JP2013009664A - 腎疾患治療剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】NC1又はその抗体投与により作製した腎疾患モデルによりスクリ−ニングした腎疾患治療剤を提供する。
【解決手段】次の通り構成する。イ、タイプ4コラ−ゲンのNC1分画(又はその部分や構成ペプタイド)又はその抗体を動物に投与して作製した「腎疾患」モデルを用いて開発する腎疾患治療剤、及び同モデルを用いて開発する免疫抑制効果や抗アレルギ−効果を持つ腎疾患治療剤。ロ、タイプ4コラ−ゲンのNC1分画(又はその部分や構成ペプタイド)より成るか、これらを抗原として作製した抗体より成る腎疾患治療剤。ハ、抗NC1抗体の測定による、腎炎の初期を検出する方法。
【選択図】なし
【解決手段】次の通り構成する。イ、タイプ4コラ−ゲンのNC1分画(又はその部分や構成ペプタイド)又はその抗体を動物に投与して作製した「腎疾患」モデルを用いて開発する腎疾患治療剤、及び同モデルを用いて開発する免疫抑制効果や抗アレルギ−効果を持つ腎疾患治療剤。ロ、タイプ4コラ−ゲンのNC1分画(又はその部分や構成ペプタイド)より成るか、これらを抗原として作製した抗体より成る腎疾患治療剤。ハ、抗NC1抗体の測定による、腎炎の初期を検出する方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、腎疾患モデル動物及び腎疾患モデルによりスクリ−ニングした腎疾患治療剤に関する。
従来、動物に腎炎モデルを作製するには、1)腎臓の5/6切除(発症までに2−3ヵ月と長期間を要する)、2)抗サイ1の静注(腎炎の期間は1週間と短くその後自然回復する)、3)片側腎の切除と「2)」との併用(再現性が難しく、しかも発症までに2−3ヵ月を要する)、4)アドリアマイシンなどの薬剤静注(発症までに2−3ヵ月と長期間を要する)などの方法がある。
従来の方法はいずれも一長一短があり、薬物のスクリ−ニングや副作用検出にふさわしいものではなかった。
一方、腎炎モデルとして、腎臓の糸球体基底膜からのタイプ4コラ−ゲンのNC1分画を用いる方法も文献(ラット投与による実験)に記載されているが、投与6週間後には半数が腎不全で死ぬとも、記載されており、余りにも激症であり、薬物のスクリ−ニングや副作用検出にふさわしいものではなかった。又抗原としてのNC1の抽出精製の困難さもあり、薬効評価に用いられていなかった。
従来の方法はいずれも一長一短があり、薬物のスクリ−ニングや副作用検出にふさわしいものではなかった。
一方、腎炎モデルとして、腎臓の糸球体基底膜からのタイプ4コラ−ゲンのNC1分画を用いる方法も文献(ラット投与による実験)に記載されているが、投与6週間後には半数が腎不全で死ぬとも、記載されており、余りにも激症であり、薬物のスクリ−ニングや副作用検出にふさわしいものではなかった。又抗原としてのNC1の抽出精製の困難さもあり、薬効評価に用いられていなかった。
従来の方法は、1)発症まで長時間を要するので、実験に直ぐ掛かれず動物飼育費も重む、2)実験途中で自然回復するので、薬効の判定がし難い、3)再現性がなく、追試で薬効を比較し難い、4)激症のため、実験途中で死ぬなどの欠点があった。以上の欠点を解消した腎炎モデルが作製できれば、腎疾患治療薬の開発や他薬剤の副作用検出(腎疾患への影響)に利用できる。
本発明者は、長い間腎疾患や他疾患に伴う二次性腎疾患の治療薬開発と早期検出方法に努めてきた。
先ず、抽出精製方法を工夫し、ウシ腎臓の糸球体基底膜から、安定的に品質維持された「タイプ4コラーゲンのNC1分画(以降NC1と言う)」を得た。
(本発明に於いてタイプ4コラ−ゲンはタイプIVコラ−ゲンと、NC1分画はNC1領域と同義に用いる。)
つまり、1)抽出過程で蛋白分解酵素阻害剤を適量加える(NEM及びPMSFを抽出溶液中にそれぞれ最終濃度0.1Mから0.01mMになるように、望ましくは、10mMから0.1mMになるように加える)、2)精製途中で加熱(40度以上50度以下で5分以上)する、3)電気泳動で特定バンド(49〜33kDaの間及び28〜20kDa)を示すものをカラム抽出(吸光度が7Sのピ−クの90%以上で、4倍以内のもの)する−である。このNC1は常に一定の生化学的特性と保存性を示す。
先ず、抽出精製方法を工夫し、ウシ腎臓の糸球体基底膜から、安定的に品質維持された「タイプ4コラーゲンのNC1分画(以降NC1と言う)」を得た。
(本発明に於いてタイプ4コラ−ゲンはタイプIVコラ−ゲンと、NC1分画はNC1領域と同義に用いる。)
つまり、1)抽出過程で蛋白分解酵素阻害剤を適量加える(NEM及びPMSFを抽出溶液中にそれぞれ最終濃度0.1Mから0.01mMになるように、望ましくは、10mMから0.1mMになるように加える)、2)精製途中で加熱(40度以上50度以下で5分以上)する、3)電気泳動で特定バンド(49〜33kDaの間及び28〜20kDa)を示すものをカラム抽出(吸光度が7Sのピ−クの90%以上で、4倍以内のもの)する−である。このNC1は常に一定の生化学的特性と保存性を示す。
さらに腎炎モデルを作製する時、NC1の投与方法は、NC1と同容量のFCAとを混和し、両後足のフットパット(又は、尾根部や背部の皮内)に投与する。サルでは、例えばカニクイザル(投与時体重2kgから3.5kgが望ましい)は、3mg/kgから0.1mg/kgまでの量を投与し、望ましくは、1mg/kgである。ラット(投与時4週令から20週令)やマウス(投与時4週令から20週令)では、2mg/匹から5μg/匹までの量を投与し、望ましくは、5μg/匹から200μg/匹であり、より望ましくは、10μg/匹から100μg/匹である。
抗体投与の場合は、抗体を動物の静脈や腹腔に単独投与する。抗体は、ポリクロでも、モノクロでも良い。モノクロは、IgG1でもIgG2でも良いが、IgG1の方が弱い腎炎を惹起する。ポリクロはポリクロを作製する時、動物種間、個体間で抗体価がばらつくので、使用時に留意する必要があるが、モノクロはいつも一定の抗体価を示すものが得られるので、作製の手間は要するが使用は楽である。サルでのモノクロ投与は、例えばカニクイザル(投与時体重2kgから3.5kgが望ましい)は、2mg/kgから10μg/kgまでの量を投与し、望ましくは、1mg/kgから50μg/kgである。ラット(投与時4週令から15週令)やマウス(投与時4週令から15週令)では、1mg/匹から5μg/匹までの量を投与し、望ましくは、200μg/匹から5μg/匹である。
その結果、提示の投与法と量でラットやマウス等のげっ歯類及びサルなどの哺乳動物に感作した時に、確実に腎炎を発症させながら、実験途中で死亡などの激症を生じさせない特徴を持つ。
抗体投与の場合は、抗体を動物の静脈や腹腔に単独投与する。抗体は、ポリクロでも、モノクロでも良い。モノクロは、IgG1でもIgG2でも良いが、IgG1の方が弱い腎炎を惹起する。ポリクロはポリクロを作製する時、動物種間、個体間で抗体価がばらつくので、使用時に留意する必要があるが、モノクロはいつも一定の抗体価を示すものが得られるので、作製の手間は要するが使用は楽である。サルでのモノクロ投与は、例えばカニクイザル(投与時体重2kgから3.5kgが望ましい)は、2mg/kgから10μg/kgまでの量を投与し、望ましくは、1mg/kgから50μg/kgである。ラット(投与時4週令から15週令)やマウス(投与時4週令から15週令)では、1mg/匹から5μg/匹までの量を投与し、望ましくは、200μg/匹から5μg/匹である。
その結果、提示の投与法と量でラットやマウス等のげっ歯類及びサルなどの哺乳動物に感作した時に、確実に腎炎を発症させながら、実験途中で死亡などの激症を生じさせない特徴を持つ。
本発明に用いるNC1は、ウシ以外の動物でも良く、例えば、ヒト、サル、ブタ、羊、ヤギ等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類、ラット、マウス等のげっし類、鮭、鮫などの魚類、昆虫類、その他の動物や、細菌、微生物でも良い。
又、NC1の由来臓器は、腎臓に限らず、胎盤、眼その他いずれの臓器でも良いが、腎臓又は胎盤が望ましい。他の臓器に比較し、大量に入手しやすく精製の費用も安くなる。
更に、NC1は、抽出精製のみでなく合成しても良く、遺伝子操作で、その全体又は、部分を合成させて使用しても良い。しかし、NC1全体を用いることは、特定α鎖(α3やα4)のNC1を用いるより発症を緩やかにする。
又、NC1の由来臓器は、腎臓に限らず、胎盤、眼その他いずれの臓器でも良いが、腎臓又は胎盤が望ましい。他の臓器に比較し、大量に入手しやすく精製の費用も安くなる。
更に、NC1は、抽出精製のみでなく合成しても良く、遺伝子操作で、その全体又は、部分を合成させて使用しても良い。しかし、NC1全体を用いることは、特定α鎖(α3やα4)のNC1を用いるより発症を緩やかにする。
次に、この疾患モデルを用いて、薬物のスクリーニングを行い腎炎治療薬を見出だした。
サイクロスポリンを始めとする免疫抑制剤は、腎炎治療薬と成り得るし、従来、抗炎症剤、抗アレルギ−剤、アトピ−治療剤として用いられていた薬剤も、腎炎治療薬として効能が拡大できる。
同時に、本発明のスクリーニング方法の有効性も確認できた。
更に腎炎に伴う二次性疾患の治療剤、例えば透析剤、腎性貧血剤、降圧剤、骨疾患治療剤のスクリーニングや評価にも使える。
一方、長期に薬剤を服用する糖尿病、高血圧、骨粗鬆症、高脂血症、その他の慢性疾患では、長期の服用による腎臓への影響が懸念される。特に、これらの薬を利用する機会の多い中高年は、若年者にくらべ腎臓の代謝能力が著しく劣っているので、より留意する必要がある。
その点、本発明の腎炎モデルを、一般薬剤の長期連用による腎機能の劣化している中高年者への影響を検討するのにもふさわしい。
もちろん、短期間投与の薬剤、例えば抗生物質などの腎疾患患者への影響を確認するにも適している。
サイクロスポリンを始めとする免疫抑制剤は、腎炎治療薬と成り得るし、従来、抗炎症剤、抗アレルギ−剤、アトピ−治療剤として用いられていた薬剤も、腎炎治療薬として効能が拡大できる。
同時に、本発明のスクリーニング方法の有効性も確認できた。
更に腎炎に伴う二次性疾患の治療剤、例えば透析剤、腎性貧血剤、降圧剤、骨疾患治療剤のスクリーニングや評価にも使える。
一方、長期に薬剤を服用する糖尿病、高血圧、骨粗鬆症、高脂血症、その他の慢性疾患では、長期の服用による腎臓への影響が懸念される。特に、これらの薬を利用する機会の多い中高年は、若年者にくらべ腎臓の代謝能力が著しく劣っているので、より留意する必要がある。
その点、本発明の腎炎モデルを、一般薬剤の長期連用による腎機能の劣化している中高年者への影響を検討するのにもふさわしい。
もちろん、短期間投与の薬剤、例えば抗生物質などの腎疾患患者への影響を確認するにも適している。
又、NC1や、抗NC1抗体は、腎炎治療薬となり得る。NC1や、抗NC1抗体の事前投与で腎炎発症を抑制する。この場合は、感作に先立つ薬物の事前投与によるスクリ−ニングである。本方法もスクリ−ニング方法として有効である。更に、血清中の抗NC1抗体の検出は、蛋白尿に先立つので、腎疾患の早期検出に有用である。
血液中の抗NC1抗体を免疫反応を用いて測定する方法とその試薬。
ラット血清中の抗NC1抗体を、酵素免疫反応(ELISA)で測定する時、試薬として、1)NC1をコ−トしたプレ−ト、2)酵素標識抗ラットIgG抗体、3)発色基質(TMB,過酸化水素)、4)反応停止液(硫酸)を用いて測定する。
もちろん、免疫反応として、酵素免疫反応に限定されず、AB法、RIA,免疫発光法、沈降反応、凝集反応他を含み、酵素標識の抗体としては、ポリクロ−ナル又はモノクロ−ナル抗体を問わず、又それを放射性物質、発光物質で標識した物、無標識物でも良い。
反応形式は、サンドイッチ法に囚われず、競合法等でも良い。
プレ−トに替え、ガラス、磁性物質、ラテックスにしても良く、無しにして固相法を用いないことでも良い。
プレ−トにNC1をコ−トする時、コ−ト物質をアビジン、ビオチン、又はこれらの結合した成分を介しても良い。
コ−ト時に用いるNC1の動物種としては、検体と同一の種が望ましく(ここではラット)又、ウシ、ヒト、サル、ブタ、羊、ヤギ等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類、マウス等のげっし類、魚類、その他の動物でも良い。NC1の由来臓器は、腎臓が望ましいが、これに限定されない。
プレ−トにコ−トするNC1は、複数種を混合したものでも良い。又、NC1は、生体抽出物やリコンビナントのみでなく、構成ペプタイド(特定分画、合成品を含む)でも良い。
更に第二抗体は、抗検体IgG抗体に限定されず、抗検体IgM抗体、抗検体IgA抗体、抗検体イムノグロブリン抗体でも良いが、抗検体IgG抗体が望ましい。
測定する検体がヒト,サル、マウスなどラット以外の時は、前述のラット用試薬成分を検体に合わせる。
ラット血清中の抗NC1抗体を、酵素免疫反応(ELISA)で測定する時、試薬として、1)NC1をコ−トしたプレ−ト、2)酵素標識抗ラットIgG抗体、3)発色基質(TMB,過酸化水素)、4)反応停止液(硫酸)を用いて測定する。
もちろん、免疫反応として、酵素免疫反応に限定されず、AB法、RIA,免疫発光法、沈降反応、凝集反応他を含み、酵素標識の抗体としては、ポリクロ−ナル又はモノクロ−ナル抗体を問わず、又それを放射性物質、発光物質で標識した物、無標識物でも良い。
反応形式は、サンドイッチ法に囚われず、競合法等でも良い。
プレ−トに替え、ガラス、磁性物質、ラテックスにしても良く、無しにして固相法を用いないことでも良い。
プレ−トにNC1をコ−トする時、コ−ト物質をアビジン、ビオチン、又はこれらの結合した成分を介しても良い。
コ−ト時に用いるNC1の動物種としては、検体と同一の種が望ましく(ここではラット)又、ウシ、ヒト、サル、ブタ、羊、ヤギ等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類、マウス等のげっし類、魚類、その他の動物でも良い。NC1の由来臓器は、腎臓が望ましいが、これに限定されない。
プレ−トにコ−トするNC1は、複数種を混合したものでも良い。又、NC1は、生体抽出物やリコンビナントのみでなく、構成ペプタイド(特定分画、合成品を含む)でも良い。
更に第二抗体は、抗検体IgG抗体に限定されず、抗検体IgM抗体、抗検体IgA抗体、抗検体イムノグロブリン抗体でも良いが、抗検体IgG抗体が望ましい。
測定する検体がヒト,サル、マウスなどラット以外の時は、前述のラット用試薬成分を検体に合わせる。
1.NC1の特性;
ウシ腎臓の糸球体基底膜よりタイプ4コラ−ゲンのNC1を精製し、その特徴は下記の通りである。
・NC1の電気泳動像は一定(49〜33kDaの間及び28〜20kDa)
・抗タイプ4コラーゲン(三本鎖領域)抗体と反応しないが、作製した各種の抗NC1抗体(ポリクロ/ウサギ、ラット、モノクロ/マウス)と反応する。
・同上の抗NC1抗体は別途用意したタイプ4コラーゲン(K34 ヒト胎盤由来タイプ4コラ−ゲン コラ−ゲン技術研修会製)と反応しない。
・提示方法で、動物に投与した時、腎炎の発症率100%で、投与6週後の生存率95%以上となるタイプ4コラ−ゲンのNC1。
ウシ腎臓の糸球体基底膜よりタイプ4コラ−ゲンのNC1を精製し、その特徴は下記の通りである。
・NC1の電気泳動像は一定(49〜33kDaの間及び28〜20kDa)
・抗タイプ4コラーゲン(三本鎖領域)抗体と反応しないが、作製した各種の抗NC1抗体(ポリクロ/ウサギ、ラット、モノクロ/マウス)と反応する。
・同上の抗NC1抗体は別途用意したタイプ4コラーゲン(K34 ヒト胎盤由来タイプ4コラ−ゲン コラ−ゲン技術研修会製)と反応しない。
・提示方法で、動物に投与した時、腎炎の発症率100%で、投与6週後の生存率95%以上となるタイプ4コラ−ゲンのNC1。
2.NC1感作によるラット腎炎モデル
(以降実施例で用いるNC1は、上記「実施例1」で得たものである)
1)発症試験1
ラット;ウイスタ−系・雌・5週令・3匹×2群(チャ−ルスリバ−社)
投与部位;尾根部皮内
投与量;FCAと共に初回NC1を0.05mg/匹、以降2週間毎に0.1mg×4回
結果;投与個体は全て強蛋白尿を示した。
実験終了後は全て生存した。
実験中の挙動(投与部位の足腫れ有り)・体重には健常群と投与群とに大差がなかった。し
初回投与後35日で抗体OD値は8000倍稀釈も原血清も同じだった。
初回投与後42日の測定で随時尿の蛋白は最高濃度を示した。
結論;追加免疫の繰り返しで、抗体価が上昇し、全て発症、全て生存し、腎炎モデルとして、使用可能である。
2)発症試験2
ラット;WKY/NCrj・雌・7週令・投与10匹非投与5匹
投与部位;両後足フットパット
投与量;FCA(1対1)と共にNC1として0.1mg(片足0.05mg)×1回
結果;投与個体は3週間後に全て強蛋白尿を示した。
実験終了の6週間まで全て生存した。剖検で糸球体の破壊が認められた。
実験中の挙動・体重には非投与群とに差が無かった。
(投与部位の腫れで4−5日足を引きずる)
蛋白尿は、投与後2週間で2匹が、3週間後で全10匹が陽性を示した。
血清中抗体価は投与後2週間で全10匹が2000以上、4週間で4400より10000以上まで上昇した(抗体価は吸光度1.00になる稀釈倍率で示す)。
尿中抗体価は投与後2週間で2匹の蛋白尿陽性検体のみで10と20、4週間で全10匹が50〜1000を示した。(添付3、添付4)
結論;血清中の抗体は、尿中蛋白や尿中抗体に先行して検出されるので、腎疾患の早期検出に有用である。
抗体価は、血清中が尿中の10倍以上であったので、血清測定が望ましい。
3)発症試験3
ラット;ウイスタ−・雌・8週令・3匹
投与部位;背部皮内
投与量;FCA(1対1)と共にNC1として0.1mg、追加免疫2週後同量
測定;尿試験紙(テルモウリエ−ス;蛋白陽性は+1〜+4)
結果;投与1週後より5週まで、±から+1で、6週以降3か月間、+1又は+2で弱い蛋白尿を継続し、同時に潜血反応も示した。
結論;軽微で長期の蛋白尿出現は、軽症の腎炎モデルとして有用である。
(以降実施例で用いるNC1は、上記「実施例1」で得たものである)
1)発症試験1
ラット;ウイスタ−系・雌・5週令・3匹×2群(チャ−ルスリバ−社)
投与部位;尾根部皮内
投与量;FCAと共に初回NC1を0.05mg/匹、以降2週間毎に0.1mg×4回
結果;投与個体は全て強蛋白尿を示した。
実験終了後は全て生存した。
実験中の挙動(投与部位の足腫れ有り)・体重には健常群と投与群とに大差がなかった。し
初回投与後35日で抗体OD値は8000倍稀釈も原血清も同じだった。
初回投与後42日の測定で随時尿の蛋白は最高濃度を示した。
結論;追加免疫の繰り返しで、抗体価が上昇し、全て発症、全て生存し、腎炎モデルとして、使用可能である。
2)発症試験2
ラット;WKY/NCrj・雌・7週令・投与10匹非投与5匹
投与部位;両後足フットパット
投与量;FCA(1対1)と共にNC1として0.1mg(片足0.05mg)×1回
結果;投与個体は3週間後に全て強蛋白尿を示した。
実験終了の6週間まで全て生存した。剖検で糸球体の破壊が認められた。
実験中の挙動・体重には非投与群とに差が無かった。
(投与部位の腫れで4−5日足を引きずる)
蛋白尿は、投与後2週間で2匹が、3週間後で全10匹が陽性を示した。
血清中抗体価は投与後2週間で全10匹が2000以上、4週間で4400より10000以上まで上昇した(抗体価は吸光度1.00になる稀釈倍率で示す)。
尿中抗体価は投与後2週間で2匹の蛋白尿陽性検体のみで10と20、4週間で全10匹が50〜1000を示した。(添付3、添付4)
結論;血清中の抗体は、尿中蛋白や尿中抗体に先行して検出されるので、腎疾患の早期検出に有用である。
抗体価は、血清中が尿中の10倍以上であったので、血清測定が望ましい。
3)発症試験3
ラット;ウイスタ−・雌・8週令・3匹
投与部位;背部皮内
投与量;FCA(1対1)と共にNC1として0.1mg、追加免疫2週後同量
測定;尿試験紙(テルモウリエ−ス;蛋白陽性は+1〜+4)
結果;投与1週後より5週まで、±から+1で、6週以降3か月間、+1又は+2で弱い蛋白尿を継続し、同時に潜血反応も示した。
結論;軽微で長期の蛋白尿出現は、軽症の腎炎モデルとして有用である。
3.NC1感作によるサル腎炎モデル 発症試験4
サル;カニクイザル・雌・2匹(3.0kg,2.6kg、共に4歳)
投与部位;両後足フットパット
投与量;FCA(1対1)と共にNC1として4mg(片足2mg)×1回
結果;中蛋白尿を示した。1匹は2週後(154mg/24hr)、1匹は3週間後(81mg/24hr)である。
実験終了時(6週間)は強蛋白尿(339mg/24hr,249mg/24hr)で、臓器の変化は、肺臓、肝臓にはなく腎臓のみで、糸球体に破壊があった。
結論;哺乳類であるサルで、100%発症し、実験中100%生存する安定した腎炎モデルを作製できる。
サル;カニクイザル・雌・2匹(3.0kg,2.6kg、共に4歳)
投与部位;両後足フットパット
投与量;FCA(1対1)と共にNC1として4mg(片足2mg)×1回
結果;中蛋白尿を示した。1匹は2週後(154mg/24hr)、1匹は3週間後(81mg/24hr)である。
実験終了時(6週間)は強蛋白尿(339mg/24hr,249mg/24hr)で、臓器の変化は、肺臓、肝臓にはなく腎臓のみで、糸球体に破壊があった。
結論;哺乳類であるサルで、100%発症し、実験中100%生存する安定した腎炎モデルを作製できる。
4.NC1感作によるマウス腎炎モデル 発症試験5
マウス;BALB/c・雌・5週令・3匹(チャ−ルズリバ−社)
投与部位;背部皮内
投与量;FCA(1対1)と共にNC1として0.1mg、追加免疫2週後同量
測定;尿試験紙(テルモウリエ−ス;蛋白陽性は+1〜+4)
結果;投与1週後より7週まで+1又は+2で、弱い蛋白尿を継続した。
マウス;BALB/c・雌・5週令・3匹(チャ−ルズリバ−社)
投与部位;背部皮内
投与量;FCA(1対1)と共にNC1として0.1mg、追加免疫2週後同量
測定;尿試験紙(テルモウリエ−ス;蛋白陽性は+1〜+4)
結果;投与1週後より7週まで+1又は+2で、弱い蛋白尿を継続した。
5.抗NC1抗体投与によるマウス腎炎モデル 発症試験6
マウス;BALB/c・雌・5週令・9匹(チャ−ルズリバ−社)
投与部位;腹腔内
投与量;抗NC1抗体(マウスモノクロ抗体、IgG1、12D)を、10,20,50μgを各3匹に投与し、2週後同量追加投与した。
測定;尿試験紙(テルモウリエ−ス;蛋白陽性は+1〜+4)
結果;投与1週後より7週まで+1又は+2で、弱い蛋白尿を継続した。
結論;軽微で長期の蛋白尿出現は、軽症の腎炎モデルとして有用である。
6.抗NC1抗体投与によるラット腎炎モデル 発症試験7
ラット;ウイスタ−・雌・8週令・3匹(チャ−ルズリバ−社)
投与部位;腹腔内
投与量;抗NC1抗体(マウスモノクロ抗体、IgG1、12D)を、50μgを各3匹に投与、2週後同量追加投与した。
測定;尿試験紙(テルモウリエ−ス;蛋白陽性は+1〜+4)
結果;投与1週後より4か月間、+1、±又は+2で、弱い蛋白尿を継続した。
−はなかった。
結論;軽微で長期の蛋白尿出現は、軽症の腎炎モデルとして有用である。
マウス;BALB/c・雌・5週令・9匹(チャ−ルズリバ−社)
投与部位;腹腔内
投与量;抗NC1抗体(マウスモノクロ抗体、IgG1、12D)を、10,20,50μgを各3匹に投与し、2週後同量追加投与した。
測定;尿試験紙(テルモウリエ−ス;蛋白陽性は+1〜+4)
結果;投与1週後より7週まで+1又は+2で、弱い蛋白尿を継続した。
結論;軽微で長期の蛋白尿出現は、軽症の腎炎モデルとして有用である。
6.抗NC1抗体投与によるラット腎炎モデル 発症試験7
ラット;ウイスタ−・雌・8週令・3匹(チャ−ルズリバ−社)
投与部位;腹腔内
投与量;抗NC1抗体(マウスモノクロ抗体、IgG1、12D)を、50μgを各3匹に投与、2週後同量追加投与した。
測定;尿試験紙(テルモウリエ−ス;蛋白陽性は+1〜+4)
結果;投与1週後より4か月間、+1、±又は+2で、弱い蛋白尿を継続した。
−はなかった。
結論;軽微で長期の蛋白尿出現は、軽症の腎炎モデルとして有用である。
7.薬効試験1
ラット;WKY/NCrj・雌・8週令・3匹
試験法;「発症試験2」を用いた。
投与薬剤;免疫抑制剤の例として、サイクロスポリンAを使用
投与量;感作翌々日より50mg/kg/日を経口投与で連日投与
結果;感作4週間後で、2匹には微弱な(尿試験紙)蛋白尿、1匹は陰性しか認められなかった。
結論;本発明のスクリーニング方法は、薬効評価に有用である。
8.薬効試験2
ラット;WKY/NCrj・雌・5週令・6匹(1薬剤2匹)対照2匹計8匹
試験法;「発症試験2」を用いた。
投与薬剤;NC1、
抗NC1ポリクロ抗体(ウサギ由来)、
抗NC1モノクロ抗体(マウス由来)
投与量;各薬剤(蛋白量として)0.4mg/匹を連日4週間の経口投与後、感作した。
結果;感作4週間後で、対照は強呈色であったが、投与群はいずれも微弱から中の蛋白呈色であった。
結論;本発明のスクリーニング方法が、薬効評価に有用であるのみならず、NC1及びその抗体は、腎炎治療剤となり得る。
ラット;WKY/NCrj・雌・8週令・3匹
試験法;「発症試験2」を用いた。
投与薬剤;免疫抑制剤の例として、サイクロスポリンAを使用
投与量;感作翌々日より50mg/kg/日を経口投与で連日投与
結果;感作4週間後で、2匹には微弱な(尿試験紙)蛋白尿、1匹は陰性しか認められなかった。
結論;本発明のスクリーニング方法は、薬効評価に有用である。
8.薬効試験2
ラット;WKY/NCrj・雌・5週令・6匹(1薬剤2匹)対照2匹計8匹
試験法;「発症試験2」を用いた。
投与薬剤;NC1、
抗NC1ポリクロ抗体(ウサギ由来)、
抗NC1モノクロ抗体(マウス由来)
投与量;各薬剤(蛋白量として)0.4mg/匹を連日4週間の経口投与後、感作した。
結果;感作4週間後で、対照は強呈色であったが、投与群はいずれも微弱から中の蛋白呈色であった。
結論;本発明のスクリーニング方法が、薬効評価に有用であるのみならず、NC1及びその抗体は、腎炎治療剤となり得る。
9.抗NC1抗体の測定
検体;NC1感作後10日目のラット血清(5匹)及び未処理ラット(5匹)
測定法;ELISA法とラテックス凝集法
ELISA法の概要;
試薬1、NC1(ウシ腎糸球体基底膜由来タイプ4コラ−ゲンのNC1)を0.5μg/穴をコ−トしたマイクロプレ−ト
試薬2、HRP標識抗ラットIgG抗体(ウサギ由来ポリクロ−ナル)
試薬3、TMB試薬(TMB0.1%,過酸化水素0.02%、0.1Mクエン酸緩衝液)
試薬4、反応停止液(0.5M硫酸)
検体は、リン酸緩衝液で2000倍に希釈し、100μl/穴を用いた。
測定方法:試薬1に検体100μl/穴→2時間インキュベ−ション及び洗浄→試薬2、100μl/穴→1時間インキュベ−ションおよび洗浄→試薬3、100μl→30分インキュベ−ション→試薬4、50μl→測定(吸光度450nm)
結果:感作5検体中、抗NC1抗体は、全てに認められた。未投与検体5例ではまったく認められなかった。 (付表4)
よって、本法は、腎疾患で蛋白尿が出現する前の早期血清中の抗NC1抗体の存在を検出でき、腎疾患発症を予知できる。
なおラテックス凝集法を用いた時は、検体の稀釈が100倍で同じ結果を得た。
結論;本発明の抗NC1抗体測定法は、実験動物の評価及び、腎炎の早期検出に有用である。
検体;NC1感作後10日目のラット血清(5匹)及び未処理ラット(5匹)
測定法;ELISA法とラテックス凝集法
ELISA法の概要;
試薬1、NC1(ウシ腎糸球体基底膜由来タイプ4コラ−ゲンのNC1)を0.5μg/穴をコ−トしたマイクロプレ−ト
試薬2、HRP標識抗ラットIgG抗体(ウサギ由来ポリクロ−ナル)
試薬3、TMB試薬(TMB0.1%,過酸化水素0.02%、0.1Mクエン酸緩衝液)
試薬4、反応停止液(0.5M硫酸)
検体は、リン酸緩衝液で2000倍に希釈し、100μl/穴を用いた。
測定方法:試薬1に検体100μl/穴→2時間インキュベ−ション及び洗浄→試薬2、100μl/穴→1時間インキュベ−ションおよび洗浄→試薬3、100μl→30分インキュベ−ション→試薬4、50μl→測定(吸光度450nm)
結果:感作5検体中、抗NC1抗体は、全てに認められた。未投与検体5例ではまったく認められなかった。 (付表4)
よって、本法は、腎疾患で蛋白尿が出現する前の早期血清中の抗NC1抗体の存在を検出でき、腎疾患発症を予知できる。
なおラテックス凝集法を用いた時は、検体の稀釈が100倍で同じ結果を得た。
結論;本発明の抗NC1抗体測定法は、実験動物の評価及び、腎炎の早期検出に有用である。
Claims (2)
- 下記の腎臓由来タイプ4コラーゲンNC1分画を、下記の動物に下記の条件で投与した時、腎炎の発症率が100%で、投与6週後の生存率95%以上となる腎炎惹起方法。
1.投与物質は、以下の全条件を満足するウシ腎臓由来タイプ4コラーゲンNC1分画
1)投与物質の抽出工程の特徴;
47〜50℃で1日間の熱処理をする
2)投与物質の特定域の採取;
電気泳動像が特定バンド(49〜33kDa及び28〜20kDa)であり、カラム抽出する時は吸光度が7Sのピークの90%以上で4倍以内のものを採取する
3)投与物質の免疫的特性;
(1)作製したウサギ由来(ポリクロ)、ラット由来(ポリクロ)、マウス由来(モノクロ)のいずれの抗NC1抗体とも反応する
(2)抗タイプ4コラーゲン(三本鎖領域)抗体と反応しない
(3)前述のウサギ由来(ポリクロ)、ラット由来(ポリクロ)、マウス由来(モノクロ)のいずれの抗NC1抗体もヒト胎盤由来タイプ4コラーゲンと反応しない
2.腎炎モデル;カニクイサル(個体あたり2〜3.5kg)
投与量;同量のFCAと共に1回当たり3mg/kg〜0.1mg/kg×1回
投与部位;フットパット又は背部皮内
結果の判定;
投与2〜3週後に蛋白尿を示し、
6週後には強蛋白尿となり、腎糸球体組織に破壊が生じる」 - 請求項1の腎炎惹起方法によるカニクイサル腎炎モデル。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017035089A (ja) * | 2011-05-31 | 2017-02-16 | サントリー食品インターナショナル株式会社 | 飲料組成物 |
-
2012
- 2012-04-01 JP JP2012094217A patent/JP2013009664A/ja active Pending
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6008000852; 佐渡 義一ら: 重井医学年報 15, 1993, pp.17-27 * |
JPN6011039933; Sado, Y. et al: 'Experimental autoimmune glomerulonephritis with pulmonary hemorrhage in rats. The dose-effect relati' Journal of Clinical & Laboratory Immunology Vol.15, 1984, pp.199-204 * |
JPN6011041065; 畑 隆一郎、服部 俊治、新井 克彦 編: 細胞外マトリックス研究法[5]第IV部.機能解析法 下 , 19990120, pp.48-61, コラーゲン技術研修会 * |
JPN6012003572; 日経バイオテクノロジー最新用語辞典91 第1版, 19910425, p.290 * |
JPN6012003574; 本庄重男: Experimental Animals 第36巻,第4号, 1987, p.367-379 * |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017035089A (ja) * | 2011-05-31 | 2017-02-16 | サントリー食品インターナショナル株式会社 | 飲料組成物 |
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