JP2013137311A5

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Publication number: JP2013137311A5
Application number: JP2012273726A
Authority: JP
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2014-05-22
Anticipated expiration: 2023-04-11

Claims

少なくとも1つのNLSおよび光学的に検出可能なポリヌクレオチド若しくはペプチドを含む検出用部分を含む膜貫通型タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、少なくとも1つのヌクレオチド配列（ここで、野生型の膜貫通型タンパク質はNLSおよび検出用部分を含まず、該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列がNLS及び検出用部分をコードするように修飾されている。）を含む、単離された細胞。
該ヌクレオチド配列が、RRR-(11 aa)-KRRK、KK-(15 aa)-KKRK、KRKRRP、PKKNRLRRK、KRQR-(20 aa)-KKSKK、PAAKRVKLD、QRKRQK、HRIEEKRKRTYETFKSI、KKKYKLK、KKFKR、AFSAKKFKR、KSKKKAQ、PKKKRKV、KKKKRKREK、LKRPRSPSS、KRK-(22 aa)-KELQKQITK、GKKKYKLKH、EED-(350 aa)-KKKRERLD、CYFQKKAANMLQQSGSKNTGAKKRK、DILRR-(323 aa)-PKQKRK、SSDDEATADSQHSTPPKKKRKV、RKKRK-(9 aa)KAKKSK、KR-(11 aa)-KKLR、RRPS-(22 aa)-RRKRQK、KR-(10 aa)-KKKL、RKRK-(7 aa)-RRSRYRK、およびMISEALRKAから選択されるNLSをコードするように修飾されている、請求項1記載の細胞。
細胞内における該検出用部分の分布が、該検出用部分に特異的な抗体を含む抗体ベースの検出系に対する結合を可能とすることで決定される、請求項1記載の細胞。
該抗体ベースの検出系が、（i）該検出用部分に特異的な第1の抗体、および光学的に検出可能な標識を有し、かつ該第1の抗体に特異的な第2の抗体を含むか、または(ii) 該検出用部分に特異的で、かつ光学的に検出可能な標識を有する第1の抗体を含む、請求項3記載の細胞。
該光学的に検出可能な標識が、発光標識または蛍光標識である、請求項4記載の細胞。
該光学的に検出可能なポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、およびこれらの修飾型異型からなる群より選択されるポリペプチドである、請求項1記載の細胞。
該膜貫通型タンパク質が、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）、輸送体、サイトカイン受容体、チロシンキナーゼ受容体、および低密度リポタンパク質（LDL）受容体からなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載の細胞。
該GPCRが、ドーパミンD1受容体、ドーパミンD2受容体、ドーパミンD3受容体、ドーパミンD5受容体、ヒスタミン1受容体、システイニルロイコトリエン受容体1、システイニルロイコトリエン受容体2、オピオイド受容体、ムスカリン受容体、セロトニン受容体、β2-アドレナリン受容体、および代謝共役型グルタミン酸4受容体からなる群より選択される、請求項7記載の細胞。
該輸送体が、ドーパミン輸送体およびセロトニン輸送体からなる群より選択される、請求項7記載の細胞。
該サイトカイン受容体が、エリスロポイエチン受容体およびインスリン受容体からなる群より選択される、請求項7記載の細胞。
該チロシンキナーゼ受容体が、上皮成長因子受容体およびインスリン受容体からなる群より選択される、請求項7記載の細胞。
個々の配列が少なくとも1つのNLSを含む異なる膜貫通型タンパク質を含むタンパク質をコードする、複数のヌクレオチド配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の細胞。
該個々のヌクレオチド配列が、異なる検出用部分を含むタンパク質をコードする、請求項12記載の細胞。
以下の段階を含む、少なくとも1つの膜貫通型タンパク質と相互作用する能力に関して候補化合物をスクリーニングする方法：
少なくとも1つの核局在配列（NLS）および検出用部分を含む膜貫通型タンパク質を含むタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列でトランスフェクトされ、該コードされたタンパク質を細胞内で発現する細胞に候補化合物を接触させる段階；ならびに
細胞内における該検出用部分の分布を検出することで、該細胞内における該発現されたタンパク質の分布を決定する段階；
ここで、候補化合物を接触させなかった対照細胞に対して、該候補化合物と接触させた細胞内で細胞膜において該検出用部分が保持されることは、該候補化合物が該膜貫通型タンパク質と相互作用することを示す。
該検出用部分が、該膜貫通型タンパク質のアミノ酸配列の抗原部分を含む検出用ペプチドであり、および／または該ヌクレオチド配列が、少なくとも１つのNLSおよび検出用部分を含む膜貫通型タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、請求項14記載の方法。
野生型のタンパク質がNLSを欠き、該膜貫通型タンパク質をコードするヌクレオチド配列がNLSをコードするように修飾されている、請求項14または15記載の方法。
野生型の膜貫通型タンパク質がNLSを含む、請求項14または15記載の方法。
該検出用部分が抗原ペプチドであり、細胞内における抗原ペプチドの分布が、抗原ペプチドに特異的な抗体を含む抗体ベースの検出系に対する結合を可能とすることで決定される（好ましくは、該抗体ベースの検出系が、抗原ペプチドに特異的な第1の抗体、および検出用標識を有し、かつ第1の抗体に特異的な第2の抗体を含むか、または該抗体ベースの検出系が、抗原ペプチドに特異的で、かつ検出用標識を有する第1の抗体を含む；
ここで、該検出用標識は、好ましくは、光学的に検出可能な標識であり、さらに好ましくは、発光標識または蛍光標識である）、または、ここで、該検出用部分が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、およびこれらの修飾型異型からなる群より選択されるポリペプチドである、請求項14記載の方法。
該膜貫通型タンパク質が、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）（好ましくは、ドーパミンD1受容体、ドーパミンD2受容体、ドーパミンD3受容体、ドーパミンD5受容体、ヒスタミン1受容体、システイニルロイコトリエン受容体1、システイニルロイコトリエン受容体2、オピオイド受容体、ムスカリン受容体、セロトニン受容体、β2-アドレナリン受容体、および代謝共役型グルタミン酸4受容体からなる群より選択される）、輸送体（好ましくはドーパミン輸送体またはセロトニン輸送体）、サイトカイン受容体（好ましくは、エリスロポイエチン受容体またはインスリン受容体）、チロシンキナーゼ受容体（好ましくは、上皮成長因子受容体またはインスリン受容体）、および低密度リポタンパク質（LDL）受容体からなる群より選択される、請求項14〜18のいずれか一項記載の方法。
細胞に、少なくとも1種類の膜貫通型タンパク質と相互作用することがわかっている化合物を接触させてから、細胞に候補化合物を接触させる、請求項14記載の方法であって、
ここで、膜貫通型タンパク質と相互作用することがわかっている化合物を接触させたが候補化合物を接触させなかった対照細胞における検出用部分の分布に対して、細胞膜において該検出用部分が保持されることは、候補化合物が膜貫通型タンパク質と相互作用することを示す、方法。
以下の段階を含む、少なくとも1つの膜貫通型タンパク質と相互作用する能力に関して候補化合物をスクリーニングする方法：
少なくとも１つの核局在配列（NLS）を含む膜貫通型タンパク質を含むタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列でトランスフェクトされ、該コードされたタンパク質を細胞内で発現する細胞に候補化合物を接触させる段階；ならびに
細胞膜に残存したNLS含有膜貫通型タンパク質のレベルを、細胞の細胞膜画分を単離し、同画分に膜貫通型タンパク質の標識リガンドを接触させ、同画分とリガンドの結合のレベルを決定することで決定する段階；
ここで、候補化合物を接触させなかった対照細胞の細胞膜における該膜貫通型タンパク質のレベルに対して、該候補化合物と接触させた細胞内で細胞膜において膜貫通型タンパク質が保持されることは、化合物が膜貫通型タンパク質と相互作用することを示す。
標識リガンドが放射標識リガンドである、請求項21記載の方法。
野生型のタンパク質がNLSを欠き、該膜貫通型タンパク質をコードするヌクレオチド配列がNLSをコードするように修飾されている、請求項21または22記載の方法。
野生型の膜貫通型タンパク質がNLSを含む、請求項21または22記載の方法。
該膜貫通型タンパク質が、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）（好ましくは、ドーパミンD1受容体、ドーパミンD2受容体、ドーパミンD3受容体、ドーパミンD5受容体、ヒスタミン1受容体、システイニルロイコトリエン受容体1、システイニルロイコトリエン受容体2、オピオイド受容体、ムスカリン受容体、セロトニン受容体、β2-アドレナリン受容体、および代謝共役型グルタミン酸4受容体からなる群より選択される）、輸送体（好ましくはドーパミン輸送体またはセロトニン輸送体）、サイトカイン受容体（好ましくは、エリスロポイエチン受容体またはインスリン受容体）、チロシンキナーゼ受容体（好ましくは、上皮成長因子受容体またはインスリン受容体）、および低密度リポタンパク質（LDL）受容体からなる群より選択される、請求項21〜24のいずれか一項記載の方法。