JP2013066536A - 止血効果に優れたシート状止血材 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】繊維成形体にフィブリノゲンが固定化されたシートと、繊維成形体にトロンビンが固定化されたシートからなるシート状止血材。かかる繊維成形体は平均繊維径0.1〜10μmの生分解性ポリマー繊維からなり、0.01mm2以上の貫通孔がないか、繊維表面の平滑度が1.07以下である。
【選択図】なし
Description
フィブリノゲン製剤は主に2液混合型の液状型製剤(特許文献1)とコラーゲンなどの支持体にフィブリノゲンとトロンビンを固定化したシート型製剤(特許文献2)が存在する。しかしながら、液状型製剤は凍結乾燥されたフィブリノゲンとトロンビンをそれぞれ使用時に溶解して用いる必要があること、さらには完全に溶解させるのに時間がかかり、緊急時に使用できないなどの問題点を有している。
また、タココンブの場合、同一シート内にフィブリノゲンとトロンビンが共存されており、使用直前に溶液に浸すと同時にフィブリノゲンとトロンビンが溶解して反応が開始するが、その反応はシート内部で起こる。そのため、たとえフィブリンが溶出したとしても組織接着部位へ十分浸透する前に凝固反応が進み、組織表面のみの接着となるため、十分な組織接着効果を示さない。
このような問題点を解決するために、生体吸収性材料からなるシート状フィブリン糊接着剤の検討がなされている(特許文献3)。しかしながら、フィブリノゲン固定化シートに非イオン性界面活性剤が必要であること、また、凍結乾燥後のシートは担持させたフィブリノゲンがシートから剥がれ落ちてしまうという問題点を抱えている。
繊維成形体(A)および繊維成形体(B)はいずれも平均繊維径0.1〜10μmの生分解性ポリマー繊維からなり、かつ、
0.01mm2以上の貫通孔を有さない特性と、繊維表面の平滑度が1.07以下である特性のうち、少なくともいずれか一つの特性をさらに有する、
ことを特徴とするシート状止血材である。
本発明で用いられるフィブリノゲンやトロンビンは、動物から調製したものでも、遺伝子組換え技術により製造したものでもよい。動物由来であればヒト由来が好ましい。また、アミノ酸配列を改変した蛋白質も使用できる。
なお、シート状止血材はフィブリノゲンおよびトロンビンを含有するため、保存中に一部でフィブリンを生じることがあるが、こうしたフィブリンを含むものも本発明の範囲である。
本発明のシート状止血材において、フィブリノゲンやトロンビンを固定化する方法は問わないが、例えばフィブリノゲン等の溶液に予め成形された繊維成形体を浸漬した後、凍結乾燥することにより作製できる。また、フィブリノゲン等をエタノールなどに分散させた溶液をスプレーなどで繊維成形体に噴霧して固定化してもよい。
本発明のシート状止血材において、繊維成形体(A)および繊維成形体(B)はいずれも生分解性ポリマーからなる。
このとき、乳酸の共重合体は、伸縮性を付与するモノマー成分が少ないほうが好ましい。ここで伸縮性を付与するモノマー成分としては、カプロラクトンモノマーや、エチレングリコール、1,2−プロピレングリコール、1,3−プロピレングリコール、1,2−ブタンジオール、1,4−ブタンジオール、ポリカプロラクトンジオール、ポリアルキレンカーボネートジオール、ポリエチレングリコールユニットなどの軟質成分が例示できる。これらの軟質成分はポリマー重量比で20%未満であることが好ましい。これよりも軟質成分が多いと自己支持性を失いやすく、柔らかすぎて取り扱いにくい繊維成形体になる。
また、生分解性ポリマーの重量平均分子量としては、1×103〜5×106であり、好ましくは1×104〜1×106、より好ましくは5×104〜5×105である。また、生分解性ポリマーの末端構造やポリマーを重合する触媒は任意に選択できる。
本発明で用いる生分解性ポリマーは高純度であることが好ましく、とりわけ生分解性ポリマー中に含まれる添加剤や可塑剤、残存触媒、残存モノマー、成型加工や後加工に用いた残留溶媒などの残留物は少ないほうが好ましい。特に医療に用いる場合は、安全性の基準値未満に抑える必要がある。
すなわち、0.01mm2以上の貫通孔を有する場合、凍結乾燥後のフィブリノゲンまたはトロンビンの保持性が低下することがある。また、0.01mm2以上の貫通孔を有する場合、フィブリノゲンまたはトロンビンは容易にシートから脱落するため、シート内で担持量に斑が生じ、止血効果にばらつきが生じることがある。
また、本発明のシート状止血材において、繊維成形体(A)および繊維成形体(B)の厚みは50μmから300μmが好ましい。50μmよりも薄いと必要量のフィブリノゲンおよびトロンビンが担持できず好ましくない。300μmよりも厚いと必要となるフィブリノゲンおよびトロンビンの量が過剰量必要となり好ましくない。
本発明で用いるリン脂質は、動物組織から抽出したものでも人工的に合成したものでもよい。かかるリン脂質としては、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどが挙げられる。これらは1種類を選択してもよいし、2種類以上の混合物を用いてもよい。好ましくはホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンであり、さらに好ましくはジラウロイルホスファチジルコリンまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである。
得られた繊維成形体の表面を走査型電子顕微鏡(キーエンス株式会社:商品名「VE8800」)により、倍率2000倍で撮影して得た写真から無作為に20箇所を選んで繊維の径を測定し、すべての繊維径の平均値を求めて平均繊維径とした。n=20である。
2.平均厚:
高精度デジタル測長機(株式会社ミツトヨ:商品名「ライトマチックVL−50」)を用いて測長力0.01Nによりn=10にて繊維成形体の膜厚を測定し、平均値を算出した。なお、本測定においては測定機器が使用可能な最小の測定力で測定を行った。
3.貫通孔の有無および平均表面開孔面積
得られた繊維成形体の表面を走査型電子顕微鏡(キーエンス株式会社:商品名「VE8800」)で撮影して得た写真から、貫通孔の有無を確認した。
4.繊維表面の平滑度:
AFMとして、デジタルインスツルメント社製Nano Scope IIIaを使用した。カンチレバーはAC−240TS(シリコン製:ばね定数2N/m)を使用した。観察に際して分解能低下を防ぐため、カンチレバーは探針の汚染、磨耗がない新品を使用した。また、探針−試料表面間に働く力は必要最小限の力に設定し、走査中の試料の破損、探針の磨耗を防いだ。観察は、探針が繊維中心部にコンタクトするようにし、探針走査方向が繊維軸と一致するように観察視野1×1μm2で行った。走査速度は0.7Hzとした。分解能は256×256pixels以上とした。繊維は曲率をもっているため、AFM観察後、装置に付属している傾き補正ソフト等を用いて繊維が有する曲率、マクロな形態上のうねりをキャンセルした。傾き補正は、探針が完全に繊維中心部にコンタクトし、走査方向と繊維軸方向が一致した場合は二次傾き補正を行ったが、そうでない場合は三次傾き補正処理、フラット処理を行った。傾き補正後、装置付属の表面粗さ解析を行い、表面積率を算出した。表面積率とは、観察面が理想的にフラットであると仮定したときの面積S0に対する実際の表面積Sの比率Sratioであり、Sratio=S/S0で表される。評価はランダムに行った観察視野20点の平均値をもって行った。
5.フィブリノゲン保持量(重量変化確認)
1×1cm2に切り出したシートの重量(A)を測定し、シートの両端をピンセットで挟み、10回折りまげを実施した後、再度シートの重量(B)を測定する。
重量変化(%)=B/A×100
0.4%のジラウロイルホスファチジルコリンを含有したポリ乳酸(重量平均分子量26万2千、Purac社製)11重量部をジクロロメタン溶液90重量部で溶解し、均一な溶液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.8mm、電圧は8kV、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体に、70℃10分間熱処理を実施した。得られた繊維成形体の平均繊維径は4.1μm、厚さは79μmであった。0.01mm2以上の貫通孔は観察されなかった。繊維表面の平滑度は、1.004であった。
市販の生体組織接着剤である「ボルヒール」(登録商標、一般財団法人化学及血清療法研究所製、以下同じ)のキットに含まれるフィブリノゲン溶液1.25mLを、上記で作製した繊維成形体(5×5cm2)上に染み込ませた。フィブリノゲン溶液は、容易にシート内に染み込んだ。この検体を凍結後、24時間凍結乾燥させたものをフィブリノゲン固定化シートとした。フィブリノゲンは、シート内部全面に均一に担持されていた。そのSEM像を図1に示す。シートの両端をピンセットで挟み、10回折りまげを実施し、重量変化を確認した。本シートを取り扱っても担持したフィブリノゲンが崩壊することはなく、重量変化はなかった(100%保持)。
次に、ボルヒールのキットに含まれるトロンビンを付属の溶解液により溶解し、1875単位/mLのトロンビン溶液を調製した。このトロンビン溶液33.75μLを、上記で作製した繊維成形体(2×2.5cm2)上に均一にしみ込ませた。トロンビン溶液は、容易にシート内に染み込んだ。この検体を凍結後、24時間凍結乾燥させたものをトロンビン固定化シートとした。トロンビンは、シート内部全面に均一に担持されていた。
0.7%のジラウロイルホスファチジルコリンを含有したポリ乳酸(重量平均分子量26万2千、Purac社製)11重量部をジクロロメタン溶液90重量部で溶解し、均一な溶液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.8mm、電圧は8kV、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体に、70℃10分間熱処理を実施した。得られた繊維成形体の平均繊維径は3.8μm、厚さは85μmであった。0.01mm2以上の貫通孔は観察されなかった。繊維表面の平滑度は、1.006であった。
ボルヒールのキットに含まれるフィブリノゲン溶液1.25mLを、上記で作製した繊維成形体(5×5cm2)上に染み込ませた。フィブリノゲン溶液は、容易にシート内に染み込んだ。この検体を凍結後、24時間凍結乾燥させたものをフィブリノゲン固定化シートとした。フィブリノゲンは、シート内部全面に均一に担持されていた。そのSEM像を図2に示す。シートの両端をピンセットで挟み、10回折りまげを実施し、重量変化を確認した。本シートを取り扱っても担持したフィブリノゲンが崩壊することはなく、重量変化はなかった(100%保持)。
次に、ボルヒールのキットに含まれるトロンビンを付属の溶解液により溶解し、1875単位/mLのトロンビン溶液を調製した。このトロンビン溶液33.75mLを、上記で作製した繊維成形体(2×2.5cm2)上に均一にしみ込ませた。トロンビン溶液は、容易にシート内に染み込んだ。この検体を凍結後、24時間凍結乾燥させたものをトロンビン固定化シートとした。トロンビンは、シート内部全面に均一に担持されていた。
ポリ乳酸(重量平均分子量26万2千、Purac社製)11重量部をジクロロメタン溶液90重量部で溶解し、均一な溶液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.8mm、電圧は8kV、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体に、70℃10分間熱処理を実施した。得られた繊維成形体の平均繊維径は3.6μm、厚さは81μmであった。0.01mm2以上の貫通孔は観察されなかった。繊維表面の平滑度は、1.005であった。
ボルヒールのキットに含まれるフィブリノゲン溶液1.25mLを、上記で作製した繊維成形体(5×10cm2)上に染み込ませた。フィブリノゲン溶液はシートへ染み込みにくかった。この検体を凍結後、24時間凍結乾燥させたものをフィブリノゲン固定化シートとした。フィブリノゲンは、シート内部全面に均一に担持されていた。そのSEM像を図3に示す。シートの両端をピンセットで挟み、10回折りまげを実施し、重量変化を確認した。本シートを取り扱っても担持したフィブリノゲンが崩壊することはなく、重量変化はなかった(100%保持)。
次に、ボルヒールのキットに含まれるトロンビンを付属の溶解液により溶解し、1875単位/mLのトロンビン溶液を調製した。このトロンビン溶液33.75μLを、上記で作製した繊維成形体(5×10cm2)上に均一にしみ込ませた。トロンビン溶液はシートへ染み込みにくかった。この検体を凍結後、24時間凍結乾燥させたものをトロンビン固定化シートとした。トロンビンは、シート内部全面に均一に担持されていた。
繊維成形体として、ポリグリコール酸系不織布であるネオベール(登録商標、グンゼ株式会社製、平均繊維径20μm、厚さ150μm)を用いた以外は、実施例1と同様に、フィブリノゲン固定化シートおよびトロンビン固定化シートを作製した。SEM観察により0.01mm2以上の貫通孔が観察された。繊維表面の平滑度は、1.069であった。
上で調製したフィブリノゲン溶液はシートへ染み込みにくかった。この検体を凍結後、24時間凍結乾燥させたものをフィブリノゲン固定化シートとした。シートの両端をピンセットで挟み、10回折りまげを実施し、重量変化を確認した。フィブリノゲンは、シート内部全面に均一に担持されておらず、シートはピンセットで取り扱うと、担持されていたフィブリノゲンが剥落した(重量変化89%)。SEM像を図4に示す。
同様に、上で調製したトロンビン溶液もシートへの染み込みが悪かった。この検体を凍結後、24時間凍結乾燥させたものをトロンビン固定化シートとした。トロンビンは、シート内部全面に均一に担持されていた。
Claims (9)
- 繊維成形体(A)にフィブリノゲンが固定化されたシートと、繊維成形体(B)にトロンビンが固定化されたシートから構成されるシート状止血材であって、繊維成形体(A)および繊維成形体(B)はいずれも平均繊維径0.1〜10μmの生分解性ポリマー繊維からなり、かつ0.01mm2以上の貫通孔を有さない特性と、繊維表面の平滑度が1.07以下である特性のうち、少なくともいずれか一つの特性をさらに有する、ことを特徴とするシート状止血材。
- フィブリノゲンが固定化されたシートおよびトロンビンが固定化されたシートの厚みがいずれも50〜300μmである請求項1に記載のシート状止血材。
- 生分解性ポリマーがポリ乳酸および/または乳酸の共重合体である、請求項1または2に記載のシート状止血材。
- 繊維成形体(A)および繊維成形体(B)が、生分解性ポリマーに対して0.1から10重量%のリン脂質を含有する、請求項1から3のいずれかに記載のシート状止血材。
- リン脂質がホスファチジルコリンおよび/またはホスファチジルエタノールアミンである請求項4に記載のシート状止血材。
- リン脂質がジラウロイルホスファチジルコリンである請求項4に記載のシート状止血材。
- リン脂質がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである請求項4に記載のシート状止血材。
- 繊維成形体(A)および繊維成形体(B)がいずれもエレクトロスピニング法にて製造されたものである請求項1から7のいずれかに記載のシート状止血材。
- フィブリノゲンが固定化されたシートとトロンビンが固定化されたシートからなる二層構造からなる請求項1から8のいずれかに記載のシート状止血材。
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