JP2012533597A - 栄養剤として適用するためのクルミ抽出物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、「栄養剤として適用するためのクルミ抽出物(Walnut extracts for nutraceutical applications)」と題する2009年7月20日出願の米国仮特許出願第61/226,780号にに基づく、35U.S.C.§119(e)にしたがう優先権の利益を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に援用される。
本発明は、一般に、リン脂質、特にホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルセリン(PS)、およびホスファチジルイノシトール(PI)が、自然に存在するクルミに見られるクルミ油と比べて富化されている、クルミ核抽出物に関する。PE/PCおよび/またはPIを組み合わせると相乗的な治療効果が存在することがわかった。
ES2008−021 総脂質画分の3.5%
ES2008−022 総脂質画分の1.5%
ES2008−021 総脂質画分の5.2%
ES2008−022 総脂質画分の3.6%
ES2008−021 ホスファチジルコリン(PC)22.2%(m/m)
PCと表される他のホスファチジル脂質13.9%(m/m)
ES2008−022 ホスファチジルコリン(PC)5.4%(m/m)
PCと表される他のホスファチジル脂質15.2%(m/m)
ES2008−021 1.3%(m/m)
ES2008−022 0.5%(m/m)
クルミ抽出物、ならびに大豆由来のPCおよびPSをエタノールに溶解させ、アッセイ緩衝液で希釈して、最終試験アッセイ濃度とした。
100μgのアミロイド[A]β1−40(Sigma−Aldrich、A1075)を25μlのTris緩衝液に溶解させた。サンプルを絶えず振盪しながら37℃で3日間インキュベートした。
活性サンプル:アミロイドβ溶液10μl+阻害剤(TRIS緩衝液に溶解させることが好ましい)を含むTRIS緩衝液40μl
空試薬サンプル:阻害剤(TRIS緩衝液に溶解させることが好ましい)を含むTRIS緩衝液50μl
対照サンプル:アミロイドβ溶液10μl+TRIS緩衝液40μl
3日後、各サンプルを2μM(636.8μg)のチオフラビンTおよび950μlのグリシン/NaOH緩衝液(50mMのグリシン、pH=9.0)と混合した。蛍光を励起435nm/発光485nmで測定した。
各「活性サンプル」から対応する「空試薬サンプル」の蛍光強度を差し引く。得られる蛍光強度を、対照サンプルについて測定した蛍光強度と比較した。対照からみた蛍光強度の減少を%として示すことにより、凝集の阻害%を算出した。
乾燥質量、強熱残分、およびHPLC/ELSDによって決定した含有量は、一貫している。
粒径3μmの150×3.2mm Prevailシリカカラム(Alltech Associates,Inc.)を使用した。充填物および内径が同じ予備カラムを使用した。溶離プログラムは、t=0分で87.5:12:0.5(v/v/v)のクロロホルム:メタノール:トリエチルアミン緩衝液(pH3、1Mギ酸)からt=20分で28:60:12(v/v/v)の線形勾配とした。移動相は、t=21分で初期条件に戻し、t=30分の次の注入までカラムが平衡に達するようにした。流量は0.5mL/分で維持し、これによって背圧が55〜90バールとなった。注入体積は25μLとした。サンプルおよびカラムを40℃で平衡化した。
PLクラスの定量分析のためのELSD(N2 1.5L/分、噴霧温度85℃)
PL構造の定性分析およびPLクラスの確認のためのESI−MS(ポジティブモード、m/z 100〜1200、GAIN 2、停止時間 100ミリ秒、フラグメンター 可変、乾燥ガス 12LのN2/分、ネブライザー圧力 50psi、温度は300℃、毛管圧力 3500V)
サンプルをクロロホルム/メタノール=2:1(v/v)に溶解/懸濁させた。サンプルを希釈して校正範囲(サンプル1〜10mg/溶媒ml)にした。
利用可能な基準化合物(Sigma−Aldrich)をクロロホルム/メタノール=2:l(v/v)に20〜200μg/mlの濃度で溶解させた。ELSDでは、主なPLクラスの反応は幾分似ているので、基準化合物がない場合、L−ホスファチジルコリン(P3841)が外部標準物質として役立つ。その場合、結果は、「ホスファチジルコリンとしてのリン脂質」と表示する。L−ホスファチジルコリン(P3841)は、ほぼ完全に、同時に溶出される2種の化合物からしか構成されないので、最も信頼できる較正手順であるとみなされる。
この実施例では、クルミ抽出物サンプルによるヒト血中(アセチル)コリンエステラーゼの阻害(エルマン法:5,5’−ジチオビス−2−ニトロ安息香酸(DTNB、エルマン試薬)を色原体として使用し、コリンエステラーゼ活性のレベルを412nmでの吸光度の増大として記録)を実証する。
アルツハイマー病患者に見られる斑の徴候であるアミロイドβ凝集を、in vitro試験アッセイ系において引き起こした。
クルミ抽出物:
得られたサンプルは、濾過後(シリンジフィルター0.45μm)直接試験に導入し(ES2008−022)、または可溶化後に導入した(125mgのES2008−021/ml)。抽出物を以下の実験に使用した。
100μgのアミロイド[A]β1-40(Sigma−Aldrich、A1075)を25μlのTris緩衝液に溶解させる。
活性サンプル:アミロイドβ溶液10μl+阻害剤(TRIS緩衝液に溶解させることが好ましい)を含むTRIS緩衝液40μl
空試薬サンプル:阻害剤(TRIS緩衝液に溶解させることが好ましい)を含むTRIS緩衝液50μl
対照サンプル:アミロイドβ溶液10μl+TRIS緩衝液40μl
3日後、各サンプルを2μM(636.8μg)のチオフラビンTおよび950μlのグリシン/NaOH緩衝液(50mMグリシン、pH=9.0)と混合する。励起435nm/発光485nmで蛍光を測定する。
各「活性サンプル」から対応する「空試薬サンプル」の蛍光強度を差し引く。得られる蛍光強度を対照サンプルについて測定した蛍光強度と比較する。対照からみた蛍光強度の減少を%として示すことにより、凝集の阻害%を算出した。
試験系をさらに拡大して、すでに生成しているアミロイドβ凝集を後退させる能力について、上記サンプルを評価した。脱線維化効力は、アルツハイマー病の治癒を示唆するものである。
クルミ抽出物:
得られたサンプルは、濾過後(シリンジフィルター0.45μm)直接試験に導入し(ES2008−022)、または可溶化後に導入した(125mgのES2008−021/ml)。抽出物を以下の実験に使用した。
100μgのアミロイド[A]β1-40(Sigma−Aldrich、A1075)を25μlのTris緩衝液に溶解させる。
活性サンプル:アミロイドβ溶液10μl+阻害剤(TRIS緩衝液に溶解させることが好ましい)を含むTRIS緩衝液40μl
空試薬サンプル:阻害剤(TRIS緩衝液に溶解させることが好ましい)を含むTRIS緩衝液50μl
対照サンプル:アミロイドβ溶液10μl+TRIS緩衝液40μl
3日後、各サンプルを2μM(636.8μg)のチオフラビンTおよび950μlのグリシン/NaOH緩衝液(50mMグリシン、pH=9.0)と混合する。励起435nm/発光485nmで蛍光を測定する。
各「活性サンプル」から対応する「空試薬サンプル」の蛍光強度を差し引く。得られる蛍光強度を対照サンプルについて測定した蛍光強度と比較する。
潜在的に阻害性である化合物の存在下/非存在下でのアセチルコリンエステラーゼ活性の分光学的評価。試験の原理は、酵素アッセイの間に遊離したコリンがエルマン試薬と結合することである。
阻害剤溶液:
対応するサンプル(ES2008−021、ES2008−22)10mgを秤量し、1mlのメタノールを加える。
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH=8、NaOH)を溶液Aと30:1の比で混合する。
5,5’−ジチオ−ビス[2−ニトロ安息香酸]39.6mgおよびNaHCO3 15.0mgを10mlのフラスコに量り入れ、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH=7、NaOH)でメスアップする。
70IU/H2Omlの酵素活性を含むヒトアセチルコリンエステラーゼの溶液を調製する。
Claims (32)
- ホスファチジルエタノールアミン(PE)とホスファチジルコリン(PC)とを含み、PE対PCの重量比が約0.43より大きいクルミ抽出物組成物。
- ホスファチジルイノシトール(PI)をさらに含む、請求項1に記載のクルミ抽出物組成物。
- スフィンゴ脂質をさらに含む、請求項2に記載のクルミ抽出物組成物。
- スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリンである、請求項3に記載のクルミ抽出物。
- リン脂質/スフィンゴ脂質の重量比が5:1を上回る、請求項3に記載のクルミ抽出物。
- 不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸の重量比が約1:1より大きい、請求項1に記載のクルミ抽出物。
- ホスファチジルイノシトール(PI)とホスファチジルコリン(PC)とを含み、PI対PCの重量比が約0.88より大きいクルミ抽出物組成物。
- ホスファチジルエタノールアミン(PE)をさらに含む、請求項7に記載のクルミ抽出物組成物。
- スフィンゴ脂質をさらに含む、請求項8に記載のクルミ抽出物組成物。
- スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリンである、請求項9に記載のクルミ抽出物。
- リン脂質/スフィンゴ脂質の重量比が5:1を上回る、請求項9に記載のクルミ抽出物。
- 不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸の重量比が約1:1より大きい、請求項7に記載のクルミ抽出物。
- ホスファチジルイノシトール(PI)とホスファチジルエタノールアミン(PE)とを含み、PI対PEの重量比が約0.4より大きいクルミ抽出物組成物。
- ホスファチジルコリン(PC)をさらに含む、請求項13に記載のクルミ抽出物組成物。
- スフィンゴ脂質をさらに含む、請求項14に記載のクルミ抽出物組成物。
- スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリンである、請求項15に記載のクルミ抽出物。
- リン脂質/スフィンゴ脂質の重量比が5:1を上回る、請求項15に記載のクルミ抽出物。
- 不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸の重量比が約1:1より大きい、請求項13に記載のクルミ抽出物。
- 少なくとも約10重量%のリン脂質を含む、クルミ抽出物由来の脂質組成物。
- クルミ抽出物のリン脂質の重量百分率が少なくとも約20%以上である、請求項19に記載の脂質組成物。
- リン脂質が(PE)、ホスファチジルコリン(PC)、およびホスファチジルイノシトール(PI)である、請求項20に記載の脂質組成物。
- PE対PCの重量比が約0.43より大きい、請求項21に記載の脂質組成物。
- PI対PCの重量比が約0.88より大きい、請求項21に記載の脂質組成物。
- PI対PEの重量比が約0.4より大きい、請求項21に記載の脂質組成物。
- βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ/または脳における代謝を促進する方法であって、状態の1つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項1に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
- βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ/または脳における代謝を促進する方法であって、状態の1つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項7に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
- βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ/または脳における代謝を促進する方法であって、状態の1つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項13に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
- βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ/または脳における代謝を促進する方法であって、状態の1つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項19に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
- ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルコリン(PC)、およびホスファチジルイノシトール(PI)を含む組成物。
- PC:PI:PEの重量比が約3:2:5である、請求項29に記載の組成物。
- 不飽和脂肪酸対飽和脂肪酸の重量比が約2:1〜約2.5:1である、請求項29に記載の組成物。
- βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ/または脳における代謝を促進する方法であって、状態の1つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項29に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
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