JP2013242336A - 被検物質検知センサー - Google Patents

Abstract

【課題】電気化学計測値のバラつきが小さい被検物質検知センサーを提供する。
【解決手段】作用電極１と対電極２とが絶縁体３を介して一体化されてなり、作用電極１に被検物質が接触することで出力電圧が変化する被検物質検知センサーであって、作用電極１は、対電極２及び絶縁体３よりも小さく形成されて絶縁体３の表面の一部に設けられ、絶縁体３には作用電極１を囲う周壁４が形成されていて、周壁４が被検物質を収容する溜り部として機能し、作用電極１とは別に参照電極６が設けられており、参照電極６は周壁４に埋設されている。
【選択図】図３

Description

本発明は、対電極と作用電極とが絶縁体を介して一体化されてなり、被検物質の作用電極に対する接触により出力電圧が変化する被検物質検知センサーに係り、とくに、生体中のタンパク質、生理活性物質等を少量の検体量で迅速に検出する被検物質検知センサーに関する。

生体中のタンパク質や、微量成分の生理活性物質等を検出する被検物質検知センサーは、分子認識素子に加えて、トランスデューサーである信号変換素子を有する。分子認識素子は化学反応や物理反応を検出し、検出された信号を信号変換素子が電気信号に変換することで、被検物質が検出される。

このようなセンサーの一つとして、電界効果型トランジスタ（以下、ＦＥＴと呼ぶ）を信号変換素子とするセンサーがあり、イオン選択性膜を有するイオン感応性電界効果型トランジスタを用いるｐＨセンサー、グルコースセンサー等が実用化されている。ＦＥＴを信号変換素子とすることで、既存の半導体製造技術を用いてセンサーの小型化や集積化を実現することができる。

最近では、従来の抗体検査試薬及び装置やウイルス等の抗原検査試薬検査及び装置に比べて迅速且つ簡便に、かつ感度良く動作するセンサーを実現するために、例えば、特許文献１、２に開示されているように、ＦＥＴを信号変換素子とするバイオセンサーがいくつか提案され、さらには、二端子素子を信号変換素子とするセンサーも提案されている（例えば、特許文献３参照）。

このようなセンサーについて、本発明者らは、特許文献４に示すように、先に、構造が単純で、ＦＥＴを信号変換素子とするセンサーに匹敵しうるほどの高感度を有するうえ、構造の自由度の高い、二端子の信号変換素子を有するセンサーを提案した。

しかし、現在実用化されているセンサーは、先に述べたｐＨセンサーやグルコースセンサー等の少数の例があるのみである。言い換えれば、生体中のタンパク質や微量成分の生理活性物質等を検出する被検物質検知センサーであって、分子認識素子と、信号変換素子とを備えるセンサーは、未だ実用化されるに至っていない。

特開２００５−２１８３１０号公報 特開２００４−３４７５３２号公報 特開２００４−１０８８１５号公報 特開２００８−１１６２１０号公報

本発明は、電気化学計測値のバラつきが小さい被検物質検知センサーを提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の第１の構成は、作用電極と対電極とが絶縁体を介して一体化されてなり、作用電極に被検物質が接触することで出力電圧が変化する被検物質検知センサーであって、作用電極は対電極及び絶縁体よりも小さく形成されて絶縁体の表面の一部に設けられており、絶縁体には作用電極を囲う周壁が形成されていて周壁が被検物質を収容する溜り部として機能することを特徴とする。
具体的には、作用電極と対電極とが絶縁体を介して一対化されてなり、作用電極に被検物質が接触することで出力電圧が変化する被検物質検知センサーにおいて、対電極は板状に形成され、絶縁体は対電極の上面を覆っており、作用電極は絶縁体の表面の一部に設けられ、絶縁体には作用電極を囲う周壁が形成され、作用電極と絶縁体との接触面積が対電極と絶縁体との接触面積より小さく設定され、作用電極と対電極とに電源が接続されて構成されている。
また、第１の構成において、周壁は作用電極上に形成されてもよい。具体的には、作用電極と対電極とが絶縁体を介して一体化されてなり、作用電極に被検物質が接触することで出力電圧が変化する被検物質検知センサーであって、作用電極上に形成された壁部を有し、壁部は被検物質を保持するための開口部を有し、作用電極は絶縁体の表面を露出させるための開口部を有し、壁部の開口部内に保持される被検物質は、作用電極の開口部を介して絶縁体の表面に接することを特徴とする。

本発明による第２の構成の被検物質検知センサーは、第１の被検物質検知センサーにおいて、前記作用電極とは別に参照電極が設けられていることを特徴とする。
本発明による第３の構成の被検物質検知センサーは、第２の被検物質検知センサーにおいて、参照電極を前記溜り部の外側に配置したことを特徴とする。
本発明による第４の構成の被検物質検知センサーは、第２の被検物質検知センサーにおいて、参照電極を、前記溜り部を形成する周壁内に埋没して設けたことを特徴とする。
本発明による第５の構成の被検物質検知センサーは、第２の被検物質検知センサーにおいて、参照電極を、溜り部内に配置したことを特徴とする。

本発明による第６の構成の被検物質検知センサーは、第１から第５の構成の被検物質検知センサーの何れかにおいて、作用電極を複数個設け、個々の作用電極にそれぞれ前記溜り部を設けたことを特徴とする。
本発明による第７の構成の被検物質検知センサーは、第１から第６の構成の被検物質検知センサーの何れかにおいて、一つの溜り部内に複数の作用電極を配置したことを特徴とする。
本発明による第８の構成の被検物質検知センサーは、第１から第７の構成の被検物質検知センサーの何れかにおいて、溜り部を、作用電極の安定作用を補償する所定量の被検物質を貯留することができる。
本発明による第９の構成の被検物質検知センサーは、第１から第８の構成の被検物質検知センサーの何れかにおいて、前記溜り部を形成する周壁に対して撥水性を付与したことを特徴とする。
本発明による第１０の被検物質検知センサーは、第１から第８の構成の被検物質検知センサーの何れかにおいて、前記溜り部を形成する周壁に対して撥油性を付与したことを特徴とする。

本発明により、従来に比べ、高精度で電圧が得られるので、被検物質に対して安定した電気化学計測データが得られることとなる。
このことは、本センサーの新たな可能性を開くものであり、従来では分析不可能であった物質の相違も電気化学的に分析可能になるものと期待される。
また、第２の構成の被検物質検知センサーから第５の構成の被検物質検知センサーでは、電極上に分子が付着し、それぞれの電位がずれてしまえば、真の電位を決定することができないことを防止するために、基準としてアースの役割をする、つまり電位が変化しない参照電極を設けている。これにより、両電極の電位を安定して決定できる。
また、この参照電極は、抗原抗体反応の経時的変化を観測するために作用電極に一定の電位を与えた場合、表面の抗体に抗原が反応し始め、表面の電界が変化したときなどにも有用である。
その中でも、第４の構成の被検物質検知センサーに示すように、溜り部を構成する周壁内に埋没してすることで参照電極の汚れを完全に回避することができる。

さらに、第６の構成の被検物質検知センサーのように、複数の作用電極のそれぞれに溜り部を設けることで、上記利点に加え、多数のサンプルを同時に処理できる。

また、第７の構成の被検物質検知センサーのようにすることで、不均一な被検物質であってもその平均的な値を検出することができるし、一部の作用電極を参照電極として機能させることもでき、作用電極とは別途の参照電極を特別に設ける必要がなくなる。
さらに、第９の構成の被検物質検知センサーでは親水性の被検物質が周壁を伝って上昇することがなくなり、第１０の構成の被検物質検知センサーでは親油性の被検物質が周壁を伝って上昇することがなくなるので、溜り部からの漏れ出しを阻止することとなる。特に、溜り部の容量が小さいほど、この漏れ出し阻止の効果は安定した検知データを得る上で有用となる。

（ａ）は本発明の実施形態に係る溜り部中に作用電極を有する単セル被検物質検知センサーの平面図、（ｂ）は（ａ）中に示した破断面における縦断面図である。 図１の単セル被検物質検知センサーに配線と電流計と電圧計とを配した接続例を示す図である。 本発明の実施形態に係る、溜り部中に作用電極のほか参照電極を設けた単セル被検物質検知センサーの縦断面図である。 本発明の実施形態に係る、溜り部外に参照電極を設けた単セル被検物質検知センサーの縦断面図である。 本発明の実施形態に係る、周壁中に参照電極を埋め込んで設けた単セル被検物質検知センサーの縦断面図である。 本発明の実施形態に係る、溜り部中に作用電極及び参照電極を設け、作用電極と参照電極とは塩橋を形成できる周壁で隔離されている単セル被検物質検知センサーの縦断面図である。 本発明の実施形態に係る、溜り部中に作用電極及び参照電極を設け、その作用電極と参照電極とは周壁で完全に隔離されている単セル被検物質検知センサーの縦断面図である。 図７で示した単セル被検物質検知センサーに配線と電流計と電圧計とを配した接続例を示す図である。 （ａ）はスダレ型形状の作用電極又は参照電極を示す平面図、（ｂ）は（ａ）の縦断面図である。 （ａ）はドーナツ型形状の作用電極又は参照電極を示す平面図、（ｂ）は（ａ）の縦断面図である。 （ａ）は格子型形状の作用電極又は参照電極を示す平面図、（ｂ）は（ａ）の縦断面図である。 基板、絶縁膜、電極及びフォトレジストでつくられる周壁の構築を示す説明図である。 本発明の実施形態に係る、単セル被検物質検知センサーを含むパッケージの縦断面図である。 図１３のパッケージにソケットが付いたユニットの縦断面図である。 図１４のパッケージ及びソケットに囲いが設けられ、更に取外し自在のカバーがセットされた単セル被検物質検知センサー装置を示す図である。 本発明の実施形態に係る、セルの数を８個とした多セル式の被検物質検知センサーの平面図である。 本発明の実施形態に係る被検物質検知センサーの反応場を表す説明図である。 従来の二端子信号変換素子を有するセンサーの反応場を表す説明図である。 出力電圧の抗原濃度依存性を示すグラフであって、■は抗体存在下における反応を、◆は抗体非存在下における反応を示す。

以下、添付図面を参照しながら、本発明を更に詳しく説明する。
図１（ａ）は本発明の第１実施形態に係る被検物質検知センサー１００を示す平面図、図１（ｂ）はその断面図である。また、図２は図１で示した単セル被検物質検知センサー１００に配線と、電流計と、電圧計と、電源と、を配した接続例を示す図である。
被検物質検知センサー１００は、作用電極１と、対電極２と、絶縁体３と、周壁４と、を備えている。以下、これらの構成で成るものを、被検物質検知センサー本体部と呼ぶ場合がある。

対電極２は、半導体又は導電体としての機能を持つ材質で板状体に形成されている。このように板状体に形成することで自立保形性を備えることができる。これによりセンサー全体を自立保形するのに有用である。半導体物質としては、シリコン、ゲルマニウム等のＩＶ族元素、砒化ガリウム、リン化インジウム等のＩＩＩ−Ｖ化合物、テルル化亜鉛等のル等が一般に知られており、いずれも下記の実施例と同様に用いることができる。板状の厚さは、通常は０．１ｍｍ〜１．０ｍｍであることが好ましく、０．３〜０．５ｍｍが更に好ましい。本実施形態で対電極２はシリコン基板で構成されている。

絶縁体３は、作用電極１と対電極２とを絶縁する部材である。絶縁体３としては、酸化シリコン、窒化シリコン、酸化アルミニウム、酸化チタン等の無機化合物、あるいはアクリル樹脂、ポリイミド等の有機化合物等が一般に知られており、いずれも下記実施例と同様に用いることができる。無機物質を絶縁体３として用いる場合は、蒸着等の方法で膜状にして前記対電極２の表面に形成することができるが、有機物質ではそのフィルムを対電極２の表面に張り付けるなどして一体化することができる。
絶縁体３の表面には、水酸基、アミノ基、カルボキシル基等の官能基が導入されていてもよい。
絶縁体膜表面に抗体などを固定化するとき、予め官能基を表面に結合させておくことにより、これら官能基に抗体を結合させ、より安定な固定化を実現したり、あるいは抗体を配向させたりすることが可能となる。
絶縁体３の厚さは、通常１０〜１０００ｎｍが好ましく、２０〜５００ｎｍが更に好ましい。絶縁体３が薄すぎるとトンネル電流が流れる恐れがあり、絶縁体３が厚すぎると感度が低下する恐れがある。
本実施形態では、図１（ｂ）に示すように、絶縁体３は対電極２の上面全体を覆うように、本例では略同じ面積で形成されている。

作用電極１は、対電極２に電圧を印加する電極であり、絶縁体３を挟んで対電極２と一体化されている。本実施形態に係る被検物質検知センサー１００では、作用電極１は対電極２の形状と非対称に形成されると共に対電極２の材質も相違する。具体的には、作用電極１は対電極２の上面及びそれを覆う絶縁体３よりもサイズが小さく設定、つまり作用電極１は絶縁体３の一部だけを覆うように構成されている。これにより、絶縁体３の表面は部分的に露呈している。作用電極１と絶縁体３との接触面積は対電極２と絶縁体３との接触面積より小さく設定されている。作用電極１の材質としては、金、白金、チタン、アルミニウム等の金属が好ましく用いられ、あるいは導電性プラスチック等を用いることもできる。
作用電極１の形状は、サンプル液の単位体積あたりの接触面積が大きくなるようにすることが好ましい。そうすれば、作用電極がサンプル液の誘電率等の影響を受けやすくなり、サンプル液に含まれる被検物質の濃度を感度良く検知できるからである。
また、サンプル液の単位体積あたりの接触面積を大きくするためには、例えば、作用電極１の形状を多数の開口部を有する形状とすればよい。多数の開口部を有する形状の例には、図９に示すスダレ形、図１０に示す同心円形もしくはドーナツ形、図１１に示す格子形等がある。

図９に示したような金属でなるスダレ形状の作用電極の場合、その金属の各々の櫛の幅は、１０μｍ〜数百μｍ程度の細さが好ましい。櫛の幅がこの程度に細いと、電極の開口部面積を広げることができるので、必要に応じて、当該開口部領域の絶縁膜に被検物質認識分子を多く結合させることができる。一方、櫛の幅が１０μｍ未満に細すぎると、作用電極から薄膜状のサンプル液に流れる電流値が減少して、電極としての効果を示しにくくなる。これは、作用電極下の電界の構造が“面”から“線”に変わることにより、シリコン基板や絶縁膜に垂直な電気力線が作用電極下で放射状に分散し、充分に高い電界を得ることができなくなるためと考えられる。

また、金属でなるスダレ形状の作用電極の場合、作用電極間の間隔、すなわち、櫛の間の間隔は１００〜２００μｍ程度が好ましい。必要に応じて、当該開口部領域の絶縁膜に被検物質認識分子を多く結合させるためであり、また、十分に広い反応場を提供するためである。

また、作用電極の高さは、サンプル液の単位体積あたりの作用電極の有効接触面積を大きくすることを考えると、０．１μｍ〜数１００μｍ程度が好ましい。

本実施形態の被検物質検知センサー１００は、作用電極１の全体若しくは一部を囲う周壁４を備えている。周壁４は絶縁体３の表面に形成されている。この周壁４と絶縁体３とで溜り部１１が画成され、この溜り部１１はサンプル液を収容する容器として機能する。

周壁の表面性状としては、被検物質の性状に反発するようにするのが望ましい、被検物質が親水性である場合は、撥水性とするのが好ましく、また、被検物質が親油性である場合は、撥油性とするのが好ましい。これは、周壁を越えて溜り部１１の外へ液状の被検物質を流出させないようにするためである。そのような周壁の材質としては、例えば、クラリアントジャパン製ＡＺ５２１４Ｅ等のフォトレジストやＰＩＱ等のポリイミド樹脂などの撥水性樹脂や、テフロン（登録商標）を代表例とするフッ素系樹脂などが適宜使用可能である。なお、このような樹脂を構成材料ではなく周壁表面のコート剤として用いることも可能である。

また、溜り部１１に溜まった被検物質の深さは、できるだけ均一とするのが安定したデータを得る上で好ましいので、その底部となる絶縁体３の表面を平坦とするのみならず、周壁４の高さも一定とするのが望ましい。
溜り部１１の収容量は、被検物質の電気的な特性により定められるものであるが、下記の実施例のような生体材料の検知に当たっては、０．００１〜２５μＬ（マイクロリットル）が好ましく、更には０．１μＬ〜２．０μＬが好ましい。

また、周壁の高さは、作用電極１の高さより高くして、貯留された被検物質により前記作用電極の上面にも被さるようにするのが好ましく、通常は１μｍ〜２ｍｍから選ばれる一定高さが好ましく、更には２μｍ〜１０μｍから選ばれる一定高さが好ましい。

周壁と絶縁膜とで囲われた空間が溜り部１１となり、ここに所定量のサンプル液を保持することができる。周壁は撥水性部材である場合、サンプル液、通常は水溶液が溜り部１１から上に突出するように盛り上がるが、通常は溜り部外へ流出することはない。
前記溜り部１１の平面視形状は特に制限されないが、製造の容易性からすれば、通常は、方形（長方形を含む）又は円形（楕円形を含む）が好ましい。方形の場合の一辺長さ又は円形の場合の直径は、取扱いの容易さ、反応場の広さ、必要なサンプル液量等を考えると、２〜４ｍｍ程度が好ましい。

本発明における被検物質検知センサー１００には、必要に応じて、絶縁膜上に作用電極１とは別の参照電極６を設けてもよい。参照電極６は、図３に示すように溜り部１１中に設けてもよく、図４に示すように溜り部１１中に設けてもよい。また、図５に示すように参照電極６を周壁４中に埋め込んでもよい。また、図６に示すように、溜り部１１中に作用電極１及び参照電極６を設け、作用電極１と参照電極６とは塩橋７を形成できる周壁４’によって隔離してもよい。また、図７に示すように、溜り部１１中に作用電極１及び参照電極６を設け、その作用電極１と参照電極６とを周壁４で完全に隔離してもよい。図８は、図７で示した単セル被検物質検知センサー本体部に配線と電流計と電圧計とを配した接続例を示す図である。図８中の１８はポテンシオスタットである。

本発明の被検物質検知センサー１００は、公知の半導体製造技術、すなわち、電子ビームリソグラフィやフォトリソグラフィ等によって製造できる。シリコン等よりなる基板状の対電極２、つまりシリコン基板の上表面に絶縁体３を形成して、この絶縁体３の上表面に所望のパターンの作用電極３及び／又は参照電極６（金属）を形成する。作用電極３及び／又は参照電極６の周囲に所望のパターンの周壁４を形成して溜り部１１とする。図１２は、対電極２、絶縁体３、作用電極１及びフォトレジストでつくられる周壁４の構築を示している。対電極２、絶縁体３、作用電極１及び周壁４は実際には互いに密着している。

前述の図１〜図１１の被検物質検知センサー１００では、作用電極１の周囲に所望のパターンの周壁４を形成して溜り部１１としているが、これらの周壁４に代えて、本実施形態に係る被検物質検知センサー１００は図１２に示すように構成されてもよい。図１２に示す構成例では、作用電極１の上に周壁（前述の周壁４と同じ材料であるが、配置位置が異なるため、以下、壁部４Ａと呼ぶ。）が形成されており、この壁部４Ａが試料を保持するための開口部４Ｂを有する。この開口部４Ｂ領域の下側に配設される作用電極１の領域に、絶縁体３の表面を露出させるための開口部１Ａが形成されている。このため、壁部４Ａの開口部４Ｂ内に保持される試料液は、作用電極１の開口部１Ａを介して、絶縁体３の表面に接する。作用電極１の開口部１Ａの形状や数は、図１２に限定されるものではなく、例えば、図９に示すスダレ形、図１０に示す同心円形もしくはドーナツ形、図１１に示す格子形等であってもよい。
作用電極１上に形成される壁部４Ａや作用電極１まわりに形成される周壁４は、開口全体を覆う形状の他、例えば壁の一部が切り欠かれて平面視Ｃ字型に形成されていてもよい。

こうして得られた被検物質検知センサー１００を用いて、単セル被検物質検知センサー本体部を含むパッケージ（図１３参照）１１０、そのパッケージ１１０にソケット１４が付いたユニット（図１４参照）１２０、更には、そのユニット１２０に囲い１５を設け、更に取外し自在の、例えば透明なカバー１６がセットされた単セル被検物質検知センサー装置（図１５参照）１３０を組み立てることができる。
具体的には、図１３に示すパッケージ１１０では、ガラスエポキシ基板１０上に対電極２が設けられている。この対電極２上には電極パッド８Ａと絶縁体３とが形成されている。電極パッド８Ａは電極パッド８Ｂにボンディングワイヤ９Ａを介して接続されている。電極パッド８Ｂはガラスエポキシ基板１０を貫通して取り付けられている。絶縁体３上には、作用電極１とそれを囲う周壁４とが形成されている。作用電極１は、絶縁体３上に形成された電極パッド８Ｃにボンディングワイヤ９Ｂを介して接続されている。電極パッド８Ｃは、ガラスエポキシ基板１０を貫通して取り付けられた電極パッド８Ｄにボンディングワイヤ９Ｃを介して接続されている。
図１４に示すユニット１２０では、図１３に示すパッケージ１１０が固定台５０の上面に固定されている。固定台５０には、電極パッド８Ｂ及び８Ｄに対応した位置に固定台５０を貫通する穴５１が形成されている。この固定台５０の下方には複数のばね１３を介してベース１４が取り付けられている。ばね１３はベース１４から固定台５０を引き離すように付勢されている。ベース１４には上面から上方へピン状電極１２，１２が突出している。これらのピン状電極１２，１２は固定台５０の穴５１に差し込まれており、ばね１３の付勢力に抗して、固定台５０をベース側へ押し付けるとピン状電極１２，１２が電極パッド８Ｂ，８Ｄに接触する。これにより、図示省略する電源装置からの電力が電極パッド８Ｂ，８Ｄを介して被検物質検知センサー１００に供給される。

以上説明した本発明の実施形態に係る被検物質検知センサー１００では、作用電極１から出ている電気力線のほとんどは絶縁体膜である絶縁体３を通してシリコン基板でなる対電極２に入り込み、いわば作用電極の洩れ電場が検出に寄与することできる。
ここで、図１７は本発明に係る被検物質検知センサー１００の反応場Ｒの説明図であり、従来の二端子信号変換素子を有するセンサーの反応場Ｒが図１８に示すように作用電極の上に限られていたのに対して、本発明に係る被検物質検知センサー１００での反応場Ｒは、被検物質に接する作用電極側面から出た電気力線Ａのほとんどが作用電極１まわりの絶縁体３を通して対電極２に入り込むように、広く構成される。このように、被検物質検知センサー１００によれば、作用電極１まわりの絶縁体膜の広く平坦な領域に一様な電界を印加することができる。
これにより、被検物質検知センサー１００によれば従来に比べ高精度で同様な被検物質に対しての電圧が得られるので、安定した電気化学計測データが得られることとなる。

以上の説明は、一の対電極２上に配置される作用電極１の数を一としたが、作用電極１の数は多数であっても構わない。図１６は、複数の作用電極１と、それぞれの作用電極１上に溜り部１１とが一の対電極２上に設けられる多セル被検物質検知センサーを示す。例として、セルの数が８個の多セル被検物質検知センサー１００を示している。この場合、ＰＮ接合などを用いて各作用電極間を電気的に分離して、それぞれが独立して検知データを送出できるようにすることが好ましい。

また、本発明の被検物質検知センサー１００の溜り部中の絶縁体３には、ヘテロジーニアス法によって抗体や酵素等の被検物質認識分子を予め結合されていてもよく、あるいは、これら被検物質認識分子を結合させることなく、ホモジニアス法として溶液反応に用いてもよい。被検物質認識分子を結合させることで、特定のタンパク質や化学物質などを特異的に検出することができ、バイオセンサーとして用いることができる。

図１６に示したような８セル集積型被検物質検知センサー（Ｔ０００５、実施例１）を製作した。対電極２としては片面に膜厚０．３μｍの絶縁体３であるＳｉＯ２膜を形成したシリコン基板を用いた。シリコン基板の大きさは１５ｍｍ角、厚みは５５０μｍである。作用電極１としては厚み０．７７μｍのスダレ状金電極（図１２参照）を用い、溜り部形成用の周壁４としてはフォトレジストレジスト（クラリアントジャパン製ＡＺ５２１４Ｅ）を用いた。フォトレジストの厚みは２μｍであり、溜り部の直径は２ｍｍである。なお、比較としては、溜り部１１を持たない８セル集積型被検物質検知センサー（Ｔ００２０、比較例１）を製作した。
本発明の被検物質検知センサー（Ｔ０００５）と比較用センサー（Ｔ００２０）の動作特性を調べた。それぞれのセンサーチップを図２に準じて接続して動作特性を調べた。ただし、電源は交流電源としてファンクションジェネレータを用い、電流計の代わりにオシロスコープを用いた。
それぞれのセンサーの反応場に超純水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び血清を各々、マイクロピペットで一定量、例えば１μＬを滴下し、出力電圧の最大値を比較した。ファンクションジェネレータを用いて電圧５０ｍＶ、周波数１００Ｈｚの正弦波を入力し、その出力電圧をオシロスコープを用いて計測した。オシロスコープの出力電圧は１６周期の平均値で表示し、その最大値を自動測定モードで取得した。電圧値の最小単位は４ｍＶである。得られたデータを表１にまとめた。ファンクションジェネレータとして岩通計測株式会社製ファンクションジェネレータＳＧ−４１０４を用い、オシロスコープとして岩通計測株式会社製デジタルオシロスコープＤＳ−５１０２を用いた。

サンプル滴下前は両センサーとも標準偏差０．０ｍＶを示し、反応場の均一性が示されている。超純水を滴下したとき両センサーの間に顕著な差は見られなかったが、ＰＢＳ、血清を滴下した場合には両センサー間の差は大きかった。血清を滴下した場合、比較例１では標準偏差が３．９ｍＶであるのに対して、実施例１では２ｍＶで、比較例１に比べてバラツキが約半分に小さくなっている。さらに、ＰＢＳの場合には比較例１では標準偏差が５．８ｍＶであるのに対して、実施例１では１．３ｍＶで、比較例１に比べてバラツキが約１／４に小さくなっている。
出力電圧値のバラツキに大きな差がある要因の一つとして、溜り部１１があるとサンプルがセル底部の反応場に接する面積が一定であり、溜り部１１がない場合には反応場に接する面積が一定とならないことが考えられる。また、一方で、超純水の場合には、高い表面張力により、溶液が広がらず反応場に接する面積が一定に保たれやすいため、両センサーともに出力電圧値のバラツキが小さかったと推定している。また、溜り部をもたない比較センサーの場合、溜り部をもつ実施例１に比べて出力電圧の平均値が超純水滴下で２．５ｍＶ、ＰＢＳ滴下で４ｍＶ及び血清滴下で５ｍＶだけ増大していた。比較センサーの場合は、標準偏差の大きさに加えて、システマティックエラーが含まれていると考えられる。
なお、後述の実施例２では溶媒としてＰＢＳを用いたが、セルを持たない比較例１では、ＰＢＳを用いた場合の標準偏差が５．８ｍＶで、グラフ上の最小目盛、つまり２ｍＶを大きく上回る（図１９参照）ため、これを抗原抗体反応の高感度検出に使用することは難しい。

（ホモジニアス法、交流計測）
実施例１に示す被検物質検知センサーとして８セル集積型被検物質検知センサーを用い、特定のタンパク質であるα−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）をホモジニアス法と交流計測とで検知と測定とを行った。手順は次の通り。
（１）濃度１００ｎｇ／ｍＬの抗ＡＦＰ（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）抗体のＰＢＳ希釈液を、４本の試験管にそれぞれ５μＬずつ入れた。このようにして抗体含有の試験管を用意した。
（２）４本の試験管に、ＡＦＰを含まないＰＢＳをそれぞれ５μＬずつ入れた。このようにして抗体非含有の試験管を用意した。
（３）濃度０．０、１．６、６．２５、２５ｎｇ／ｍＬのＡＦＰのＰＢＳ希釈液５μＬを上記各シリーズの試験管、つまり抗体含有の試験管と抗体非含有の試験管とに滴下し、攪拌した。その結果、次の８種類の反応液を含む試験管が得られる。
・サンプルＡ：ＡＦＰ抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）５μＬ＋ＡＦＰ抗原（０ｎｇ／ｍＬ）（ＰＢＳ）５μＬ
・サンプルＢ：ＡＦＰ抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）５μＬ＋ＡＦＰ抗原（１．６ｎｇ／ｍＬ）５μＬ
・サンプルＣ：ＡＦＰ抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）５μＬ＋ＡＦＰ抗原（６．２５ｎｇ／ｍＬ）５μＬ
・サンプルＤ：ＡＦＰ抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）５μＬ＋ＡＦＰ抗原（２５ｎｇ／ｍＬ）５μＬ
・サンプルＥ：ＰＢＳ ５μＬ＋ＡＦＰ抗原（０ｎｇ／ｍＬ）（ＰＢＳ）５μＬ
・サンプルＦ：ＰＢＳ ５μＬ＋ＡＦＰ抗原（１．６ｎｇ／ｍＬ）５μＬ
・サンプルＧ：ＰＢＳ ５μＬ＋ＡＦＰ抗原（６．２５ｎｇ／ｍＬ）５μＬ
・サンプルＨ：ＰＢＳ ５μＬ＋ＡＦＰ抗原（２５ｎｇ／ｍＬ）５μＬ
（４）上記各試験管を密閉し、室温で一昼夜保存した。
（５）上記８種類の反応液を１チップ上の８個のセルに各々０．８５μＬずつ滴下した。（６）電極間に振幅１０Ｖ、周波数２０Ｈｚの正弦波の電圧を与え、濃度の異なるセルごとに出力電圧を継続的に計測した。
（７）同様の実験を、別の８セル集積型被検物質検知センサーを３つ用いて実行し、平均値を取った。

抗体が存在した場合及び抗体が存在しない場合の、抗原濃度に応じる出力電圧の最大値、すなわち平均値の結果を、次の表２に示す。

表２の結果を、グラフにプロットしたものが図１９である。図中の■は抗原のみを含む系を示し、◆は抗原と抗体とを含む系を示す。抗原のみを含む系ではより一定値に近い電圧特性を示す一方で、抗原と抗体とを含む系では抗原濃度の増大に呼応して、出力電圧が低下していることが分かる。これは、抗原抗体双方を含む系の電気特性が抗原抗体反応によるものと考えられる。

なお、この実施例では、被検物質検知センサーの絶縁体３に予め抗体を結合させていないホモジニアス法で行なったが、被検物質検知センサーの絶縁体３に予め抗体を結合させたテロジニアス法を行なうこともでき、また、交流計測に代えて直流計測でも可能である。

図３〜図７は、参照電極の配置に関する例を示したものである。上記のセンサーの製造手順は、すでに説明した内容と同じであるから、ここでは説明を省略する。
図３には、溜り部１１の内部に作用電極１のほか参照電極６を設けた構造を示した。作用電極１と対電極２の二つの電極では両者の電位の差を決定することはできても、電極上に分子が付着し、それぞれの電位、特に基板上の電極電位がずれてしまえば、真の電位を決定することはできない。この為、基準としてアースの役割をする、つまり電位が変化しない参照電極６を用意すれば両電極の電位を決定することができる。
また、抗原抗体反応の経時的変化を観測したいとき、作用電極１に一定の電位を与える場合、表面の抗体に抗原が反応し始め、表面の電界が変化したときなどに有用である。なお、配線は図８と同様である。

図４には、溜り部１１の外側に参照電極６を設けた構造を示した。
電気化学セルにおける参照電極１の接地位置は作用電極１と対電極２と同じセル内とする。図４、５、７、８のような構造では通常の電気化学的意味の参照電極として役割を果たすことができない。しかし、被検物質検知センサーでは、基板上の作用電極１や参照電極６から出ている電気力線のほとんどは絶縁体膜を通して基板に入り込む。いわば作用電極１の洩れ電場が検出に寄与する。この為、外部に参照電極６を曝しても、対電極２−参照電極６間の電位差は一定に保たれ、参照電極６と作用電極１の電位差を計測することにより、参照電極６の電位を決定することができる。

図５には、周壁４に参照電極６を埋設した構造を示す。
図４と同様な理由で参照電極６として機能するが、図４では参照電極６を露出してあるのに比べて図５では参照電極６を埋設することにより、参照電極６を防護することができた。露出してある場合には、図１６のように複数ある電極の内任意の電極を参照電極６として用いることが可能となるが、溜り部１１のサンプルや埃により参照電極６が汚れる可能性がある。これを避ける為、予め参照電極６に特化した電極を埋設することにより、安定した電位計測が可能となる。

図６には、溜り部中に作用電極及び参照電極を設け、作用電極と参照電極とは隔壁、すなわち塩橋７で隔離されている構造を示す。
被検物質は主としてタンパク質になり、抗原抗体反応中の荷電状態は、通常問題視されない。しかし、発明者の経験から、イオン性が高く帯電しやすい被検物質、例えば、カルシウムを配位するカルモジュリンなどでは高感度が得られる傾向があるが、帯電している可能性がある。こうしたサンプルについては塩橋を用いてイオン濃度をコントロールすることにより、安定した反応が得られる可能性がある。将来、一検体他項目の検出をするときにイオン交換膜を反応場間に設けることにより、被検物質の交差をある程度回避できると考えられる。
カルモジュリンの場合にはカルシウムイオンの交換膜を設けることが効果的と考える。被検物質にしたがって交換膜を準備する必要がある。一検体他項目検出において、複数の被検物質の大きさが異なる場合には塩橋の大きさや直径を被検物質の大きさに合わせ、選択的に塩橋を通過させることが考えられる。

図７には、溜り部１１中に作用電極１及び参照電極６を設け、その作用電極１と参照電極６とは周壁４で完全に隔離されている構造を示す。この場合、参照電極６として機能するが、図７では参照電極６を接地した溜り部１１には抗体のみを収容し、作用電極１側の溜り部１１には同量の抗体に加えて被検物質の抗原を滴下する。これにより、抗原の量、抗原抗体反応の進行に伴う溶液の誘電率の変化を参照電極と作用電極の電位差により、決定することが可能となる。

１：作用電極
２：対電極
３：絶縁体
４、４’：周壁
５：試料液
６：参照電極
７：隔壁
８Ａ〜８Ｄ：電極パッド
９Ａ〜９Ｃ：ボンディングワイヤ
１０：ガラスエポキシ基板
１１：溜り部
１２：ピン状電極
１３：ばね
１４：ソケット
１５：囲い
１６：カバー
１７：開口部
１８：ポテンシオスタット
２１：作用電極
２２：対電極
２３：絶縁体
２４：周壁
２５：試料液
１００：被検物質検知センサー
１１０：パッケージ
１２０：ユニット
１３０：被検物質検知センサー装置
Ｒ：反応場

Claims (7)

1. 作用電極と対電極とが絶縁体を介して一体化されてなり、前記作用電極に被検物質が接触することで出力電圧が変化する被検物質検知センサーであって、
   前記作用電極は、前記対電極及び前記絶縁体よりも小さく形成されて、前記絶縁体の表面の一部に設けられており、
   前記絶縁体には前記作用電極を囲う周壁が形成されていて前記周壁が被検物質を収容する溜り部として機能し、
   前記作用電極とは別に参照電極が設けられており、前記参照電極が前記周壁に埋設されていることを特徴とする被検物質検知センサー。
2. 作用電極と対電極とが絶縁体を介して一体化されてなり、前記作用電極と前記対電極とには電源が接続されて前記作用電極に被検物質が接触することで出力電圧が変化する被検物質検知センサーであって、
   前記対電極は板状に形成され、
   前記絶縁体は前記対電極の上面を覆っており、
   前記作用電極は前記絶縁体の表面の一部に設けられて前記作用電極と前記絶縁体との接触面積が前記対電極と前記絶縁体との接触面積より小さく設定されており、
   前記絶縁体には前記作用電極を囲う周壁が形成されていて前記周壁が前記被検物質を収容する溜り部として機能し、
   前記作用電極とは別に参照電極が設けられており、前記参照電極は、前記周壁に埋設されていることを特徴とする被検物質検知センサー。
3. 前記作用電極が複数個設けられていて、個々の作用電極にそれぞれ前記溜り部が設けられている請求項１又は２に記載の被検物質検知センサー。
4. 一つの前記溜り部内に複数の作用電極が配置されてなる請求項１又は２に記載の被検物質検知センサー。
5. 前記溜り部は、前記作用電極の安定作用を補償する所定量の被検物質を貯留する請求項１又は２に記載の被検物質検知センサー。
6. 前記溜り部を形成する周壁が撥水性を有する請求項１〜５の何れかに記載の被検物質検知センサー。
7. 前記溜り部を形成する周壁が撥油性を有する請求項１〜５の何れかに記載の被検物質検知センサー。

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