JP2013181870A - イムノクロマトグラフィー用試験ストリップ - Google Patents

Abstract

【課題】全血の前処理を必要とせず、さらに溶血による影響が解消されたイムノクロマトグラフィー用試験ストリップの提供。
【解決手段】検体試料処理部とクロマトグラフィー媒体部からなるイムノクロマトグラフィー用試験ストリップであって、検体処理部が（１）サンプルパッド、（２）コンジュゲートパッド、（３）血球分離膜の３部材から構成されており、血球分離膜末端のみがクロマトグラフィー媒体上に載置されているイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。
【選択図】図１０

Description

本発明はイムノクロマトグラフィー用試験ストリップに関する。

抗原とこれに対する抗体による特異的反応を利用して特定の抗原又は抗体よりなる被検出物質を検出する免疫測定法が近年生化学的検査の一手段として広く利用されている。
この手法のなかでも、試料中の被検出物質と、感作処理により検出用粒子に結合した抗体又は抗原とを免疫反応により結合させ、これによって生ずる検出用粒子の凝集状態を測定する凝集法が、簡便な方法として知られており、特に結果の目視判定が可能である点で一般的に用いられている方法である。
また、標識物質により標識化した抗体又は抗原を免疫反応により試料中の被検出物質に結合させ、この結合状態にある標識物質等を測定する方法も知られており、標識物質として放射性同位元素を用いる放射免疫測定法、酵素を用いる酵素免疫測定法、螢光物質を用いる螢光免疫測定法なども採用されている。
これらの免疫測定法では、被検出物質と標識物質により標識化した抗体等との反応工程、被検出物質と結合状態にある標識物質と結合状態にない標識物質との分離工程が必要となるが、これらの工程を、クロマトグラフィーの原理を応用して、固定相とそれに接して連続的に流れる移動相からなる系で行う方法として、イムノクロマトグラフ法が知られている。

免疫測定の方法には、サンドイッチ法又は競合法等が知られているが、イムノクロマトグラフ法によりサンドイッチ法で試料中の抗原よりなる被検出物質を検出する場合には、以下のような操作が行われる。
（１）被検出物質である抗原に特異的に結合する抗体を固定化試薬とし、この固定化試薬をクロマトグラフ媒体の所定の部位に所定の形で塗布すること等により、クロマトグラフ媒体の任意の位置に反応部位を形成する。
（２）一方、被検出物質と特異的に結合する抗体を検出試薬とし、この検出試薬を酵素等の標識物質により標識する、又は、検出試薬を不溶性担体等の標識物質に感作することにより、標識化した検出試薬を調製する。
（３）移動相を構成する展開液を、被検出物質を含む試料及び標識化した検出試薬と共に、固定相であるクロマトグラフ媒体上を展開させる。
以上の操作により、クロマトグラフ媒体に形成された反応部位において、被検出物質である抗原が、反応部位に固定した固定化試薬である抗体と結合することにより捕捉されると共に、この抗原と、標識化した検出試薬である抗体とによって抗原−抗体反応が生ずる結果、当該反応部位においては固定化試薬（固定化した抗体）−被検出物質（抗原）−検出試薬（標識化した抗体）の三者のサンドイッチ型結合体が生成し、試料中に被検出物質が存在するときに反応部位に間接的に標識物質が結合することによって所定のシグナルが現れ、これによって被検出物質の検出を行うことができる。

このようなイムノクロマトグラフ法は、操作が簡便であり、短時間で測定可能であることから、臨床検査や研究室における測定試験等で広く利用されている。イムノクロマトグラフ法の標識物質には、一般に酵素又は不溶性担体が用いられるが、特別な操作を必要とせず、視覚的に検出することができる不溶性担体（コロイド状金属粒子又は着色ラテックス粒子等）を標識物質に採用することにより、イムノクロマトグラフ法の特徴である簡便な検出方法としての利用価値が一層高くなる。近年、金コロイド粒子の凝集を指標とする方法が多く採用されている。

しかし、全ての検体を同一に取り扱うことはできない。たとえば血液は赤血球や白血球、血小板などの細胞を含んでおり、これらを除去するか血漿成分に遅れて展開されるようにしなければならない。特に赤血球が破裂するとイムノクロマトグラフの展開膜（クロマトグラフ媒体）が赤色に染まってしまい、微量物質の目視での判定が困難になってしまう。このため血液（全血）を測定試料とする場合にはあらかじめ、血球を除去する操作が必要となる。
最近ではイムノクロマトグラフィー用の試験ストリップ自体に血漿、血清分離パッドを設置した方法が開発されている。例えばイムノクロマトグラフストリップの検体試料処理部の試料添加部直下に血球の分離パッドを設置し、血球成分をこの分離パッドに保持させ、血球成分がイムノクロマトグラフィー媒体部に流出させずに血漿成分を先に展開させる方法である。

この手法では、全血中の赤血球の破裂を防ぎ、溶血させないことが重要であり、多くの方法が提案されている。血球捕捉膜にカルボキシメチルセルロース膜を用いる方法（特許文献１：特開２００２−２１４２３６号公報）、プロパノールやアクリルアミドを用いる方法（特許文献２：特開２００２−３５０４２８号公報）などが一例として挙げられる。 また、親水性焼結多孔物質を用いて赤血球を分離してこれを各種操作に用いる方法（特許文献３：特許第２９４０９９０号公報）、が提案されている。さらに、血中のＨＩＶの検出のために、血球分離を目的とするガラス繊維からなる膜を備えたストリップ構造が提案されている（特許文献４：特開平１１−２４８７０８号公報）。これらの方法は、必ずしも溶血を防ぐことができず、クロマトグラフィー媒体が血色素で赤くなってしまうことを防ぐことができない。
あるいは、血球（特に赤血球）を溶血させた後イムノクロマトグラフィーに付し、展開された色素を除去する方法が提案されている（特許文献５：国際公開第２００４／２０６９３０号）。この方法は、赤血球の破壊を積極的に実施することとなるが、そのための操作や、赤く着色された展開部分の脱色という余分な操作が必要になる。
このように全血を直接イムノクロマトに付し、精度良く目的物質を検出するには不十分であった。

特開２００２−２１４２３６号公報 特開２００２−３５０４２８号公報 特許第２９４０９９０号公報 特開平１１−２４８７０８号公報 国際公開第２００４／２０６９３０号

本発明は試験試料である全血の前処理を必要とせず、さらに溶血による影響が解消されたイムノクロマトグラフィー用試験ストリップの提供を課題とする。

本発明者らは、研究の結果イムノクロマトグラフィー法を用いた全血を試験試料とする被険物質の測定において、従来のイムノクロマトグラフィー試験用ストリップの検体処理部の構成を再検討し、全血を試料としても溶血の影響のでない試験用ストリップの構造を見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は次の構成よりなる。
１．不透水性基材上に担持されている、被検出成分に結合可能な結合物質を固定化した判定部を有するクロマトグラフィー媒体と、
クロマトグラフィー媒体よりも試料展開方向上流側の位置で不透水性基材上に担持されている、試料が添加される検体処理部からなるイムノクロマトグラフィー用試験ストリップであって、
該検体処理部は、血液試料を添加するサンプルパッド、血球を分離する血球分離膜、標識物質を含有するコンジュゲートパッドから構成されており、
血球分離膜は試料展開方向下流側の一部が、クロマトグラフィー媒体の展開方向上流側末端上部に積層されており、中間部が不透水性基材上に積層されており、他端部がコンジュゲートパッド層に積層されており、
コジュゲートパッドは、血球分離膜より試料展開方向の上流側に配置されており、
サンプルパッドは、試料展開方向の一端が、不透水性基材上に積層され、他端側はコンジュゲートパッドの上部に積層されていることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。
２．サンプルパッドの下流側の一部が、コンジュゲートパッドに積層された血球分離膜上さらに積層されている１．記載のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。
３．サンプルパッドと血球分離膜が直接接触していない１．記載のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。
４．血液試料が全血である１．〜３．のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。
５．コンジュゲートパッドに抗体結合金ナノ粒子標識試薬が含有されている１．〜４．のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。
６．判定部に検出成分認識抗体が結合している１．〜５．のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。

本発明により、全血を直接測定しても溶血の影響のないイムノクロマトグラフィー用試験ストリップが提供される。そしてこの試験ストリップにより正確なイムノクロマトグラフィー試験の実施が可能となる。

従来のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップの構造を示す。 実施形態１のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップの構造を示す。 実施形態２のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップの構造を示す。 比較形態１のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップの構造を示す。 比較形態２のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップの構造を示す。 比較形態３のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップの構造を示す。 比較形態４のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップの構造を示す。 実施形態１、実施形態２を用いたイムノクロマトグラフィーの判読状態をスケッチした画像を示す。 比較形態１〜４を用いたイムノクロマトグラフィーの判読状態をスケッチした画像を示す。 本発明の実施形態２の試験ストリップを用いて、１０分間イムノクロマトグラフィーを行いヒト全血中のＰＳＡ濃度を測定した結果を示す。 本発明の実施形態２の試験ストリップを用いて１５分間イムノクロマトグラフィーを行ってヒト全血中のＰＳＡ濃度を測定した結果を示す。

検体処理部の構造
まず従来の全血用のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップの構造について説明する。
本発明のイムノクロマトグラフィーでは、試料添加する側を上流、または上流側、クロマトグラフィーが展開されてゆく方向を下流または下流側と呼ぶ。
従来の全血用のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップは例えば図１に示す構造を有しており、さらに検体処理部は図４に示す構造を有している。すなわち、不透水性基材（４）の上に積層された、試験試料を添加する検体処理部（６）とクロマトグラフィー媒体部（５）からなる。検体処理部は異なる性質の３層からなり、それぞれ下流側に少しずつずらして積層した構造となっている。すなわちサンプルを添加するサンプルパッド（１）、血球を結合分離して血漿とする血球分離膜（３）、血漿中の被険物質と結合する抗体を用いた標識物質を含有するコンジュゲートパッド（２）である。そしてコンジュゲートパッド（２）がクロマグラフィー媒体（５）に一部積層されている。さらにコンジュゲートパッド（２）を介して血球分離膜（３）が積層されている。さらにコンジュゲートパッド（２）を介して最上流側にサンプルパッド（１）が積層載置されている。この３層構造を備えた部位を検体処理部（６）と呼ぶ。
検体処理部（６）において、抗凝血剤を含む全血はサンプルパッド（１）に添加され、血球分離膜（３）によって血漿と血球が分離され、コンジュゲートパッド（２）で試験対象物質が抗原抗体反応によって特異的に標識と結合し複合体となり、複合体は血漿と共にコンジュゲートパッド（２）からクロマトグラフィー媒体（５）に毛管現象で移動し、クロマトグラフィー媒体部（５）のクロマトグラフィー担体上を毛管現象で展開して行き、クロマトグラフィー上の検出部において停止し、検出される。サンプルパッド（１）は試料を一時的に吸収保持するグラスファイバー、ポリアクリル繊維やポリエチレン繊維などの合成繊維、乾燥紙、紙パルプ、織物、レーヨンやキュプラ等の再生セルロース繊維等からなる膜、又はそれらの組み合わせからなる膜が使用される。そして血球分離部（３）は、赤血球、白血球、血小板などの血球細胞成分を分離又はその展開流速を極端に低下させることにより、血漿成分を優先的にメンブレンへ展開させる機能を有していれば良く、セルロースやポリアミド等の合成高分子繊維、グラスファイバー繊維からなる薄手濾紙等の膜が用いられる。その膜は、少なくとも検体である全血中に含まれる赤血球を分離できるものであれば良く、好ましくは白血球や血小板などの血球細胞成分も分離又はその展開流速を極端に低下させることにより、血漿成分を優先的にメンブレンへ展開させる機能を有するものを用いる。通常水酸基、アミノ基、カルボキシメチル基などの官能基化された合成高分子繊維や、ポリビニルアルコールなどの合成高分子アルコールなどを結合させたグラスファイバーが用いられる。そしてコンジュゲートパッド（２）はガラス繊維不織布や、セルロース類不織布、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル等の合成高分子繊維不織布が用いられる。
しかし、この構成では全ての血球が捕捉されず、検体処理部から流出した血球がクロマトグラフィー媒体部で破壊され、そしてクロマト媒体部で血色素が展開されて、クロマトグラフィー全体が赤く染まってしまう。

一方本発明のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップは、この検体処理部の構造が異なっている。
図２、図３に本発明のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップの構造を示し、説明する。該検体処理部は、血液試料を添加するサンプルパッド（１）、血球を分離する血球分離膜（３）、標識物質を含有するコンジュゲートパッド（２）から構成されており、血球分離膜（３）は試料展開方向下流側の一部が、クロマトグラフィー媒体（４）の展開方向上流側末端上部に積層されており、中間部が不透水性基材上に積層されている。さらに血球分離膜他端部の一部分は不透水性基材に直接またはコンジュゲートパッド（２）を介して積層されている。コンジュゲートパッド（２）は、血球分離膜（３）より試料展開方向の上流側に配置されており、サンプルパッド（１）は、上流側の一端が、不透水性基材上に積層され、他端側はコンジュゲートパッド（２）の上部に積層されている。そしてより好ましくは、サンプルパッドと血球分離膜は直接接触しないことが、クロマトグラフィーに好結果を与える。
なお、サンプルパッド（１）、コンジュゲートパッド（２）、血球分離膜（３）を含む構造を本明細書では検体処理部（６）と総称する場合がある。
以上の配置構造をとることによって血球分離が確実に行われ、クロマトグラフィー媒体上で血球が破壊されてクロマトグラフィーが血色素で染まることが抑制される。

クロマトグラフ媒体
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップに用いるクロマトグラフ媒体は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性のものであって、使用される検出試薬、固定化試薬、被検出物質などと反応しないものであり、短時間での判定で十分な感度が得られる展開速度を有していれば、特にその素材が限定されるものではない。
本発明において、クロマトグラフ媒体としては、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、アルミナ等のセラミック微粒子又は有機高分子の微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース又は酢酸セルロース等のセルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。微粒子はそれ自体が多孔性でなくとも、充填された状態では微粒子間に空隙が生じクロマトグラフ媒体として機能する。好ましくはセルロース誘導体やナイロンの膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等であり、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙である。

本発明のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップで用いるクロマトグラフ媒体の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。操作をより簡便にするためには、反応部位が表面に形成されているクロマトグラフ媒体の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。

反応部位
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップにおいて用いるクロマトグラフ媒体上には、被検出物質と特異的に結合する物質、例えば抗体が固定化試薬として任意の位置に固定化された反応部位が形成される。固定化試薬をクロマトグラフ媒体に固定化する方法としては、固定化試薬をクロマトグラフ媒体に物理的又は化学的手段により直接固定化する方法と、固定化試薬をラテックス粒子などの微粒子に物理的又は化学的に結合し、この微粒子をクロマトグラフ媒体に捕捉して固定化する間接固定化方法がある。
直接的に固定化する方法としては、物理吸着を利用しても良いし、共有結合によってもよい。一般にクロマトグラフ媒体がニトロセルロース膜又は混合ニトロセルロースエステル膜の場合、物理吸着を行うことができる。共有結合ではクロマトグラフ媒体の活性化には一般的に臭化シアン、グルタルアルデヒド、カルボジイミド等が用いられるが、いずれの方法も用いることができる。間接的に固定化する方法としては、不溶性微粒子に固定化試薬を結合した後に、クロマトグラフ媒体に固定化する方法がある。不溶性微粒子の粒径はクロマトグラフ媒体に捕捉されるが移動することのできないサイズのものを選択することができ、好ましくは平均粒径１０μｍ程度以下の微粒子である。これらの粒子としては抗原抗体反応に使用されるものが種々知られており、本発明でもこれら公知の粒子を使用することができる。例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの乳化重合法によって得られる有機高分子ラテックス粒子などの有機高分子物質の微粒子、ゼラチン、ベントナイト、アガロース、架橋デキストランなどの微粒子、シリカ、シリカ−アルミナ、アルミナなどの無機酸化物や無機酸化物にシランカップリング処理などで官能基を導入した無機粒子等が挙げられる。本発明においては、感度調整の容易さ等から直接固定化の方が好ましい。また、クロマトグラフ媒体への固定化試薬の固定化には、いろいろな方法が使用できる。例えば、マイクロシリンジ、調節ポンプ付きペン、インキ噴射印刷等、種々の技術が使用可能である。反応部位の形態としては特に限定されないが、円形のスポット、クロマトグラフ媒体の展開方向に垂直にのびるライン、数字、文字や＋、−などの記号等として固定化することもできる。

固定化試薬を固定化した後、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、ツイーン２０、トリトンＸ−１００、ＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。
その他、クロマトグラフ媒体には、必要に応じて、被検出物質を含む試料を添加するための試料添加部位（サンプルパッド等）、試料中の血球等の固形成分を除去する部位（血球分離部位等）、展開液を添加するための展開液添加部位、反応部位に捕獲されなかった被検出物質や展開液を吸い取る吸収部位（吸収パッド等）、測定が正常に行われたことを示す対照部位等を組み入れてもよい。これらの部位の部材は、毛管現象により試料液や展開液が移動できれば特に限定されず、一般的には、ニトロセルロース膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の複数の多孔性物質からその目的に応じたものを選択して用い、固定化試薬が固定化されたクロマトグラフ媒体と毛管で繋がるように配置することができる。

標識物質
本発明で用いられる検出試薬は、被検出物質と特異的に結合する物質、例えば抗体であり、標識物質により標識化される。イムノクロマトグラフ法における検出試薬の標識には、一般に酵素等も使用されるが、被検出物質の存在を目視で判定するのに適していることから、本発明の標識物質としては不溶性担体が用いられる。本発明においては、検出試薬を不溶性担体に感作することにより標識化した検出試薬を調製する。
本発明で用いられる標識物質としての不溶性担体には、金、銀、白金のようなコロイド状金属粒子、酸化鉄のようなコロイド状金属酸化物粒子、硫黄などのコロイド状非金属粒子及び合成高分子よりなるラテックス粒子、その他を用いることができる。特にコロイド状金粒子を用いれば検出が簡便で好ましい。

不溶性担体は、被検出物質の存在を視覚的に判定するのに適した標識物質であり、目視による判定を容易にするためには有色であることが好ましい。コロイド状金属粒子及びコロイド状金属酸化物粒子は、それ自体が粒径に応じた特定の自然色を呈するものであり、その色彩を標識として利用することができる。合成高分子よりなるラテックス粒子は自然の状態で白色であるため、そのままでは標識物質として使用することはできないが、例えば油溶性染料によって、特に水系媒体中のラテックス粒子を、油溶性染料の油性有機溶剤による溶液のエマルジョンによって染色することにより、所望の色彩を所望の濃さで有するものとすることができる。

本発明における標識物質として用いることのできるラテックス粒子は、種々のモノマーを重合又は共重合させることによって得ることができる。ここにモノマーとしては、例えばスチレン、クロルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ビニルトルエンなどの重合性不飽和芳香族類、例えば（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマール酸などの重合性不飽和カルボン酸類、例えば（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニルなどの重合性不飽和カルボン酸エステル類、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール−（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニルなどの不飽和カルボン酸アミド類、重合性不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル類、共役ジエン類などを挙げることができる。これらのモノマーは、標識物質として要求される表面特性、比重などによって適宜選択され、１種を単独で又は２種以上を混合して使用することができる。

本発明において、標識物質として特に好ましいラテックス粒子としては、例えばスチレンとメタクリル酸との共重合体、スチレンとイタコン酸との共重合体などを挙げることができる。このような共重合体を得るための重合反応のための重合開始剤としては、過硫酸塩などを用いることができる。標識物質として使用されるラテックス粒子の平均粒径は５０〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。

本発明における標識物質として用いることのできるコロイド状金属粒子及びコロイド状金属酸化物粒子には、例えば、コロイド状金粒子、コロイド状銀粒子、コロイド状白金粒子、コロイド状酸化鉄粒子、コロイド状水酸化アルミニウム粒子などが挙げられる。特に、コロイド状金粒子とコロイド状銀粒子が適当な粒径において、コロイド状金粒子は赤色、コロイド状銀粒子は黄色を示す点で好ましい。これらのコロイド状金属粒子の平均粒径は１〜５００ｎｍ、特に強い色調が得られる１０ｎｍ〜１５０ｎｍ、より好ましくは２０〜１００ｎｍの範囲内であることがさらに好ましい。
これらの不溶性担体に関しては、ラテックス粒子又はコロイド状金属粒子のいずれにおいても、その表面が負に荷電していることが知られている（例えば、特開平５−１３３９５６号公報参照）。例えば、コロイド状金属粒子では、その製造過程で添加される還元剤由来のアニオンがその表面に吸着しており、相互の凝集が妨げられて分散した状態を保っている。そして、この状態のコロイド状金属粒子に、表面電荷を中和しない程度の低濃度の界面活性剤を添加すると、粒子が鎖状に数個程度凝集することが知られている（特開２００６−５８７８１号公報）。このように、本発明のイムノクロマトグラフ法において、移動相を構成する展開液に酸素原子含有極性基を有するビニル系水溶性ポリマー及び非イオン性界面活性剤を添加すると、クロマトグラフ媒体上の反応部位に捕捉された不溶性担体が数個程度凝集することにより、反応部位で観察される陽性シグナルの増幅が見られると推測される。特に、コロイド状金属粒子においては、凝集によって反応部位に蓄積する粒子の数が増加することにより、目視判定されるシグナル量が増加するのみならず、粒子の光吸収スペクトル特性が変化することにより、反応部位においてより明瞭な陽性シグナルを得ることが可能となると推測される。このような利点を有することから、コロイド状貴金属粒子、特にコロイド状金粒子は、本発明の標識物質として好ましいものである。
コロイド状金属粒子として、例えばコロイド状金粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法によりコロイド状金粒子を調製することができる。

本発明で用いられる検出試薬をコロイド状金属粒子に感作する方法としては、物理吸着や化学結合などの公知の方法が使用できる。例えば、コロイド状金粒子に抗体を感作した検出試薬は、金粒子がコロイド状に分散した溶液に抗体を加えて物理吸着させた後、牛血清アルブミン溶液を添加して抗体が未結合である粒子表面をブロッキングすることにより調製する。

実際のイムノクロマトグラフ法の実施において、不溶性担体により標識化した検出試薬は、移動相を構成する展開液に分散して適用することもできるし、固定相を構成するクロマトグラフ媒体における移動相の展開移動経路上、すなわちクロマトグラフ媒体の移動相が適用される端部と反応部位との間の領域に存在させて適用することもできる。クロマトグラフ媒体上に存在させる場合、検出試薬が展開液に速やかに溶解して毛管作用によって自由に移動できるように、検出試薬を支持させるのが好ましい。支持させる部位には、検出試薬が感作された不溶性担体の再溶解性を良好にするため、サッカロース、マルトース、ラクトース等の糖類、マンニトール等の糖アルコールを添加して塗布したり、これらの物質を予めコーティングしたりしておくこともできる。検出試薬を塗布・乾燥等によりクロマトグラフ媒体上に存在させる際には、固定化試薬が固定化されたクロマトグラフ媒体に直接、塗布・乾燥等することもできるし、別の多孔性物質、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維濾紙、ナイロン不織布に塗布・乾燥等して検出試薬保持部材を形成した後、固定化試薬が固定化されたクロマトグラフ媒体と毛管で繋がるように配置してもよい。

被検出物質
本発明の方法により検出される被検出物質としては、それに特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されず、蛋白質、ペプチド、核酸、糖（特に糖タンパク質の糖部分、糖脂質の糖部分等）、複合糖質などを例示することができる。本発明において「特異的に結合する」とは、生体分子が持つ親和力に基づいて結合することを意味する。このような親和力に基づく結合としては、抗原と抗体との結合、糖とレクチンとの結合、ホルモンと受容体との結合、酵素と阻害剤との結合、相補的核酸同士及び核酸と核酸結合蛋白質との結合などが挙げられる。従って、被検出物質が抗原性を有する場合、被検出物質に特異的に結合する物質としてはポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を例示することができる。また、被検出物質が糖の場合、被検出物質に特異的に結合する物質としてはレクチンタンパク質を例示することもできる。具体的な被検出物質としては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２タンパク、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、敗血症マーカー、ＣＡ１９−９、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＰＡ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、便潜血、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＲＰ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、梅毒抗体、インフルエンザウイルス、ヒトヘモグロビン、クラミジア抗原、Ａ群β溶連菌抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、ロタウイルス、アデノウイルス、アルブミン、糖化アルブミン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
以上の構成からなるイムノクロマトグラフィー用試験ストリップはそのまま、あるいは必要に応じてプラスチックで整形したハウジングに入れて使用することができる。

展開液
本発明で用いられる展開液は、イムノクロマトグラフ法において移動相を構成する液体であり、固定相であるクロマトグラフ媒体上を、被検出物質を含む試料及び標識化した検出試薬と共に移動する。このような展開液であれば、どのようなものであっても良い。

以下、本発明を実施例に基づいて説明する。

１．イムノクロマトグラフィー用試験ストリップの作製
（１）クロマトグラフフィー媒体の作製
クロマトグラフィー用の媒体としてニトロセルロースからなるシートＨＦ２４０（ミリポア社製：３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。５重量％のイソプロピルアルコールを含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になる様に抗ＰＳＡモノクローナル抗体（第一抗体）を希釈した。この溶液４０μＬをメンブレン上に１ｍｍの幅で塗布し、６０℃で一晩乾燥させ、クロマトグラフィー媒体を作製した。

（２）標識物質溶液の作製
金コロイド分散液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ９．０）で０．０２５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した抗ＰＳＡモノクローナル抗体（第二抗体）を０．１ｍＬ加え、室温で１０分間静置した。次いで、０．０１重量％のメトキシ−ＰＥＧ−チオール５０００（日本油脂株式会社製、商品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−０５０ＳＨ、分子量５０００）を含むＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を０．１ｍＬ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、０．１重量％の牛血清アルブミンを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を０．１ｍＬ加え標識物質を分散させた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。

（３）コンジュゲートパッドの作製
上記で作製した標識試薬溶液３００μＬに３００μＬの１０重量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１５ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバー製のパッド（ＳｕｒｅＷｉｃｋ、商品名、ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドを作製した。

（４）サンプルパッドの作製
３０ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバー製のパッド（ＳｕｒｅＷｉｃｋ、商品名、ミリポア社製）を用い、２．５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を均一に１．８ｍＬ吸収させた後、４時間凍結乾燥させサンプルパッドを作製した。

（５）血球分離膜
血球分離膜ＧＦ／ＤＶＡ（商品名、Ｗｈａｔｍａｎ社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。

（６）イムノクロマトグラフィー試験ストリップの作製
片面に粘着剤が塗布されたバッキングシートから成る基材に、上記で作製したクロマトグラフィー媒体、血球分離膜、コンジュゲートパッド、サンプルパッド、さらに展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを貼り合わせ、実施形態１、実施形態２、比較形態１〜４を作製した。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、イムノクロマトグラフィー試験ストリップとした。

２．イムノクロマトグラフィー測定
ヒト全血を用いた血中ＰＳＡの検出
作製したイムノクロマトグラフィー試験用ストリップを用いて、血液中のＰＳＡ検出を行った。
即ち、血液中のＰＳＡ濃度が０．１ｎｇ／ｍＬ未満の陰性検体と、ＰＳＡ濃度が０．５ｎｇ／ｍＬである陽性検体を被検体とし、被検体１５０μＬをイムノクロマトグラフィー用試験片のサンプルパッド上に載せて展開させ、１５分後に目視判定をした。テストラインの赤い線を確認できるものを「＋」、赤い線は確認できるが、非常に色が薄いものを「±」、赤い線を確認できないものを「−」とした。また、１５分後の目視による展開性の判定として、吸収パッドまで展開されたものを「良好」、展開されないものを「不良」、吸収パッド直前まで展開されたものを「やや不良」と判定し、溶血の有無も併せて確認した。その結果を表１に示す。また各試験ストリップのクロマトグラフィーの画像を図８、図９に示す。

表１図８及び図９から明らかなように、本発明のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップは溶血の影響もなく、高感度の検出が可能であることが確認できた。また比較形態１〜４の試験用ストリップを用いた試験は溶血の発生により検出感度が低下するか、測定困難であった。

３．ＰＳＡを対象とした濃度依存性試験
実施形態２のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップを用いて、測定感度及び濃度依存性に与える影響を確認した。
最終濃度の１０倍濃度のＰＳＡを陰性検体で１０倍希釈して試験サンプルとした。試験サンプル１２０μＬをストリップに添加し１０分後あるいは１５分後の試験ストリップの検出強度は、展開時間１０分後あるいは１５分後にラインの発色強度をデンシトメーターで測定して求めた。尚、その測定値が１５ｍＡｂｓ以上であれば、目視で鮮明に赤色のラインが確認できる。
測定結果を表２、図１０、図１１に示す。展開時間１０分、１５分のいずれも濃度依存性の反応を示すことを確認できた。

図１０、図１１、表２から明らかなように、全血（陰性検体）にＰＳＡの標準品を添加して、本発明のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップを用いて、１０分または１５分展開後にデンシトメーターで測定したＡＢＳ値は血中のＰＳＡ濃度に依存した回帰直線を示した。したがって、本願発明のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップを用いた測定は、血液中のＰＳＡ濃度変化を正確に反映しているものである。また、通常、コロイド状金粒子を用いたイムノクロマトグラフィーでは、１０ｍＡＢＳが肉眼での検出限界といわれている。本発明では、血中ＰＳＡが０．５ｎｇ/ｍＬの濃度であれば検出可能なことが明らかとなった。また測定時間も１０分間の展開で検出可能であり、短時間で血中ＰＳＡの陽性判定が可能となった。

１．サンプルパッド
２．コンジュゲートパッド
３．血球分離膜
４．パッキングシート
５．クロマトグラフィー媒体
６．検体処理部

Claims (6)

1. 不透水性基材上に担持されている、被検出成分に結合可能な結合物質を固定化した判定部を有するクロマトグラフィー媒体と、
   クロマトグラフィー媒体よりも試料展開方向上流側の位置で不透水性基材上に担持されている、試料が添加される検体処理部からなるイムノクロマトグラフィー用試験ストリップであって、
   該検体処理部は、血液試料を添加するサンプルパッド、血球を分離する血球分離膜、標識物質を含有するコンジュゲートパッドから構成されており、
   血球分離膜は試料展開方向下流側の一部が、クロマトグラフィー媒体の展開方向上流側末端上部に積層されており、中間部が不透水性基材上に積層されており、他端部がコンジュゲートパッド層に積層されており、
   コジュゲートパッドは、血球分離膜より試料展開方向の上流側に配置されており、
   サンプルパッドは、試料展開方向の一端が、不透水性基材上に積層され、他端側はコンジュゲートパッドの上部に積層されていることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。
2. サンプルパッドの下流側の一部が、コンジュゲートパッドに積層された血球分離膜上さらに積層されている請求項１記載のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。
3. サンプルパッドと血球分離膜が直接接触していない請求項１記載のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。
4. 血液試料が全血である請求項１〜３のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。
5. コンジュゲートパッドに抗体結合金ナノ粒子標識試薬が含有されている請求項１〜４のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。
6. 判定部に検出成分認識抗体が結合している請求項１〜５のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用試験ストリップ。

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