JP2013158289A - アクリルアミド分解性セルフクローニング麹菌 - Google Patents

Abstract

【課題】アミダーゼを誘導培養なしに発現し、アクリルアミド分解活性の高いセルフクローニング麹菌、および前記麹菌を用いたアクリルアミド低減方法を提供する。
【解決手段】麹菌由来の特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子または前記ポリペプチドをコードする核酸分子と相補的な塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列を有し、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が誘導培養なしに発現する状態で遺伝子導入されたセルフクローニング麹菌、前記麹菌とアクリルアミド含有物を接触処理する工程を含むアクリルアミドを低減させる方法、およびアクリルアミド低減飲料または食品の製造方法。
【選択図】図８

Description

本発明は、セルフクローニング麹菌、その麹菌を用いてアクリルアミド含有物からアクリルアミドを低減させる方法、およびその麹菌を用いたアクリルアミド低減飲食品の製造方法に関する。さらに詳細には、アクリルアミドを分解するアミダーゼを誘導培養することなく常時産生することのできるセルフクローニング麹菌とその利用に関する。

アクリルアミドは、ＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨ_２で表される構造を有する有機化合物であり、常温において無色無臭で白色の結晶であり、水やアルコール、アセトンに溶けやすい性質がある。室温では安定であるが、溶融すれば加熱や紫外線によって激しく重合してポリアクリルアミドになる。

ヒトに対する影響として、アクリルアミドの摂取は、皮膚障害、言語障害、末梢神経炎、小脳性失調等を引き起こすことが知られている。職業曝露や事故によりアクリルアミドを口、肺、皮膚から大量に吸引した場合、中毒症状として中枢神経および末梢神経に障害を引き起こすことが確認されている。国際がん研究機関（ＩＡＲＣ）の調査によると、発がん性物質の分類において「ヒトに対しておそらく発がん性がある物質（グループ２Ａ）」としている。また、米国カリフォルニア州の有害物質管理法であるプロポジション６５（安全飲料および有害物質執行法）では、２０１１年２月にアクリルアミドは、がんまたは生殖毒性を引き起こす物質として記載されるようになった。

食品においては、アクリルアミドは、原材料に含まれるアスパラギン等の特定のアミノ酸と果糖やブドウ糖等の還元糖とが、揚げる、焼く、焙るなどの高温での加熱処理によりアミノカルボニル反応（メイラード反応）を起こすことで生成すると考えられている。この生成経路の他にも、アスパラギンや還元糖以外の食品成分が原因物質となっている可能性や、アミノカルボニル反応以外の経路からもアクリルアミドが生成する可能性があると考えられている。アクリルアミドは、例えば、食品では、ポテトチップスなどのじゃがいもを揚げた食品、ビスケットなどの穀類を原料とする焼き菓子などに含まれ、飲料ではコーヒーやほうじ茶などに含まれる。コーヒーにおけるアクリルアミドの含量は高いことが知られており、1杯のコーヒーに含まれるアクリルアミドは約２μｇになると考えられている。

微生物の中には、アクリルアミドを分解するアミダーゼを産生する種があることが知られており、これまでに種々の微生物を用いて食品中や飲料中のアクリルアミドを分解する方法が開発されてきた。例えば、麹菌を用いてアクリルアミドを分解する方法が知られている（特許文献１）。また、アクリルアミドの分解活性能を短期的に向上させるための、糸状菌の培養方法が知られている（特許文献２）。微生物を用いて食品や飲料中のアクリルアミドを分解する場合、遺伝子組換え微生物では安全性が疑問視されている。したがって、遺伝子組換え微生物によらないアクリルアミド高分解性菌のスクリーニング方法が開発されている（特許文献３）。

特開２０１０−１８３８６７号 特開２０１１−９２１８５号 特開２０１０−３５４４９号

自然界の微生物においてアミダーゼは誘導酵素であり、一定量のアクリルアミドの存在下で培養した後でないとアミダーゼを産生しないため、飲料や食品中のアクリルアミドを分解する場合は、微生物を誘導培養することによりアミダーゼを発現させる必要があり、工業的な観点からは応用が困難である。したがって、本発明は、誘導培養を行わずともアミダーゼを発現することができ、アクリルアミド分解性が非常に高い麹菌を提供することを目的とする。さらに、本発明は、アクリルアミドの低減方法、アクリルアミド低減飲食品の製造方法、およびアクリルアミド低減飲食品を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、以下に示すアクリルアミド分解性セルフクローニング麹菌、その麹菌を用いてアクリルアミド含有物からアクリルアミドを低減させる方法、アクリルアミド低減飲食品の製造方法、およびアクリルアミド低減飲食品により、前記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の対象となるセルフクローニング麹菌は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子または前記ポリペプチドをコードする遺伝子と相補的な塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列を有し、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、誘導培養なしに発現し得る状態で導入されることを特徴とする。

また本発明の遺伝子は、改良エノラーゼプロモーターの下流に作用的に連結されていることを特徴とする。

本発明にかかるセルフクローニング麹菌は、アミダーゼの比活性が少なくとも２７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上であることを特徴とする。

本発明にかかるセルフクローニング麹菌は、リアルタイムＰＣＲ法において、アミダーゼ遺伝子の発現量がセルフクローニング前の元株と比較して少なくとも２０００倍以上であることを特徴とする。

また本発明にかかるアクリルアミド含有物からアクリルアミドを低減させる方法は、本発明にかかるセルフクローニング麹菌をアクリルアミド含有物と接触処理する工程を含むことを特徴とする。

前記方法において、本発明にかかるセルフクローニング麹菌を、乾燥ヘチマ、セルロース、ゲル状ビーズ、多孔性ガラスビーズ、多孔質セラミックス、および不織布からなる群より選択される担体に保持することができる。前記セルフクローニング麹菌を担体に保持することは、培養時に菌体が脆弱になることを防ぐことができる点で好ましい。

本発明にかかる接触処理は、２５℃以上、４５℃以下の温度で往復振とう培養する工程を含むことができる。往復振とう培養する場合の温度は、下限の温度が２５℃以上であり、好ましくは３０℃以上であり、さらに好ましくは３２℃以上である。上限の温度が４５℃以下であり、好ましくは４０℃以下であり、さらに好ましくは３５℃以下である。往復振とう培養する場合の温度は、２５℃以上であれば酵素反応の至適温度を下回ることがなく、４５℃以下であれば酵素失活が起こることはない。

また本発明にかかるアクリルアミド低減飲食品の製造方法は、セルフクローニング麹菌をアクリルアミド含有飲食品と接触処理する工程を含むことを特徴とする。

また本発明によると、セルフクローニング麹菌を接触処理することにより、処理前と比較してアクリルアミドの残存率が５０％以下である飲食品を提供することができる。

本発明によると、セルフクローニング麹菌を接触処理することにより、１−プロパノール、酢酸エチル、２−メチル−１−ブタノール、イソブチルアルコール、イソアミルアルコール、エタノール、および２−ペンタノンが、処理前と比較してそれぞれ２倍以上増加した飲食品を提供することができる。

本発明によると、アクリルアミドの含有量が４ｐｐｂ以下であるコーヒー飲料を提供することができる。

本発明によれば、アクリルアミドを分解するアミダーゼ活性の高いセルフクローニング麹菌を提供することができる。このようなセルフクローニング麹菌を用いることにより、アクリルアミドの含有率が高い飲食品、例えばコーヒー、ほうじ茶などから効率的かつ安全にアクリルアミドを分解することができる。また、本発明の菌株は、誘導培養を行わずにアミダーゼを産生することができるため、誘導培養の工程を省いて工業的にアクリルアミド低減飲食品を提供することができる。

製造例１におけるセルフクローニングに用いたベクターＰｅｎｏＡ１４２の構築手順を示す図である。 製造例２におけるセルフクローニングに用いたｐＳＥＮＳｅｌｆ２プラスミドの構築手順を示す図である。 製造例４および５における染色体上の形質転換用遺伝子断片の模式図を示す。 製造例５におけるサザンブロッティング法による解析結果を示す。図４Ａは、ターミネーター部分を認識するプローブを用いた場合、図４Ｂは、ｐUC１１８部分を認識するプローブを用いた場合の解析結果を示す。 試験例１におけるセルフクローニング麹菌のアミダーゼ比活性の測定結果を示す。 試験例２におけるセルフクローニング麹菌のアミダーゼ遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲ法により測定した結果を示す。 試験例３におけるアクリルアミド添加水でのセルフクローニング麹菌のアクリルアミド低減試験の結果を示す。 試験例４におけるアクリルアミド添加コーヒーでのセルフクローニング麹菌のアクリルアミド低減試験の結果を示す。 試験例５におけるアクリルアミド無添加コーヒーでのアクリルアミド低減試験の結果を示す。図９Ａはアクリルアミド無添加のコーヒー抽出液におけるアクリルアミド低減効果を示し、図９Ｂはアクリルアミド無添加のコーヒー製品におけるアクリルアミド低減効果を示す。 試験例６におけるコーヒー抽出液でのカフェイン低減試験の結果を示す。 試験例７におけるコーヒー抽出液でのリン酸および有機酸量の測定結果を示す。 試験例８におけるコーヒー抽出液でのクロロゲン酸類量の測定結果を示す。 試験例１０におけるコーヒー抽出液での官能評価試験の結果を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、アクリルアミドを分解するタンパク質であるアミダーゼをコードする遺伝子を高発現するセルフクローニング麹菌に関する。本発明が対象とする麹菌は、アクリルアミド分解活性を有するものであれば、いかなるアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）麹菌であっても良いが、アクリルアミド分解活性が高いものが好ましい。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の糸状菌としては、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・グラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｕｓ）、およびアスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）などを挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、歴史的に飲食品として安全に摂取されてきたアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）が挙げられる。

本発明において「セルフクローニング」とは、宿主に導入されたＤＮＡが、当該微生物と分類学上の同一の種に属する微生物のＤＮＡのみであることをいう。食品安全委員会でセルフクローニングであることの認定を受けることにより、当該微生物を「遺伝子組換え体」ではなく、通常の食品微生物として用いることができる。本発明においては、例えば、アスペルギルス・オリゼ由来のＤＮＡを用いて遺伝的に改変されてアミダーゼ遺伝子を高発現するアスペルギルス・オリゼは「セルフクローニング麹菌」である。アスペルギルス・オリゼ由来のアミダーゼタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。また、アスペルギルス・オリゼ由来のアミダーゼ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。

本発明において「核酸分子」とは、ＤＮＡやＲＮＡの遺伝情報の保存、遺伝情報の伝達に関与する分子をいい、特定のタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子、またはこれと相同な遺伝子を含む。「遺伝子」は、自然物に限られず、人工的に生成された遺伝子も含まれる。「相同な遺伝子」とは、当該遺伝子と塩基配列において相同性の高い遺伝子をいい、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有する遺伝子をいう。本発明では、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子またはこれと相同な遺伝子は、自然物だけでなく、人工的にも生成され得る。本発明において「ハイブリダイゼーション」との用語は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）において定義されているように用いられる。「ストリンジェントな条件」とは、塩濃度、有機溶媒、温度、その他の条件によって定義される。すなわち、塩濃度の低下、有機溶媒濃度の増加、またはハイブリダイゼーションの温度上昇などによってストリンジェンシーは増加する。ハイブリダイゼーション後の洗浄条件もストリンジェンシーに影響を与える。洗浄条件においても、塩濃度や温度により影響を受ける。例えばストリンジェントな条件とは、６×ＳＳＣの高イオン濃度下、６５℃でハイブリダイズさせた後、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにより５５℃で１時間洗浄した後に、なおハイブリダイゼーションを形成しているような条件をいう。

本発明において、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子（以下、アミダーゼ遺伝子、または目的遺伝子とも言う）を高発現させるためのセルフクローニング麹菌は、麹菌由来のプロモーター配列、アミダーゼ遺伝子、およびターミネーター配列を有する。さらには、形質転換において好適に利用され得る選択マーカー配列を有していてもよい。前記プロモーターは麹菌において機能し得るプロモーターであればよく、例えば、エノラーゼプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、α−アミラーゼプロモーター、グルコアミラーゼプロモーター、セルラーゼプロモーター、セロビオハイドラーゼプロモーター、アセトアミダーゼプロモーター等のプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。好適には、恒常的に高い転写能を有することからエノラーゼプロモーターが用いられる。

本発明において、「改良エノラーゼプロモーター」とは、麹菌のエノラーゼプロモーター中に麹菌のアミラーゼプロモーター内に共通して存在するシスエレメントであるｒｅｇｉｏｎＩＩＩを１２タンデム導入したプロモーターである。導入前に比べ、２０倍の強さを有する転写能の高いプロモーターである（引用文献：Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６９（１）， ２０６−２０８， ２００５）。

本発明における目的遺伝子は、前記プロモーター配列の下流（３‘末端側）に作用的に連結され得る。「作用的に」連結しているとは、ある２つの核酸配列が、メッセンジャーＲＮＡに転写されるために正しい配向および正しい読み取り枠で連結されていることをいう。形質転換用ベクターを構築するための核酸配列の挿入、連結、および除去などには、公知の遺伝子工学的手法を用いることができる。

本発明のターミネーター配列は、目的遺伝子の発現においてメッセンジャーＲＮＡの転写を停止させる機能があれば特に限定されない。

本発明の選択マーカー配列は、麹菌の形質転換体を作成する際に使用されている選択マーカー配列であれば特に限定されない。例えば、ｓＣマーカー、ｎｉａＤマーカー、ａｒｇＢマーカー、ａｄｅＡマーカー、ｐｔｒＡマーカー、ｐｙｒＧマーカー等を使用することができるが、染色体上にホモロガスに遺伝子導入できるため、安定的な遺伝子発現を期待できるという理由からｓＣマーカーが好ましい。

本発明において、各塩基配列の連結または除去には制限酵素認識配列を使用することができる。制限酵素を用いることにより、大腸菌由来の核酸配列を除去し、セルフクローニング麹菌の作成が容易となる。しかし、形質転換用ベクターには余分な制限酵素配列を含まずに設計することが好ましい。

また本発明において、形質転換用ベクターにはエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡシグナル、複製起点などを付加することができる。

本発明の形質転換体は、麹菌細胞内で目的遺伝子を発現するための発現単位（プロモーター配列、目的遺伝子のオープンリーディングフレーム、ターミネーター配列）が少なくとも１つ含まれるが、前記発現単位が複数含まれていてもよい。本発明において「コピー数１」の形質転換体とは、宿主ＤＮＡに目的遺伝子の発現単位が１つ形質転換されていることを示し、その発現単位の形質転換された数によって、「コピー数２」、「コピー数３」、「コピー数４」、またはそれ以上のコピー数を有する形質転換体があり得る。

本発明において、「ホモロガスな状態での形質転換」とは、宿主の染色体における目的の部位に対して目的遺伝子が挿入されることをいう。また、「ヘテロガスな状態での形質転換」とは、形質転換を行うことにより、宿主の染色体における目的としていない部位に対して目的遺伝子が挿入されることをいう。

本発明において形質転換方法は、例えばプロトプラスト−ＰＥＧ法、カルシウム−ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等の公知の方法を採用できる。プロトプラスト−ＰＥＧ法による遺伝子導入は、Ｎｅｇｒｕｔｉｕ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７） ８：３６３−３７３およびＭａｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．“ＰＥＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎａｌｅｄ ＤＮＡ”、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８２：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載の方法を採用することができる。

麹菌の染色体内に目的遺伝子を含む発現単位が形質転換により挿入されたことは、プローブを用いたサザンブロット法、ＰＣＲ法等の公知の方法により確認することができる。本発明において「プローブ」とは、目的とする配列に対して特異的にハイブリダイズするように設計された分子をいう。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等が挙げられる。

上記形質転換方法により得られた形質転換体は、目的遺伝子を発現し得るため、培養することにより目的タンパク質を得ることができる。形質転換体の培養方法は、麹菌の培養に通常用いられる培地で、通常の培養条件を採用することができる。例えば、ＹＰＤ（Yeast ｐｅｐｔｏｎｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ）培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、デキストロース２％、いずれもｗ／ｖ、ｐＨ６．５）およびＣＤ（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）培地（スクロース３％、ＮａＮＯ_３０．３％、ＭｇＳＯ_４・_７Ｈ_２Ｏ ０．０５％、ＫＣｌ ０．０５％、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ０．０１％、ＦｅＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ ０．００１％、いずれもｗ／ｖ、ｐＨ９．０）等を用いることができるが、これらに限定されない。形質転換体の培養温度の下限は、２５℃以上であり、好ましくは３０℃以上であり、さらに好ましくは３２℃以上である。形質転換体の培養温度の上限は、４５℃以下であり、好ましくは４０℃以下であり、さらに好ましくは３５℃以下である。形質転換体の培養温度が２５℃以上であれば酵素反応の至適温度を下回ることがなく、４５℃以下であれば酵素失活が起こることはない。

得られた目的タンパク質は、必要であれば適宜単離または精製された後、定性分析または定量分析に供されるが、必ずしも精製されなくてもよい。精製方法としては、エタノール沈殿、酸抽出、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、中高圧液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、および超臨界流体クロマトグラフィー等の公知の方法を採用することができる。

本発明において得られたアミダーゼタンパク質の酵素活性は、例えば上記ＹＰＤ培地で培養された麹菌の菌体を、予めアクリルアミドを添加したＭｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液に加えて、一定時間反応後に生成したアクリル酸をＨＰＬＣで定量することにより算出することができる。具体的な一例として、以下の測定方法を示す。麹菌胞子を１×１０^７ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌでＹＰＤ培地を用いて、３０℃、３日間、１００ｒｐｍで振とう培養を行った後、菌体を集菌、洗浄後、液体窒素により凍結させた菌体を乳鉢ですりつぶす。湿菌体量の２倍量の０．１Ｍ−Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、菌体内酵素を抽出する。得られた抽出液０．４ｍｌにアクリルアミド２０００ｐｐｍ含有０．１Ｍ−Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、３０℃で３０分間反応後、０．５Ｎ−ＨＣｌを０．２ｍｌ添加して反応を停止させる。この反応液を０．４５μｍメンブレンフィルターでろ過し、生成したアクリル酸量をＨＰＬＣで定量する。アクリルアミドは東京化成社製を用い、ＨＰＬＣは島津製作所社製ＬＣ−２０１０ＡＨＴ ＨＰＬＣシステム、カラムは資生堂社製ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ８を用いる。移動層は０．１％（ｗ／ｖ）リン酸水溶液、測定条件はカラム温度４０℃、検出波長２００ｎｍ、送液速度１ｍｌ／ｍｉｎで行う。アミダーゼの比活性はタンパク質１ｍｇあたり１分間に生成したアクリル酸量で算出する。本発明のセルフクローニング麹菌のアミダーゼの比活性は、少なくとも２７μｍol／ｍin／ｍｇ以上であり、５０μｍol／ｍin／ｍｇ以上が好ましく、１００μｍol／ｍin／ｍｇ以上がより好ましい。

本発明において得られるセルフクローニング麹菌のアミダーゼ遺伝子の発現量は、公知の方法により測定することが可能であり、例えばリアルタイムＰＣＲ法により測定することができる。リアルタイムＰＣＲ法によれば、ハウスキーピング遺伝子等の発現量を標準として、目的遺伝子であるアミダーゼ遺伝子の発現量の相対値を測定することが可能である。リアルタイムＰＣＲ装置としては７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ２．０（Ｒｏｃｈｅ社製）などを用いることができるが、これらに限定されない（参考文献：Ｗａｔｓｏｎ， Ｒ． １９９３． Ｋｉｎｅｔｉｃ ＰＣＲ： Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６−１０３０）。

リアルタイムＰＣＲ法により、アミダーゼ遺伝子の増幅を検出するためにはプライマー配列としては、以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用することができる。
フォワードプライマー： ＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＴＴＡＧＣＣＡＡＴＧＧ（配列番号３）
リバースプライマー： ＴＧＡＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴ（配列番号４）

リアルタイムＰＣＲ法により、アミダーゼ遺伝子の増幅を検出するためのサイクリング・プロトコル（サイクル条件）としては、５０℃で２分、９５℃で１０分、その後４５サイクルを９５℃で１５秒、６０℃で６０秒で行うことができる。本発明のセルフクローニング麹菌のアミダーゼ遺伝子の発現量は、セルフクローニング前の元株と比較して少なくとも２０００倍以上であり、５０００倍以上が好ましく、１００００倍以上がより好ましい。

本発明により得られたセルフクローニング麹菌は、様々な工業的および商業的な利用法に用いられ得る。例えばセルフクローニング麹菌をアクリルアミド含有物に接触処理することにより、アクリルアミド含有物からアクリルアミドを低減させることが可能である。またセルフクローニング麹菌をアクリルアミド含有飲食品に接触処理することにより、アクリルアミド低減飲食品の製造方法を提供することが可能である。またセルフクローニング麹菌からアミダーゼタンパク質を精製して、アクリルアミド含有物に加えることも可能である。

本発明において「接触処理」とは、アクリルアミド含有物に対して、本発明のセルフクローニング麹菌を物理的に接触させることをいう。アクリルアミド含有物は液体に限らず、固体または粉状物であってもよい。

上記接触処理に際しては、本発明のセルフクローニング麹菌を、そのまま使用することもできるが、担体に保持（以下、固定とも言う）させた状態でアクリルアミド含有物に接触させることもできる。担体としては、乾燥ヘチマ、セルロース、ゲル状ビーズ、多孔性ガラスビーズ、多孔質セラミックス、不織布等の適宜なものを使用することができるが、麹菌の付着のために担体表面が粗いものが好ましく、培養時に本発明のセルフクローニング麹菌が弱らないように多孔性の担体であることが好ましい。乾燥ヘチマは公知の方法で調整することができ、例えば、４ｍｍ角程度に裁断したヘチマを乾燥させて作成することができる。

本発明のセルフクローニング麹菌の固定化の方法としては、公知の方法で採用することができ、例えば結合法および包括法にて行うことができるが、これらに限定されない。結合法は、焼結ガラス、多孔質セラミックス、多孔性ガラスビーズ、キトサン、セライト、シリカゲル、ゼオライト、活性炭、スポンジ、綿等の水不溶性担体にセルフクローニング麹菌を固着させる方法である。包括法は、アルギン酸カルシウム、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、カラギーナン、アガロース、セルロース、デキストリン等の天然または合成のポリマーのマトリクス中に菌体を取り込ませる方法である。

上記接触処理に際しては、適宜な条件によりアクリルアミド含有物と本発明のセルフクローニング麹菌とを接触させることができる。振とう方法としては、回転振とう、往復振とう等の公知の方法を採用することができるが、これらに限定されない。振とう中の溶存酸素濃度を高めるために、往復振とうが好ましい。往復振とう時の回転速度の下限は、５０ｒｐｍ以上で行うことができ、好ましくは８０ｒｐｍ以上で行うことができ、さらに好ましくは９０以上で行うことができる。往復振とう時の回転速度の上限は、２００ｒｐｍ以下で行うことができ、好ましくは１５０ｒｐｍ以下で行うことができ、さらに好ましくは１２０ｒｐｍ以下で行うことができる。５０ｒｐｍ以上の回転速度であれば、菌体吸着量が不足せず、２００ｒｐｍ以下の回転速度であれば、菌体同士が激しく接触することがなく、菌体量が確保できる。振とう時の温度条件の下限は、２５℃以上であり、好ましくは３０℃以上であり、さらに好ましくは３２℃以上である。振とう時の温度条件の上限は、４５℃以下であり、好ましくは４０℃以下であり、さらに好ましくは３５℃以下である。振とう時の温度条件が２５℃以上であれば酵素反応の至適温度を下回ることがなく、４５℃以下であれば酵素失活が起こることはない。

本発明のセルフクローニング麹菌をアクリルアミド含有飲食品と接触処理することにより、アクリルアミド低減飲食品を製造することが可能である。ここで「飲食品」とは、飲料および食品を示しており、「アクリルアミド含有飲食品」とは、アクリルアミドを含む飲食品として知られているものをいい、飲料ではコーヒー、ほうじ茶、緑茶、紅茶、ウーロン茶、ビール、カカオ飲料などが挙げられ、食品では、じゃがいもの加工品であるポテトチップス、フライドポテトなど、穀物加工品であるトースト、朝食用シリアルなど、チョコレート製品、乳製品、ココアパウダー、乳幼児用ビスケット、またはベビーフードなどが挙げられるが、これらに限定されない。

アクリルアミド低減飲料を製造する場合は、液体の飲料に本発明のセルフクローニング麹菌を接触させて処理することで、アクリルアミドを低減させる。その後、セルフクローニング麹菌を沈殿、ろ過等の公知の分離方法により除去するか、高温、低温、凍結等の公知の方法により不活化させることができるが、これらに限定されない。また、食用としての安全性が認められる場合は、セルフクローニング麹菌の除去や不活化を行わずにアクリルアミド低減飲料とすることも可能である。

アクリルアミド低減食品を製造する場合は、製造段階において、本発明のセルフクローニング麹菌を食品の原料に混ぜ込むこと、または、固体の食品に対して、本発明のセルフクローニング麹菌を含む液体を噴霧することができるが、これらに限定されない。食品が製造段階において液状物である場合は、この液状物に本発明のセルフクローニング麹菌を接触させて処理することができる。本発明のセルフクローニング麹菌と接触処理した液状物を、固形物に加工すること、またはフリーズドライ処理等の方法により、急速に凍結乾燥させて加工することも可能である。

本発明のセルフクローニング麹菌を接触処理することにより、処理前と比較してカフェインをも低減させたアクリルアミド低減飲食品を製造することもできる。

本発明のセルフクローニング麹菌を接触処理することにより、処理前と比較してクエン酸、リンゴ酸、キナ酸、グリコール酸、乳酸、ギ酸、酢酸等の有機酸を低減させ、かつ処理前と比較してリン酸を増加させたアクリルアミド低減飲食品を製造することもできる。

本発明のセルフクローニング麹菌を接触処理することにより、処理前と比較してモノクロロゲン酸、フェルロイルキナ酸、ジカフェオイルキナ酸等のクロロゲン酸類を低減させたアクリルアミド低減飲食品を製造することができる。

本発明のセルフクローニング麹菌を接触処理することにより、処理前と比較して１−プロパノール、酢酸エチル、２−メチル−１−ブタノール、イソブチルアルコール、イソアミルアルコールなどの香気成分を増加させたアクリルアミド低減飲食品を製造することができる。これらの香気成分は、処理前と比較して、２倍増加させることができ、好ましくは５倍、さらに好ましくは８倍増加させることができる。

アクリルアミド低減飲食品がコーヒーである場合は、本発明のセルフクローニング麹菌を接触処理したことにより、様々な香気成分が増減して、コーヒーに花のような香りを与え、苦味や濃厚感の少ない軽い風味のコーヒーとすることができる。

次に、製造例、試験例等により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［製造例１］（ＰｅｎｏＡ１４２の作成手順）
ｐＳＥＮＳｅｌｆ２プラスミドの作成手順を、図１および図２に沿って説明する。図１に示すように、アスペルギルス・オリゼ由来の改良プロモーターであるＰｅｎｏＡ１４２の作成手順を説明する。プラスミドｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）を制限酵素ＤｒａＩＩＩおよびＳａｌＩで消化した。ＰｅｎｏＡ前半部分をプライマーＸ１（配列番号５）、Ｙ１（配列番号６）を用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株（独立行政法人酒類総合研究所より入手）のゲノムを鋳型として、ＰＣＲ法による増幅を行い、制限酵素ＤｒａＩＩＩにより消化をして、さらにｒｅｇｉｏｎＩＩＩをプライマーＸ２（配列番号７）、Ｙ２（配列番号８）を用いて、ＰＣＲ法による増幅を行い、制限酵素ＸｈｏＩ処理後に平滑末端化後、制限酵素ＳａｌＩで消化した。次に上述のｐＵＣ１１８、ＰｅｎｏＡ前半部分、およびｒｅｇｉｏｎＩＩＩの３断片をライゲーションした。

次に、得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩ消化した。ＰｅｎｏＡ後半部分をプライマーＸ３（配列番号９）、Ｙ３（配列番号１０）を用いてＰＣＲ法による増幅を行い、制限酵素ＳａｌＩで消化した後、２断片をライゲーションした。

続いて、得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、脱リン酸化した。さらにｒｅｇｉｏｎＩＩＩをプライマーＸ４（配列番号１１）、Ｙ４（配列番号１２）を用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のゲノムを鋳型として、ＰＣＲ法による増幅を行い、制限酵素ＥｃｏＲＶ処理後にリン酸化した。これら２断片をライゲーションした。

続いて、得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、脱リン酸化した。さらにｒｅｇｉｏｎＩＩＩをプライマーＸ４（配列番号１１）、Ｙ４（配列番号１２）を用いて得られたプラスミドを鋳型として、ＰＣＲ法による増幅を行い、制限酵素ＥｃｏＲＶ処理後にリン酸化した（ｒｅｇｉｏｎＩＩＩ２タンデム断片）。これら２断片をライゲーションした。これにより得られたプラスミドに上述の方法でさらに２個のｒｅｇｉｏｎＩＩＩ２タンデム断片をライゲーションした。この方法を２回繰り返し、ｒｅｇｉｏｎＩＩＩの個数を６個にした。

得られたｒｅｇｉｏｎＩＩＩ６タンデムを有するプラスミドを鋳型としｒｅｇｉｏｎＩＩＩ６個をプライマーＸ５（配列番号１３）、Ｙ４（配列番号１２）を用いて、ＰＣＲ法による増幅を行い、制限酵素ＥｃｏＲＶ処理後にリン酸化した。この断片を同プラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＶ部位に導入した。これによりＰｅｎｏＡ１４２（ｐＵＣ１１８−ＰｅｎｏＡ１４２）を構築した。

［製造例２］（ｐＳＥＮＳｅｌｆ２プラスミドの構築）
図２に示すように、前述のＰｅｎｏＡ１４２（ｐＵＣ１１８−ＰｅｎｏＡ１４２）を制限酵素ＳａｌＩおよびＳａｐＩにて消化した。２５１２ターミネーターをプライマーＸ６（配列番号１４）、Ｙ６（配列番号１５）を用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株ゲノムを鋳型として、ＰＣＲ法による増幅を行い、制限酵素ＳａｌＩ処理後にリン酸化した。次に、後半１０５０塩基を欠失したｓＣマーカーをプライマーＸ７（配列番号１６）、Ｙ７（配列番号１７）を用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株ゲノムを鋳型として、ＰＣＲ法による増幅を行い、制限酵素ＳａｐＩ処理後にリン酸化した。続いてこれらの３断片をライゲーションした。

得られたプラスミドを制限酵素ＮａｒＩおよびＰｓｈＡＩにて消化した。次に前半５６５塩基を欠失したｓＣマーカーをプライマーＸ８（配列番号１８）、Ｙ８（配列番号１９）を用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株ゲノムを鋳型として、ＰＣＲ法による増幅を行い、制限酵素ＮａｒＩおよびＰｓｈＡＩにて処理した。次にこれら２断片をライゲーションした。

これによりｐＳＥＮＳｅｌｆ２プラスミドを構築することができた。ｐＳＥＮＳｅｌｆ２プラスミドへのアミダーゼ遺伝子導入後に制限酵素ＫｐｎＩで消化し、アミダーゼ遺伝子を有する断片を精製すれば、麹菌以外の配列を１塩基も持たない遺伝子断片を取得することができる。この断片を用いて麹菌の形質転換を行うことにより、外来の塩基を１塩基も持たないセルフクローニング株の取得が可能となった。

［製造例３］（ｐＳＥＮＳｅｌｆ２−ａｍｉｄａｓｅプラスミドの作成）
得られたｐＳＥＮｓｅｌｆ２プラスミドを制限酵素ＰｍｌIおよびＮｒｕIにより消化し、アガロースゲル電気泳動により単離、精製後に脱リン酸化した。プライマーＸ９（配列番号２０）、Ｙ９（配列番号２１）を用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株ゲノムを鋳型として、ＰＣＲ法による増幅を行い、制限酵素ＰｍｌＩおよびＮｒｕＩにて消化し、リン酸化した。プライマーＸ９（配列番号２０）にはｅｎｏＡ ５’ＵＴＲの３’端の５塩基、プライマーＹ９（配列番号２１）には２５１２ターミネーターの５’端の６塩基を含んでおり、この断片をライゲーションにて導入した。これにより、ｐＳＥＮＳｅｌｆ２−ａｍｉｄａｓｅプラスミドを構築することができた。

［製造例４］（形質転換用遺伝子断片の作成）
得られたｐＳＥＮｓｅｌｆ２−ａｍｉｄａｓｅプラスミドを大腸菌DH5αに遺伝子導入し、その大腸菌を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地５０ｍＬで、３７℃、一晩培養した後、遠心分離により大腸菌を回収した。市販のプラスミドＤＮＡ精製キット（キアゲン社製ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）を用いて大腸菌からプラスミドを精製抽出した。次いでこのプラスミドを制限酵素KpnIおよびSwaIで消化し、アガロースゲル電気泳動により、約７．５ｋｂｐのｓＣマーカーとアミダーゼ遺伝子からなる形質転換用遺伝子断片を切り出し、精製を行った。

［製造例５］（形質転換体の作成およびサザンブロッティング法による確認）
得られた形質転換用遺伝子断片１０μｇを用いて、プロトプラスト−ＰＥＧ法（参考文献：生物工学会誌第76巻、第5号、１８７−１９３、１９９８）により、アスペルギルス・オリゼNS4株（ＲＩＢ４０株から派生した、ｎｉａＤおよびｓＣ二重欠損株：独立行政法人酒類総合研究所から分譲）（参考文献：Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１（８）， １３６７−１３６９， １９９７）を形質転換し、３０株の形質転換体を得た。これら形質転換体をデキストリン・ペプトン培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％KＨ_２ＰＯ_４、０．０５％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）で３０℃、３日間振とう培養した後、培養液と菌体を分離した。

ΔΔＣＴ法（参考文献：Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ： ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ： Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２ ： Ｒｅｖ Ｂ）を用いて、各株に挿入された形質転換用遺伝子断片のコピー数を確認した。すなわち、ゲノム中に1コピー存在する遺伝子をコントロールとしてリアルタイムPCRを行い、その比からコピー数の推定を行った。この結果、３０株のうち、形質転換用遺伝子断片が挿入されたコピー数がコピー数１であるものは１３株、コピー数２であるものは９株、コピー数３であるものは２株、コピー数４であるものは２株であった。形質転換用遺伝子断片が挿入されなかったものは４株であった。

染色体上の形質転換遺伝子断片の模式図を図３に示す。上段のシングルコピー（コピー数１）では、セルフクローニング麹菌の染色体上に形質転換用遺伝子断片が１つ組み込まれた状態を示している。下段のマルチコピーでは、セルフクローニング麹菌の染色体上に形質転換用遺伝子断片が複数組み込まれた状態（この図ではコピー数２）を示している。

次いで、得られた形質転換体から４株を選び、常法によりゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを、制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、ターミネーター部分またはｐＵＣ１１８部分を認識するプローブを用いてサザンブロッティング法により解析を行った。図３において、ターミネーター配列上部の横棒は、下記サザンブロッティング法におけるプローブの認識部位を示している。斜体文字Ｂで示す制限酵素による切断部によりシングルコピー株では１１．６ｋｂｐ、マルチコピー株では１１．６ｋｂｐおよび７．６ｋｂｐが形成されることが示されている。また、ＢｇｌＩＩはベクターのｐＵＣ１１８部分を切断することはないため、ｐＵＣ１１８部分が仮に混入し、それがゲノムに組み込まれていたとしても、検出することができる。

サザンブロッティング法による解析結果を図４に示す。図４Ａは、ターミネーター部分を認識するプローブを用いた場合、図４Ｂは、ｐＵＣ１１８部分を認識するプローブを用いた場合の解析結果を示している。図４Ａに示すように、サンプル番号１１、１８、２６では、１１．６ｋｂｐおよび７．６ｋｂｐの２本のバンドが検出され形質転換用遺伝子断片が宿主染色体にホモロガスな状態で挿入されていることが確認された。サンプル番号６では、７．６ｋｂｐのバンドは検出されたが、１１．６ｋｂｐのバンドは検出されなかったため、形質転換用遺伝子断片が宿主染色体にヘテロガスな状態で挿入されていることが確認された。なお、３．７ｋｂｐのバンドは、宿主ゲノム上に存在するターミネーターに由来する。図４Ｂに示すように、ｐUC１１８部分を認識するプローブを用いた場合、サンプル１１、１８、２６では、バンドが検出されなかった。この解析結果から、形質転換体のゲノムには、大腸菌プラスミド由来のＤＮＡは挿入されておらず、形質転換体はセルフクローニング株であることが確認できた。

[試験例１]（セルフクローニング麹菌のアミダーゼ比活性の測定）
セルフクローニングを行う前の元株（親株ともいう）であるＮＳ４株、コピー数１の麹菌株、コピー数２の麹菌株、コピー数３の麹菌株、およびコピー数４の麹菌株は、ＹＰＤ（Yeast ｐｅｐｔｏｎｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ）培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、デキストロース２％、いずれもｗ／ｖ、ｐＨ６．５）を用いて、２×１０^７ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ、３０℃、３日間、１００ｒｐｍで振とう培養を行った。Ｎｏ．１００株はＹＰＤ培地で３０℃、３日間、１００ｒｐｍで振とう培養を行った後、２００ｐｐｍアクリルアミド添加ＣＤ（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）培地（スクロース３％、ＮａＮＯ_３０．３％、ＭｇＳＯ_４・_７Ｈ_２Ｏ ０．０５％、ＫＣｌ ０．０５％、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ０．０１％、ＦｅＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ ０．００１％、いずれもｗ／ｖ、ｐＨ９．０）を用いて、３５℃、２日間、１００ｒｐｍで振とう培養を行った。ここで、Ｎｏ．１００株はセルフクローニングされた菌株ではなく、アクリルアミド添加ＣＤ培地で誘導培養を行うことにより、従来株より多くのアミダーゼを産生することが知られている株である（特許文献１）。

アミダーゼ比活性の測定結果を図５に示す。図５の縦軸は測定されたアミダーゼの比活性値（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）、横軸は実験に用いた菌株の種類を示す。麹菌胞子を１×１０^７ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌでＹＰＤ培地を用いて、３０℃、３日間、１００ｒｐｍで振とう培養を行った後、菌体を集菌、洗浄後、液体窒素により凍結した菌体を乳鉢ですりつぶし、湿菌体量の２倍量の０．１Ｍ−Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、菌体内酵素を抽出した。得られた抽出液０．４ｍｌにアクリルアミド２０００ｐｐｍ含有０．１Ｍ−Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、３０℃で３０分間反応後、０．５Ｎ−ＨＣｌを０．２ｍｌ添加して反応を停止させた。

この反応液を０．４５μｍメンブレンフィルターでろ過し、生成したアクリル酸量をＨＰＬＣで定量した。アミダーゼの比活性はタンパク質１ｍｇあたり１分間に生成したアクリル酸量で表した。アクリルアミドは東京化成社製を用いた。ＨＰＬＣは島津製作所社製ＬＣ−２０１０ＡＨＴ ＨＰＬＣシステム、カラムは資生堂社製ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ８を用いた。移動層は０．１％（ｗ／ｖ）リン酸水溶液、測定条件はカラム温度４０℃、検出波長２００ｎｍ、送液速度１ｍｌ／ｍｉｎで行った。

［試験例２］（セルフクローニング麹菌のアミダーゼ遺伝子発現量の測定）
セルフクローニング麹菌におけるアミダーゼ遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ法で測定した結果を図６に示す。図６の縦軸はセルフクローニングを行っていない元株（ＮＳ４）を１とした各麹菌株のアミダーゼ遺伝子の発現量を示す。横軸は実験に用いた麹菌株の種類を示す。リアルタイムＰＣＲ装置は、７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、アミダーゼ遺伝子の増幅を検出するためにはプライマー配列としては、以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用した。
フォワードプライマー： ＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＴＴＡＧＣＣＡＡＴＧＧ（配列番号３）
リバースプライマー： ＴＧＡＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴ（配列番号４）

アミダーゼ遺伝子の増幅を検出するためのサイクリング・プロトコルは、５０℃で２分、９５℃で１０分、その後４５サイクルを９５℃で１５秒、６０℃で６０秒の条件で行った。

［試験例３］（アクリルアミド添加水におけるアクリルアミド低減試験）
セルフクローニングを行う前の元株であるＮＳ４株、コピー数１の麹菌株、コピー数２の麹菌株、コピー数３の麹菌株、およびコピー数４の麹菌株は、ＹＰＤ（Yeast ｐｅｐｔｏｎｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ）培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、デキストロース２％、いずれもｗ／ｖ、ｐＨ６．５）を用いて、３０℃、３日間、１００ｒｐｍで振とう培養を行った。

乾燥ヘチマは、市販のヘチマを4ｍｍ角程度に裁断して、栄養源として、ヘチマ０．５ｇにＹＰＤ培地１．５ｍｌを吸着させ、オートクレーブにより滅菌処理した後、６０℃で２４時間乾燥させることで作成した。１００ｍｌの容器にその乾燥ヘチマ０．５ｇとＹＰＤ培地４０ｍｌを加え、オートクレーブにより滅菌処理した後、各セルフクローニング麹菌を２×１０^７ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ植菌後、３０℃、３日間、１００ｒｐｍで振とう培養を行うことにより、各菌株を乾燥ヘチマに固定した。この固定化菌株を滅菌水で洗浄した。Ｎｏ．１００株はアミダーゼの産生を誘導するため、２００ｐｐｍアクリルアミド添加ＣＤ培地を用いて３０℃で３日間、１００ｒｐｍで振とう培養を行った。ここで乾燥ヘチマは菌体が付着しやすく、かつ菌体の生育に適している。振とう培養を行っても菌体を傷つけずに乾燥ヘチマに保持できるため、菌体を固定化した乾燥ヘチマを再利用することも可能である。

アクリルアミド１０ｐｐｍ添加水に前記固定化菌株を加え、３５℃、１００ｒｐｍで往復振とうさせることにより反応を開始した。反応開始後０時間、２時間、４時間、６時間、２４時間で反応液を回収して、０．４５μｍフィルターでろ過後、ＨＰＬＣでアクリルアミドの濃度を測定した。アクリルアミド１０ｐｐｍ添加水におけるアクリルアミド低減試験の結果を図７に示す。図７の縦軸はアクリルアミドの残存率（％）、横軸は各セルフクローニング麹菌を接触処理した経過時間を示す。図７において、Ｎｏ．１００株はセルフクローニングされた菌株ではなく、２００ｐｐｍアクリルアミド添加ＣＤ培地で誘導培養を行うことにより、従来株より多くのアミダーゼを産生することが知られている株であり、ＮＳ４株はセルフクローニングを行う前の元株である。また、サンプル番号のａｍｄ＃２は、コピー数１のセルフクローニング麹菌株を示し、サンプル番号のａｍｄ＃１は、コピー数２のセルフクローニング麹菌株を示し、サンプル番号のａｍｄ＃１８は、コピー数３のセルフクローニング麹菌株を示し、サンプル番号のａｍｄ＃１１は、コピー数４のセルフクローニング麹菌株を示している。

ここで往復振とうによる反応は、反応液中の溶存酸素濃度を増加させることにより、アクリルアミド低減効率を高めることができるため有効である。ここで反応温度を３５℃に設定することにより、酵素分解の最適温度であることにより、アクリルアミド低減効率を高めることができるため有効である。

［試験例４］（アクリルアミド添加コーヒーにおけるアクリルアミド低減試験）
アクリルアミド１０ｐｐｍ添加コーヒーに前記固定化菌株を加え、３５℃、１００ｒｐｍで往復振とうさせることにより反応を開始した。反応開始後０時間、２時間、４時間、６時間、２４時間で反応液を回収して、０．４５μｍフィルターでろ過後、ＨＰＬＣでアクリルアミドの濃度を測定した。アクリルアミド１０ｐｐｍコーヒーにおけるアクリルアミド低減試験の結果を図８に示す。縦軸はアクリルアミドの残存率（％）、横軸は菌株を接触処理した経過時間を示す。図８において、各麹菌のサンプル番号は試験例３と同様である。

[試験例５]（アクリルアミド無添加コーヒーにおけるアクリルアミド低減試験）
アクリルアミド無添加のコーヒー抽出液におけるアクリルアミド低減効果をＧＣ−ＭＳにより測定した結果を図９Ａに示す。図９Ａの縦軸はアクリルアミドの残存量（ｐｐｂ）、横軸は本発明のセルフクローニング麹菌を接触処理した経過時間を示す。コーヒー豆（Ｌ値１７．７）を粉砕した後、９５℃の熱水を加水比１：１７になるように加水し抽出を行った後、室温まで自然冷却して、コーヒー抽出液とした。このコーヒー抽出液に、前記固定化菌株（コピー数４の麹菌株）を加え、３５℃、１００ｒｐｍで往復振とうさせることにより反応を行った。コーヒー抽出液に対し、前処理として固層抽出を行いサンプル中の夾雑物の除去を行なった。

その後、誘導体化を行なった後ＧＣ−ＭＳ（ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０、島津製作所製）に供した。ＧＣ条件としては、膜厚１．０μｍのＺＢ−１（３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．、島津ジーエルシー株式会社製）カラムを用いて、カラム温度は、７０℃で１分間、１２℃／分で１２０℃まで温度上昇させ、１２０℃からは５℃／分で１６０℃まで上昇させ、その後２０℃／分で温度上昇させて３００℃で５分間に設定した。気化室温度は２７０℃、キャリアガスはヘリウムガスを用いた。線速度は５５ｃｍ／ｓｅｃで行った。ＭＳ.条件としては、イオン源２７０℃、検出器電圧が０．０５ｋｖ、ＳＩＭサンプレートは０．２秒、選択イオンはアクリルアミド、アクリルアミド１３Ｃ３、ナフタレン−ｄ８、フェナンスレンを用いた。

アクリルアミド無添加のコーヒー製品におけるアクリルアミド低減効果をＧＣ−ＭＳにより測定した結果を図９Ｂに示す。図９Ｂの縦軸はアクリルアミドの残存量（ｐｐｂ）、横軸は麹菌を接触処理した経過時間を示す。コーヒー製品は、一般的な生産工程により製造、販売されている缶コーヒー（無糖タイプ：ＢＲＩＸ１．０）の内容液を用いた。この缶コーヒーに、前記固定化菌株（コピー数４の麹菌株）を加え、３５℃、１００ｒｐｍで往復振とうさせることにより反応を行った。その後、誘導体化を行なった後、上記条件で、ＧＣ−ＭＳ（ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０、島津製作所製）に供した。

［試験例６］（コーヒー抽出液でのカフェイン低減試験）
上記コーヒー抽出液中におけるカフェイン量の経時的変化を測定した結果を図１０に示す。図１０の縦軸はカフェイン量（ｍｇ／１００ｍｌ）、横軸は処理時間（時間）を示している。コーヒー抽出液の調整、固定化菌株（コピー数４の麹菌株）との接触、および反応は試験例５に記載の方法により行った。検量線は、β−フェネチルアルコールを内部標準とし、HPLCクロマトグラムより得られるカフェインとβ−フェネチルアルコールの面積比を求めることにより作成した。コーヒー抽出液中のカフェインをHPLCにて分析し、カフェインとβ−フェネチルアルコールの面積比を求め、試料中のカフェイン含有量を算出した。ＨＰＬＣ用のカラムは、Nucleosil １０ C１８（２５０mm×４mm I.D.）を用い、移動層はメタノールと０．２M過塩素酸とを２：８の割合で混合した溶液を用い、流速は１．０mＬ/minで行った。検出には、紫外線分光光度計（検出波長２７０ｎｍ）を用いた。

［試験例７］（コーヒー抽出液でのリン酸および有機酸量の測定結果）
コーヒー抽出液中のリン酸および有機酸（クエン酸、リンゴ酸、キナ酸、グリコール酸、乳酸、ギ酸、酢酸）の定量をＨＰＬＣによるポストラベル（ＢＴＢ指示薬）検出法にて行なった結果を図１１に示す。図１１の縦軸はコーヒー抽出液中のリン酸および有機酸の含有量（ｍｇ／１００ｍｌ）、横軸はセルフクローニング麹菌とコーヒー抽出液との接触処理時間を示している。コーヒー抽出液の調整、固定化菌株（コピー数４の麹菌株）との接触、および反応は試験例５に記載の方法により行った。カラムはＳｈｏｄｅｘ ＲＳｐａｋ ＫＣ−８１１（３０ｃｍ ｘ ８ｍｍ Ｉ．Ｄ． ×４）を用い、カラム温度は６０℃、移動相は３ｍＭ ＨＣｌＯ_４ ／ Ｈ_２Ｏを用い、移動相流速は１ｍｌ／ｍｉｎで行った。ラベル化液は１５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２ｍＭ ＮａＯＨ、０．２ｍＭ ＢＴＢを用い、ラベル化液の流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。検出には、紫外線分光光度計（検出波長４４５ｎｍ）を用いた。

［試験例８］（コーヒー抽出液でのクロロゲン酸類量の測定結果）
コーヒー抽出液中のクロロゲン酸類（モノクロロゲン酸類、フェルロイルキナ酸類、ジカフェオイルキナ酸類）の定量をHPLCにより行った結果を図１２に示す。図１２の縦軸はコーヒー抽出液中のクロロゲン酸類の含有量（ｍｇ／ｍｌ）、横軸はセルフクローニング麹菌とコーヒー抽出液との接触処理時間を示している。コーヒー抽出液の調整、固定化菌株（コピー数４の麹菌株）との接触、および反応は試験例５に記載の方法により行った。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（１５０ｍｍ ｘ ４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．）を用い、カラム温度は４０℃、移動相はＡ）１０mM リン酸緩衝液、およびＢ）１０ｍＭリン酸のアセトニトリル溶液を用い、移動相流速は１mｌ／ｍｉｎで行った。ＨＰＬＣ時のグラジエント条件を表１に示す。
（ＨＰＬＣ時のグラジエント条件）

［試験例９］（コーヒー抽出液での香気成分の変化）
セルフクローニング麹菌との接触処理によるコーヒー抽出液中の香気成分の変動をＧＣ−ＭＳにより測定した結果を表２に示す。表２に記載の香気成分のうち、接触処理により増加した香気成分を表３に示す。コーヒー抽出液の調整、固定化菌株（コピー数４の麹菌株）との接触、および反応は試験例５に記載の方法により行った。ヘッドスペース条件は、温度６０℃、保温時間３０ｍｉｎ、トランスファー温度１８０℃、ニードル温度１２０℃、試料注入時間０．１ｍｉｎ、キャリアガス圧力１１０ｋＰａで行った。ＧＣ条件は、カラムＺＢ１０．３２ｍｍＩ．Ｄ．膜厚３．０μｍ、カラム温度４０℃(５ｍｉｎ)−５℃／ｍｉｎ−６０℃−１５℃／ｍｉｎ−２５０℃(３ｍｉｎ)、Ｈｅ圧力８０ｋＰａ、注入口温度２５０℃、スプリット比０、スプリット流量２０．４ｍＬ／ｍｉｎで行った。ＭＳ条件は、インターフェース温度３００℃、ＳＩＭサンプリングレート０．２秒で行った。

［試験例１０］（官能評価試験）
セルフクローニング麹菌との接触処理によるコーヒーの香味の変化についての官能評価試験結果を図１３に示す。図１３の縦軸は、各評価項目についての平均評点、横軸は各評価項目の別を示している。各評価項目について４種の棒グラフがあり、左から順に、接触処理前、接触処理後３時間、接触処理後６時間、または接触処理後１６時間における評価結果を示している。

UCC上島珈琲株式会社R&Dセンターに所属する２０〜４０代の中から男性７名、女性４名の合計１１名（平均年齢30.5歳）をパネラーとして選出し官能評価試験を実施した。コーヒー抽出液の調整、固定化菌株（コピー数４の麹菌株）との接触、および反応は試験例５に記載の方法により行った。そのコーヒー抽出液試料および無処理試料（コントロール）を適宜プラスチック容器に分注し、サンプル名は記号化し、品温１０℃で供試し、官能検査室で実施した。コーヒー抽出液試料は、試験例５のアクリルアミド無添加コーヒーの調整条件に準じた。

評価項目はＨａｙａｋａｗａらの提案した属性評価用語を参考に、香りの質として「花のような香り」、「果実のような香り」、「カラメルのような香り」、味覚の評価として「酸味」、「苦味」、「渋味」、「濃厚感」、「後味」を選定した（参考文献：Ｈａｙａｋａｗａ, Ｆ., Ｋａｚａｍｉ, Ｙ., Ｗａｋａｙａｍａ，Ｈ., Ｏｂｏｓｈｉ, Ｒ., Ｔａｎａｋａ, Ｈ., Ｍａｅｄａ, Ｇ., Ｈｏｓｈｉｎｏ, Ｃ., Ｉｗａｗａｋｉ, Ｈ ａｎｄ Ｉｙａｂａｙａｓｈｉ, Ｔ. Sｅｎｓｏｒｙ Lｅｘｉｃｏｎ ｏｆ Bｒｅｗｅｄ Cｏｆｆｅｅ ｆｏｒ JａｐａｎｅｓｅCｏｎｓｕｍｅｒｓ, Uｎｔｒａｉｎｅｄ Cｏｆｆｅｅ Pｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｓ ａｎｄ Tｒａｉｎｅｄ Cｏｆｆｅｅ Ｔａｓｔｅｒｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｅｎｓｏｒｙ ｓｔｕｄｉｅｓ，２５ （２０１０） ９１７−９３９．）。評価尺度は０を中心に＋４点から−４点までの９段階の絶対評価を官能評価用紙に自己記入することにより実施した。さらに同じ官能用紙にコメント欄を設け、パネラーは自由に感想を記述した。匂いについてはサンプルを鼻先で嘆いで評価し、その他の属性についてはサンプルをロに含んで評価を行った。評価結果についてはデータを回収した後、ＳＰＳＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １７．０ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（エス・ピー・エス・エス(株)）を用いて多重比較を行った。自由記述によるコメントについては、「日本酒や甘酒を連想させる香り」「アルコールを感じる香り」「香りが良い」との回答があった。

アミダーゼ遺伝子をエノラーゼプロモーター遺伝子の下流に接続して遺伝子導入を行ったセルフクローニング麹菌を作成することによって、誘導培養をすることなく、アミダーゼ遺伝子を発現させることが可能となり、アクリルアミドを低減させた飲食品の製造が可能となる。

Claims (11)

1. 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子または前記ポリペプチドをコードする遺伝子と相補的な塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列を有し、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、誘導培養なしに発現し得る状態で導入されたセルフクローニング麹菌。
2. 前記遺伝子が、改良エノラーゼプロモーターの下流に作用的に連結されている請求項１記載のセルフクローニング麹菌。
3. アミダーゼの比活性が少なくとも２７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上である、請求項１または２記載のセルフクローニング麹菌。
4. リアルタイムＰＣＲ法において、アミダーゼ遺伝子の発現量がセルフクローニング前の元株と比較して少なくとも２０００倍以上である、請求項１〜３のいずれか１項記載のセルフクローニング麹菌。
5. アクリルアミド含有物からアクリルアミドを低減させる方法であって、前記請求項１〜４のいずれか１項記載の麹菌を、前記アクリルアミド含有物と接触処理する工程を含む方法。
6. 前記請求項１〜４のいずれか１項記載の麹菌が、乾燥ヘチマ、セルロース、ゲル状ビーズ、多孔性ガラスビーズ、多孔質セラミックス、および不織布からなる群より選択される担体に保持されている、請求項５記載の方法。
7. アクリルアミド低減飲食品の製造方法であって、前記請求項１〜４のいずれか１項記載の麹菌を、アクリルアミド含有飲食品と接触処理する工程を含む方法。
8. 前記請求項１〜４のいずれか１項記載の麹菌が、乾燥ヘチマ、セルロース、ゲル状ビーズ、多孔性ガラスビーズ、多孔質セラミックス、および不織布からなる群より選択される担体に保持されている、請求項７記載の方法。
9. 前記請求項１〜４のいずれか１項記載の麹菌を接触処理することにより、処理前と比較してアクリルアミドの残存率が５０％以下である飲食品。
10. セルフクローニング麹菌を接触処理することにより、１−プロパノール、酢酸エチル、２−メチル−１−ブタノール、イソブチルアルコール、イソアミルアルコール、エタノール、および２−ペンタノンが、処理前と比較してそれぞれ２倍以上増加した飲食品。
11. アクリルアミドの含有量が４ｐｐｂ以下であるコーヒー飲料。
    

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