JP2013124916A

JP2013124916A - 分子の分析装置

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Publication number: JP2013124916A
Application number: JP2011273438A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Goto; 真一後藤; Sachiyuki Ishida; 祥之石田
Original assignee: Sharp Corp
Current assignee: Sharp Corp
Priority date: 2011-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2013-06-24
Anticipated expiration: 2031-12-14
Also published as: JP5930524B2

Abstract

【課題】生体関連分子を含む試料の前処理から、分離された生体関連分子の転写膜への固定までの一連の工程を、自動で効率的に行うことが可能な分析装置の提供。
【解決手段】分析対象の分子を含む試料を保持し、前記試料から前記分子を分離する分離部２と、分離された前記分子を分離部２から転写する転写膜５と、分離された前記分子を転写している転写膜５を移動させる転写膜駆動部８と、前記分子を転写後の転写膜５に光を照射するための光源７と、を備え、分離部２は、前記試料を保持し、前記分子を分離する分離媒体２１と、分離媒体２１を格納した分離槽２２と、を有し、転写膜駆動部８は、転写膜５を送り出すための送り出しロール８１と、転写膜５を巻き取るための巻き取りロール８２とを有する分析装置１。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料中に含まれる生体関連分子の分離及び検出を効率的に行うことができる、分子の分析装置に関する。

転写、翻訳調節機構の解明は近年の生物学の重要課題として位置付けられており、生体の設計図であるＤＮＡから、mＲＮＡへの転写、機能体であるタンパク質への翻訳まで、一連のセントラルドグマをコントールする上で、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）及びＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）が必須の生体分子であることが知られている。

ＤＮＡ結合タンパク質は、結合対象のＤＮＡに対して親和性を示す部位を有し、ＤＮＡの特定配列と特異的に結合するタンパク質と、非特異的に結合するタンパク質との、２種類に大きく分類できる。
ＤＮＡの特定配列と特異的に結合するタンパク質の代表としては、転写調節タンパク質が挙げられる。転写調節タンパク質はＤＮＡ上のプロモーター又はエンハンサー等の、転写を制御するＤＮＡ領域に結合し、ＤＮＡの遺伝情報をＲＮＡに転写する過程を促進又は抑制する。転写因子は単独で、又は他のタンパク質と複合体を形成することによって、この機能を果たす。例えば、ヒトのゲノム上には、転写因子をコードする遺伝子がおよそ１８００存在すると推定されている。
ＤＮＡの特定配列と非特異的に結合するタンパク質の代表としては、ＤＮＡの複製、修復又は組み換え等に関与するタンパク質が挙げられる。これらタンパク質は、ＤＮＡと結合し、ＤＮＡ変異配列の修復やメチル化等の役割を担うことが知られている。

一方、ＤＮＡから転写されたＲＮＡは一次ＲＮＡと呼ばれ、タンパク質に翻訳されるまで、プレＲＮＡスプライシング、ＲＮＡエディティング、核と細胞質との間のｍＲＮＡのシャッフリング等、様々に制御される。近年の研究によって、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）は、このようなＲＮＡの制御に必要不可欠な分子であり、その欠損は様々な疾患、例えば、神経疾患、免疫疾患、代謝疾患等の直接的な原因になることが明らかにされている。

このように、ＤＮＡ結合タンパク質及びＲＮＡ結合タンパク質は、生体現象の根幹となる転写、翻訳機構の調節因子であり、医学、分子生物学、農学、薬学等の生命科学の学際分野で広くその理解が求められている。そこで、これら生体関連分子の分析方法が種々開発されている。

例えば、特定のタンパク質と特定のＤＮＡ配列との結合を確認する手法として、ゲルシフトアッセイが知られている。ゲルシフトアッセイでは、タンパク質−ＤＮＡ複合体が、タンパク質と結合していないフリーのＤＮＡよりも、非変性ポリアクリルアミドゲル中での移動度が小さいという泳動度の差異に基づいて、ＤＮＡとタンパク質との結合の有無を分析する。このときのＤＮＡやタンパク質の検出には、従来のラジオアイソトープ（ＲＩ）での標識によるオートラジオグラフィー検出に代わり、利便性及び検出感度により優れる化学発光や蛍光標識等を利用した検出が汎用されている。

さらに、この発展技術として、ゲルシフトアッセイ後に、ウェスタンブロッティング法、サザンブロッティング法又はサウスウェスタンブッティング法等によって、ＤＮＡやタンパク質を検出する分析方法も検討されている（特許文献１参照）。この分析方法では、例えば、分析対象試料の前処理（インキュベート等）、電気泳動、分離した分子の転写膜への転写、転写された分子のクロスリンクによる転写膜への固定を順次行い、分子を検出可能な状態とする。そして、検出された分子からは種々の情報を取得でき、分子の分析が可能となる。ここで、クロスリンクとは、転写膜上の分子に対して光を照射し、励起した分子を、光化学反応により転写膜に共有結合させる手法である。

この分析方法では、従来、上記の各工程を実験者が手作業で行ってきたが、例えば、ゲルが軟らかい材料で破損し易いため、慎重な取り扱いが必要であり、作業が煩雑で長時間を要し、熟練を要するなど、作業効率が低いという問題点があった。そして、ここまでは、ＤＮＡ結合タンパク質及びＲＮＡ結合タンパク質について主に説明してきたが、これら以外の生体関連分子の分析にも同様の問題点があった。そこで、作業の効率化を目的として、工程の自動化技術が検討されており、例えば、分析対象試料の電気泳動から、分離した分子の転写膜への転写までを、自動で行う方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。

特開２００１−３２１１９９号公報特開２００７−２９２６１６号公報

しかし、上記分析方法での工程の自動化は、まだ改善の余地が残されており、さらなる効率化が求められている。例えば、試料の前処理、試料の電気泳動、転写膜への分子の転写、分子のクロスリンクは、それぞれ専用の装置で行われるが、装置間で試料を移動する作業には依然多くの時間及び労力を要し、さらに移動によって試料の一部を失う可能性がある。また、試料は、変性や失活を抑制するために、安定な環境下において短時間で取り扱うことが必要であり、この観点からも一連の工程をより短時間で行うことが求められている。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、生体関連分子を含む試料の前処理から、分離された生体関連分子の転写膜への固定までの一連の工程を、自動で効率的に行うことが可能な分析装置を提供することを課題とする。

上記課題を解決するため、
本発明は、分析対象の分子を含む試料を保持し、前記試料から前記分子を分離する分離手段と、分離された前記分子を前記分離手段から転写する転写膜と、分離された前記分子を転写している前記転写膜を移動させる駆動手段と、前記分子を転写後の前記転写膜に光を照射するための光源と、を備えたことを特徴とする分子の分析装置を提供する。

また、本発明は、かかる分子の分析装置において、前記光源を複数個備え、少なくとも２個の光源が、前記転写膜を挟んで互いに対向する位置に配置され、前記転写膜の両面に光が照射可能とされていることを特徴とする分子の分析装置を提供する。
また、本発明は、かかる分子の分析装置において、前記光源を複数個備え、少なくとも２個の光源が、前記転写膜の移動方向に沿って直列に配置されていることを特徴とする分子の分析装置を提供する。
また、本発明は、かかる分子の分析装置において、前記光源を複数個備え、少なくとも２個の光源が、互いに異なる波長域の光を照射可能とされていることを特徴とする分子の分析装置を提供する。
また、本発明は、かかる分子の分析装置において、前記光源を複数個備え、少なくとも２個の光源により、２００〜３５０ｎｍの少なくともいずれかの波長域の光が照射可能とされていることを特徴とする分子の分析装置を提供する。

また、本発明は、かかる分子の分析装置において、前記光源と前記転写膜との間に、さらに、スリットが設けられたもしくは設けられていない光遮蔽部材、又はレンズを備え、前記転写膜への光の照射範囲が調節可能とされていることを特徴とする分子の分析装置を提供する。
また、本発明は、かかる分子の分析装置において、前記光源と前記転写膜との間に、さらにレンズを備え、前記転写膜への光の照射強度が調節可能とされていることを特徴とする分子の分析装置を提供する。
また、本発明は、かかる分子の分析装置において、前記分離手段は、緩衝液を介して電流を流すことにより、前記分子を分離する分離媒体と、前記分離媒体を格納した分離槽と、を有し、前記分離媒体は、電流を流す前に前記試料を保持しておくための試料保持部を有し、前記分離槽は、電流を流すための、上流側の第一の開口部及び下流側の第二の開口部を有することを特徴とする分子の分析装置を提供する。

また、本発明は、かかる分子の分析装置において、前記分子が核酸及び／又は核酸を含む複合体であり、前記転写膜が光の照射によって、前記核酸及び／又は複合体と共有結合を形成可能であることを特徴とする分子の分析装置を提供する。
また、本発明は、かかる分子の分析装置において、前記分子が核酸、並びに核酸及びタンパク質の複合体であり、前記転写膜が光の照射によって、前記核酸及び複合体と共有結合を形成可能であることを特徴とする分子の分析装置を提供する。
また、本発明は、かかる分子の分析装置において、前記分離手段が、電気泳動による分子ふるい効果によって前記分子を分離する、ポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲルを分離媒体として有することを特徴とする分子の分析装置を提供する。
また、本発明は、かかる分子の分析装置において、前記転写膜の材質が、ポリフッ化ビニリデン、ニトロセルロース又はナイロンであることを特徴とする分子の分析装置を提供する。

本発明によれば、生体関連分子を含む試料の前処理から、分離された生体関連分子の転写膜への固定までの一連の工程を、自動で効率的に行うことが可能な分析装置が提供される。

第一の実施形態に係る分析装置を例示する概略断面図である。図１に示す分析装置の分離部を構成する分離媒体及び分離槽を示す概略斜視図である。図１に示す分析装置を使用して、光源から転写膜へ光照射している状態を例示する斜視図である。本発明の第二の実施形態に係る分析装置における、光源の配置形態を例示する概略図である。本発明の第三の実施形態に係る分析装置における、光源の配置形態を例示する概略図である。本発明の第四の実施形態に係る分析装置における、光源の配置形態を例示する概略図である。第四の実施形態に係る分析装置における、他の光源の配置形態を例示する概略図である。第四の実施形態に係る分析装置における、さらに他の光源の配置形態を例示する概略図である。

＜分子の分析装置＞
本発明に係る分子の分析装置は、分析対象の分子を含む試料を保持し、前記試料から前記分子を分離する分離手段と、分離された前記分子を前記分離手段から転写する転写膜と、分離された前記分子を転写しながら、前記転写膜を移動させる移動手段と、前記分子を転写後の前記転写膜に光を照射するための光源と、を備えたことを特徴とする。
かかる分析装置を使用することで、試料の前処理から、分離された分子の転写膜への固定までの一連の工程を、自動で効率的に行うことができる。

分析対象の前記分子は、具体的には、生体内の反応に関与する生体関連分子であり、天然由来分子、合成分子、並びに天然由来分子及び／又は合成分子の複合体のいずれでもよい。
好ましい前記分子としては、チミン等の核酸塩基構造に代表される、光化学反応で他の分子と共有結合を形成し得る構造を骨格内に有するものが例示でき、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）等の核酸；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）等の核酸アナログ；前記核酸及び核酸アナログからなる群から選択される二種以上の複合体；前記核酸及び核酸アナログからなる群から選択される一種以上と、一種以上のタンパク質との複合体が例示でき、核酸、核酸を含む複合体がより好ましく、核酸、核酸とタンパク質との複合体がさらに好ましく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）が特に好ましい。なお、ここで「核酸を含む複合体」とは、構成分子の少なくとも一つが核酸である複合体を意味するものとする。

前記核酸としては、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、mＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ＭｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ＰｉＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＳｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＳｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等が例示できる。

前記タンパク質は、動物由来タンパク質、植物由来タンパク質、微生物由来タンパク質、合成タンパク質、これらの二種以上が混成された混成タンパク質、及びこれらタンパク質が糖鎖修飾等の翻訳後修飾を受けた修飾タンパク質のいずれでもよい。

前記動物由来タンパク質としては、ヒト、実験動物、家畜もしくは培養細胞から得られた組織を構成するタンパク質、又は抽出されたタンパク質が例示できる。ここで、前記実験動物としては、キイロショウジョウバエ、線虫、マウス、モルモット、アフリカツメカエル、メダカ、カニクイザル、ニホンザル等が例示できる。
前記植物由来タンパク質としては、農業用植物；トウモロコシ、サトウキビ等のバイオエタノール製造用の植物；薬理効果を有する植物；漢方薬剤の原料植物等が例示できる。
前記微生物由来タンパク質としては、ウイルス、細菌、真菌又は原虫に由来するタンパク質が例示でき、病原性微生物に由来するタンパク質が好ましい。

分析に供する前記試料は、前記分子を含むものであり、生体から採取した生体由来試料、該生体由来試料を処理して得られた処理試料、前記分子を二種以上混合して人工的に作製した人工試料、これら試料の二種以上を混合して得られた混合試料等が例示できる。
分析対象となる前記分子は、一種のみでもよいし、二種以上でもよく、目的に応じて任意に調節できる。

（第一の実施形態）
図１は、本発明の第一の実施形態に係る分析装置を例示する概略断面図である。
ここに示す分析装置１は、分離部２、第一の緩衝液槽３、第二の緩衝液槽４、転写膜５、ガイドロール６、光源７、及び転写膜駆動部８を備える。
分離部２は、分析対象の前記分子を含む試料を保持し、この試料から前記分子を分離する分離手段を構成する。
転写膜５は、分離された前記分子を分離部２から転写するものである。
転写膜駆動部８は、分離された前記分子を転写している転写膜５を移動させる駆動手段を構成し、転写膜５を送り出すための送り出しロール８１と、転写膜５を巻き取るための巻き取りロール８２とを有する。
そして、第一の緩衝液槽３には陰極３１が配置され、第二の緩衝液槽４には陽極４１が配置されている。

陰極３１及び陽極４１は、電線を介して直流電源と電気的に接続されている（図示略）。
陰極３１及び陽極４１の材質は公知のものでよく、白金、金、銀、銅等の金属や、カーボン等の非金属が例示できる。

分離部２は、第一の緩衝液槽３と第二の緩衝液槽４との間に設けられ、これらが直列となるように配置されている。このとき、分析装置１は、筐体１１中の所定の箇所に分離部２を配置することで、第一の緩衝液槽３及び第二の緩衝液槽４がそれぞれ同時に構成されるようになっている。
分析装置１は、第一の緩衝液槽３の内部に第一の緩衝液３２が、そして第二の緩衝液槽４の内部に第二の緩衝液４２が、それぞれ充填されて使用される。

第一の緩衝液３２及び第二の緩衝液４２としては、導電性を有する公知の組成のものが使用でき、分析対象の分子の種類に応じて適宜選択すればよい。電気泳動に利用可能な好ましいものとしては、トリス（Ｔｒｉｓ）／グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝液、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝液、Ｔｒｉｓ／ホウ酸／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）緩衝液、Ｔｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡ緩衝液、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ／トリシン緩衝液等が例示できる。

分離部２は、分子を分離する分離媒体２１と、この分離媒体２１を格納した分離槽２２とを有する。分離槽２２は、第一の緩衝液槽３に向けて開口された第一の開口部２２ａと、第二の緩衝液槽４に向けて開口された第二の開口部２２ｂとを有し、内部に格納した分離媒体２１が、これら開口部で露出可能となっている。第一の開口部２２ａ及び第二の開口部２２ｂは、それぞれ電極に対向して配置されている。そして分離槽２２は、第一の開口部２２ａを有する側面が第一の緩衝液槽３の一つの壁面を構成し、第二の開口部２２ｂを有する側面が第二の緩衝液槽４の一つの壁面を構成している。例えば、電気泳動時には、泳動上流側の第一の開口部２２ａから、泳動下流側の第二の開口部２２ｂへ向けて電流が流れる。なお、本発明において「泳動上流」とは、試料の泳動方向における上流を、「泳動下流」とは、試料の泳動方向における下流をそれぞれ意味する。したがって、泳動下流端が、試料から分離された分子を転写膜へ転写する部位となる。

筐体１１の材質は、絶縁性を有していればよく、石英ガラス等のガラス；セラミックス；アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ塩化ビニル等の合成樹脂が例示できる。そして、第一の緩衝液槽３及び第二の緩衝液槽４の緩衝液との接触箇所の材質は、耐薬品性及び防水性が高い材質が好ましい。
筐体１１は、その材質に応じて公知の方法で作製すればよい。

図２は、分離部２を構成する分離媒体２１及び分離槽２２を示す概略斜視図である。
分離槽２２は、上板２２１、下板２２２及び封止部材２２３を用いて構成される。上板２２１の下面と下板２２２の上面が対向するようにして、上板２２１及び下板２２２は配置され、これらの対向面間の空隙部に分離媒体２１が格納される。すなわち、下板２２２、分離媒体２１及び上板２２１は、この順に密着して積層されている。
上板２２１は、第一の開口部２２ａ側の周縁部に沿って、該周縁部近傍に第三の開口部２２ｃが設けられている。第三の開口部２２ｃは、後述するゲル状の分離媒体２１用の原料の注入口に相当する。

上板２２１の大きさは、分析対象の試料の数や量に応じて適宜調節すればよいが、取り扱い性の観点からは、長辺の長さ（分子の移動方向に対して直交する方向の長さ）Ｙ_１が４０〜８０ｍｍであることが好ましく、短辺の長さ（分子の移動方向の長さ）Ｘ_１が２０〜４０ｍｍであることが好ましく、厚さＺ_１が０．５〜２ｍｍであることが好ましい。
第三の開口部２２ｃの長辺方向の長さＹ_１１は、第一の開口部２２ａの長辺方向の長さに対して９０〜９８％であることが好ましい。

下板２２２は、第三の開口部２２ｃが設けられていないこと以外は、上板２２１と同様のものであり、その形状（第三の開口部２２ｃが設けられていないことを除く）及び大きさは、組み合わせる上板２２１と同じであることが好ましい。

封止部材２２３は、上板２２１の第三の開口部２２ｃに、矢印Ｉで示すように挿入されて装着されるものであり、幅広の基体部２２３ａ上に凸状部２２３ｂが突設された形状を有しており、その長手方向に対して垂直な断面の形状が略Ｔ字状である。封止部材２２３の装着時には、凸状部２２３ｂは第三の開口部２２ｃに嵌合し、基体部２２３ａは、その凸状部２２３ｂが設けられている面（図中の下面）が、上板２２１の分離媒体２１との接触面とは反対側の面（図中の上面）に接触することで、第三の開口部２２ｃが封止される。
なお、分離槽２２は、第一の開口部２２ａ及び第二の開口部２２ｂが設けられていない側面（図中の手前の面と、これとは反対側の奥の面）の近傍において、上板２２１と下板２２２との間に、板状又は棒状のスペーサ（図示略）が設けられた構成であってもよい。

上板２２１、下板２２２及びスペーサの材質は、絶縁性を有していればよく、石英ガラス等のガラス；セラミックス；アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ塩化ビニル等の合成樹脂が例示できる。なかでも、親水性を有し、平坦性及び放熱性に優れることから、ガラスが好ましい。
上板２２１、下板２２２及びスペーサは、その材質に応じて公知の方法で作製すればよい。

上板２２１及び下板２２２の少なくとも一方には、分離媒体２１の温度を調節するための温調手段（図示略）が設けられていることが好ましく、上板２２１及び下板２２２の両方に、温調手段が設けられていることがより好ましい。また、前記温調手段は、上板２２１又は下板２２２の内部に組み込まれていることが好ましい。前記温調手段としては、ペルチェ素子が例示できる。

分離媒体２１は、例えば、電気泳動によって前記試料から分析対象の分子を分離するものであり、分子の種類に応じて適宜選択すればよく、好ましいものとしては、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルが例示できる。また、超微細柱（ナノピラー）が立設された構造のものでもよい。
分離媒体２１のうち、分離槽２２の第一の開口部２２ａの近傍（電気泳動時の泳動上流側）には、後述するように、試料を保持するための試料保持部（図示略）が設けられており、分子を分離する前の試料を保持すると共に、試料をその種類に応じて前処理できるようになっている。

第二の緩衝液槽４には、ガイドロール６及び転写膜駆動部８が設けられている。
転写膜５は、送り出しロール８１から送り出され、ガイドロール６でガイドされて、最終的には巻き取りロール８２で巻き取られるようになっている。図中の矢印Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、それぞれ、矢印Ｍで示す方向に転写膜５を移動させた（送り出した）時の、送り出しロール８１、巻き取りロール８２及びガイドロール６の回転方向を示す。

転写膜５は、転写膜駆動部８による移動時に、分離槽２２の第二の開口部２２ｂにおける分離媒体２１の露出面２１ｂと接触していてもよいし、接触していなくてもよいが、分子の転写量が向上する点から、接触していることが好ましい。接触していない場合、分離媒体２１の前記露出面２１ｂと転写膜５との間の距離は、０．１ｍｍ以下であることが好ましい。なお、符号２１ａは、分離槽２２の第一の開口部２２ａにおける分離媒体２１の露出面を示す。
また、分離媒体２１の前記露出面２１ｂと陽極４１との間に、ガイドロール６等の介在構造が存在しない場合には、転写膜５は、転写膜駆動部８による移動時に、陽極４１と接触していてもよいし、接触していなくてもよい。

転写膜５の材質は、検出対象の分子を固定できればよく、疎水性であることが好ましく、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ニトロセルロース、ナイロン等の合成樹脂が例示できる。

転写膜５の大きさは、組み合わせる分離部２の大きさに応じて設定すればよい。例えば、短辺の長さ（図中の矢印Ｍで示す転写膜５の移動方向に対して直交する方向、すなわち転写膜５の幅方向の長さ）は、分離媒体２１の同方向の長さに対して同等以上であることが好ましく、取り扱い性の観点からは、前記Ｙ_１と同様の範囲であることが好ましい。転写膜５の長辺の長さ（転写膜５の移動方向の長さ）は、転写膜５の移動速度にもよるが、８０〜１２０ｍｍであることが好ましい。そして、転写膜５の厚さは、０．０５〜２ｍｍであることが好ましい。

ガイドロール６は、分離槽２２の第二の開口部２２ｂにおいて露出されている分離媒体２１（前記露出面２１ｂ）に対して、上記のように接触又は非接触の状態で転写膜５の配置位置を維持すると共に、図中の矢印Ｍで示す方向への転写膜５の移動をガイドする。

ガイドロール６は、その回転軸方向が、分離槽２２の第二の開口部２２ｂの長辺方向に略平行となるように、第二の開口部２２ｂに対向して配置され、第二の開口部２２ｂにおいて露出されている分離媒体２１から転写膜５へ、分離された分子を転写できるようになっている。

ガイドロール６の回転軸方向の長さは、第二の開口部２２ｂの長辺方向の長さよりも短くてもよいが、前記長辺方向の長さと同等であることが好ましい。また、ガイドロール６は、１個だけ設けられていてもよいが、複数個が互いに間隔を空けて直列に設けられていてもよい。ただし、構成を簡略化できる点から、ガイドロール６の数は１個であることが好ましい。

ガイドロール６、送り出しロール８１及び巻き取りロール８２の材質は、絶縁性を有していればよく、上板２２１等と同様でよい。

光源７は、分子を転写後の転写膜５に光を照射するものであり、転写膜５の送り方向（移動方向）において、分離槽２２の第二の開口部２２ｂ（分離媒体２１の露出面２１ｂ）よりも下流側に配置されている。ここではさらに、第二の緩衝液槽４に充填された第二の緩衝液４２の液面よりも下流側で、且つ巻き取りロール８２よりも上流側に配置された例を示している。そして、光源７は、転写膜５の分子の転写面（分子の転写時に、分離媒体２１と対向する面）に光を照射できるように配置されている。光源７により光を照射されると、転写膜５上の分子は、転写膜５とクロスリンクして転写膜５に強固に固定される。なお、転写膜５の光源７による光の照射面は、分子の転写面でなくてもよいが、分子をより強固に固定できる点から、ここに示すように分子の転写面であることが好ましい。

光源７は、紫外領域の波長の光を照射可能なものが好ましく、２００〜４００ｎｍのいずれかの波長域の光を照射可能なものがより好ましく、２００〜３５０ｎｍのいずれかの波長域の光を照射可能なものが特に好ましい。
また、光源７は、転写膜５に対して１０〜５０００μＷ／ｃｍ^２の照度で光を照射可能なものが好ましい。
装置を小型化し、且つ転写された分子を十分にクロスリンクさせるためには、分子が転写され、光が照射されている転写膜５の領域と、光源７の光放射面との距離は、０．１〜１０ｃｍであることが好ましい。
光源７を備えた光照射装置（手段）としては、ＵＶクロスリンカー等が例示できる。

なお、ここでは、分析対象の分子を含む試料からこの分子を分離する分離部として、分離媒体及び分離槽２２を有するものを示しているが、分子を分離及び転写できるものであれば、これに限定されない。
また、ここでは、分子の転写時に、転写膜５の配置位置を維持し、転写膜５の移動をガイドする手段として、ガイドロールを使用した例を示しているが、これらの目的を達することができれば、その他の手段を使用してもよい。

分析装置１は、後述する分析の各工程を行う機構を一体化しているので、小型化が容易である。

分析装置１を使用して、分子は、例えば、（１）試料の前処理、（２）分子の分離、（３）分離された分子の転写膜への転写（以下、「（３）転写」と略記する）、及び（４）分子の転写膜とのクロスリンク（以下、「（４）クロスリンク」と略記する）という工程を経て、転写膜へ固定され、分析可能な状態となる。以下、主にゲルシフトアッセイを行う場合を例に挙げて、各工程について説明する。

（１）試料の前処理は、分子を目的の状態とするために行う。例えば、検出対象の分子が、核酸及び核酸アナログからなる群から選択される二種以上の複合体；核酸及び核酸アナログからなる群から選択される一種以上と、一種以上のタンパク質との複合体；等の２分子以上の複合体である場合には、これら複合体を形成させる。例えば、検出対象の分子がＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）又はＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）である場合には、ＤＮＡ又はＲＮＡと、タンパク質とを混合して混合液を作製し、これをインキュベートすればよい。

（１）試料の前処理に際しては、分離媒体２１の試料保持部に試料を導入する。試料保持部は、後述するように電流を流す前に、導入した試料を保持しておくためのものである。試料保持部は、例えば、ゲル状の分離媒体２１の場合、分離部２の第三の開口部２２ｃから内部にこの分離媒体２１の原料を充填し、次いで、封止部材２２３を第三の開口部２２ｃに挿入してから前記原料をゲル化させ、封止部材２２３を取り外すことで、封止部材２２３の凸状部２２３ｂによって型どりされた分離媒体２１における凹部として形成できる。このとき、封止部材２２３として、凸状部２２３ｂの先端部がくし歯状とされたものを使用することで、このくし歯に対応した複数個の凹部（試料保持部）を形成できる。

（１）試料の前処理は、試料保持部中で公知の方法で行えばよい。例えば、前記インキュベートの場合、試料保持部中の試料を、好ましくは２０分〜３時間、より好ましくは３０分〜１時間、温度調節しながら静置すればよい。温度調節は、例えば、分離槽２２に設けられた前記温調手段により行うことができる。インキュベート時の温度は、前処理に要する時間を短縮できる点から、３６．５〜３７．５℃であることが好ましい。なお、ここに挙げた前処理条件は一例であり、検出対象の分子の種類に応じて、適宜調節することが好ましい。

（２）分子の分離は、（１）試料の前処理後に、陰極３１及び陽極４１に電圧を印加することで行うことができる。このとき、第一の緩衝液３２及び第二の緩衝液４２を介して電流が流れるが、分離槽２２の第一の開口部２２ａ側から第二の開口部２２ｂ側へ向けて、分離媒体２１中を電流が流れることで、試料中の各種分子は、その分子量や電荷量に応じて、分離媒体２１中を第一の開口部２２ａ側から第二の開口部２２ｂ側へ向けて移動し、分子ふるい効果や電気的引力の効果により、互いに分離される。例えば、ＤＮＡやＲＮＡ（核酸）は、ＤＮＡ結合タンパク質やＲＮＡ結合タンパク質（核酸とタンパク質との複合体）よりも分子量が小さく、ＤＮＡ結合タンパク質やＲＮＡ結合タンパク質では、タンパク質の電荷の影響があるので、同じ電流値での分離媒体２１における移動距離は、ＤＮＡやＲＮＡの方がＤＮＡ結合タンパク質やＲＮＡ結合タンパク質よりも長くなり、この泳動距離の差に基づいてこれら分子は分離される。
電圧の印加条件は、試料中に含まれる各種分子の種類、分離媒体２１の種類等に応じて、適宜調節すればよい。
電圧印加時には、前記温調手段により分離媒体２１を、例えば、２〜１０℃に温度調節することで、電気泳動のばらつきを抑制でき、より高精度に分子を分離できる。

（３）転写は、（２）分子の分離時（上記の電圧印加時）に、転写膜駆動部８によって転写膜５を移動させることで行う。転写膜駆動部８によって、転写膜５は、送り出しロール８１から送り出され、ガイドロール６でガイドされながら移動する。一方、試料中に含まれていた各種分子は、分離媒体２１中で互いに分離され、同じ電流値での移動距離が長い（移動度が大きい）ものから順に、第二の開口部２２ｂにおける分離媒体２１の露出面２１ｂから排出される。そして、排出された分子は、直ちに転写膜５に接触して吸着され、転写される。

（４）クロスリンクは、（３）転写後の転写膜５に光源７から光照射することで行う。転写後の分子は、その構造の少なくとも一部が照射光によって励起され、光化学反応により転写膜５との間で共有結合を形成し、クロスリンクすることで、強固に固定される。

光源７による転写膜５への光照射は、巻き取りロール８２による転写膜５の巻き取り前であれば、いずれのタイミングで行ってもよいが、分子転写後に速やかに光照射することで、転写された分子は、温度や湿度等の影響を受けることがなく、その結果、立体構造が高度に維持されたまま、変性することなくより安定化された状態で固定される。なお、（１）試料の前処理から（２）分子の分離までの間は、光照射は不要なので、この間の光源７の作動は必ずしも必要ではない。
図３は、分析装置１を使用して、光源７から転写膜５へ光照射している状態を例示する斜視図である。図中、符号５ａは、光源７による転写膜５上の光照射領域を示す。

照射光は、紫外光であることが好ましく、２００〜４００ｎｍの少なくともいずれかの波長の光を含むことが好ましく、２００〜３５０ｎｍの少なくともいずれかの波長の光を含むことがより好ましく、例えば、２５４ｎｍ、２６０ｎｍ、３０５ｎｍ、３１０ｎｍ及び３２０ｎｍのいずれか１以上の波長の光を含むことがさらに好ましい。

（４）クロスリンク後の転写膜５は、最終的に巻き取りロール８２で巻き取られ、保存可能な状態となる。
そして、（１）試料の前処理から、転写膜５の巻き取りまでの一連の工程は、プログラミングによって全自動で行うことができる。

転写膜５に固定された分子の検出は、その分子の種類に応じて公知の方法で行えばよい。好ましい検出方法としては、蛍光標識された抗体を用いて、抗原−抗体反応によりタンパク質を検出する方法（ウエスタンブロッティング法）や、抗ジゴキシゲニン−ＡＬＰ（ＤＩＧラベル）、又はストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｂｉｏｔｉｎラベル）を用いて、化学発光によりＤＮＡ、ＤＢＰ、タンパク質を検出する方法が例示でき、これら以外にも、サザンブロッティング法、サウスウェスタンブロッティング法、ＣＢＢ染色法、銀染色法、エチレンブロマイド染色法等を適用できる。

分析装置１を使用することにより、分子の分析においては、（１）試料の前処理から（４）クロスリンクを経て、転写膜５の巻き取りまでの一連の工程をすべて自動で行うことができる。このように、これらの工程を、装置の変更等を伴うことなく、すべて連続的に自動で行うことができるので、分子を従来よりも短時間で分析でき、例えば、上記一連の工程を０．５〜３時間程度という短時間で行うことが可能である。分子の分離を短時間で行えば、分離媒体２１の変質を抑制することができ、分子の分離媒体２１中での不要な拡散も防止できる。さらに、一連の工程で熟練を要する作業が不要で、精度も向上し、試料や分離した分子を失う危険性も低減できる。したがって、分析装置１を使用することにより、従来よりも効率的に分子を分析できる。

図１では、光源７がそのまま転写膜５に対して１個配置された例を示しているが、分析装置における光源の配置形態を調節することで、より優れた効果が得られる分析装置とすることができる。このようなより好適な分析装置について、以下、説明する。

（第二の実施形態）
図４は、本発明の第二の実施形態に係る分析装置における、光源の配置形態を例示する概略図である。
ここに示す分析装置は、光源７を２個備え、１個は転写膜５の一方の面に、残りの１個は転写膜５の他方の面（前記一方の面とは反対側の面）に、それぞれ配置されている。すなわち、これら２個の光源７は、転写膜５を間に挟むように配置され、転写膜５の両面に光照射できるようになっている。転写膜５のこれら面の一方は、分子の転写面である。この点以外、ここに示す分析装置は、図１に示す分析装置１と同じである。

このように光源７を配置することで、より高強度の光を転写膜５に照射でき、より多くの分子をクロスリンクさせることができる。通常、転写膜５は繊維状又はポア状であるが、転写膜５の片面のみに光照射した場合には、照射光が到達し易いのは、照射面（片面）とその近傍の領域であり、分子のクロスリンクはこのような領域で生じ易く、それ以外の領域（例えば、転写膜５の厚さ方向の中央部から、前記照射面とは反対側の面までの間の領域）では生じ難くなる。これに対し、転写膜５の両面に光照射した場合には、転写膜５の厚さ方向に、照射光が万遍なく到達するので、厚さ方向のすべての領域で分子のクロスリンクが生じ易くなる。

２個の光源７は、転写膜５の長手方向（図中の矢印Ｍで示す転写膜５の移動方向）及び転写膜５の幅方向（図中の矢印Ｍで示す転写膜５の移動方向に対して直交する方向）の少なくとも一方において、配置位置が一致していなくてもよいが、配置位置のずれは小さいほど好ましく、両方において配置位置が一致していることがより好ましい。すなわち、２個の光源７は、転写膜５を挟んで互いに対向する位置に配置されていることが好ましい。このようにすることで、より優れた効果が得られる。

なお、ここでは、光源７の数が２個である場合を示しているが、光源７の数は複数であればよく、その数は特に限定されない。例えば、光源７の数が３個以上である場合には、少なくとも２個の光源７が、上記関係を満たしていればよい。ただし、分析装置の取り扱い性と得られる効果を考慮すると、本実施形態での光源７の数は、２〜４個であることが好ましい。

ここに示す分析装置を使用した場合も、光の照射方法が異なる点以外は、図１に示す分析装置１を使用した場合と同様の方法で、分子を分析できる。

（第三の実施形態）
図５は、本発明の第三の実施形態に係る分析装置における、光源の配置形態を例示する概略図である。
ここに示す分析装置は、光源７を３個備え、これら３個の光源７が、転写膜５の長手方向（図中の矢印Ｍで示す転写膜５の移動方向）に沿って、直列に配置されている。転写膜５の光照射面は、分子の転写面であることが好ましい。この点以外、ここに示す分析装置は、図１に示す分析装置と同じである。

これら光源７として、互いに異なる波長域の光が照射可能であるものを使用することで、複数の波長域の光を同時に又は連続して照射できる。例えば、分子のクロスリンクに最適な光の波長が不明である場合、その波長の特定に時間と労力を要することがある。これは、クロスリンクさせる分子の種類や、転写膜５の材質によって、最適な光の波長が異なるからである。これに対して、これら光源７により、複数の波長域の光を同時に又は連続して照射することで、最適な光の波長を特定しなくても、容易に分子をクロスリンクさせることができるようになる。より具体的には、例えば、これら光源７により、好ましくは２００〜４００ｎｍ、より好ましくは２００〜３５０ｎｍの少なくともいずれかの波長の光（好ましくは２００〜４００ｎｍ、より好ましくは２００〜３５０ｎｍの一部の波長もしくは波長域の光又は全波長域の光）を照射することで、効率的にクロスリンクさせることができる。

また、これら光源７同士の間隔を狭くすることで、光源７を１個のみ使用した場合よりも、照射光の強度をより大きくできる。

なお、ここでは、光源７の数が３個である場合を示しているが、光源７の数は複数であればよく、その数は特に限定されない。そして、複数個の光源７のうち、少なくとも２個の光源７が、上記関係を満たしていればよい。ただし、分析装置の取り扱い性と得られる効果を考慮すると、本実施形態での光源７の数は、３〜５個であることが好ましい。例えば、光源７の数が５個である場合には、２５４ｎｍ、２６０ｎｍ、３０５ｎｍ、３１０ｎｍ又は３２０ｎｍの波長の光を含み、これら波長が互いに異なる光源７を使用することが好ましい。

（第四の実施形態）
図６は、本発明の第四の実施形態に係る分析装置における、光源の配置形態を例示する概略図である。
ここに示す分析装置は、光源７の光放射面７ａ上に、光遮蔽部材７１を備えたこと以外は、図１に示す分析装置と同じである。

光遮蔽部材７１には、転写膜５の長手方向（図中の矢印Ｍで示す転写膜５の移動方向）に対して直交する方向に延びるスリット７１ｂが設けられている。そして、光遮蔽部材７１の遮光面７１ａが光源７の光放射面７ａに接触し、スリット７１ｂが光源７の光放射面７ａ上に重なるようにして、光遮蔽部材７１が配置されている。なお、図５では、判り易く示すために、光源７及びスリット７１を断面表示している。
光遮蔽部材７１は、スリット７１ｂが設けられている部位を除いて、光源７の光放射面７ａの全面を覆うことができれば、その外形は特に限定されない。

このような光遮蔽部材７１を設けることで、転写膜５への光の照射領域（転写膜５上の光照射面の領域）を調節できる。通常、光源７からの照射光は、放射状に広がって進むため、光源７と転写膜５との間の距離によっては、転写膜５の光照領域において、照射光の強度にばらつきが生じることがある。照射光の強度がばらつくと、分子のクロスリンクの程度にもばらつきが生じてしまう。しかし、光遮蔽部材７１を設け、スリット７１ｂを通過した光が到達することで、転写膜５上の光照射領域は、スリット７１ｂの方向に長い形状となり、この長手方向（スリット７１ｂの方向）において、照射光の強度がより均一となる。

光遮蔽部材７１の材質は、樹脂、金属、セラミックス等、光の透過率が低いものであれば公知のものでよく、特に限定されない。

なお、ここでは、光遮蔽部材７１として、その遮光面７１ａが光源７の光放射面７ａに接触しているものを示しているが、本実施形態ではこれに限定されず、光遮蔽部材７１は、光源７と転写膜５との間に設けられていればよく、光源７に接触していなくてもよい。
また、ここでは、スリット７１ｂの方向が、転写膜５の長手方向に対して直交する方向である場合を示しているが、スリット７１ｂの方向は、目的に応じて任意に設定できる。

また、ここでは、光遮蔽部材として、光通過部位の形状がスリット状であるものを示しているが、光通過部位の形状及び大きさは、目的に応じて任意に設定できる。そして、光通過部位の形状及び大きさを調節することで、転写膜５への光の照射領域の形状及び大きさを任意に設定できる。

図７は、本実施形態に係る分析装置における、他の光源の配置形態を例示する概略図である。
ここに示す分析装置は、図６に示す分析装置において、光遮蔽部材７１に代えて、スリットが設けられていない光遮蔽部材７２を備えたものである。この点以外、ここに示す分析装置は、図６に示す分析装置と同じである。

光遮蔽部材７２は、スリット７１ｂが設けられていない点以外は、上記の光遮蔽部材７１と同様のものである。ここでは、光遮蔽部材７２として、外形が四角形状であるものを示しているが、これに限定されない。
光遮蔽部材７２は、光源７の光放射面７ａのうち、光の照射方向に対して左側の特定の領域のみを覆うようにして、その遮光面７２ａが光放射面７ａに接触して配置されている。

このような光遮蔽部材７２を設けることで、転写膜５への光の照射領域（転写膜５上の光照射面の領域）を調節できる。具体的には、転写膜５の幅方向（図中の矢印Ｍで示す転写膜５の移動方向に対して直交する方向）において、光の照射方向に対して右側の特定の領域のみに光を照射することができ、このときの光照射領域５ａのみにおいて、分子をクロスリンクさせることができる。符号５ｂは、光遮蔽部材７２を設けなければ光が照射されていたはずの転写膜５での遮光領域を示す。分子の分析においては、このように、転写した分子の一部はクロスリンクさせないことが必要になる場合もあり、本実施形態の分析装置はこのような分析に好適である。

なお、ここでは、光遮蔽部材７２として、その遮光面７２ａが光源７の光放射面７ａに接触しているものを示しているが、本実施形態ではこれに限定されず、光遮蔽部材７２は、光源７と転写膜５との間に設けられていればよく、光源７に接触していなくてもよい。
また、ここでは、光源７の光放射面７ａのうち、光の照射方向に対して左側の特定の領域のみを、光遮蔽部材７２で覆うようにした例を示しているが、光遮蔽部材７２で覆う光放射面７ａの領域は、目的に応じて任意に設定できる。

図８は、本実施形態に係る分析装置における、さらに他の光源の配置形態を例示する概略図である。
ここに示す分析装置は、図６に示す分析装置において、光遮蔽部材７１に代えて、レンズ７３を備えたものである。この点以外、ここに示す分析装置は、図６に示す分析装置と同じである。
レンズ７３を介して光を照射することで、転写膜５への光の照射領域（転写膜５上の光照射面の領域）を調節できる。具体的には、光源７の通常使用時よりも転写膜５への光の照射領域を狭めることができる。また、同時に、光源７の通常使用時よりも転写膜５の光照射面において、照射光の強度を大きくできる。

本発明は、医学、薬学、生化学等の、生体関連分子の分析が必要とされる分野全般で利用可能である。

１・・・分析装置、２・・・分離部、２１・・・分離媒体、２２・・・分離槽、２２ａ・・・第一の開口部、２２ｂ・・・第二の開口部、３・・・第一の緩衝液槽、３２・・・第一の緩衝液、４・・・第二の緩衝液槽、４２・・・第二の緩衝液、５・・・転写膜、５ａ・・・光照射領域、７・・・光源、７１，７２・・・光遮蔽部材、７３・・・レンズ、７１ｂ・・・スリット、８・・・転写膜駆動部、８１・・・送り出しロール、８２・・・巻き取りロール

Claims

分析対象の分子を含む試料を保持し、前記試料から前記分子を分離する分離手段と、
分離された前記分子を前記分離手段から転写する転写膜と、
分離された前記分子を転写している前記転写膜を移動させる駆動手段と、
前記分子を転写後の前記転写膜に光を照射するための光源と、
を備えたことを特徴とする分子の分析装置。
前記光源を複数個備え、少なくとも２個の光源が、前記転写膜を挟んで互いに対向する位置に配置され、前記転写膜の両面に光が照射可能とされていることを特徴とする請求項１に記載の分子の分析装置。
前記光源を複数個備え、少なくとも２個の光源が、前記転写膜の移動方向に沿って直列に配置されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の分子の分析装置。
前記光源を複数個備え、少なくとも２個の光源が、互いに異なる波長域の光を照射可能とされていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の分子の分析装置。
前記光源を複数個備え、少なくとも２個の光源により、２００〜３５０ｎｍの少なくともいずれかの波長域の光が照射可能とされていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の分子の分析装置。
前記光源と前記転写膜との間に、さらに、スリットが設けられたもしくは設けられていない光遮蔽部材、又はレンズを備え、前記転写膜への光の照射範囲が調節可能とされていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子の分析装置。
前記光源と前記転写膜との間に、さらにレンズを備え、前記転写膜への光の照射強度が調節可能とされていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子の分析装置。
前記分離手段は、緩衝液を介して電流を流すことにより、前記分子を分離する分離媒体と、前記分離媒体を格納した分離槽と、を有し、
前記分離媒体は、電流を流す前に前記試料を保持しておくための試料保持部を有し、
前記分離槽は、電流を流すための、上流側の第一の開口部及び下流側の第二の開口部を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の分子の分析装置。
前記分子が核酸及び／又は核酸を含む複合体であり、前記転写膜が光の照射によって、前記核酸及び／又は複合体と共有結合を形成可能であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の分子の分析装置。
前記分子が核酸、並びに核酸及びタンパク質の複合体であり、前記転写膜が光の照射によって、前記核酸及び複合体と共有結合を形成可能であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の分子の分析装置。
前記分離手段が、電気泳動による分子ふるい効果によって前記分子を分離する、ポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲルを分離媒体として有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分子の分析装置。
前記転写膜の材質が、ポリフッ化ビニリデン、ニトロセルロース又はナイロンであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分子の分析装置。