域Ｍ３内の小区画Ｃ２に関する補間演算は、観察領域Ａ４内の近接するフォーカス位置抽出ポイントＦＰにおける実測合焦位置のみを用いて行う。作成されたフォーカスマップは、撮像座標記録部５５（図２参照）に格納される。
続くステップＳ３０において、顕微鏡システム１は、スキャン範囲Ｍ３に対応する免疫染色標本上の領域が写った高解像画像（ＶＳ画像）を作成する。詳細には、顕微鏡コントローラ２０は、ステップＳ２９において作成したフォーカスマップに登録されているステージ座標（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に電動ステージ１３を順次移動させる。ＴＶカメラ３０は、電動ステージ１３が移動するごとに、各小区画Ｃ２に対応する免疫染色標本上の領域を撮像して、画像データをホストシステム５０−１に入力する。ホストシステム５０−１において、制御部５７は、入力された画像データに基づき、互いに隣接する小区画Ｃ２同士の顕微鏡画像を繋ぎ合わせる連結処理を行う。このような電動ステージ１３の移動、画像データの入力、及び顕微鏡画像の連結処理という一連の動作を、フォーカスマップに登録された全ての小区画Ｃ２に対して繰り返すことで、スキャン範囲Ｍ３に対応する広視野で高精細なＶＳ画像が作成される。このようにして作成されたＶＳ画像の画像データは、ＶＳ画像ファイル（図４参照）に格納される。
なお、本実施の形態１においては、観察領域Ａ４より外側の小区画Ｃ２についても高倍率対物レンズにより撮像を行っているが、非観察領域Ａ５のみの小区画Ｃ２については撮像対象外とし、非観察領域Ａ５の高解像画像を作成しなくても良い。
続くステップＳ３１において、制御部５７は、ＨＥ染色標本上で設定された全ての注目領域Ａ３（図６参照）に対して、免疫染色標本上で対応する領域のＶＳ画像作成処理が完了したか否かを判断する。未だＶＳ画像が作成されていない観察領域Ａ４が残っている場合（ステップＳ３１：Ｎｏ）、顕微鏡システム１の動作はステップＳ２７に戻る。
一方、全ての観察領域Ａ４についてＶＳ画像の作成が完了した場合（ステップＳ３１：Ｙｅｓ）、スライド搬送装置６０は、電動ステージ１３上に載置されているスライドガラス標本２を搬出して、該スライド搬送装置６０に返却する（ステップＳ３２）。それにより、免疫染色標本に対するＶＳ画像の作成処理が完了する。
これらのステップＳ２０〜Ｓ３２の一連の動作は、スライド搬送装置６０内に収容されている免疫染色標本の全てに対して繰り返される。その後、処理はメインルーチンに戻る。
次に、免疫染色標本の標的分子の発現量を算出する発現解析ステップＳ６について詳しく説明する。なお、標的分子の発現量算出の具体的な処理については、特開２０１１−１７９９２４号公報も参照されたい。
また、以下の説明においては、免疫染色標本のＶＳ画像が通常のカラー（ＲＧＢ）画像からなる場合について説明するが、免疫染色標本のＶＳ画像の作成処理（ステ ップＳ５）において、光路に配置される光学キューブを切り替えることによりマルチバンド画像の撮像を行い（特開２０１１−１７９９２４号公報参照）、マルチバンド画像からなるＶＳ画像に対して発現解析を行っても良い。
まず、発現量算出部５７６は、免疫染色標本のＶＳ画像を構成する各画素のＲＧＢ値をＨＳＶ値に変換したＨＳＶ画像を作成する。そして、青紫色近傍の色相領域をＨ色素で染まっている領域、茶褐色近傍の色素領域をＤＡＢ色素で染まっている領域として抽出する。
また、発現量算出部５７６は、処理対象の免疫染色標本の標本情報のうち、染色情報を取得する。ここで、染色情報には、例えば、Ｈ＋ＤＡＢ（ＥＲ）、Ｈ＋ＤＡＢ（ＨＥＲ２）というように、当該免疫染色標本の染色に使用した色素と、該色素が染色する標的分子の情報とが含まれている。そこで、発現量算出部５７６は、染色情報から、色素の種類及び標的分子の細胞における発現部位（細胞核、細胞質、細胞膜）を識別する。そして、標的分子の発現部位に応じた陽性細胞率の算出を行う。
例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）、Ｋｉ−６７といった細胞核内タンパクの発現量を求める場合、発現量算出部５７６は、Ｈ色素及びＤＡＢ色素で染まっている領域を対象として細胞核抽出を行う。具体的には、Ｈ色素のみで染まっている細胞核を標的分子の発現が陰性細胞としてカウントし、一方、ＤＡＢ色素のみ、又はＤＡＢ色素及びＨ色素の両方に染まっている細胞核を標的分子の発現が陽性細胞としてカウントする。そして、次式（２）により、陽性細胞の比率Ｐを算出する。
Ｐ＝ＮＰ÷（ＮＮ＋ＮＰ） …（２）
式（１）において、符号ＮＰは陽性細胞数を示し、符号ＮＮは陰性細胞数を示す。
また、ＨＥＲ２といった細胞膜上のタンパクの発現量を求める場合、発現量算出部５７６は、Ｈ色素で染まっている領域を対象として細胞核抽出を行い、ＤＡＢ色素で染まっている領域を細胞膜として抽出する。そして、細胞核と細胞膜との位置関係や、ＤＡＢの発現状況（発現の有無）等に基づいてＨＥＲ２陽性細胞を決定し、陽性細胞率を算出する（参考：特開２０１１−１７９９２４号公報）。
このようにして取得された発現解析の結果（陽性細胞率）は、ＶＳ画像ファイル内の標的分子の発現解析結果データ部Ｄ５（図４参照）に記録され、当該免疫染色標本のＶＳ画像の閲覧時に、ＶＳ画像と共にモニタ５３に表示される。
なお、ＨＥ染色標本上で、高解像画像の生成対象となる注目領域Ａ３を設定する際に（図５のステップＳ３）、腫瘍が大きく注目領域Ａ３が広範囲に及ぶ場合や、注目領域Ａ３内に非腫瘍部が存在する場合がある。そのような場合には、例えば図１３に示すように、注目領域Ａ３の内で発現解析の対象とする発現解析対象領域Ａ６を病理医にさらに指定（限定）させることにより、発現解析の対象部位を腫瘍部等の必要な領域のみに限定しても良い。この場合、ホストシステム５０−１は、病理医が注目領域Ａ３を選択した段階で、所定のメッセージをモニタ５３に表示するなどして、発現解析対象領域Ａ６を併せて指定させると良い。この場合、発現解析に要する時間を短縮することが可能になる。
また、注目領域Ａ３内に間質細胞といった非腫瘍領域が存在する場合には、間質細胞においては細胞核の円形度が低いという特性を利用して、間質細胞を発現解析の演算対象外としても良い。
以上説明したように、実施の形態１によれば、病理組織診断の基本となるＨＥ染色標本による形態診断時に、病理医に腫瘍部等の標的分子の発現解析の対象領域（注目領域）を指定させ、その後は、病理医を介在させることなく、標的分子染色標本内の指定された領域の高解像画像（ＶＳ画像）を作成することができる。従って、通常の病理診断業務フローに即して、効率良く且つ短時間に、病理診断に必要なＶＳ画像を作成することが可能となる。
また、実施の形態１によれば、ＨＥ染色標本の高解像画像をもとに病理医に注目領域を指定させるので、病理医にとっては、低解像の標的分子染色画像を観察する場合と異なり、腫瘍部等を注目領域として適切且つ容易に選択することが可能となる。
また、実施の形態１によれば、病理医の判断により設定された注目領域に基づき、標的分子染色標本のうちの必要な領域についてのみ高解像画像を作成するので、画像ファイル容量を低減することができる。従って、画像データを記憶する記憶装置の記憶容量を従来よりも削減することが可能となる。
また、実施の形態１によれば、標的分子染色標本の高解像画像を作成する際に、ＨＥ染色標本の画像情報を基に、標的分子染色標本のうちの必要部位のみに対して合焦精度を高めるので、効率良く且つ短時間に、高精細な画像を取得することができる。
また、実施の形態１によれば、病理医が予め指定した領域（例えば腫瘍部）における標的分子の発現状況を自動的に解析することができる。従って、従来のようにＶＳ画像の閲覧時に領域指定して標的分子の発現解析を行う場合と異なり、処理時間を短縮することができる。それにより、広範囲の腫瘍部等に対して発現解析を実行することも可能となる。さらに、腫瘍部等の合焦精度が悪い場合には発現解析に支障を来すことがあるが、上述のとおり、本実施の形態１において、標的分子染色標本のＶＳ画像は高精度に合焦されているので、信頼性の高い発現解析を実行することが可能となる。
また、実施の形態１によれば、大量のスライドガラス標本に対して連続バッチ処理的に標的分子染色の発現解析を実行することができるので、分子学的病理検査の効率を向上することが可能となる。
（変形例）
次に、実施の形態１の変形例について説明する。
上記実施の形態１においては、標的分子の発現確認用の標識として免疫染色であるＤＡＢ染色を用いると共に、対比染色としてヘマトキシリン染色を用いた。しかしながら、標的分子の発現確認用の標識として、蛍光染色を行っても良い。
ここで、標的分子を蛍光標識する場合の対比染色（例えば細胞核の染色）としては、一般的に、蛍光色素であるＤＡＰＩが用いられるが、本変形例においては、ＤＡＰＩの替わりに、明視野観察による形態観察が可能な非蛍光又は低量子収率の色素を用いる。例えば、対比染色として細胞核をＨ色素で染色し、エストロゲン受容体（ＥＲ）を認識する抗ＥＲ抗体をＡｌｅｘａ５５５で蛍光標識し、ＨＥＲ２受容体（ＨＥＲ２）を認識する抗ＨＥＲ２抗体をＣｙ５で蛍光標識した多重染色標本を作成する。
なお、対比染色としてＤＡＰＩを使用しない理由は、標本領域の位置ズレ量の補正及びスキャン範囲を決定する際に、偏射照明（暗視野照明）を行うと、標本領域の位置検出精度が低下するからである。
このような多重染色標本（標的分子染色標本）のＶＳ画像を作成する際には、明視野観察により多重染色標本全体の低解像画像を作成（図１１のステップＳ２４）し、対応するＨＥ染色標本の低解像画像との間で標本領域の位置ズレを補正（ステップＳ１６）した後、ＨＥ染色標本上で設定された注目領域に対応する観察領域を含むスキャン範囲を決定（ステップＳ２７）する。そして、スキャン範囲のフォーカスマップを作成（ステップＳ２９）し、顕微鏡装置１０における観察法を蛍光観察に切り替えて、スキャン範囲の高解像画像を作成する（ステップＳ３０）。
以上説明した変形例によれば、標的分子が蛍光標識された標本においても、Ｈ色素による核の染色情報を利用して、スライドガラス上の標本領域を抽出することができる。この際、染色情報を用いるので、スライドガラス上に存在するゴミ等の影響を排除して、標本領域の抽出精度を向上させることが可能となる。それにより、ＨＥ染色標本と標的分子染色標本との間での標本領域の位置ズレを精度よく補正することが可能となる。
ここで、従来においても、例えば乳癌におけるエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）、ＨＥＲ２受容体（ＨＥＲ２）、Ｋｉ−６７といった複数の標的分子の発現をＶＳ画像により可視化する方法として、複数種類の標的分子を互いに異なる蛍光色素で多重標識すると共に、形態観察用の染色を同時に施した多重染色標本を作成し、明視野観察によって腫瘍部等の注目領域を指定し、蛍光観察によって標識分子の発現情報を取得する技術が提案されていた（例えば特開２００９−１４９３９号公報参照）。この場合、必要な病理標本の切片数（即ち、作成するスライドの枚数）を例えば４枚から１枚に削減することができる、細胞レベルで複数の標的分子の発現情報を確認することができるといったメリットがある。しかしながら、上記技術においては、画像生成の過程で病理医の介在が必要となっていた。これに対して、上述した本変形例によれば、ＨＥ染色標本による形態診断時に病理医が注目領域を指定した後は、病理医を介在させることなく、当該注目領域に対応する多重染色標本内の領域が写った高解像画像（ＶＳ画像）を自動で作成することができる。
また、一般には、腫瘍部位の決定はＨＥ染色による形態観察で行われるが、ＨＥ染色と蛍光色素とを同時に標識すると、エオジンの自家蛍光が問題となり、標的分子の発現を正しく検出することができなかった。また、ヘマトキシリンと蛍光色素とを同時に標識した標本においては、ヘマトキシリンが染色した核の情報のみから腫瘍部位を選択することになり、核異型や構造異型が弱い場合に腫瘍部位の選択が不適切になったり、浸潤部位の判定が困難になるなどしていた。これに対して、本変形例においては、対比染色の色素としてヘマトキシリンのみを用いるので、多重染色標本の蛍光観察において、自家蛍光が問題となることはない。また、本変形例によれば、ＨＥ染色標本の画像上で腫瘍部位を選択するので、注目領域を適切に設定することが可能となる。
また、従来、同じ切片標本に対して形態観察及び蛍光観察を行うために、ＨＥ染色を施した標本を撮像した後、脱染色して蛍光標識する技術も知られていた（例えば、特開２００９−１４９３９号公報参照）。しかしながら、この場合、ＨＥ染色及び脱染色といった作業に手間がかかっていた。また、蛍光標識された標本上では、位相差等のコントラスト情報のみに基づいて標本領域を判断することになるため、スライドガラス上のゴミと標本との区別がつかず、標本領域を正確に検出することが困難であった。このため、高解像画像のＶＳ画像を作成すべき注目領域の決定も容易ではなかった。これに対して、本変形例によれば、あるＨＥ染色標本に対して、同一包埋ブロックから採取された別の切片に対して蛍光染色を含む多重染色を施した標本を作成するので、脱染色の作業を省くことができる。また、本変形例によれば、ＨＥ染色標本の画像上で注目領域を指定し、ＨＥ染色標本に対する多重染色標本上の標本領域の位置ズレを補正した上で、指定された注目領域に対応する領域の高精細な画像を作成するので、短時間に効率良く、必要な領域の高解像画像を取得することが可能となる。
また、従来、同一の標本ブロックからＨＥ染色標本と蛍光標識標本とを作成し、ＨＥ染色標本に基づいて注目領域を決定し、この注目領域に基づいて蛍光標識標本から標本領域の抽出及び決定を行う技術も提案されていた（例えば、特開２００９−１４９３９号公報参照）。しかしながら、この場合も、標本領域の抽出及び決定はコントラスト情報のみで行っているため、注目領域の決定に問題が生じるおそれがあった。これに対して、本変形例によれば、画像データを２値化して輪郭抽出することにより標本領域を検出するので、スライドガラス上のゴミ等の影響を受け難くなり、標本領域の抽出精度を向上させることが可能となる。また、本変形例によれば、標本領域の重心座標を用いて、ＨＥ染色標本に対する多重染色標本の標本領域の位置ずれを補正するので、ＨＥ染色標本において指定された注目領域に対応する多重染色標本上の領域を、より正確に特定することが可能となる。
（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２について説明する。
図１４は、本発明の実施の形態２に係る顕微鏡システムが備えるホストシステムの構成を示すブロック図である。なお、顕微鏡システム全体の構成については、実施の形態１と同様である。
図１４に示すように、実施の形態２に係るホストシステム５０−２は、図２に示す制御部５７の代わりに、制御部５８を備える。制御部５８は、制御部５７に対して、合焦評価部５８１をさらに備える。なお、制御部５８以外のホストシステム５０−２の構成は、実施の形態１と同様である。
実施の形態２においては、免疫染色標本のＶＳ画像の作成処理（図５のステップＳ５参照）においてスキャン範囲の高解像画像を作成する際に（図１１のステップＳ３０参照）、各小区画Ｃ２の合焦評価を行い、合焦不良であった場合に顕微鏡画像を再取得することを特徴とする。
図１５は、スキャン範囲の高解像画像を作成する処理の詳細を示すフローチャートである。
ステップＳ２９（図１１参照）に続くステップＳ２０１において、制御部５８は、スキャン範囲のフォーカスマップに登録されているフォーカス位置抽出ポイントにおける合焦評価値の最小値を取得する。この際、観察領域Ａ４（図１２参照）内の小区画Ｃ２における合焦評価値のみを最小値の判断対象とし、非観察領域Ａ５における合焦評価値は判断対象外とする。また、フォーカスマップ内の合焦評価値の最小値が所定の閾値よりも大きい場合には、所定の閾値を最小値として設定しても良い。
続くステップＳ２０２〜Ｓ２１０において、顕微鏡システム１は、フォーカスマップに登録されている全ての小区画Ｃ２に対して、以下の処理を行う。
ステップＳ２０２において、ホストシステム５０−２は、ステップＳ２５（図１１参照）において交換された高倍対物レンズを使用して処理対象の小区画Ｃ２を撮像した顕微鏡画像をＴＶカメラ３０から取得する。
続くステップＳ２０３において、合焦評価部５８１は、処理対象の小区画Ｃ２が観察領域Ａ４に含まれるか否かを判定する。小区画Ｃ２が観察領域Ａ４に含まれない場合（ステップＳ２０３：Ｎｏ）、第２ＶＳ画像作成部５７５は、ステップＳ２０２において取得した顕微鏡画像を隣接する小区画Ｃ２の顕微鏡画像と繋ぎ合わせる連結処理を実行する（ステップＳ２１０）。
一方、処理対象の小区画Ｃ２が観察領域Ａ４に含まれる場合（ステップＳ２０３：Ｙｅｓ）、続いて合焦評価部５８１は、当該小区画Ｃ２がフォーカス位置抽出ポイントＦＰであるか否かを判定する（ステップＳ２０４）。即ち、顕微鏡画像が、実測された合焦位置において撮像されたものであるか否かを判断する。小区画Ｃ２がフォーカス位置抽出ポイントである場合（ステップＳ２０４：Ｙｅｓ）、処理はステップＳ２１０に移行する。
一方、処理対象の小区画Ｃ２がフォーカス位置抽出ポイントでない場合（ステップＳ２０４：Ｎｏ）、合焦評価部５８１は、当該小区画Ｃ２に標本像ＳＰ’が存在するか否か（空洞か）を判定する（ステップＳ２０５）。この判定は、ステップＳ２０２において取得した顕微鏡画像の合焦評価演算領域（例えば、顕微鏡画像の中央３０％の領域）内に、標本像ＳＰ’が写った画素が所定値以上の割合で存在するか否かを判断することにより行われる。例えば、画素値（Ｒ、Ｇ、Ｂ）の各々が所定値（例えば、２１８）以上であって、且つ、画素値の差の絶対値｜Ｒ−Ｇ｜、｜Ｂ−Ｇ｜が所定値（例えば２）以下である場合、標本像ＳＰ’が写った画素であると判断される。
なお、ステップＳ２０２において取得した顕微鏡画像が合焦不良であるために標本像ＳＰ’が検出されないことも考えられる。この場合、図１１に示すステップＳ２４で取得されるスライド全体の低解像画像において、該当する領域を評価することで標本像ＳＰ’の有無の判断を行っても良い。
処理対象の小区画Ｃ２に標本像ＳＰ’が存在しない場合（ステップＳ２０５：Ｎｏ）、処理はステップＳ２１０に移行する。
一方、処理対象の小区画Ｃ２に標本像ＳＰ’が存在する場合（ステップＳ２０５：Ｙｅｓ）、合焦評価部５８１は、取得した顕微鏡画像について合焦評価演算を実行して合焦評価値を算出する（ステップＳ２０６）。
ステップＳ２０７において、合焦評価部５８１は、合焦評価演算により算出された合焦評価値が、フォーカスマップに記録された合焦評価値の最小値よりも小さいか否かを判定する。算出された合焦評価値が記録された最小値以上である場合（ステップＳ２０７：Ｎｏ）、処理はステップＳ２１０に移行する。
一方、算出された合焦評価値が記録された最小値よりも小さい場合（ステップＳ２０７：Ｙｅｓ）、合焦評価部５８１は、処理対象の小区画Ｃ２が合焦不良であると判断する。これに応じて、顕微鏡システム１は、Ｚ軸移動制御を行って合焦位置を探索し、合焦位置における顕微鏡画像を再取得する（ステップＳ２０８）。
続くステップＳ２０９において、合焦評価部５８１は、フォーカスマップから取得した合焦評価値の最小値を更新する。
さらに、ステップＳ２１０において、第２ＶＳ画像作成部５７５は、再取得した顕微鏡画像を隣接する小区画Ｃ２の顕微鏡画像と繋ぎ合わせる連結処理を実行する。
ステップＳ２１１において、制御部５８は、スキャン範囲内の全ての小区画Ｃ２について処理が終了したか否かを判断する。未だ処理されていない小区画Ｃ２が残っている場合（ステップＳ２１１：Ｎｏ）、処理はステップＳ２０２に以降する。一方、全ての小区画Ｃ２に対する処理が終了した場合（ステップＳ２１１：Ｎｏ）、処理はメインルーチンに戻る。
以上説明したように、実施の形態２によれば、観察領域Ａ４内で実測された合焦評価値を参照して、補間演算により合焦位置が算出された小区画Ｃ２の入力画像（顕微鏡画像）の合焦状態を判定する。即ち、実施の形態２によれば、Ｚ軸移動制御を行うことなく合焦評価を行うので、処理時間を短縮することが可能となる。また、合焦不良と判断された場合には、実測された合焦位置における顕微鏡画像を再取得するので、画質の高いＶＳ画像を作成することが可能となる。
また、上述したように、腫瘍部等が写った領域の合焦精度が悪い場合には、標的分子の発現解析において支障を来すことがあるが、本実施の形態２においては、合焦不良が生じた場合には顕微鏡画像を再取得して、高精度に合焦されたＶＳ画像を作成するので、発現解析における信頼性をさらに高めることが可能となる。
（実施の形態３）
次に、本発明の実施の形態３について説明する。
図１６は、本発明の実施の形態３に係る顕微鏡システムが備えるホストシステムの構成を示すブロック図である。なお、顕微鏡システム全体の構成については、実施の形態１と同様である。
図１６に示すように、実施の形態３に係るホストシステム５０−３は、図２に示す制御部５７の代わりに、制御部５９を備える。制御部５９は、制御部５７に対して、条件判定部５９１及び警告制御部５９２をさらに備える。なお、制御部５９以外のホストシステム５０−３の構成は、実施の形態１と同様である。また、条件判定部５９１及び警告制御部５９２を、図１２に示す制御部５８に対して追加しても良い。
条件判定部５９１は、発現量算出部５７６が標的分子の発現量の算出のためにユーザが選択する注目領域Ａ３が所定の条件を満たしているか否かを判定する。
警告制御部５９２は、条件判定部５９１により、ユーザが選択した注目領域Ａ３が所定の条件を満たしていないと判定された場合に、ユーザに対して警告するための制御を、例えばモニタ５３に対して行う。この場合、警告制御部５９２及びモニタ５３が警告手段を構成する。
例えば、腫瘍部におけるＫｉ−６７の発現を検出する場合、少なくとも５００個以上の細胞について発現状況を調べて陽性細胞率を算出することが望まれている。このため、標的分子の陽性細胞率を算出する前提として、所定の細胞数が必要となる。
そこで、条件判定部５９１は、ユーザがＨＥ染色標本のＶＳ画像上で注目領域Ａ３を選択した際に（図５のステップＳ３参照）、ＶＳ画像における青紫色近傍の色相領域を、Ｈ色素により染色された領域として抽出すると共に、当該領域内から細胞核を抽出して、その数をカウントする。
細胞核の抽出は、例えば、次のようにして実行される。まず、公知の輪郭追跡等の手法により、細胞核の候補領域の輪郭を抽出する。そして、抽出された輪郭をもとに、その形態的な特徴を表す形態特徴量を算出する。細胞核の形態特徴量としては、例えば、外接長方形や重心、面積、周囲長、円形度、長径、短径、アスペクト比等が挙げられる。これらの形態特徴量のうちの１つ以上が所定の範囲に含まれる輪郭の領域が、細胞核として抽出される（特開２０１１−１７９９２４号公報参照）。
条件判定部５９１はさらに、カウントされた細胞核数は細胞数に等しいとみなし、細胞数が所定の数（例えば、５００個）に達しない場合に、算出条件が満たされていないと判定する。
これに応じて、警告制御部５９２は、条件判定部５９１によって抽出された細胞数と警告表示とをモニタ５３に表示させ、病理医等のユーザに注目領域の変更を促す。警告表示の内容としては、例えば、「細胞数が足りません。注目領域の選択をやり直してください。」といったメッセージの文字表示であっても良いし、注意喚起のためのマークの表示（点滅表示）であっても良い。或いは、警告制御部５９２は、メッセージの音声読み上げや警告音によりユーザに警告を行うこととしても良い。
以上説明したように、実施の形態３によれば、実際に免疫染色標本の作成及びＶＳ画像の生成処理が実行される前の段階、即ち、病理医が標本の形態観察を行っている段階で、注目領域の選択の妥当性を病理医が認識することができる。従って、必要に応じて注目領域の選択作業を病理医にやり直させることにより、注目領域内の細胞数不足によるＶＳ画像の再取得といった無駄な作業を回避することができる。
（実施の形態４）
次に、本発明の実施の形態４について説明する。
上述した実施の形態１〜３においては、標的分子の発現確認用の標識として免疫染色を行ったが、この他にも、ＩＳＨ（In situ hybridization）法、ＦＩＳＨ（蛍光 In situ hybridization）法、若しくはＣＩＳＨ（Chromogenic In situ hybridization）法による検出プローブによって標本を処理しても良い。本実施の形態４においては、免疫染色以外の方法により標的分子の発現確認用の標識を行う場合について説明する。なお、実施の形態４に係る顕微鏡システム全体の構成については、実施の形態１と同様である。
まず、標的分子の発現確認用の標識として、ＦＩＳＨ（蛍光 In situ hybridization）法による検出プローブを用いる場合について説明する。なお、検出プローブは特に限定されることはなく、例えば、ダコ社の製品であるHER2 FISH pharmDx Kit等の公知のＦＩＳＨ用の検出プローブを用いることができる。
ここで、ＦＩＳＨ法は、細胞核内の遺伝子異常を蛍光観察法により検出する方法であるが、遺伝子の異常を可視化するためには、顕微鏡システムにおいて、４０倍〜１００倍程度の高倍率の対物レンズを用いて標的分子の発現を観察する必要がある。しかしながら、このような高倍率の対物レンズにおいては、通常、被写界深度が浅くなるため、細胞の深さ方向(即ち、対物レンズの焦点深度方向)に偏在する標識プローブからのシグナルの検知が不完全となり、観察精度が悪化するおそれがある。このような場合、観察精度を向上させるためには、焦点深度方向の互いに異なる複数の位置においてそれぞれ合焦された複数枚の高解像画像を生成することが考えられる。しかしながら、注目領域Ａ３の全ての領域について、合焦位置を変えて複数枚の高解像画像を取得すると、画像取得に長時間を要してしまう。
そこで、本実施の形態４においては、高解像画像の生成対象となる注目領域Ａ３内に、発現解析対象領域Ａ６（図１３参照）を病理医にさらに設定させる。そして、発現解析対象領域Ａ６に対しては、合焦位置を変えて複数枚の高解像画像を取得し、注目領域Ａ３内であって発現解析対象領域Ａ６以外の領域に対しては、ユーザ所望の合焦位置における高解像画像を１枚だけ取得する。それにより、発現解析対象領域Ａ６全体について、病理医による観察に必要な高解像画像を短時間で取得することが可能となる。
なお、発現解析対象領域Ａ６の設定タイミング及び方法としては、上述したように、病理医が注目領域Ａ３を選択した段階で、所定のメッセージをモニタ５３に表示するなどして、病理医に発現解析対象領域Ａ６を指定させると良い。
また、発現解析対象領域Ａ６について取得した複数枚の高解像画像の画像データは、互いに合焦位置が異なる画像データとして別々に保存しても良いし、互いに合焦位置が異なる複数の画像を画像処理により合成して全焦点画像を生成し、被写界深度を拡大させた１つの画像を表す画像データとして保存しても良い。
この他、標的分子の発現確認用の標識として、ＩＳＨ法やＣＩＳＨ法を用いる場合においても同様に、病理医が注目領域Ａ３を選択する際に、併せて、注目領域Ａ３内に発現解析対象領域Ａ６を指定させると良い。これらの場合においても、発現解析対象領域Ａ６に対して合焦位置を変えながら複数の画像を取得することにより、病理医による観察に必要な高解像画像を短時間で取得することが可能となる。
本発明は、上述した実施の形態１〜４及び変形例そのままに限定されるものではなく、各実施の形態１〜４及び変形例に開示されている複数の構成要素を適宜組み合わせることによって、種々の発明を形成することができる。例えば、実施の形態に示される全構成要素からいくつかの構成要素を除外して形成してもよい。あるいは、異なる実施の形態に示した構成要素を適宜組み合わせて形成してもよい。
１ 顕微鏡システム
２ スライドガラス標本
１０ 顕微鏡装置
１１ 透過観察用光学系
１１０ 透過照明用光源
１１１ コレクタレンズ
１１２ 透過用フィルタユニット
１１３ 透過シャッタ
１１６ 反射ミラー
１１７ コンデンサ光学素子ユニット
１１８ トップレンズユニット
１２ 落射観察用光学系
１２０ 落射照明用光源
１２１ コレクタレンズ
１２２ 落射用フィルタユニット
１２３ 落射シャッタ
１３ 電動ステージ
１３１、１３２ モータ
１４ レボルバ
１４ａ、１４ｂ 対物レンズ
１５ 光学キューブユニット
１５ａ、１５ｂ 光学キューブ
１６ ビームスプリッタ
１７ 接眼レンズ
２０ 顕微鏡コントローラ
２１ ステージＸ−Ｙ駆動制御部
２２ ステージＺ駆動制御部
３０ ＴＶカメラ
４０ カメラコントローラ
５０−１、５０−２、５０−３ ホストシステム
５１ ビデオボード
５２ 入力部
５３ モニタ
５４ 画像データ記録部
５５ 撮像座標記録部
５６ プログラム記録部
５７、５８、５９ 制御部
５７１ 合焦位置算出部
５７２ 第１ＶＳ画像作成部
５７３ 標本選択部
５７４ 注目領域設定部
５７５ 第２ＶＳ画像作成部
５７６ 発現量算出部
５８１ 合焦評価部
５９１ 条件判定部
５９２ 警告制御部
６０ スライド搬送装置
７０ バーコードリーダ

Claims (12)

  1. 顕微鏡が備える対物レンズに対して標本を前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させ、前記標本を部分的に撮像することにより複数の顕微鏡画像を取得し、該複数の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせてなるバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムにおいて、
    包埋ブロックから薄切された第１の切片に対して明視野による形態観察可能な染色を施して作成された第１の標本について、第１のバーチャルスライド画像を作成する第１バーチャルスライド画像作成手段と、
    前記第１のバーチャルスライド画像における注目領域を設定する注目領域設定手段と、
    前記包埋ブロックから薄切され、前記第１の切片とは異なる第２の切片に対して、標的分子の発現確認用の標識を施して作成された第２の標本のうち、前記注目領域に対応する領域である観察領域について、第２のバーチャルスライド画像を作成する第２バーチャルスライド画像作成手段と、
    を備えることを特徴とする顕微鏡システム。
  2. 前記形態観察可能な染色は、ヘマトキシリン・エオジン染色であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
  3. 前記標的分子の発現確認用の標識は、ＩＳＨ（In situ hybridization）法、ＦＩＳＨ（蛍光 In situ hybridization）法、若しくはＣＩＳＨ（Chromogenic In situ hybridization）法による検出プローブ、又は免疫染色であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
  4. 前記標的分子の発現確認用の標識は、蛍光染色であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
  5. 前記観察領域の形状に応じて合焦位置を算出する合焦位置算出手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  6. 前記観察領域内を部分的に撮像することにより取得された顕微鏡画像に対し、合焦が不良か否かを判定する判定手段をさらに備え、
    前記第２バーチャルスライド画像作成手段は、前記観察領域における合焦が不良と判定された部分について、顕微鏡画像を再取得することを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡システム。
  7. 前記第２のバーチャルスライド画像における標的分子の発現量を算出する発現量算出手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  8. 前記第１及び第２の標本の各々に、少なくとも切片を薄切した包埋ブロックに関する情報及び染色の種類を含む標本情報が付与されており、
    前記標本情報を取得する標本情報取得手段と、
    前記第１の標本から取得された前記標本情報に基づいて、前記第２の標本を選択する標本選択手段と、
    をさらに備えることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  9. 複数の標本を収容可能であり、且つ、該複数の標本の各々を前記対物レンズの視野範囲に順次搬送且つ搬出可能なスライド搬送手段をさらに備え、
    前記スライド搬送手段が搬送した前記複数の標本に対して連続的に処理を行うことを特徴とする請求項８に記載の顕微鏡システム。
  10. 前記注目領域設定手段によって設定された前記注目領域内に存在する細胞数をカウントする細胞数カウント手段と、
    細胞数が所定値に満たない場合にユーザに対して警告する警告手段と、
    をさらに備えることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
  11. 顕微鏡が備える対物レンズに対して標本を前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させ、前記標本を部分的に撮像することにより複数の顕微鏡画像を取得し、該複数の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせてなるバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムが実行する標本画像生成方法において、
    包埋ブロックから薄切された第１の切片に対して明視野による形態観察可能な染色を施して作成された第１の標本について、第１のバーチャルスライド画像を作成する第１バーチャルスライド画像作成ステップと、
    前記第１のバーチャルスライド画像における注目領域を設定する注目領域設定ステップと、
    前記包埋ブロックから薄切され、前記第１の切片とは異なる第２の切片に対して、標的分子の発現確認用の標識を施して作成された第２の標本のうち、前記注目領域に対応する領域である観察領域について、第２のバーチャルスライド画像を作成する第２バーチャルスライド画像作成ステップと、
    を含むことを特徴とする標本画像生成方法。
  12. 顕微鏡が備える対物レンズに対して標本を前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させ、前記標本を部分的に撮像することにより複数の顕微鏡画像を取得し、該複数の顕微鏡画像を相互に繋ぎ合わせてなるバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムが実行する標本画像生成プログラムにおいて、
    包埋ブロックから薄切された第１の切片に対して明視野による形態観察可能な染色を施して作成された第１の標本について、第１のバーチャルスライド画像を作成する第１バーチャルスライド画像作成ステップと、
    前記第１のバーチャルスライド画像における注目領域を設定する注目領域設定ステップと、
    前記包埋ブロックから薄切され、前記第１の切片とは異なる第２の切片に対して、標的分子の発現確認用の標識を施して作成された第２の標本のうち、前記注目領域に対応する領域である観察領域について、第２のバーチャルスライド画像を作成する第２バーチャルスライド画像作成ステップと、
    を前記顕微鏡システムに実行させることを特徴とする標本画像生成プログラム。
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