JP2012522979A - 結腸直腸癌のインビトロ診断のためのプロディフェンシン−ａ６・アッセイ方法 - Google Patents

Abstract

本発明は結腸直腸癌を有することが疑われる患者から得られた生物試料中のプロディフェンシン-Ａ６の存在を決定することによる結腸直腸癌のインビトロ診断法に関する。前記方法は、結腸直腸癌に関する早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療、予後診断、及び再発診断のために使用できる。

Description

本発明は癌腫学分野に関する。本発明の目的は、より具体的には、ヒト患者から採取された生物試料におけるプロディフェンシン−Ａ６の存在を決定することによる、この患者における結腸直腸癌のインビトロ診断のための方法であって、早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療及び予後診断のため、及び結腸直腸癌に関する再発診断のための両方に使用可能な方法である。

結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、主要な公衆衛生の問題である。その全世界的な発病率は、１９９６年では新規事例８７５，０００件と推定された（文献１）。男女両方を考慮して、西洋諸国において、最も頻繁に発生する癌であり、癌による最も多い死因の最初の３つに通常分類される。全てのステージを考慮に入れた５年生存率は、約６０％である。

早期診断だけが、治癒的治療の希望を与える。しかしながら、現時点において、早期では血清学的スクリーニングテストも特異的な診断検査もない。

現在ヨーロッパでは、結腸直腸癌のスクリーニングは、２つの異なったアプローチで実施されている：第１に、糞便中の血液の存在を探すことを含む臨床関連領域のテストを使用するものである（糞便潜血反応、ＦＯＢＴ、例えばＨｅｍｏｃｃｕｌｔ（登録商標）の名で市販されている）。この技術は、その臨床有用性が証明されている。５０から７４歳の間の個体では２年ごとに使用され、結腸直腸癌による死亡率を１５〜２０％減少できる（文献２）。このためには、該当する集団の半分以上がスクリーニングに定期的に参加し、陽性テストの場合には結腸鏡検査法を実行し、続いて場合により適切な治療をすることが必要である。

それにもかかわらず、このスクリーニング技術は、一定数の不利な条件により劣っている：
・このテストの主な欠点は、あまり良くない感受性であり、それは最もアデノーマ（前癌の形成異常病変）で顕著であり、そのサイズが大きい場合や高度の異形成を示す場合は、１０のうち１の場合で癌の進行に結果としてなる。
・また、このテストはあまり特異的でない。糞便中の血液の出現は、潰瘍性大腸炎、痔核、瘻などの非腫瘍症状に関連する可能性がある。この場合、結腸鏡検査法による検査を行わなければならないが、以下に記載されている欠点を伴う。
・最後に、Ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ（登録商標）テストは解釈するのが困難である；従って、それらは資格のある適格なスタッフによって、専門施設で調べられなければならない。

また、ヒト・ヘモグロビンに特異的な免疫学的検査も記載されている（Ｆｅｃａ ＥＩＡ（登録商標）、Ｈｅｍｅ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）等）。それらは多分Ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ（登録商標）と比較して向上しているが、基本的に同じ問題を呈する。ＩｎＳｕｒｅ^ＴＭ（Ｅｎｔｅｒｉｘ社によって市販されている）により、ＣＲＣに苦しむ患者の８７％、及び前癌ポリープを有する患者の４７％を検出できる。それは、糞便のヒト・ヘモグロビンを、特にこの分子のグロビン部分を検出するテストである。

第２のスクリーニング・ストラテジーは５０歳以後に結腸鏡検査法を組織的に行うことであり、理論的には結腸直腸癌による死亡率を減少することを可能にする。しかしながら、良い健康状態の個体において、この試験の許容性は、死亡率を減少するために内視鏡検査を使用するスクリーニング方針に対してはあまりにも低い（このスクリーニング・ストラテジーを設けているヨーロッパ諸国の結腸鏡検査法の順守のレベルは、約２％である）。結腸の穿孔と出血及び死亡（１／１００００）は無視できないリスク（０．１％）であり、また公衆衛生のためにはあまりにも高価である。さらにまた、結腸鏡検査法は非常に限定的な前もった結腸調製を必要とし、それが主に低い順守を説明する。

イムノアッセイによって検査されうる腫瘍マーカーは、結腸直腸癌との関係において、長い間記載されてきた。それらは、特に胎児性癌抗原（ＣＥＡ）及びＣＡ１９-９である。
ＣＥＡはフォローアップのために使われている。それは、感受性と特異性が不十分であるので、結腸直腸癌のスクリーニングに、又は早期診断のためには使用できない。これは、このマーカーが他の種類の癌によって及び良性病変において発現されるためである。いろいろあるけれども、ＣＥＡと他の腫瘍マーカー（例えばＣＡ１９-９またはＣＡ７２-４）を組合わせることによって、特異性を失うことなしに感受性を増すことが可能である。

ＣＡ１９-９の生理的変異の原因はまれであるが、他の良性の症状（肝・胆道系の症状、膵臓の症状）、または悪性病状はＣＡ１９-９の増加を誘発する可能性がある。従って、このマーカー単独では診断のためにも重要でない。それにもかかわらず、その血清濃度が腫瘍のサイズおよび転移癌の存在と相関しているので、フォローアップ治療又は再発の早期証明を可能にしうる。

さらに、市販の試験が提案されている：
・Ｃｏｌｏｐａｔｈ（登録商標）／ＣｏｌｏｒｅｃｔＡｌｅｒｔ^ＭＤ（Ａｍｂｒｉｌｉａによって市販されている）は、ＣＲＣのための迅速で、比較的非侵襲的スクリーニングテストである。Ｃｏｌｏｐａｔｈ（登録商標）は結腸直腸の病的状態をもつ個体の直腸の粘液のプラスマローゲン（リン脂質の部分である複合脂質のクラス）を検出し、ＣｏｌｏｒｅｃｔＡｌｅｒｔ^ＭＤは直腸の粘液のＴ抗原、複合糖類を検出する。Ｃｏｌｏｐａｔｈ（登録商標）／ＣｏｌｏｒｅｃｔＡｌｅｒｔ^ＭＤテストは試験片に直腸の粘液の塗布することを含み、陽性または陰性の結果はシッフ反応に基づく。Ａｍｂｒｉｌｉａは１７８７個体を研究して、Ｃｏｌｏｐａｔｈ（登録商標）／ＣｏｌｏｒｅｃｔＡｌｅｒｔ^ＭＤは早期ステージ結腸直腸癌の５４％のケース及び全ステージを合わせて４９％を検出することを証明した。
・ＣＯＬＡＲＩＳ（Ｍｙｒｉａｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって市販されている）は、血液で、遺伝性非腺腫性大腸癌（ＨＮＰＣＣ症候群）をスクリーニングするためにＭＬＨ１及びＭＳＨ２遺伝子の突然変異を検出するテストである。試験の結果は３週で入手できる。Ｍｙｒｉａｄは現在利用可能な最も感受性があり及び最も特異的なシークエンシング技術を使用する。当該テストは、高価である。
・ＤＲ-７０（登録商標）（ＡＭＤＬによって市販されている）は、様々な種類の癌（肺、結腸、胸部、肝臓、胃、その他）を検査するテストである。従って、ＣＲＣに特異的でない。当該テストの原理は、二重サンドイッチＥＬＩＳＡ技術（ＤＲ-７０抗原の分析）に基づく。検出は、酵素反応（ビオチンとストレプトアビジンに結合する抗体）によって実施される。着色した反応は、癌の存在を示す。

出願人は、本願で驚くべきことに、悪性結腸腫瘍によって癌組織から放出されており、これらの腫瘍に特有な腺癌の新規マーカーを示しており、それは悪性腫瘍から離れたものと腫瘍自体の両方の生物試料において検出することができる。
したがって、本発明の第１の目的は結腸直腸癌を有することが疑われる患者から得られた生物試料、好ましくは腫瘍から離れた試料において、プロディフェンシン−Ａ６の存在を決定することによる結腸直腸癌のインビトロ診断の方法である。

また、本発明は、結腸直腸癌に関する早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療、予後診断、及び再発診断の両方のための当該方法の使用に関する。
本発明の方法は、従って、患者から採取された生物試料、潜在的な腫瘍から離れた生物試料のプロディフェンシン−Ａ６の存在を調査することを含む簡単なテストによって、特異的に早期に結腸直腸癌を診断可能にする。実際、出願人は、予想外に、結腸腫瘍はプロディフェンシン−Ａ６を特異的に分泌するだけでなく、ガン組織の外に放出されることを示し、以下でより詳細に証明するように、本願方法が実施された生物試料中のその濃度が正常患者で決定された基準値と比較して上昇することを示したためである。

したがって、腫瘍から離れている可能性があるか、又は離れていない可能性がある生物試料のプロデフェンシン−Ａ６の存在の決定は、調査される病的状態に関する決定を可能にする。そのため、本発明の方法の利点の１つは、組織診断が侵襲的にとられる生検を必要とするのに対して、診断試料として潜在的腫瘍から離れた試料を使用する可能性にあり、それによって、簡単で非侵襲性の診断を可能にすることである。実際に、組織マーカー、例えば組織切片（免疫組織化学）における研究は、予後診断の重要性がある場合があるが、結腸直腸癌のスクリーニングまたは診断について重要ではない。

デフェンシンは、微生物の攻撃に対する宿主の防衛手段に関係する抗菌性ペプチドの一系統である。それらは、３０から４０アミノ酸から成り、選択的に膜を分解する特性を有する。他の真核生物のタンパク質のように、デフェンシンは、成熟したタンパク質の形態でまたは前駆体の形態で存在しうる。
前駆体（または前駆体タンパク質とも呼ばれている）はプロペプチドと成熟した部分とから成る。したがって、プロデフェンシン−Ａ６は、成熟したデフェンシン−Ａ６タンパク質の前駆体タンパク質であって、１００アミノ酸から成り、シグナルペプチド（アミノ酸１−１９）、プロペプチド（アミノ酸２０−６５）と成熟したデフェンシン−Ａ６タンパク質（アミノ酸６６−１００）を含む。

通常は、前駆体タンパク質は、代謝分子だけであると長い間考えられてきた。しかしながら、ニューロペプチド分野において特に、ある程度の数の最近の実施例は、特定の状態で、前駆体タンパク質は、それらが生み出すことができる成熟ペプチドの生物学的活性に特異的で分離性の生物学的活性を有することを示す。一般に認められているように、前駆体タンパク質の配列は成熟したタンパク質のものを含んでおり、例えば、プロデフェンシンの配列はデフェンシンのものを含むが、それらの等電点と分子量は異なる。従って、デフェンシンとプロディフェンシンは、２つの異なるタンパク質と思われている。
デフェンシンα５（文献３）とデフェンシンα６（文献４）は、基本的には、小腸のパネート細胞によって産生される。デフェンシンα５とデフェンシンα６のｍＲＮＡは、クローン病の場合に結腸組織で過剰発現する（文献５）。デフェンシンα６は、Nam et al.（文献６）によって、大腸癌のための潜在的なマーカーとして同定された。Nam et al.は、デフェンシンα６を特異的に検出する競争ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。Nam et al.は、結腸直腸癌を有する診断される患者の閾値（３０ｎｇ／ｍｌ）を定めた。健康な１８人の提供者の血清と４９人分の癌の血清の解析から、Nam et al.は、８３．３％の診断特異性のためについて６９．４％の診断感受性を得た。前記文献は、デフェンシンα６前駆体、プロディフェンシンα６に関して何ら記載していない。
したがって、デフェンシンα６前駆体、プロディフェンシン−Ａ６(Swiss Prot No.Q01524)は、癌、特に結腸直腸癌に関するマーカーとして有用である可能性があると記載されたことはなく、悪性腫瘍から離れている可能性があるか又は離れていない可能性がある生物試料で検出される可能性について記載されたことはない。

「前駆体タンパク質の存在を決定する」なる表現は、健康な患者に対して決定された基準値を越えている、前駆体の決定を意味することを目的とする。研究される前駆体は、１００アミノ酸の完全な前駆体、シグナルペプチドなしの前駆体タンパク質（アミノ酸２０から１００）またはプロペプチド単独（アミノ酸２０から６５）であってもよい。後者の断片、例えばプロペプチドの断片であって成熟したタンパク質（アミノ酸６６から１００）が除外されたもの及びその断片であってもよい。

本発明のある特定の実施態様によれば、シグナルペプチドなしのプロディフェンシン−Ａ６の前駆体の存在が決定される。Swiss-Protデータベースのこの前駆体のために記載されている配列は、配列番号１（ＥＰＬＱＡＥＤＤＰＬＱＡＫＡＹＥＡＤＡＱＥＱＲＧＡＮＤＱＤＦＡＶＳＦＡＥＤＡＳＳＳＬＲＡＬＧＳＴＲＡＦＴＣＨＣＲＲＳＣＹＳＴＥＹＳＹＧＴＣＴＶＭＧＩＮＨＲＦＣＣＬ；アミノ酸２０−１００に対応する）である。好ましくは、少なくとも配列番号２（ＥＰＬＱＡＥＤＤＰＬＱＡＫＡＹＥＡＤＡＱＥＱＲＧＡＮＤＱＤＦＡＶＳＦＡＥＤＡＳＳＳＬＲＡＬＧ）と最大でも配列番号１を有するプロペプチド自体の存在が決定される。

当業者には周知のように、タンパク質多型が存在しており、上記の配列は直接例にすぎない。これらはSwiss-Protデータベースに示すコンセンサス配列であるが、アミノ酸置換はそれが同じタンパク質であるかどうか考慮するために当業者によって評価されるパーセンテージの中に存在してもよい。同様に、アミノ酸６５のプロペプチドの切断のための部位は、理論上のものであり、目安として与えられるだけである。
「結腸腫瘍による放出」なる表現は、機構を問わず、腫瘍細胞自身による、又は腫瘍の進行から生じている細胞表現型の病変または変化に続く隣接非腫瘍細胞による腫瘍マーカーの能動的または受動的な分泌、放出を意味することを目的とする。

「本発明の方法が実施される生物試料」なる表現は、興味がある腫瘍マーカーを含む可能性がある任意の生物試料を意味することを目的とする。腫瘍から離れていない生物試料の例として、腫瘍、この腫瘍の生検、リンパ節または患者の転移ガンに由来する組織のような固体試料、及びこれらの固体試料から精製された細胞を挙げることができる。腫瘍から離れた生物試料の例として、全血またはその派生物（例えば、血清または血漿、尿、唾液と滲出液、骨髄と糞便）のような体液及びこれらの体液から精製された細胞を挙げることができる。血液またはその派生物、更には糞便、滲出液及びこれらの液体試料から精製された細胞が好ましい。

本発明の方法は、プロディフェンシン−Ａ６に加えて、必要に応じて結腸腫瘍による癌組織から放出される少なくとも一つの他の腫瘍マーカーを検出することによって改良されうる。このように、少なくとも２つのマーカーの組合せは、結腸直腸癌の診断のためのテストの特異性及び感受性を改良することを可能にする。

このように、また、本発明の他の目的は、以下のグループのマーカーの存在を、単独で又は組合わせて検討して、決定することを含む：白血球エラスターゼ・インヒビター、エズリン、アミノアシラーゼ１、肝臓脂肪酸結合タンパク質、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ及びＩ−プラスチン、β２-ミクログロブリン、プロテアソーム２０Ｓ、ガレクチン-３、Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質３α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１、ＩＩ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１９、上皮カドヘリン、ＣＥＡ、ビリン、ＣＡ１９-９、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＡ７２-２、テストステロン、ＴＩＭＰ-１、Ｃｒｉｐｔｏ-１、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、インテレクチン-１、サイトケラチン２０、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、（プロ）デフェンシン-Ａ５、ＭＩＦ、ピルビン酸キナーゼＭ２−ＰＫ、カルグラニュリンＣ、ＣＤ２４、ＣＣＳＡ−３（結腸癌特異的抗原）及びＣＣＳＡ−４、メチル化プロフィールについて特異的な修正を有する血液のＤＮＡ断片の検出、例えばＡＸＬ４遺伝子のメチル化ＤＮＡ（aristaless様ホメオボックス４遺伝子メチル化）またはセプチン-９遺伝子のメチル化ＤＮＡ、糞便ＤＮＡ断片の特異的な変性の検出、例えば糞便ＤＮＡの特異的な変異又は糞便ＤＮＡのメチル化プロフィールの特異的な変性、ヒト糞便のヘモグロビンの検出。

「プロディフェンシン−Ａ６以外の腫瘍マーカー」なる表現は、タンパク質またはメッセンジャーＲＮＡまたは対応する遺伝子の特異的な修飾、例えば突然変異やメチル化、を意味することを目的とする。言いかえれば、プロディフェンシン−Ａ６だけは単にタンパク質の形態でのみ捜され、それは完全または断片の形態であってもよい。

白血球エラスターゼインヒビター腫瘍マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ３０７４０、別名ＬＥＩ、Ｓｅｒｐｉｎ Ｂ１、単球／好中球・エラスターゼインヒビター、Ｍ／ＮＥＩ又はＥＩ）は、１９９２年に配列決定された（文献７）。ＬＥＩは、ＳＤＳの作用下で解離することができない複合体の形成によって、エラスターゼ型又はキモトリプシン型の特性を有するプロテアーゼを特異的に阻害する（文献８）。従って、ＬＥＩは、好中球によって産生された主なプロテアーゼのうち、白血球エラスターゼ、プロテイナーゼ３及びカテプシンＧの３つを阻害する：これらのプロテアーゼは、免疫系が細胞外又は貧食された基質の蛋白質分解によって生物を防御することを可能にする。しかしながら、これらのプロテアーゼが過度の場合、炎症性反応の原因となる。ＬＥＩは、従って、細胞プロテアーゼによって誘発される炎症性機能を調整及び制限する役割を有するかもしれない。一方で、本出願人は、驚くべきことに、特許出願WO2009/024691において、このタンパク質の濃度が健康な患者で決定された基準値と比較して増大されており、このタンパク質は結腸直腸癌を有する患者からとられる生物試料であって、当該試料がおそらく腫瘍から離れていても、良好なマーカーであることを示した。

エズリン・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１５３１１、別名ｐ８１、サイトビリンまたはビリン２）は、特に腸の上皮細胞の微小絨毛において、細胞膜と細胞の細胞骨格のアクチンフィラメントとの間で結合性を提供するタンパク質である（文献９）。Ｗ．Ｇ．Ｊｉａｎｇ及びＳ．Ｈｉｓｃｏｘ（文献１０）は、インターロイキンＩＬ-２、ＩＬ-８、ＩＬ-１０等がＨＴ２９ヒト結腸直腸癌細胞株のエズリンの発現を阻害することができることを示した。同じ著者（文献１１）は、ＨＴ１１５及びＨＲＴ１８の結腸直腸癌細胞株におけるエズリン発現の阻害は細胞間の粘着力を減少させ、細胞の可動性と侵襲性の行動を増やすことを示した。彼らは、エズリンが細胞接着分子Ｅ-カドヘリン及びβ-カテニンと相互に作用することによって、細胞／細胞及び細胞／細胞間質の粘着力を調整すると結論した。彼らは、エズリンが癌細胞の侵襲能力を制御することにおいて重要な役割を果たすかもしれないことを示唆した。さらに、Ｔ．Ｘｉａｏ等（文献１２）は、肺癌患者の血漿エズリンを定量化するためにＥＬＩＳＡアッセイを用いた。しかしながら、彼らは、対照個体と比較して何ら違いを観察しなかった。一方、本出願人は、驚くべきことに、特許出願WO2009/019365において、このタンパク質の濃度が健康な患者で決定された基準値と比較して増大されており、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、当該試料がおそらく腫瘍から離れていても、良好なマーカーであることを示した。

アミノアシラーゼ１マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ０３１５４、別名ＥＣ３．５．１．１４、Ｎ-アシル-Ｌ-アミノ酸アミドヒドロラーゼまたはＡＣＹ-１）は、アミノアシラーゼ・ファミリーの一員である。それらは、アシル化されたアミノ酸の加水分解に触媒作用を及ぼし、それにより脂肪酸とアミノ酸を提供する酵素である（文献１３）。アミノアシラーゼ酵素活性のための免疫化学的なアッセイが、Ｋ．Ｌｏｒｅｎｔｚによって１９７５年という早い時期に開発され（文献１４）、さまざまな組織と血清の分析に使われた（文献１５）。研究は、肝臓の病的状態の場合にアミノアシラーゼ活性の増加を示したが、大腸癌の場合にはそうではなかった。さらに、アミノアシラーゼ１遺伝子は、染色体３ｐ２１．１上に同定されている（文献１６）。３ｐ２１．１領域は小細胞肺癌ではホモ接合になり、この場合アミノアシラーゼ発現は抑制されるか又は検出できない（文献１７）。同様に、Ｓ．Ｂａｌａｂａｎｏｖ（文献１８）は、アミノアシラーゼ発現が腎臓癌の場合、抑制されることを示した。一方、本出願人は、驚くべきことに、特許出願WO2009/019366において、このタンパク質の濃度が健康な患者で決定された基準値と比較して増大されており、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、当該試料がおそらく腫瘍から離れていても、良好なマーカーであることを示した。

肝臓脂肪酸結合タンパク質マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０７１４８、別名Ｌ-ＦＡＢＰ、ＦＡＢＰ１、ＦＡＢＰＬ、Ｚ-タンパク質またはステロール輸送体タンパク質）は、９つのイソフォームを含むＦＡＢＰファミリーに属する。各々のイソフォームは、それが最初に検出された組織に従って名づけられる。これらのイソフォームは共有の機能及び類似した三次元構造を有するが、それらの配列相同性は高くない。Ｌ-ＦＡＢＰは１９８５年に配列決定された（文献１９）。それは、細胞質ゾルに豊富にあり、遊離脂肪酸に、更にビリルビンにも結合する能力を有する１５ｋＤａの小タンパク質である。いくつかの最近の研究では、Ｌ-ＦＡＢＰタンパク質の発現の障害が腫瘍形成過程を誘導しうることを示すように見える。前立腺癌の場合、腫瘍組織生検におけるＬ-ＦＡＢＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、正常組織よりも１０倍高かった（文献２０）。大腸癌の場合、いくつかのチームは、２次元の電気泳動法技術を用いて、正常な大腸粘膜と比較して腫瘍組織におけるＬ-ＦＡＢＰタンパク質の発現の減少を同定した（文献２１）。また、この結果は免疫組織化学技術によっても確認された。加えて、Ｌ−ＦＡＢＰタンパク質は、肝臓に転移していた結腸直腸癌患者の予後の肝切除術マーカーである（文献２２）。特許出願WO00/33083において、このマーカーは結腸癌を有する患者由来の生体液中で検出できることを示唆している。一方、本出願人は、驚くべきことに、特許出願WO2009/019368において、このタンパク質の濃度が健康な患者で決定された基準値と比較して減少しており、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、腫瘍から離れている当該試料において、良好なマーカーであることを示した。

腸脂肪酸結合タンパク質マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１２１０４、別名Ｉ-ＦＡＢＰ、ＦＡＢＰ-２またはＦＡＢＰＩ）は、１９８７年に配列決定された（文献２３）。それは、細胞質ゾルに豊富にあり、遊離脂肪酸に、更にビリルビンにも結合する能力を有する１５ｋＤａの小タンパク質である。Ｉ-ＦＡＢＰタンパク質は、小腸の腸細胞で発現され、この細胞型のタンパク質含有量のほぼ２％を構成しうる。組織レベルで、十二指腸と空腸は、結腸よりかなり高いＩ-ＦＡＢＰの量を含む（空腸：４．８μｇ／ｇ、結腸：０．２５μｇ／ｇ）（文献２４）。Ｉ-ＦＡＢＰは、正常な個体の血漿試料では検出できない。一方では、特定の病理学的背景、例えば腸の虚血、クローン病または原発性胆汁性肝硬変症において、特定の個体の血漿Ｉ-ＦＡＢＰ濃度の増加を示すことが可能である（文献２４）。前立腺癌の場合、腫瘍組織生検におけるＩ-ＦＡＢＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、正常組織よりも７倍高かった（文献２０）。ラットのアゾキシメタンによる結腸直腸腫瘍の誘導のモデルにおいて、癌の発病率を減らす食事（大豆タンパク質または乳漿加水分解産物）を与えた動物の場合は、Ｉ-ＦＡＢＰ ｍＲＮＡの発現のレベルが２．９２から３．９７倍減少する（文献２５）。一方、本出願人は、驚くべきことに、特許出願WO2009/019366において、このタンパク質の濃度が健康な患者で決定された基準値と比較して増大しており、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、腫瘍から離れている当該試料において、良好なマーカーであることを示した。

アポリポタンパク質は、極性アミノ酸で構成されるタンパク質のファミリーであり、リポタンパク質と呼ばれている親水性の巨大分子複合体の形成によって血液中の脂質の輸送を可能にする。各々のヒト血漿アポリポタンパク質の場合、遺伝的多型および／または翻訳後修飾に由来するイソフォームがあり、血液中のその存在は特定の病的状態と関連している可能性がある（文献２６）。アポリポタンパクの血漿濃度は、１ｍｇ／ｍｌのオーダーで無視できない（文献２７）。

アポリポタンパク質ＡＩマーカー（ＮＣＢＩ Ｎｏ．４９００９８、別名Ａｐｏ Ａ-Ｉ、Ａｐｏ ＡＩ及びＡｐｏ Ａ１）は、２４３アミノ酸、２８ｋＤａのタンパク質である。それは、肝臓及び腸によって基本的に合成される。ＳＥＬＤＩ-ＴＯＦ（文献２８）によって、このタンパク質は、正常な個体と比較して、結腸直腸癌で苦しんでいる患者の血清において十分に豊富でないことが示された。しかしながら、ＣＲＣを有する患者がＡｐｏ ＡＩと他のタンパク質マーカーとを組合わせることによって、正常な個体から区別されることは、この論文において特定されている。さらに、この論文は、他のチームによって実施された免疫比濁法によるＡｐｏ ＡＩの分析がＣＲＣを有する患者の血清において、このタンパク質が十分に豊富でないことを確認していないことを示している（文献２９）。一方で、Ｈａｃｈｅｍ等（文献３０）は、結腸直腸癌転移後の肝癌を有していた患者の血清のＡｐｏ ＡＩを分析した。一方で、本出願人は、驚くべきことに、ＳＥＬＤＩ-ＴＯＦ技術を実施することによってのみ、この減少を証明することが可能だったとＥｎｇｗｅｇｅｎ等（文献２８）によって提案されたことに反して、イムノアッセイによる分析により、結腸直腸癌を有する患者において、このタンパク質の濃度の減少が証明できることを示した。Ｚｈａｎｇ等のチームによって使用されたように、実行されるイムノアッセイによる分析が比濁法でない限り、腫瘍から離れている生物試料のイムノアッセイによってＡｐｏ ＡＩを分析することは結腸直腸癌の診断のための良好な方法である（文献２９）。

アポリポタンパクＡＩＩマーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０２６５２、別名ＡｐｏＡ ＩＩ、Ａｐｏ-ＡＩＩ及びＡｐｏ Ａ２）は、ジスルフィド架橋によって連結される各々７７アミノ酸の２つのポリペプチド鎖から成る１７３８０Ｄａのタンパク質である。アポリポタンパクＡＩのように、アポリポタンパクＡＩＩは、肝臓及び腸によって基本的に合成される。Ｈａｃｈｅｍ等（文献３０）は、結腸直腸癌転移後の肝癌を有していた患者の血清のＡｐｏ ＡＩＩを分析した。しかしながら、結果は有意でなく、求められる病的状態に関しては結論を出すことは可能でない。一方、本出願人は、驚くべきことに、特許出願WO2009/019370において、このタンパク質の濃度が健康な患者で決定された基準値と比較して減少しており、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取された生物試料であって、腫瘍から離れている当該試料において良好なマーカーであることを示した。
Ｉ-プラスチンマーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ１４６５１、別名腸特異的プラスチン又はプラスチン１）は、３つの代表例、Ｉ-プラスチン、Ｌ-プラスチン及びＴ-プラスチンが知られているヒトのプラスチンのファミリーに属する。一部の研究者はプラスチン類を「フィンブリン」と呼ぶが、他の研究者はフィンブリンの名をＩ-プラスチンのために残している。プラスチンは、アクチンに結合し、それにより細胞骨格（細胞の骨格）を形成するタンパク質である。それらは、真核生物進化の全体にわたって比較的よく保存されている７０ｋＤａのタンパク質である。それらは強い組織特異性を呈し、一度に一つのイソフォームのみが正常組織に存在する（文献３１）。癌に関するプラスチンの使用は特許ＵＳ-Ａ-５３６０７１５にすでに記載されており、細胞が造血性または潰瘍性、すなわち癌性であるかどうかを決定する方法を提案する。この方法は、細胞レベルのＬ-プラスチン及びＴ-プラスチンのアッセイ、より具体的にはそのｍＲＮＡのアッセイを請求する。しかしながら、これらの特性にもかかわらず、従来の研究には、血清または糞便試料を使用した結腸直腸癌の診断に関してプラスチンの重要性を評価することを実施するものはなかった。さらにまた、Ｉ-プラスチンは、潜在的癌マーカーとしてこれまで想定さえされなかった（文献３２）。一方で、出願人は、驚くべきことに、特許出願WO2009/019369において、このタンパク質の濃度が健康な患者で決定された基準値と比較して減少しており、このタンパク質が結腸直腸癌を有する患者から採取される生物試料であって、腫瘍からおそらく離れている当該試料において、優良なマーカーであることを示した。

β２-ミクログロブリン・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ６１７６９、別名β２-ミクログロブリン、β２Ｍ）は、大部分の核を有するヒト細胞の表面に見られる低分子量タンパク質（１１から１２ｋＤａ）である。血清β２-ミクログロブリン・レベルは癌を患っている特定の患者において増加し、この増加は特異性がないか、または腫瘍の性質、疾患のステージまたは重症度と相関する。また、有意な増加は他の疾患、例えば紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、シェーグレン症候群、リンパ系の悪性疾患（多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫）、特定のウイルス病（肝炎またはエイズ）において、及び血友病者患者において観察される。β２-ミクログロブリンは腎臓糸球体によってろ過されて、近位尿細管によって再吸収されるので、その血液中濃度は腎臓の病的状態の場合は変更されうる。従って、β２-ミクログロブリンの分析は、最も一般的には、腎臓の病的状態の診断ために、または獲得性の免疫不全ウイルスによる感染のフォローアップ向けである。しかしながら、このマーカーは腫瘍マーカー、特に大腸癌のものとして知られている。

プロテアソーム２０Ｓのマーカー（別名プロソーム）はプロテアソームの中心構造であり、それはそれ自身でユビキチン化タンパク質の細胞内の分解の役割を果たす分子複合体である（文献３３）。プロテアソームは、７つのサブユニットの４つのリングが結合した２８サブユニットで構成される７００ｋＤａの分子複合体である。ヒトにおいて、７つのαユニット（α１、α２、α３、α４、α５、α６及びα７）と１０のβユニット（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β１ｉ、β２ｉ及びβ５ｉ）が知られている。その触媒特性によって、プロテアソームは、細胞増殖、成長、調節とアポトーシスの機構において、従って癌化経路において中心的役割を果たす。ボルテゾミブ（ベルケード）によるプロテアソーム阻害は、多発性骨髄腫で認可された治療である。第二相または三相の治験は、血液癌または腫瘍のために進行中である。Ｔ．Ｌａｖａｂｒｅ-Ｂｅｒｔｒａｎｄ等（文献３４）は、プロテアソームの血清レベルが特定の病的状態、特に癌（骨髄腫、リンパ腫及び充実性腫瘍）の場合に増加する可能であることを示した。

ガレクチン-３マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１７９３１、別名Ｇａｌ-３、ガラクトース特異的レクチン３、ＭＡＣ-２抗原ＩｇＥ結合タンパク質、３５ｋＤａレクチン、炭水化物結合タンパク質３５、ＣＢＰ３５、ラミニン-結合タンパク質、レクチンＬ-２９、Ｌ-３１、ガラクトシド-結合タンパク質またはＧＡＬＢＰ）は、Ｎ-アセチルラクトサミン型のβ-ガラクトシド構造に結合できるレクチンである。それは、腫瘍細胞の付着、増殖、分化、脈管形成、アポトーシス、転移癌進行を含むさまざまな生物学的機能に関係する多数の機能を有するタンパク質である（文献３５）。さまざまな調査は、Ｇａｌ-３が多数の分子と複合体を形成できることを示している：ＣＥＡ、ＩｇＥ、ラミニン、ムチン、Ｍａｃ ２ＢＰ、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、フィブロネクチン等。Ｇａｌ-３の血清分析は、Ｉ．Ｉｕｒｉｓｃｉ等によって記載されている（文献３６）。Ｇａｌ-３は、Ｍａｃ-２-結合タンパク質（Ｇａｌ-３結合タンパク質）によりコートされたマイクロプレート上に捕獲されて、次に抗Ｇａｌ-３ラット抗体により明らかにされた。この研究は、胃腸癌、乳癌、肺癌、卵嚢癌、メラノーマ及び非ホジキンリンパ腫の場合、高い血清Ｇａｌ-３を示した。

Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０７１９５、別名ＬＤＨ-Ｂ、ＬＤＨ心臓ユニット、又はＬＤＨ-Ｈ）は、ホモテトラマーの形で複合体を形成することができるタンパク質である。また、このタンパク質は、Ｌ-乳酸脱水素酵素Ａ鎖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ００３３８、別名ＬＤＨ-Ａ、ＬＤＨ筋肉ユニット、またはＬＤＨ-Ｍ）と、ヘテロテトラマーの形で複合体を形成することができる。四量体複合体（ＬＤＨと呼ばれている）の血清量および／または血清酵素活性は、多くの充実性腫瘍の場合、腫瘍質量に比例して血流中で増加する。その使用は、精嚢癌の追跡調査の場合、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（β-ｈＣＧ）と胎盤のアルカリ性ホスファターゼとの組合せが推奨される。ＬＤＨは、リンパ腫、白血病および結腸癌の予後診断の重要なマーカーであると考えられる（文献３７）。

カルレティキュリン・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ２７７９７、別名ＣＲＰ５５、Ｃａｌｒｅｇｕｌｉｎ、ＨＡＣＢＰ、ＥＲｐ６０またはｇｒｐ６０）は、多機能タンパクである。それは、小胞体の全てのモノグリコシル化タンパク質と、一時的に実質的に相互に作用することができるレクチンである。Ｄ．Ｊ．ＭｃＣｏｏｌ等は、したがって、カルレティキュリンが結腸ムチンＭＵＣ２の成熟に関係していることを示した（文献３８）。組織、糞便または体液のカルレティキュリンの分析を使用するＣＲＣの診断のための方法は、特許出願ＷＯ０３／０６５００３に記載されている。

再生膵島由来タンパク質３α・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ０６１４１、別名ＲｅｇＩＩＩ-α、膵臓炎関連タンパク質１、またはＰＡＰ１）は、正常な膵臓においてわずかに発現されるタンパク質である。それは、膵臓炎の急性期の間及び慢性膵炎で苦しんでいる特定の患者に過剰発現する。この場合、それは、膵液に及び血流に現れる（文献３９）。Ｙ．Ｍｏｔｏｏ等（文献４０）は、ＥＬＩＳＡアッセイによって、その大腸癌、胃癌、肝癌または膵臓癌を有する特定の患者において、腎不全症の場合、血液中ＰＡＰ１のレベルが増加することを示した。彼らは、Ｄｙｎａｂｉｏ社（Ｌａ Ｇａｕｄｅ、フランス）によって市販されているＥＬＩＳＡアッセイ分析（ＰＡＮＣＥＰＡＰ）を使用した。

腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１６４２２、別名主要胃腸腫瘍関連タンパク質ＧＡ７３３-２、上皮細胞表面抗原、ＥｐＣＡＭ、上皮糖タンパク質、ＥＧＰ、腺癌関連抗原、ＫＳＡ、ＫＳ１／４抗原、細胞表面糖タンパク質Ｔｒｏｐ-１またはＣＤ３２６抗原）が、結腸直腸癌細胞に向かう抗体によって認識されるその能力によって、１９７９年に特徴づけられた（文献４１）。上記のように、このタンパク質はさまざまな名で知られているが、最も一般的に使用されるのはＥｐＣＡＭである。それは、特定の上皮及び多くの癌の細胞の側底面表面で発現する膜貫通タンパク質である（文献４２）。１９８２年という早い時期に、Ｈｅｒｌｙｎ等（文献４３）は、抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体の注射が結腸直腸癌を有する患者の腫瘍成長を阻害する可能性を示した。これらの結果は、エドレコロマブと呼ばれる抗ＥｐＣＡＭ抗体に基づく抗腫瘍治療の進展に結果としてなった。本治療は、Ｐａｎｏｒｅｘ^ＴＭの名で市場に出されている。そのうえ、Ｈ．Ａｂｅ等（文献４４）は、ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＥｐＣＡＭの可溶型（ＭＫ-１と呼ばれている）が、調べられている癌患者の１０％の血流において増加することを示した。

サイトケラチンは、上皮細胞の細胞骨格の中間フィラメントをつくるタンパク質の部分である。現在では、２０以上のヒト・サイトケラチンが同定されている。サイトケラチン８（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０５７８７、別名サイトケラチン-８、ＣＫ８、ケラチン-８またはＫ８、１８（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０５７８３、別名サイトケラチン-１８、ＣＫ１８、ケラチン-１８、またはＫ１８）及び１９（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０８７２７、別名サイトケラチン-１９、ＣＫ-１９、ケラチン-１９またはＫ１９）は、上皮細胞で最も豊富にあり、癌病理学の診断に役立つツールである（文献４５）。この臨床重要性は、アポトーシスの又は増殖段階の上皮細胞によるサイトケラチンの放出と関連がある。アポトーシスの場合、この放出は、カスパーゼのタンパク質分解活性下で出現するようにみえる可溶性断片の形態で起こる。分解されていないサイトケラチン形態は、血流において、これまで記載されていなかった。臨床的に使われる最も一般的な３つのサイトケラチンアッセイは、組織ポリペプチド抗原アッセイ（ＴＰＡ）、組織ポリペプチド特異性抗原（ＴＰＳ）アッセイ及びＣＹＦＲＡ２１-１アッセイである。ＴＰＡは、サイトケラチン８、１８及び１９を測定する広域スペクトル・テストである。ＴＰＳ及びＣＹＦＲＡ２１-１アッセイはより特異的であり、それぞれサイトケラチン１８及びサイトケラチン１９の断片を測定する。これらの３つのアッセイは、単独で又はタンパク質複合体の形態で存在してもよいサイトケラチン断片を検出する。ＴＰＡ、ＴＰＳまたはＣＹＦＲＡ２１-１が、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、卵嚢癌、膵臓癌、前立腺癌及び特定ＥＮＴ癌のフォローアップ治療のために使われてきた。血液の可溶性サイトケラチン断片を分析することは、実際には再発のためのスクリーニングにおいて、又は使用される治療（放射線療法、化学療法、ホルモン治療）への反応を評価することにおいて臨床価値を有する。定期的な分析により、腫瘍質量の経過を評価することが特に可能である。可溶性血液サイトケラチンの量も、腫瘍段階及び転移癌の形成に関して予後診断の側面を有する。現在、最も一般的に使用されるサイトケラチンの血液検査法は、ＣＹＦＲＡ２１-１である。それは、肺非小細胞癌を有する患者のフォローアップに、非常に推奨される。さまざまな市販のアッセイが、ＴＰＡ（ＡＢ Ｓａｎｇｔｅｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．、 Ｂｙｋ-Ｒｏｌａｎｄ、その他）、ＴＰＳ（ＩＤＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ、ＢＥＫＩ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｓ、その他）及びＣＹＦＲＡ２１-１（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｓ、ＣＩＳ Ｂｉｏ-Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｓ、その他）のために存在する。そのうえ、Ｈ．Ｋｉｍ等（文献４６）は、糞便のサイトケラチン１９（ＤｉＮｏｎＡ社）の分析は、糞便潜血アッセイと組合わせて胃腸疾患のためのスクリーニングにおいて役立つ可能性があることを示している。最後に、サイトケラチン２０（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ３５９００、別名ケラチン、Ｉ型Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ２０、ＣＫ２０、ケラチン-２０、Ｋ２０、またはＩＴタンパク質）の結腸直腸癌のマーカーとしての使用は、特許出願ＵＳ２００２／０１６０３８２に記載されている。

上皮カドヘリン・マーカー（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１２８３０、別名Ｅ-カドヘリン、ウボモルリン、カドヘリン-１、ＣＡＭ１２０／８０またはＣＤ３２４抗原））は、カルシウム依存性細胞接着に介在する膜貫通タンパク質である。それは上皮細胞において特に発現し、それらの表現型を維持することに関係している。Ｅ-カドヘリンの細胞質ドメインは、それ自体が細胞骨格のアクチン・フィラメントネットワークに結合するβ-カテニンに結合する。このＥ-カドヘリン／β-カテニン結合は、上皮組織の細胞／細胞接着を安定させることにおいて不可欠な役割を果たす。従って、Ｅ-カドヘリンの減失は、細胞接着を減少させ、癌細胞の侵襲性能力を増やしうる。Ｅ-カドヘリン又はβ-カテニンの発現の減少は、特に胃腸癌に関して、腫瘍のより高い攻撃性及び脱分化に通常関連している。Ｆ．Ｒｏｃａ等（文献４７）は、したがって結腸直腸癌を有し且つＥ-カドヘリンを過小発現させている患者は、正常な発現レベルを有する患者より好ましくない予後を有することを示した。１９８３年という早い時期に、Ｄａｍｓｋｙ等（文献４７）は、Ｅ-カドヘリンの可溶型がＭＣＦ-７乳がん細胞株によって放出される可能性を示した。この可溶型は、Ｅ-カドヘリンの細胞外部分の切断に相当する。後に、Ｍ．Ｋａｔａｙａｍａ（文献４９）は、Ｅ-カドヘリンの可溶型は癌の場合に血流中に放出される可能性があることを示し、Ｃ．Ｗｉｌｌｍａｎｎｓ等（文献５０）は、血液中のＥ-カドヘリンの量の増加は結腸直腸癌の腫瘍段階と相関していることを示した。さらに、市販のキットは、タカラ・バイオケミカルズ社（東京、日本）によって提案される。

結腸直腸癌の診断のためのＣＥＡ（胎児性癌抗原）の分析は、Ｇｏｌｄ及びＳ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ（文献５１）によって１９６５年以降、提案されてきたが、血液中のこのマーカーのアッセイは比較的進行していない段階の結腸直腸癌の診断では低い感受性を有する。従って、血清ＣＥＡの分析は、特に肝臓転移癌（文献５２）のリスクを評価するために、及びフォローアップ治療のために推薦される。加えて、それは、結腸直腸癌にあまり特異的なマーカーではない；それは、多くの他の癌（肺、胸部、その他）において、実際に増加する可能性がある。一方では、糞便のＣＥＡの分析は、血清ＣＥＡの分析または糞便血の分析よりも、より感受性があって且つより特異的に見える（文献５３）。しかしながら、この分析は、普通には、まだ提唱されない。

反応性の抗原決定基１１１６-ＮＳ-１９-９、より一般にはＣＡ１９-９（炭水化物抗原１９．９）と呼ばれているものは、高分子量タンパク質によって担持される（文献５４）。血液中のＣＡ１９-９の分析は、ＣＥＡのそれよりも特異的である。血液のＣＡ１９-９レベルは、結腸直腸癌、膵臓癌、肝癌（胆管癌）において増加するが、非癌性の病的状態（胆管炎、その他）の場合にも増加する。ＣＥＡと組合わせたその使用は、癌の診断時に、及び病的状態のフォローアップのために推奨される。

Ｊ．Ｈｏｌｍｇｒｅｎ等（文献５５）は、血清中のＣＡ５０抗原の量が結腸直腸癌の場合に増加したことを示した。ＣＡ５０抗原は、特異的なモノクローナル抗体によって認識されるその能力によって定義される。

ＣＡ７２マーカーに関しては、Ｔ．Ｌ．Ｋｌｕｇ（文献５６）は、血清のＣＡ７２抗原の量が結腸直腸癌の場合に増加したことを示した。ＣＡ７２抗原は、特異的なモノクローナル抗体によって認識されるその能力によって定義される。

同様に、Ｐ．Ｋｕｕｓｅｌａ等（文献５７）は、血清中のＣＡ２４２抗原の量が結腸直腸癌の場合に増加したことを示した。ＣＡ２４２抗原は、特異的なモノクローナル抗体によって認識されるその能力によって定義される。

結腸直腸癌の診断のためにテストステロンを分析することは、Ｍ．Ｈｏｌｌａｎｄ等（文献５８）によって、男性において提案された。これらの著者は、結腸直腸癌の場合は、血液テストステロンレベルの下落を示した。

ＴＩＭＰ-１マーカー、またはマトリックスメタロプロテイナーゼ１型の組織阻害物質に関しては、特許出願ＵＳ２００７／００２０７０７は、特に体液の分析によって結腸直腸癌の診断の場合にＴＩＭＰ-１を分析することを記載する。

Ｆ．Ｍｏｄｅｌ等（文献５９）は、２００６年７月に、胃腸癌の国際会議において、結腸直腸癌を有する患者の血漿のセプチン-９遺伝子のメチル化型を検出することが可能だったことを示した。

Ｍ．Ｐ．Ｅｂｅｒｔ等（文献６０）は、ＡＬＸ４遺伝子またはaristaless様ホメオボックス-４遺伝子は、対照血清においてよりも、結腸直腸癌を有する患者の血清において、より頻繁にメチル化されることを示した。限界値４１．４ｐｇ／ｍｌを使用して、彼らは、８３．３％の感受性及び７０％の特異性を得た。
ビリンは、特許出願ＦＲ２５８１４５６において、結腸直腸癌の診断のための血液マーカーとして記載された。

Ｃ．Ｂｉａｎｃｏ等（文献６１）は、血清のＣｒｉｐｔｏ-１の量が結腸直腸癌の場合には増加することを示した。マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）による腸の腫瘍形成の誘導は、Wilson et al.（文献６２）によって記載されている。近年、さらにLee et al. (文献６３）によって、ＭＩＦが結腸直腸癌の早期診断のための潜在的な血液マーカーであることが示された。

プロテイン・ジスルフィド・イソメラーゼ・マーカー（Swiss Prot No. P07237、別名EC5.3.4.1、ＰＤＩ、プロリル4-ヒドロキシラーゼ・サブユニットβ、細胞性甲状腺ホルモン結合タンパク質、ＰＤＩ Ａ１またはｐ５５）は、分子内ジスルフィド架橋の形成、切断及び再編成に触媒作用を及ぼす多機能性タンパク質である。細胞の表面で、レダクターゼとして働き、細胞に付着したタンパク質のジスルフィド架橋を切断する。細胞内部では小胞体内腔に位置する可溶性分子であり、新しく合成されたタンパク質のジスルフィド架橋を形成して再配置する。特徴的なＣＸＸＣモティーフを有するチオレドキシン型の２つの触媒ドメインを含む。ＰＤＩは、高濃度では、不適切に折りたたまれたタンパク質の凝集を抑制するシャペロンタンパク質として機能する。低濃度では、アンタゴニストの役割を有し、凝集を容易にする。更に、ＰＤＩは、さまざまな酵素（例えばプロコラーゲン・プロα鎖のプロリン残基のヒドロキシル化に触媒作用を及ぼすプロリル・ヒドロキシラーゼ）の構造的なサブユニットを形成する。特許出願EP1724586では、ＰＤＩは、特定の癌（例えば大腸癌）のための診断用マーカーと記述されている。
結腸直腸癌の診断のためのインテレクチン-１（Swiss Prot No.Q8WWA0、別名腸ラクトフェリン受容体、ガラクトフラノース結合性レクチン、内皮レクチンＨＬ-１またはＯｍｅｎｔｉｎ）の分析は、特許出願ＵＳ２００３／００８２５３３に記載されている。

結腸直腸癌のマーカーとしての、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１３６９３、別名ＴＣＴＰ、ｐ２３、ヒスタミン放出因子、ＨＲＦまたはＦｏｒｔｉｌｉｎ）及び（プロ）デフェンシン-Ａ５（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ０１５２３）の使用は、ＵＳ２００３／０１７２３８８およびＵＳ２００６／０１７９４９６に記載されている。「（プロ）デフェンシン」なる用語は、前駆体、すなわち、切断前のプロデフェンシン、プロペプチド、すなわち切断後のプロデフェンシンのＮ末端部分、切断後のＣ末端部分に対応する成熟したタンパク質、すなわちデフェンシンを意味することを目的とする。
Ｍ２−ＰＫは、二量体または四量体形態で見いだされるピルビン酸キナーゼのイソ酵素である。二量体形態は、腫瘍細胞において優勢であり、このために、腫瘍Ｍ２−ＰＫと呼ばれている。多数の研究、例えばHardt et al.（文献６４）が、結腸直腸癌マーカーとしてＥＬＩＳＡによる糞便Ｍ２−ＰＫの検出を使用している。

結腸直腸癌用マーカーとしてのカルグラニュリンＣまたはＳ１００ Ａ１２タンパク質の使用は、特許出願ＷＯ２００７／１３４７７９に記載されている。
Sagiv et al.（文献６５）は、結腸直腸癌の場合にＣＤ２４の発現の増加を示した。
結腸癌特異抗原（ＣＣＳＡ）−３及び−４のタンパク質は、Leman et al.（文献６６）によって、さらに結腸直腸癌と関係づけられた血清マーカーである。
最後に、ヒト糞便ヘモグロビンの分析は知られており、以前記載されたように実施されてもよい。

プロディフェンシン−Ａ６以外の腫瘍マーカーの濃度は、考慮中のマーカーに応じて、本発明の方法が実施される生物試料において、健康な患者で決定された基準値と比較して、増大又は減少する。
好ましくは、プロディフェンシン−Ａ６以外の腫瘍マーカーは、以下から選択される：白血球エラスターゼ阻害剤、エズリン、アミノアシラーゼ１、肝臓脂肪酸結合、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ、Ｉ−プラスチン、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、インテレクチン−１、サイトケラチン２０、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、（プロ）デフェンシン−Ａ５、ガレクチン−３、β２−ミクログロブリン、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ−１、Ｍ２−ＰＫ及びＭＩＦ。
より好ましくは、プロディフェンシン−Ａ６以外の腫瘍マーカーは、以下から選択される：Ｌ−ＦＡＢＰ、β２−ミクログロブリン、ガレクチン３、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＭＩＦ及びＩ−プラスチン。

ある特定の実施態様によれば、本発明の方法は、以下のマーカーの検出を含むか又はそれから成る：
− プロデフェンシン−Ａ６及びＬ−ＦＡＢＰ、
− プロデフェンシン−Ａ６、ＣＡ１９−９及びＣＥＡ、
− プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン及びＣＥＡ、
− プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９及びＣＥＡ、
− プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、Ｌ−ＦＡＢＰ及びＣＥＡ、
− プロデフェンシン−Ａ６、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＣＡ１９−９及びＣＥＡ、
− プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９及びＣＥＡ、
− プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、Ｌ−ＦＡＢＰ及びＣＥＡ、
− プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、ガレクチン３、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＭＩＦ及びＣＥＡ、
− プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、ガレクチン３、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＭＩＦ、Ｉ−プラスチン及びＣＥＡ。

もちろん、本発明の方法は、当業者に知られている結腸直腸癌のための他のいかなるマーカーをも検出に含むことができる。
前述のように、興味がある腫瘍マーカーは、タンパク質の形態、またはメッセンジャーＲＮＡの形態、または対応しているＤＮＡの修飾（突然変異またはメチル化の修飾）のいずれかで検出され、プロデフェンシン−Ａ６はタンパク質の形態だけで検出され、それは完全なタンパク質かまたはタンパク質の断片の形態であってもよい。

生物試料において、興味がある「タンパク質」腫瘍マーカーの存在の決定は、当業者に知られている試料におけるタンパク質の存在を決定する任意の方法、例えばイムノアッセイを含む生化学検査によって、または質量分析法によって行われることができる。
生化学検査は、分子相互作用、すなわち前記腫瘍マーカーと前記腫瘍マーカーに特異的あるいは非特異的な一つ以上の結合性パートナーとの間の反応を含む当該分野の当業者に知られている任意のテストであってもよい。
好ましくは、生化学検査は、当業者に知られているイムノアッセイであり、腫瘍マーカー間の免疫反応を含み、それは抗原と一つ以上の特異的な結合性パートナー、すなわち、この抗原に向かう抗体である。

本発明の方法で求める腫瘍マーカーに特異的な又は特異的でない結合パートナーは、これ又はこれらのマーカーに結合できる任意のパートナーである。高い特異性により又は１００％の特異性でさえも、これらのマーカーに結合できる場合、それらは特異的であると言われる。これらのマーカーへの結合の特異性が低く、他のリガンド（例えばタンパク質）に結合できる場合、それらが非特異的であると言われる。例えば、このマーカーに結合できる抗体、抗体部分、受容体と他の任意の分子をあげることができる。

結合パートナー抗体は、例えば、ポリクローナル抗体かモノクローナル抗体である。
ある特定の実施態様によれば、本発明の方法は、配列番号２の配列のプロディフェンシン−Ａ６に特異的な結合性パートナーを使用する。プロディフェンシン−Ａ６に特異的な結合性パートナーは、配列番号２の配列に含まれる任意の線形又は立体配置のエピトープを認識するモノクローナル抗体であることが望ましい。
好ましくは、モノクローナル抗体は特異的に少なくとも配列ＤＰ（配列番号４）の、好ましくは少なくとも配列ＥＤＤＰＬＤ（配列番号６）の線形エピトープ、多くても配列番号２の配列を認識し、あるいはそれは以下のエピトープから選択される立体配置のエピトープを特異的に認識する：
− 図４に示すように、少なくとも配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｒ（配列番号７）［式中、Ｘ_１はＶまたはＬ、Ｘ_２はＴまたはＬ、Ｘ_３はＰ、ＳまたはＣ、Ｘ_４はＰまたはＳ、Ｘ_５はＷまたはＴ、Ｘ_６はＡ、Ｑ、Ｍ、ＣまたはＥ、Ｘ_７はＩ、ＥまたはＤ及びＸ_８はＦ、Ｙ、ＳまたはＬ］及び多くても配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２の配列のエピトープ。
− 図４に示すように、少なくとも配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＨＸ_７（配列番号１３）［式中、Ｘ_１はＳまたはＴ、Ｘ_２はＣまたは無し、Ｘ_３はＴ、ＬまたはＥ、Ｘ_４はＨまたはＲ、Ｘ_５はＩ、ＦまたはＥ、Ｘ_６はＧまたはＶ及びＸ_７はＣまたはＮ］及び多くても配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６の配列のエピトープ。
− 図４に示すように、少なくとも配列Ｘ_１ＨＰＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７（配列番号１７）［式中、Ｘ_１がＰまたはＷ、Ｘ_２はＷまたはＥ、Ｘ_３はＳ、Ａ、ＱまたはＷ、Ｘ_４はＭ、Ｌ、ＲまたはＰ、Ｘ_５はＨ、Ｆ、ＷまたはＧ、Ｘ_６はＶまたはＡ及びＸ_７はＩまたはＶ］及び多くても配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１の配列のエピトープ。
− 図４に示すように、少なくとも配列Ｘ_１ＨＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５（配列番号２２）［式中、Ｘ_１がＹまたはＮ、Ｘ_２はＥ、ＤまたはＱ、Ｘ_３はＴ、Ｎ、Ｒ、ＭまたはＫ、Ｘ_４はＷ、ＨまたはＦ及びＸ_５はＰまたはＧ］及び多くても配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８又は配列番号２９の配列のエピトープ。

プロディフェンシン−Ａ６のプロペプチド部分を特異的に認識するモノクローナル抗体は、新規であり、本発明の別の対象を構成する。
ある実施態様によれば、本発明のモノクローナル抗体は、少なくとも配列番号４、好ましくは少なくとも配列番号６（エピトープ１）及び多くても配列番号２を有するエピトープを特異的に認識する。

別の実施態様によれば、本発明の抗−プロディフェンシン−Ａ６モノクローナル抗体は、以下のエピトープから選択されるエピトープを特異的に認識する：
− 少なくとも配列番号７［式中、Ｘ_１がＶまたはＬ、Ｘ_２はＴまたはＬ、Ｘ_３はＰ、ＳまたはＣ、Ｘ_４はＰまたはＳ、Ｘ_５はＷまたはＴ、Ｘ_６はＡ、Ｑ、Ｍ、ＣまたはＥ、Ｘ_７はＩ、ＥまたはＤ及びＸ_８はＦ、Ｙ、ＳまたはＬ］及び多くても配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２（エピトープ２）の配列のエピトープ。
− 少なくとも配列番号１３［式中、Ｘ_１がＳまたはＴ、Ｘ_２はＣ又は無し、Ｘ_３はＴ、ＬまたはＥ、Ｘ_４はＨまたはＲ、Ｘ_５はＩ、ＦまたはＥ、Ｘ_６はＧまたはＶ及びＸ_７はＣまたはＮ］及び多くても配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６（エピトープ３）の配列のエピトープ。
− 少なくとも配列番号１７［式中、Ｘ_１がＰまたはＷ、Ｘ_２はＷまたはＥ、Ｘ_３はＳ、Ａ、ＱまたはＷ、Ｘ_４はＭ、Ｌ、ＲまたはＰ、Ｘ_５はＨ、Ｆ、ＷまたはＧ、Ｘ_６はＶまたはＡ及びＸ_７はＩまたはＶ］及び多くても配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１（エピトープ４）の配列のエピトープ。
− 少なくとも配列番号２２［式中、Ｘ_１がＹまたはＮ、Ｘ_２はＥ、ＤまたはＱ、Ｘ_３はＴ、Ｎ、Ｒ、ＭまたはＫ、Ｘ_４はＷ、ＨまたはＦ及びＸ_５はＰまたはＧ］及び多くても配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８又は配列番号２９（エピトープ５）の配列のエピトープ。

さらに別の実施態様によれば、本発明の方法は、エピトープ１に特異的なモノクローナル抗体及びエピトープ２、３、４または５に特異的なモノクローナル抗体を使用する。好ましくは、本発明の方法は、エピトープ１に特異的なモノクローナル抗体及びエピトープ２または４に特異的なモノクローナル抗体を使用する。より好ましくは、本発明の方法は、エピトープ１に特異的なモノクローナル抗体及びエピトープ２に特異的なモノクローナル抗体を使用する。
「エピトープ」なる用語は少なくとも配列番号１から２９の配列によって定義される配列および均一又は不均一な様式で考慮中の配列の両側に、あるいはたった一方に分布する多くても１０、８、６又は４つの付加的なアミノ酸を有するペプチド、更にはアナログ、ホモログ及びその構造的同等物を意味することを目的とする。
一般に、「アナログ」なる用語は、修飾が抗原反応性を破壊しない限り、天然分子と比較して、一つ以上のアミノ酸付加、置換（一般に天然に関して保守的）および／または欠失を呈している配列及び天然ポリペプチド構造を有するペプチドに関連する。

特に好まれるアナログは、天然に保守的である置換、すなわちアミノ酸族内で起こる置換を含む。特異的に、アミノ酸は、４つの族：すなわち、（１）アスパラギン酸及びグルタミン酸のような酸性アミノ酸、（２）リジン、アルギニン及びヒスチジンのような塩基性アミノ酸（３）アラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンのような無極性アミノ酸（４）グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン及びチロシンのような非荷電極性アミノ酸に分割される。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは時々芳香族アミノ酸に分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる独立した置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による独立した置換、またはスレオニンのセリンによる独立した置換、またはあるアミノ酸を構造的に関連がある別のアミノ酸によって類似した保守的な置換が、生物学的活性に大きな影響を及ぼさないことが合理的に予測できる。当業者は、公知技術のＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ及びＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｅプロットを基準にして、関心のペプチド分子の変化を許容することができる涼気を容易に決定することができる。

「相同性」なる用語は、２つのペプチド分子間のパーセンテージ同一性を意味することを目的とする。配列がペプチド分子の定義済みの長さ以上の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より多くの好ましくは少なくとも８０−８５％、より好ましくは少なくとも９０％、及びより多くの好ましくは少なくとも９５−９８％以上の配列同一性を呈する場合に、２つのアミノ酸配列は互いに「実質的に相同的」である。
「構造的に同等物」なる用語は、興味があるタンパク質に含まれる任意の線形または非線形ペプチド配列を意味することを目的とし、同時に抗原反応性を保持する一方で、興味がある立体構造エピトープと同じ三次元構造を有する（例えば配列番号７から２９の配列のエピトープ）。前記の「構造的な同等物」は、例えばＳｕＭｏ（文献６７）またはＳｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅ（文献６８）システムのように、タンパク質の３Ｄ構造上または部分構造上の類似を見つけることができる生物情報工学システムを使用して、興味の立体構造エピトープを当業者が容易に得ることができる。
ポリクローナル抗体は、関心ある腫瘍マーカーによる動物の免疫化、続いて、前記動物から血清を採ること、及び特に抗体によって特異的に認識される抗原、特に前記マーカーが取り付けられたカラムにおけるアフィニティークロマトグラフィーにより血清成分から前記抗体を分離することによって精製された形態での所望の抗体の回収により得られる。

モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術によって得ることができ、その一般的原理を以下に示す。
第１に、動物（通常はマウス）は興味がある腫瘍マーカーによって免疫化され、それにより前記動物のＢリンパ球は前記抗原に対して抗体を生じることができる。続いて、これらの抗体産生リンパ球を、「不死の」ミエローマ（例えばマウス）と融合させ、それによりハイブリドーマを産生する。次に、このように得られる細胞の異種混合物を使用して、特定の抗体を産生し、際限なく増殖することができる細胞の選抜を実施する。各々のハイブリドーマは、クローンの形で繁殖し、例えばＥＬＩＳＡによって、一次元あるいは二次元のウエスタンブロットによって、免疫蛍光法によって、またはバイオセンサーによって、前記腫瘍マーカーに関する認識特性が試験されてもよいモノクローナル抗体の産生に結果としてなる。特に、上で記載されているアフィニティークロマトグラフィ技術によれば、このように選択されたモノクローナル抗体は続いて精製される。
また、モノクローナル抗体は、当業者によく知られている技術によって、遺伝子工学によって得られた組換え抗体であってもよい。

抗デフェンシン−Ａ６分子の例は知られており、Alpha Diagnostic International社のカタログのウサギ抗デフェンシン−Ａ６ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤＥＦＡ６１−Ａ）が入手できる。プロディフェンシン−Ａ６に対するモノクローナル抗体は、現在まで利用可能ではない。
抗白血球エラスターゼ・インヒビター抗体の例は知られおり、特にＡｂｃａｍカタログのウサギ抗-ＬＥＩポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ４７７３１）が入手できる。抗-ＬＥＩモノクローナル抗体（クローンＥＬＡ-１）は、Ｙａｓｕｍａｔｓｕ等（文献６９）の論文に記載されている。
抗-エズリン抗体の例は知られており、特にＡｂｃａｍカタログの抗-エズリン・モノクローナル抗体のクローン３Ｃ１２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ４０６９）及びウサギ抗-エズリン・ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ４７４１８）が入手できる。
抗-アミノアシラーゼ１抗体の例は知られており、特にＡｂｎｏｖａカタログの抗-アミノアシラーゼ１モノクローナル抗体のクローン４Ｆ１-Ｂ７（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ００００００９５-Ｍ０１）及びＡｂｃａｍカタログのチキン抗-アミノアシラーゼ１ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ２６１７３）が入手できる。
抗-肝臓脂肪酸結合タンパク質抗体の例は知られており、特にＡｂｃａｍカタログの抗-Ｌ-ＦＡＢＰモノクローナル抗体のクローン６Ｂ６（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ１００５９）及びウサギ抗-Ｌ-ＦＡＢＰポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ７８０７）が入手できる。
抗-腸脂肪酸結合タンパク質抗体の例は知られており、特にＲ＆Ｄシステムカタログの抗-Ｉ-ＦＡＢＰモノクローナル抗体のクローン３２３７０１（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ３０７８）及びＡｂｃａｍカタログのウサギ抗-Ｉ-ＦＡＢＰポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ７８０５）が入手できる。
抗-アポリポタンパク質ＡＩ抗体の例は知られており、特にＢｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログの抗-Ａｐｏ ＡＩモノクローナル抗体のクローン４Ａ９０（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ４５４０２Ｍ）及びヤギ抗-Ａｐｏ ＡＩポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５２５２Ｐ）が入手できる。
抗-アポリポタンパクＡＩＩ抗体の例は知られており、特にＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログの抗-Ａｐｏ ＡＩＩモノクローナル抗体のクローン１４０２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ２２９９-３１Ｃ）及び特にＢｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログのヤギ抗-Ａｐｏ ＡＩＩポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ７４００１Ｐ）が入手できる。
抗Ｉ-プラスチン・ポリクローナル抗体の例は知られており、特にサンタクルスバイオテクノロジーカタログにおいて入手できる。ウサギ・ポリクローナル抗体Ｈ ３００（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ-２８５３１）はＩ-プラスチン、Ｌ-プラスチン及びＴ-プラスチンと反応する。本出願人はＩ-プラスチンに対するモノクローナル抗体を開発した。
抗-β２ミクログロブリン抗体、抗-ＣＥＡ抗体、抗-ＣＡ１９-９抗体及び抗テストステロン抗体の例が知られており、特に出願人のアッセイキット、それぞれＶｉｄａｓ（登録商標）β２-ミクログロブリン、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＣＥＡ、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＣＡ１９-９^ＴＭ及びＶｉｄａｓ（登録商標）テストステロンが使用される。
抗プロテアソーム２０Ｓの抗体の例は知られており、親和性研究用製品カタログにおいて特に入手できる。
抗-ガレクチン-３抗体、抗-Ｌ-乳酸脱水素酵素Ｂ鎖抗体、抗-カルレティキュリン抗体、抗腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１抗体、抗-ＩＩ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ８抗体、抗-Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１８抗体、抗-Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１９抗体、抗-上皮カドヘリン抗体、抗-ビリン抗体及び抗-ＴＩＭＰ-１抗体は知られており、特にＡｂｃａｍカタログにおいて入手できる。
抗-再生膵島由来タンパク質３α抗体の例は知られており、特にＤｙｎａｂｉｏアッセイキット（Ｌａ Ｇａｕｄｅ、フランス）が使われる。
抗-ＣＡ２４２抗体、抗-ＣＡ５０抗体及び抗-ＣＡ７２-４抗体の例が知られており、特にＦｕｊｉｒｅｂｉｏカタログにおいて入手できる。
抗-インテレクチン-１抗体の例は知られており、アレクシス・バイオケミカルズ・カタログの抗-インテレクチン-１モノクローナル抗体のクローンＳａｌｙ-１（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＬＸ-８０４-８５０-Ｃ１００）及びウサギ抗-インテレクチン-１ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＬＸ-２１０-９４１）が入手できる。
抗-サイトケラチン２０抗体の例は知られており、特にＡｂｃａｍカタログにおいて、抗-サイトケラチン２０モノクローナル抗体のクローンＫｓ２０．８（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ９６２）及びウサギ抗-サイトケラチン２０ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ３６７５６）が入手できる。
抗-ＴＣＴＰ抗体の例は知られており、特にＡｂｎｏｖａカタログにおいて、抗-ＴＣＴＰモノクローナル抗体のクローン３Ｃ７（Ｎｏ．１５７Ｈ００００７１７８-Ｍ０１）及び抗-ＴＣＴＰポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５７Ｈ００００７１７８-Ａ０１）が入手できる。
抗-デフェンシン-Ａ５抗体の例は知られており、特にサンタクルス生物工学カタログにおいて、抗-デフェンシン-Ａ５モノクローナル抗体のクローン８Ｃ８（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ-５３９９７）及びＡｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 社カタログのウサギ抗-デフェンシン-Ａ５ポリクローナル抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤＥＦＡ５１-Ａ）が入手できる。

本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに特異的あるいは特異的でない結合パートナーが、捕捉試薬として、検出試薬として、又は捕捉及び検出試薬として使用されてもよい。
ある実施態様によれば、プロディフェンシン−Ａ６に特異的な結合性パートナーはプロディフェンシン−Ａ６の捕獲のために使用でき、それは本発明の診断法の特異性を改良することを可能にする。
免疫反応、すなわち腫瘍マーカー／結合性パートナー結合の視覚化は、検出（例えば直接的または間接的な方法）の任意の方法によって実施されてもよい。
直接的検出、すなわち標識の包含なしの場合、免疫反応は、例えば表面プラスモン共鳴によって、または導電性ポリマーを有する電極上のサイクリックボルタンメトリーによって観察される。
間接的検出は、関心のある腫瘍マーカー自身の又は「検出試薬」結合パートナーのどちらかの標識によって実施される。後者の場合は、これは競合方法として記載されている。
「標識化」なる表現は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じることができる標識試薬の付加を意味することを目的とする。これらの標識の非限定的なリストは、
・比色法、蛍光または発光によって検出可能なシグナルを生じる酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼまたはグルコース‐６‐リン酸デヒドロゲナーゼ；
・蛍光または発光化合物、染料のような発色団；
・^３２Ｐ、^３５Ｓまたは^１２５Ｉのような放射性分子、及び
・アレクサまたはフィコシアニンのような蛍光分子
を含む。

また、間接的な検出システムを使用してもよく、例えば抗リガンドと反応可能なリガンドである。リガンド／抗リガンドの組合せは当業者にとって周知であり、こういう場合では、例えば、以下の組合せである：ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチドに相補的な配列。この場合、結合パートナーを担持するのは、リガンドである。抗リガンドは、前のパラグラフに記載されている標識試薬によって直接的に検出可能であってもよいか、あるいはそれ自体がリガンド／抗リガンドによって検出可能である。
これらの間接的な検出システムは、特定の条件下でシグナルの増幅を生じることができる。このシグナル増幅技術は当業者にとって周知であり、本出願人により先の特許出願ＦＲ９８／１００８４またはＷＯ-Ａ-９５／０８０００又はＣｈｅｖａｌｉｅｒ等（文献７０）の論文を参照することができる。
使用する標識の種類に応じて、当業者は、標識を視覚化することを可能にする試薬を添加する。

上記の通りイムノアッセイの例として、ＥＬＩＳＡ，ＩＲＭＡ及びＲＩＡのような「サンドイッチ」法、「競合」法、及び免疫組織化学、免疫細胞化学、ウェスタンブロッティング及びドットブロッティングのような直接免疫検出法を挙げることができる。
プロディフェンシン−Ａ６の成熟部分（アミノ酸６６から１００）に特異的な結合パートナー、またはプロディフェンシン−Ａ６のプロペプチド部分（アミノ酸２０から６５）のエピトープを認識する結合パートナー、捕獲に使用される結合パートナーによって認識されるそれ以外のものが検出において使われる。
また、質量分析法が、体液において、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを検出するために使用されてもよい。スペクトロメトリーの原理は、当業者に広く知られており、例えばＰａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｓ（文献７１）に記載されている。
これを行うため、生物試料（前処理されていても、いなくでもよい）は質量分析計に通され、得られたスペクトルは本発明の方法で求められる腫瘍マーカーのそれと比較される。試料の前処理の例は、それを本発明の方法で求められる腫瘍マーカーのための結合パートナーのうちの一つ、例えば本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに向かう抗体、を含む免疫捕捉支持体の上に通すことを含む。試料の前処理の他の例は、試料のタンパク質類を互いに分離するための、生物試料の前分画であってもよい。当業者によく知られている技術において、試料中の優勢なタンパク質は、例えば、まず第一に除去されてもよい。
興味がある「ｍＲＮＡ」腫瘍マーカーの存在の生物試料中の決定は、試料のｍＲＮＡの存在を決定する任意の方法によって、すなわちｍＲＮＡの直接的検出またはｍＲＮＡの間接的検出の何れか、または試料のＲＮＡの存在を決定する当業者に知られている任意の他の方法によって実施されてもよい。

「ｍＲＮＡの直接的検出」なる表現は、生物試料においてｍＲＮＡ自体を証明することを意味することを目的とする。
生物試料のｍＲＮＡの直接的検出は、例えば好ましくはＰＣＲまたはＮＡＳＢＡ技術によって増幅後、ｍＲＮＡに特異的な結合パートナーとのハイブリダイゼーションによって、当業者に知られている任意手段によって実施されてもよい。
「ハイブリダイゼーション」なる表現は、適切な条件下で、２つのヌクレオチド断片が安定且つ特異的な水素結合により互いに結合し、それにより二本鎖複合体を形成することを意図する。これらの水素結合は、相補的塩基アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（またはウラシル（Ｕ））（Ａ−Ｔ結合と呼ばれる）との間に、または相補的塩基グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）（Ｇ−Ｃ結合と呼ばれる）との間に形成される。２つのヌクレオチド断片のハイブリダイゼーションは、完全なものでもよい（従って、リファレンスは相補的ヌクレオチド断片または配列である）、すなわちこのハイブリダイゼーションで得られた二本鎖複合体はＡ−Ｔ結合とＣ−Ｇ結合のみを含む。このハイブリダイゼーションは部分的あってもよく（従って、リファレンスは十分に相補的ヌクレオチド断片または配列である）、すなわち、得られた二本鎖複合体は、二本鎖複合体の形成を可能にするＡ−Ｔ結合とＣ−Ｇ結合だけでなく、相補的な塩基に結合しない塩基もまた含む。２つのヌクレオチド断片間のハイブリダイゼーションは、使用する操作条件、特にストリンジェンシーに依存する。ストリンジェンシーは、２つのヌクレオチド断片の塩基組成の観点から、加えて２つのヌクレオチド断片間のミスマッチの程度によって、特に定められる。また、ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、変性剤の性質と濃度及び／又はハイブリダイゼーション温度のような反応パラメーターに依存する。全てのこれらのデータは知られており、当業者は適切な条件を決定することができる。一般に、ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイズすることが求められるヌクレオチド断片の長さに応じて、約０．５から１Ｍの濃度の食塩水中で、約２０と７０℃との間、特に３５と６５℃との間にある。ｍＲＮＡに特異的であるかまたは特異的でない結合パートナーは、このｍＲＮＡに結合できる任意のパートナーである。例えば、核酸プローブ、増幅プライマー及びこのｍＲＮＡに結合できる他の任意の分子を挙げることが出来る。

「ハイブリダイゼーション・プローブ」なる表現は、５から１００の核酸単位、特に１０から３５の核酸単位を含み、所定の条件下でハイブリダイゼーション特異性を有し、それにより興味の標的遺伝子に特異的な物質とハイブリダイゼーション複合体を形成するヌクレオチド断片を意味することを目的とする。ハイブリダイゼーション・プローブは、その検出を可能にするマーカーを含んでもよい。
本発明の目的において、「増幅プライマー」なる用語は、５から１００核酸単位、好ましくは１５から３０核酸単位を含むヌクレオチド断片であって、酵素ポリメリゼーション、特に酵素増幅反応の開始を可能するものを意味することを目的とする。「酵素増幅反応」なる用語は、少なくとも一つの酵素の作用によってヌクレオチド断片の多数のコピーを生成する方法を意味することを目的とする。
この増幅反応は当業者にとって周知であり、以下の技術を特に挙げることができる：
−ＵＳ特許第４６８３１９５号、ＵＳ４６８３２０２、及びＵＳ４８００１５９に記載されている、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
−特許出願ＷＯ９１／０２８１８の、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づいた増幅）、及び
−ＵＳ特許第５３９９４９１号の、ＴＭＡ（転写媒介増幅）。

「検出」なる用語は、物理的方法又はＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、エチジウムブロマイドのようなインターカレーター色素による化学的方法、又はマーカーによる検出方法を意味すると目的とする。多数の検出方法が、核酸の検出用に存在する（文献７２）。
適切な標識は上記の通りある。本発明の目的では、ハイブリダイゼーションプローブは、いわゆる「検出」プローブであってもよい。この場合、いわゆる「検出」プローブは、上記の標識で標識される。この標識の存在のおかげで、所与の検出プローブと検出される転写産物との間のハイブリダイゼーション反応の存在が検出できる。
検出プローブは、特に「分子ビーコン」検出プローブであってもよい（文献７３）。これらの「分子ビーコン」は、ハイブリダイゼーションの間、蛍光性になる。それらは、ステム・ループ構造を有しており、フルオロフォアとクエンチャー基を含む。特異的なループ配列とその相補的な標的核酸配列との結合によって、ステムの巻き戻しと、適切な波長での励起において蛍光シグナルの放出が生じる。

また、ハイブリダイゼーションプローブは、更に「捕捉」プローブであってもよい。この場合、いわゆる「捕捉」プローブは、適切な手段で、すなわち直接的に又は間接的に、例えば共有結合又は吸着によって、固体支持体上に固定されるか又は固定可能である。固体支持体は当業者に知られており、合成物質または天然物質、ラテックス、磁性粒子、金属誘導体、ゲル類などを挙げることができる。固体支持体は、微量滴定プレート、特許出願ＷＯ-Ａ-９４／１２６７０に記載されているようなメンブレン、または粒子の形態であってもよい。また、複数の異なる捕捉プローブが支持体に固定されてもよく、各々の捕捉プローブは１つの標的転写産物に特異的である。
特に、多数のプローブを固定することができるバイオチップを、支持体として使用してもよい。支持体へのプローブの固定もまた当業者に知られており、直接移動、マイクロ蒸着、インサイツ合成及びフォトリソグラフィーによるプローブの配置を挙げることができる。
生物試料において、興味がある腫瘍マーカーをコードする遺伝子における、ＤＮＡ修飾又は変異の証明は、試料中におけるＤＮＡ修正を決定する任意の方法、すなわち突然変異の直接的検出、又は興味のある遺伝子座のメチル化プロフィールの修正の証明、又は試料中のＤＮＡ修正を決定するための、当業者に知られている他の任意の方法によって実施されてもよい。

突然変異は、１つのヌクレオチドの他のものとの点置換、一つ以上のヌクレオチドの欠失、及び一つ以上のヌクレオチドの挿入を含んでもよい。突然変異は、興味のある腫瘍マーカーの遺伝子のコード部分に、又は転写プロモーター領域又は転写終止領域のような５’及び３’非コード部分に位置していてもよい。
突然変異を証明するためのストラテジーは、分子生物学的技術に基づいており、ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ又は他の増幅技術による増幅、ハイブリダイゼーションおよび／またはシークエンシング工程を含む。結腸直腸癌の場合、以下の方法は、糞便ＤＮＡの突然変異を検出するために成功裏に使用される：沈殿によるＤＮＡ濃縮、磁気ビーズ上の捕捉オリゴヌクレオチドを使用した標的の濃縮、興味がある遺伝子のＰＣＲ増幅、点突然変異を同定するための固相シークエンシング（文献７４）。欠失は、予想される基準断片と変異した断片のサイズの違いに関して同定された。Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ等（文献７４）は、Ｋ-ｒａｓ、ＡＰＣとｐ５３遺伝子に位置する２１突然変異のパネルを記載しており、それは浸潤性の癌の１６／３１を検出することを可能にする。

使用された他のＤＮＡマーカーはＢＡＴ-２６欠失であり、それはマイクロサテライトの不安定性と長いＤＮＡ（Ｌ-ＤＮＡ）と呼ばれる高度に増幅可能なＤＮＡのためのマーカーであり、それは特異的なマーカーでないが、結腸の内腔に剥脱した腫瘍細胞の無秩序なアポトーシスを反映するように見える（文献７５）。これらのマーカーは、感受性に関して又は特異性に関して、十分でない。
前述のように、ＤＮＡ修正は、また、興味がある腫瘍マーカーに対応する遺伝子のメチル化プロフィールの修飾に相当してもよい。メチル化プロフィールの修飾は、低メチル化（メチル化の数が減少する）にまたはハイパー・メチル化（メチル化の数が増加する）に相当してもよい。修正された部分は、興味のある腫瘍マーカーの遺伝子のコード部分に、又は転写プロモーター領域又は転写終止領域のような５’及び３’非コード部分に位置していてもよい。

ＤＮＡメチル化の解析は、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）、亜硫酸水素塩シークエンシング、ＰＣＲと組合わせたメチル化感受性制限酵素による消化、ＣＯＢＲＡ（混合性亜硫酸水素塩切断解析）及びＭｓ-ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチド・プライマー伸長）のような質的なおよび／または定量的なＰＣＲに基づいた技術を使用して実施されてもよい。全てのこれらの技術は、方法論の論文（文献７６）に、比較的詳細に概説されている。

文献において、いくつかのハイパーメチル化された遺伝子が、結腸直腸癌の場合に報告されている。例えば、ＡＬＸ４（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ様ホメオボックス-４）遺伝子（文献６０）、ＴＰＥＦ／ＨＨＰ１（膜貫通タンパク質を含む上皮増殖因子とホリスタチンドメイン）遺伝子のプロモーター領域（文献７７）または他にセプチン-９遺伝子（文献７８）を挙げることができる。
本発明の方法において、少なくとも２つのマーカーを検出する場合、それらは、例えば異なるイムノアッセイ測定を使用して別々に、あるいはマルチプレックスアッセイにおいて同時に証明されてもよい。
本発明の方法において、異なる性質の２つのマーカー、例えばタンパク質マーカー及びｍＲＮＡマーカーが検出される場合、上記の方法から選択される２つの異なる検出方法が使用されてもよい。特許出願ＷＯ０３／１０４４９０に記載したように、それらは同じ検出媒質で、同じ反応条件下で、同時に検出されてもよい。この特許出願に記載されている検出方法の工程は、少なくとも１つの核酸および少なくとも１つの異なる性質の他のリガンドからなる標的分析物を含む試料中のハイブリダイゼーションと免疫反応を同時に検出することを含んでなり：
（ｉ）反応バッファーで希釈された試料の既知の体積量を、前記標的分析物についての捕捉パートナーであって、少なくとも一つの核酸プローブ及び少なくとも１つの抗リガンドを含む前記捕捉パートナーでプレコートした捕捉表面上に置くこと、
（ｉｉ）１５℃と６０℃との間の温度で反応させること、および
（ｉｉｉ）このようにして得られたハイブリダイゼーションと免疫反応を明視化することを含む。
生物試料は、特別な処理を必要としてもよい。なぜなら、それは、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを含んでいるか、あるいは本発明の方法で求められるマーカーを含む循環腫瘍細胞および／または本発明の方法で求められるマーカーを分泌することができる循環腫瘍細胞を含んでいる可能性があるためである。
したがって、本発明のある実施形態によれば、生物試料は、前記液体に含まれる循環腫瘍細胞を分離するために前処理される。
「循環腫瘍細胞を分離する」なる表現は、循環腫瘍細胞が濃縮された細胞分画を得ることを意味することを目的とする。
循環腫瘍細胞を分離するための生物試料の処理は、フロー・サイトメーターの細胞選別によって、フィコール上の濃縮によって、特異的抗体で覆われた磁気ビーズによる濃縮によって、または当業者に知られている特異的な濃縮法の任意の方法によって実行されうる。

生物試料としての血液の場合、循環腫瘍細胞は、磁気ビーズ（Dynal Biotech ASA、ノルウェー）に結合する抗-ＣＤ４５抗体を使用した血球の除去と組合わせたフィコール上の細胞分離の技術によって分離されることができる。
本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、次にサイトスピンによってスライド上に循環腫瘍細胞を付着させた後に、例えば本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに対する抗体により、これらの細胞の免疫細胞化学的な標識化することによって、生物試料から分離される循環腫瘍細胞を使用して直接的に行うことができる。本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、また、Metezeau等（文献７９）に記載されているフローサイトメトリー法を使用して、循環腫瘍細胞において、直接的に実施されてもよい。
これらの条件下では、前記循環細胞は、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを前記細胞内部で遮断することを可能にする条件で処理されることができる。このような処理は、Mathieu等（文献８０）によって記載されている。
本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、本発明の方法で求められるマーカーのための結合パートナー特異的な侵入を可能にするために細胞膜を透過可能にようにした後に行われる。

また、本発明の方法で使用する腫瘍マーカーの直接的検出は、循環細胞に基づいており、ＥＬＩＳＰＯＴ法によって、例えば出願人による特許出願ＷＯ０３／０７６９４２に記載されている方法によって、実行できる。この方法は生物試料の循環腫瘍細胞を検出および／または定量する方法であり、それは一つ以上の腫瘍マーカーの放出又はインビトロでの分泌を可能にする方法であって：
（ｉ）前記細胞の量を前記腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの結合性パートナーが取り付けられた培養表面の底に置くこと、
（ｉｉ）前記腫瘍マーカーが放出又は分泌されるような条件下で前記細胞を培養し、培養表面の底に免疫的に捕捉すること、
（ｉｉｉ）洗浄によって細胞を取り除くこと、
（ｉｖ）前記腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの標識されたコンジュゲートを加えること、および
（ｖ）このように得られた標識を明視化すること
を含む。

また、腫瘍細胞における本発明の方法で使用する腫瘍マーカーの直接的な検出は、本発明の方法で使用する腫瘍マーカーを分泌するような条件下で、それらを培養した後に、前記細胞の培地において実行されることができる。
腫瘍マーカーの放出または発現のための培養条件は、３７℃、湿潤雰囲気下及び５％ＣＯ_２のような通常の条件である。
また、生物試料が固体試料である場合、腫瘍マーカーの存在は、腫瘍のインビボ、インサイツで証明されてもよい。
インビボの腫瘍において腫瘍マーカーの存在を示すために、当業者に知られている任意のイメージング方法が使用されてもよい。このために、前記腫瘍マーカーの結合パートナーは、イメージング・トレーサーに結合されてもよい。
「結合パートナーをイメージング・トレーサーに結合させる」なる用語は、当業者に知られている任意のイメージング方法によって検出され、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じることができるトレーサーの付加を意味することを目的とする。したがって、トレーサーは、テクネチウム-９９のような放射性トレーサーであってもよい。この場合、原発癌または転移癌を有する器官は、腫瘍マーカーとそのトレーサーを結合する。器官によって放出される放射線は、特別なカメラ（例えばガンマ線カメラ）で撮影されうる。計測器は、放射性物質によって生成されるシンチレーションを収集して、これにより器官を視覚化することを可能にする。
本発明の他の方法において、トレーサーは、ポジトロンを放出する放射性物質（フッ素１８）を含んでもよい。画像は、それからポジトロンエミッショントモグラフィーシステムによって得られる。

本発明の他の好適な方法において、腫瘍マーカーのパートナーは、ナノパーティクルに結合することができる。例えば、それらは、超磁性体ナノパーティクルであってもよい；例えば、直接的細胞標識化に用いられるアニオン性磁気ナノパーティクルとＮＭＲ映像法によるインビボ検出である。それらは、金のナノパーティクルであってもよい。
インビボで腫瘍マーカーの検出を可能にする本発明の方法によって、腫瘍マーカー、癌、特に結腸直腸癌を生じている腫瘍マーカーに結合パートナーの結合があった体の部位、更にはそれらの遠隔転移癌と関連しているリンパ節の局在は、視覚化されることができる。
癌細胞だけがプロディフェンシン−Ａ６を分泌し、この産生は癌の悪性度に依存するので、本発明の方法が早期診断のためと、結腸直腸癌に関するスクリーニング、フォローアップ治療、予後診断及び再発診断のための両方に用いられることができる。それは本発明の別の課題を構成する。

本発明は、より非限定的具体例として提供される以下の実施例によって、更には付属の図１から６によって、より明らかに理解される：
ウエスタンブロット法による、９つの抗−プロディフェンシン−Ａ６モノクローナル抗体の比較を表す。グラフは、プロディフェンシン−Ａ６ペプチド（配列番号１、７ｎｇ／ウェル）（図１Ａ）及びトランスフェクションされた２９３Ｔの培養液上清中に分泌されたプロディフェンシン−Ａ６タンパク質（図１Ｂ）のバンドの体積に対応する信号（強度^＊ｍｍ^２）を示す。バンド体積の正確な値を、表（図１Ｃ）に示す。 ドットブロッティング技術による、９つの抗−プロディフェンシン−Ａ６モノクローナル抗体の比較を表す。グラフは、プロディフェンシン−Ａ６ペプチド（配列番号１）（図２Ａ）及びプロディフェンシン−Ａ６プロペプチド（図２Ｂ）の２つのスポットの平均体積に対応する信号（強度^＊ｍｍ^２）を示す。バンド体積の正確な値を、表（図２Ｃ）に示す。この表に記載の比率＊１００は、式：プロデフェンシン−Ａ６プロペプチド信号／プロデフェンシン−Ａ６ペプチド信号^＊１００に従って算出される。 間接的ＥＬＩＳＡ技術によるプロデフェンシン−Ａ６プロペプチドの認識の解析に関するグラフである。吸光度単位のＥＬＩＳＡ信号の正確な値は、グラフの隣の表に示す。 各抗−プロデフェンシン−Ａ６抗体１Ｈ８Ｃ９、１１Ｂ２Ｄ２、１１Ｅ８Ｃ９及び１３Ｅ７Ｆ３によって認識される配列を概括する。ファージ・ライブラリーによって提示され、研究される抗体に結合する各モチーフのアミノ酸配列を、「免疫反応性モチーフ」ボックスに記載する。各抗体ごとに、これらの免疫反応性モチーフは、太字で示されたコンセンサス配列を決定するために整列されている。 １Ｈ８Ｃ９検出抗体を有するエピトープ１に対する５つの抗−プロデフェンシン−Ａ６モノクローナル抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡによる反応性の解析を表す。使用した抗原は、分泌されたプロデフェンシン−Ａ６を含むトランスフェクションされた２９３Ｔの培養液上清である。この上清は、１／１００または１／２００に希釈された。ＲＦＶのＥＬＩＳＡ信号の正確な値は、グラフの隣の表に示す。 結腸直腸腺癌（ＣＲＣ＋）を有する患者、健康な個体（ＣＲＣ−）、炎症性消化器系疾患（ＩＤＤ）を有する患者、及び結腸直腸アデノーマを有する患者のの血清中のプロデフェンシン−Ａ６のＥＬＩＳＡによるアッセイに関するグラフである（ｐｇ／ｍｌ）； プロデフェンシン−Ａ６のペプチドＥＰＬＱＡＥＤＤＰＬＱＡＫ（配列番号３０）のためのＭＣＸカートリッジにおけるＳＰＥ分画の最適化を表す。グラフは、ＭＣＸカートリッジで分画を実施するために使用するバッファーのｐＨに関して、ペプチドの遷移７２７／５５６に対応するピークの領域を表す。図７Ａ：水に溶解されたプロデフェンシン−Ａ６；図７Ｂ：健康な個体由来のヒト血清に溶解されたプロデフェンシン−Ａ６。

実施例１：腫瘍マーカーをコードしている遺伝子のクローニング及び組換えタンパク質の発現
アミノアシラーゼ−１、ＬＥＩ、Ｌ−ＦＡＢＰ、エズリン、Ｉ−プラスチン、Ｇａｌ−３、ビリン、Ｉ−ＦＡＢＰ及びカルレティキュリン腫瘍マーカーに関して、ｃＤＮＡ増幅とクローニング、発現ベクターの構築、更には組換えタンパク質の発現と精製は、特許出願ＷＯ２００９／０２４６９１において詳しく記載した。

１．トランスフェクションによるヒト細胞のプロディフェンシン−Ａ６タンパク質の発現
プロディフェンシン−Ａ６遺伝子（ｐＣＭＶ６−ＸＬ５ ＤＥＦＡ６）のｃＤＮＡを含む発現ベクターは、Ｏｒｉｇｅｎｅ社（Cat.No.SC303095）から購入した。このベクターは、哺乳類細胞に導入後、ＣＭＶプロモータの制御のもとでプロディフェンシン−Ａ６タンパク質を発現することを可能にする。
５％のＣＯ２を有する３７℃で、ＨＥＫ２９３Ｔのヒト胚腎臓細胞がそうであったは、１０％ＦＣＳ含有のＤＭＥＭ培地の培養中で、５％ＣＯ_２、３７℃で維持した。５０％から７０％の合流点の細胞層は、以下の２つのトランスフェクション試薬のうちの１つを使用して、ｐＣＭＶ６−ＸＬ５ ＤＥＦＡ６発現プラスミドにトランスフェクションした：インビトロゲン社によって販売されているＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Cat.No.15338-100）またはＥｕｒｏｍｅｄｅｘによって販売されているＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ−１（Cat.No.MIR2300）。いずれの場合も、トランスフェクションは、試薬の生産者によって提供される手順に従って、実施された。トランスフェクション後、培養は、プロディフェンシン−Ａ６タンパク質の産生を可能にするために、４８時間インキュベートされた。次に、培養液上清は収集され、遠心分離機にかけられ、次に、細胞残屑を取り除くためにろ過された。培養液上清中にに分泌されるプロデフェンシンタンパク質は、そのフォールディングのために必要な全ての翻訳後修飾を受けた；それは天然である。抗−プロディフェンシン−Ａ６モノクローナル抗体のスクリーニング及びこれらの抗体の特徴づけのプロディフェンシン−Ａ６タンパク質のソースとして使われたのは、この上清である。

２．ペプチドの化学合成
プロディフェンシン−Ａ６タンパク質のさまざまな部分に対応する３つのペプチドは、当業者によく知られている手順（ＮｅｏＭＰＳ）に従って、化学合成によって得られた。配列番号１に記載のペプチドは、小胞体にポリペプチド鎖がトランスロケーションする間に切断されるシグナルペプチドを含まない、プロディフェンシン−Ａ６の全配列に対応する。このペプチドは、プロデフェンシン−Ａ６ペプチドまたはプロデフェンシン−Ａ６前駆体と呼ばれている。配列番号２に記載のペプチドは、プロディフェンシン−Ａ６前駆体のプロペプチド部分の全体に対応する。このペプチドは、プロデフェンシン−Ａ６プロペプチドまたはプロデフェンシン−Ａ６のプロペプチド部分と呼ばれている。配列番号３に記載のペプチドは、実質的にプロデフェンシン−Ａ６前駆体のプロペプチド部分の全体に対応する。Ｎ末端基エンドの４つのアミノ酸は、配列に含まれない。このペプチドは配列番号２の配列を有するペプチドよりも大量に生産することが容易であり、４つのアミノ酸の存在が不可欠でない場合に代わりとして使われた。
配列番号１: EPLQAEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGSTRAFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL
配列番号２: EPLQAEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGS
配列番号３: AEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGS

実施例２：腫瘍マーカーに対するモノクローナル抗体の産生

１．動物モデル
免疫化実験は、最初の免疫処理時に６から８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^ｄ）マウスに実施された。

２．免疫原と免疫化
マウスで得られた免疫応答を増大して、モノクローナル抗体を生み出すことを可能にするために、腫瘍マーカーは、組換えタンパク質の形態または実施例１に記載の手順に従って産生される合成ペプチド中で産生された。ＬＤＨタンパク質は、ＳｃｉＰａｃ社（Cat.No.103-133）より入手した。免疫原として合成ペプチドが使われた場合に、それらはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはＫＬＨ（スカシガイヘモシアニン）のような担体タンパク質に結合した。これらのタンパク質は、良好な免疫原性能力を有することが知られているフロイントアジュバント（シグマ）と体積と体積で混合され、油中水形エマルジョンの形態で調製された。各腫瘍マーカーごとに３匹のマウスが免疫化された。マウスは、１０μｇの免疫原を、０、２及び４週に、３回連続して受けた。全ての注射は、皮下に与えられた。最初の注射は完全フロイントアジュバントの混合物として与えられ、次の２回は不完全フロイントアジュバントとの混合物として与えられる。最初注射後のＤ５０とＤ７０との間に、体液性応答は、１００μｇの組換えタンパク質の静注によって再刺激された。プロデフェンシン−Ａ６のために、２つの異なる系の免疫化のを実施した。第１のグループのマウスは、（注射ごとに交替に）ＢＳＡ及びＫＬＨと組合わせたプロディフェンシン−Ａ６ペプチド（配列番号１）を注射された。第２のグループのマウスは、（注射ごとに交替に）ＢＳＡ及びＫＬＨと組合わせたプロディフェンシン−Ａ６ペプチド（配列番号２）を注射された。抗−プロデフェンシン−Ａ６抗体は、各々の２つのグループに属している動物から得られた。

３．体液性応答の出現の監視
抗体の出現を監視するために、血液サンプルは、マウスから定期的に取り出された。抗腫瘍マーカー抗体の存在は、ＥＬＩＳＡを使用して試験される。興味があるタンパク質が、捕獲（１μｇ／ウェル）のために用いられる；飽和後、さまざまな希釈度のテスト血清を抗原と反応させた（３７℃で１時間のインキュベーション）。血清に存在する特異的抗体は、アルカリホスファターゼ（Ｈ＋Ｌ，Jackson Immunoresearch, Cat.No.115-055-146）にコンジュゲートされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ抗体によって明らかにされ、それは求められている抗体に結合する（０．１μｇ／ウェル）。

４．モノクローナル抗体の産生
最後の注射の３日後に、各腫瘍マーカーごとに、免疫化されたマウスのうちの１匹が殺され；血液と脾臓が取り出された。Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（文献８１、８２）によって記載されているプロトコルに従って、脾臓から得られた脾細胞は、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と共に培養され、それらと融合されて不死化された。１２〜１４日のインキュベート期間後に、得られたハイブリドーマの上清は、本実施例のポイント３に記載されているＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗腫瘍マーカー抗体の存在を決定するために調べられた。ＢＳＡまたはＫＬＨに結合された合成ペプチドが免疫原として使われた場合に、ＢＳＡとＫＬＨに対するクローンは、捕獲のためにＢＳＡまたはＫＬＨによるＥＬＩＳＡスクリーニングを実施することによって除去された。陽性のハイブリドーマ・コロニーは当業者にとって周知である限界希釈技術に従って二回サブクローニングされた。

５．イムノブロッティングによるモノクローナル抗体の特徴づけ
アミノアシラーゼ−１、ＬＥＩ、エズリン、Ｉ−プラスチン、Ｇａｌ−３、カルレティキュリン及びＬＤＨ腫瘍マーカーに向かうモノクローナル抗体は、特許出願ＷＯ２００９／０２４６９１に記載されている。
１Ｈ８Ｃ９、１１Ｂ２Ｄ２、１３Ｅ７Ｆ３、１１Ｅ８Ｃ９、６Ｅ１Ｂ４、１０Ｃ２Ｇ３、１２Ｆ３Ｆ２、１２Ｆ８Ｅ４及び１２Ｈ４Ｅ１モノクローナル抗体は、プロディフェンシン−Ａ６に対するものであり、本実施例のポイント１から４に記載の技術を実施することによって得られた。

５．１．方法論
トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞株の培養抽出物は、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びプロテアーゼインヒビターを含有する６００μｌのＰＢＳに細胞ペレットを直接溶解し、次にＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘゲル試料調整プロトコル（インビトロゲン）に従って処理することによって調製される。組織抽出物を得るために、患者ＣＬＳＰ１０５の腫瘍と粘膜生検をメスで分離し、次に２．５ｍＭのＥＤＴＡとプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ^ＴＭ錠剤）を含む１ｍｌのＰＢＳバッファーと共に５０μｍのＭｅｄｉｃｏｎｓを使用するＭｅｄｉｍａｃｈｉｎｅシステム（Becton Dickinson）の１０サイクルの抽出に供した。これらの１０ｍｌの細胞懸濁液はプールされて、２５ｍｌにされて、次に６００ｇで１５分間遠心分離機にかけられる。上清は、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘゲル試料調整プロトコルに従って処理された組織抽出物に対応する。最終的総タンパク濃度０．４ｍｇ／ｍｌの還元試料が使用される。デポジットの体積は、ウェルにつき２０μｌであり、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘビス‐トリス４−１２％のゲル上で、ＭＥＳ泳動バッファーを使用する。泳動（２００Ｖ、１時間）の後、ＰＶＤＦ膜への転写（４００ｍＡ、４５分間）後、転写の質は、アミドブラックによる染色によって評価される。
膜は、１時間の周囲温度で、ＴＮＴ（１５ｍＭのトリス、０．１４ＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ８）の溶液中に５％の脱脂乳（Ｒｅｇｉｌａｉｔ）で飽和する。飽和後、膜は、飽和溶液中に１０μｇ／ｍｌに希釈され、さまざまなテスト抗体と共に１時間インキュベートされる。ＴＮＴによるリンス後、膜は、飽和溶液中に１：５０００（Cat.No.115-035-062, Jackson Immunoresearch）まで希釈され、抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲートと共に周囲温度で１時間インキュベートされる。リンスの後、発現は、Substrate Supersignal West Dura Extended kit(Cat.No.34076, Pierce)で、使用のための推奨された情報に従って実施される。露出時間は、図１に示す実験では２分であり、表１に示す実験では１００秒であった。
膜上のケミルミネセンス信号は、ＢｉｏＲａｄのＶｅｒｓａＤｏｃ５０００イメージシステムで測定された。ウエスタンブロットのイメージに基づいて、さまざまな腫瘍マーカーに対応するバンドの体積は、ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェア（バイオラド）によって評価された。体積は、バンドの表面積によって増大するケミルミネセンス信号の強度に対応する。

５．２．結果
試験されるさまざまな試料の関数として、図１と表１に再現されるウエスタンブロッティングの結果は、ウエスタンブロッティング解析について興味がある腫瘍マーカーに対応するバンドの体積を与える。分泌されたプロディフェンシン−Ａ６及びプロディフェンシン−Ａ６ペプチドを含有するｐＣＭＸ−ＸＬ５−プロディフェンシン−Ａ６プラスミドによってトランスフェクションされた２９３Ｔｓの培養液上清（１ウェルにつき７ｎｇ）は、９つの抗−プロディフェンシン−Ａ６抗体（図１）のウエスタンブロッティングの反応性を評価するために用いた。全ての抗体は、プロディフェンシン−Ａ６ペプチドを認識する。モノクローナルの１１Ｅ８Ｃ９を除く全ての抗体は、使用する実験条件下で培養液上清に分泌されたプロディフェンシン−Ａ６を認識する。しかしながら、得られた信号の強度は非常に異なり、全ての抗体が同じ反応性を有するというわけではないことを示す。表１に示された結果は、試験された腫瘍マーカーが患者から得られた腫瘍組織において、よく発現することを示す。プロデフェンシン−Ａ６は、Ｃａｃｏ−２またはＨＴ−２９結腸細胞株によって発現されない；このために、これらのライセートは、解析に含まれない。
試料に関して抗体により得られた信号の強度は、他の試料及び同じ抗体によって得られた信号と比較することができる。使用する技術は、組織（非遠隔試料）中のマーカーの存在または欠如、及びマーカーに関する抗体の特異性を確認することを可能にする。遠隔試料中の腫瘍マーカーの有無に関しては結論に達することは可能ではなく、前記試料中においては前記腫瘍マーカーの濃度が増減されるどうかも決定することが可能でないので、本実施例においてこの技術は遠隔試料中では用いなかった。さらに、使用する実験スキームは、ある抗体の反応性を別のものと比較することを可能にするものではない。
表１

６．ドットブロッティングによるモノクローナル抗体によるプロディフェンシン−Ａ６プロペプチドの認識の解析
６．１．方法論
ドットブロッティング解析は、プロディフェンシン−Ａ６ペプチド（配列番号１、濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）及びプロディフェンシン−Ａ６プロペプチド（配列番号３、濃度２．３８ｍｇ／ｍｌ）を使用して実施した。各試料の滴下は、ニトロセルロース膜（トランスブロット転写媒体、Bio-rad）の上に重複して置かれ、次に空気中で乾燥した。
免疫発現のプロトコルは、この実施例のパラグラフ５．１に記載されているものと同一である。この実験のために使用する露光時間は１分であった。

６．２．結果
試験した全ての抗体は、ドットブロッティング（図２）において、プロディフェンシン−Ａ６ペプチド（配列番号１）を認識する。この技術で最もよく反応する抗体は、１０Ｃ２Ｇ３クローンである。６Ｅ１Ｂ４、１２Ｆ３Ｆ２、１２Ｆ８Ｅ４及び１２Ｈ４Ｅ１抗体は均質なグループを形成し、それは１０Ｃ２Ｇ３より反応性が低いが、１Ｈ８Ｃ９、１１Ｂ２Ｄ２、１３Ｅ７Ｆ３及び１１Ｅ８Ｃ９のさらに不均一なグループよりも反応性が高い。さらに、ウエスタンブロッティングの反応性とドットブロッティングの反応性は、必ずしも相関しない：６Ｅ１Ｂ４、１２Ｆ３Ｆ２、１２Ｆ８Ｅ４及び１２Ｈ４Ｅ１抗体はドットブロッティングで類似の反応性を有するが、ウエスタンブロッティングで得られた信号の強度は異なる（図１及び２）。ウエスタンブロッティングは変性条件下で実施され、ペプチドはドットブロッティングのために変性なしで直接配置される。
６Ｅ１Ｂ４、１０Ｃ２Ｇ３、１２Ｆ３Ｆ２、１２Ｆ８Ｅ４及び１２Ｈ４Ｅ１抗体だけが、ドットブロッティングでプロディフェンシン−Ａ６プロペプチド（配列番号３）を認識する。１Ｈ８Ｃ９、１１Ｂ２Ｄ２、１３Ｅ７Ｆ３及び１１Ｅ８Ｃ９抗体はプロディフェンシン−Ａ６プロペプチド（配列番号３）と何ら有意性のある反応性を示さず、それらのエピトープがプロディフェンシン−Ａ６前駆体の成熟したデフェンシン−Ａ６部分に位置することを示す。プロディフェンシン−Ａ６プロペプチド（配列番号３）と反応する（従って、その最小限エピトープはこの配列に含まれる）５つの抗体の中で、６Ｅ１Ｂ４、１０Ｃ２Ｇ３、１２Ｆ３Ｆ２及び１２Ｆ８Ｅ４クローンは、全て同じ反応プロフィールを呈する：得られた信号の比率（プロデフェンシン−Ａ６プロペプチド／プロデフェンシン−Ａ６ペプチド^＊１００、図２）は、これら全ての抗体に関して、２９と３１との間である。１２Ｈ４Ｅ１クローンは、この比率が６であるので、これらの他の抗−プロディフェンシン−Ａ６プロペプチド抗体とは異なる。それは、その他の４つの抗体よりも、プロペプチドの認識が劣っている。

７．間接的ＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗体によるプロディフェンシン−Ａ６プロペプチドの認識の解析
７．１．方法論
９６ウェルのプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐタイプ）は、ウェルにつき２μｇにＰＢＳで希釈したプロディフェンシン−Ａ６プロペプチド（配列番号３）で一晩周囲温度で被覆した。プレートは、３７℃で１時間、１０％牛乳のＰＢＳ−０．０５％トゥイーン２０（ＰＢＳ−Ｔ）溶液で飽和する。ＰＢＳ−Ｔ中で３回の洗浄を実施し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ−Ｔに希釈した、ビオチン化されたテスト抗体０．２μｇ／ウェルは、プレートに置かれ、インキュベーションは３７℃で１時間実施される。３回のＰＢＳ−Ｔ洗浄の後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジン（Jackson Immunoresearch Cat. No. 016-030-084、１％のＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ中に１／２００００希釈、１００μｌ／ウェル）を加える。３７℃で１時間のインキュベーション及び３回のＰＢＳ−Ｔ洗浄の後、ＯＰＴ ＥＩＡ基質（ＢＤ）（１００μｌ／ウェル）を加える。２０分後に、呈色が発現した場合、反応は５Ｎの硫酸で停止され、４５０ｎｍの吸光度は測定される。提出される結果は２回測定の平均値である、平均的バックグラウンド・ノイズ（０．０２光学濃度単位）は減算されなかった。

７．２．結果
間接的ＥＬＩＳＡアッセイの結果を、図３に提出する。使用する実験条件下で、４つの抗体６Ｅ１Ｂ４、１０Ｃ２Ｇ３、１２Ｆ３Ｆ２及び１２Ｆ８Ｅ４だけが、固相上へ吸着されたプロディフェンシン−Ａ６プロペプチドに結合する。１２Ｈ４Ｅ１を含むその他の５つの抗体は、このフォーマットではプロペプチドに結合しない。１２Ｈ４Ｅ１モノクローナル抗体がプロディフェンシン−Ａ６プロペプチドを認識する場合であっても、この実験はドットブロッティング結果（図２）を確認するものであり、その反応性は他の４つのモノクローナル６Ｅ１Ｂ４、１０Ｃ２Ｇ３、１２Ｆ３Ｆ２及び１２Ｆ８Ｅ４と比較して、とても低いことを明確に証明する。

８．スポットスキャン及びファージディスプレイ・ペプチド・ライブラリ・スクリーニング技術を使用したモノクローナル抗体によって認識されるエピトープの特徴づけ
８．１．方法論
スポットスキャン技術は、Frank and Doring（文献７８）に従って適用され、セルロース膜に結合される多数のペプチドを同時に合成することを可能にする。これらのペプチドは１から４残基が重なっている８から１２のアミノ酸のペプチドの形態で標的抗原の配列を再現する。次に、これらのペプチドはブロット型の比色テストで研究される抗体と接触させられ、免疫反応性ペプチドの同定は抗体エピトープの最小限配列を導き出し、抗原上で正確にその位置を決めることを可能にする。
合成は、遊離ＮＨ_２基を鎖の末端に有する、長さ８から１０単位のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アームを一様に有するセルロース膜上で実施される。ペプチドのＣ末端エンドからＮ末端基エンドまで起こる。アミノ酸のアミノ官能基はＦｍｏｃ（９−フルオロメチルオキシカルボニル）基によって検出され、それらの側鎖（合成の間に反応することができる）はさらにトリチル、ｔ−ブチルまたはｔ−ブチル・エーテル基によって保護されている。アミノ酸の原液は、０．５ＭのＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）を含むＭＮＰ（Ｎ−メチルピロリドン）で、０．３３Ｍの濃度に調製される。アミノ酸はＡｓｐ ２２２ロボット（Ａｂｉｍｅｄ、Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ、ドイツ）を使用して置かれ、ＡｕｔｏＳｐｏｔ ＸＬソフトウェアによって制御される。このロボットの使用は、９６スポットの４枚の膜、すなわち３８４のペプチドを同時に産生することを可能にする。
１回のアミノ酸カップリング・サイクルについて、ロボットは、膜上に即座に活性化されたアミノ酸の溶液（アミノ酸原液の３倍量に対し、ＮＭＰ希釈された１．１Ｍのジイソプロピルカルボジイミド溶液の１倍量）の０．７μｌを置く。この配置は２回に繰り返され、次に膜はＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）ですすがれる。不全型又は短縮型のペプチドの出現を予防するために、反応しなかったＮＨ_２基は、次に１０％の無水酢酸のＤＭＦ溶液中で１０分間の４から６回のインキュベーションを経てアセチル化される。ＤＭＦで２分間の３回の洗浄後、アミノ酸のアミノ官能基を保護しているＦｍｏｃ基は、２０％のピペリジンのＤＭＦ溶液中で５分間のインキュベーションによって切断される。ＤＭＦで４回の洗浄後、スポットは１％のブロムフェノールブルーのＤＭＦ溶液を使用して色づけられ、次に膜はメタノールで３回すすがれて、続くカップリングサイクルの前に空気中で乾燥される。
このプロトコルは、各々の新規なアミノ酸の追加のために繰り返される。最後のアミノ酸を結合させた後に、ペプチドは全ての遊離ＮＨ_２基のブロッキングを可能にするためにアセチル化され、それで別のアミノ酸の付加を予防する。次に、全てのペプチドの側鎖は１時間のトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／トリイソブチルシラン（５：５：０．３）溶液バット中で膜をインキュベートすることによって、脱保護化する。次に、膜はジクロロメタンで４回、ＤＭＦで３回、及びメタノールで３回すすがれ、その後で空気中で乾燥され、免疫発現させるまで−２０℃で保存される。
モノクローナル抗体でスポットを免疫発現させるために、膜は最初にメタノールですすがれ、次にＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ）中で洗浄され、その後で飽和容液（ＴＢＳ−０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）に希釈されたカゼインを主成分とする１０Ｘ濃度の溶液（ウエスタンブロッキング試薬、ロッシュ）であって５％スクロースを含有するもの）中で周囲温度で一晩インキュベートされる。ＴＢＳ−Ｔ中で１０分間の洗浄後、膜は、飽和溶液で２０μｇ／ｍｌに希釈されたモノクローナル抗体で、３７℃で１時間３０分の間、インキュベートされる。次に、膜はＴＢＳ−Ｔで３回洗浄され、次に飽和溶液で１／２０００に希釈されたアルカリホスファターゼを結合する抗マウスコンジュゲート（Jackson Immunoresearch）でインキュベートされる。ＴＢＳ−Ｔで１０分間の２回の洗浄、ＣＢＳ（１０ｍＭのクエン酸、ｐＨ７、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ）での２回の洗浄の後、即座に調製された発現剤（６００μＭの５−ブロモ−４−クロロ３−インドイルリン酸塩、７２０μＭのチアゾリルブルー臭化テトラゾリウム及び５ｍＭのＭｇＣｌ_２のＣＢＳ溶液）は、暗室で３０〜４５分間、膜に接触させられる。免疫反応性ペプチドは、青紫に現われる。蒸留水での３回の洗浄後、膜はスキャンされて、次に再生まで水中で保存される。
再生はペプチドに結合した抗体及びコンジュゲートを取り除くことを可能にし、したがって別の抗体に関して更なる免疫反応性テストを実施することを可能にする。膜は、各１０分の洗浄シリーズを受ける：蒸留水での１回の洗浄、ＤＭＦでの６回の洗浄、再生バッファーＡでの３回の洗浄（８Ｍの尿素、３５ｍＭのＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１％のβ−メルカプトエタノール、再生バッファーＢでの３回の洗浄（蒸留水／エタノール／酢酸 ４：５：１）及びメタノールで２回の洗浄。次に、膜は−２０℃で保存される前に、空気中で乾燥される。
ファージディスプレイ・ペプチド・ライブラリのスクリーニングによるエピトープの特徴づけは、New England Biolabs社から市販のＰｈＤ１２ファージディスプレイ・ペプチド・ライブラリ・キット（Cat.No.E#8110S）を使用して、キットと共に提供されている指示書（２００７年１１月付のプロトコルＶｅｒ２．７）に従って実施された

８．２．結果
表２は５つの抗−プロディフェンシン−Ａ６プロペプチド抗体によって認識されるエピトープを掲載しており、そのエピトープはスポットスキャン技術によって分析された。全てのこれらの抗体はプロディフェンシン−Ａ６前駆体の同じ領域を認識し、初めのメチオニンから始まっている番号付けに従ってアミノ酸２５と３０の間に位置する（エピトープ１）。一方では、さまざまなモノクローナルによって認識される正確な配列は、同一でない。したがって、１０Ｃ２Ｇ３クローンは２つのアミノ酸（ＤＰ）の最小限配列を認識するが、１２Ｈ４Ｅ１と６Ｅ１Ｂ４クローンは結合するために６つのアミノ酸（ＥＤＤＰＬＱ）の最小配列を必要とする。図２及び３に示される結果は、１０Ｃ２Ｇ３クローンは、プロディフェンシン−Ａ６ペプチドの認識について、ドットブロッティングと間接的ＥＬＩＳＡで最も高いシグナルをえることが可能にすることを示す。驚くべきことに、１２Ｈ４Ｅ１クローンは、認識した最小配列が６Ｅ１Ｂ４抗体と同一であっても、抗体がプロディフェンシン−Ａ６（図２及び３）のエピトープ１を目的とする他の抗体とは異なる。１２Ｈ４Ｅ１クローンは、プロディフェンシン−Ａ６プロペプチド（配列番号３）よりも、完全前駆体タンパク質（配列番号１）の状況において、ＥＤＤＰＬＱ配列（配列番号６）をより良く認識する。
表２

^ａ試験される抗体に対するプロディフェンシン−Ａ６の結合性のための領域のアミノ酸配列。かっこの間の数字はプロディフェンシン−Ａ６のアミノ酸配列上のエピトープの位置に対応し、番号付けが初めのメチオニンから始まる。

１Ｈ８Ｃ９、１１Ｂ２Ｃ２、１３Ｅ７Ｆ３及び１１Ｅ８Ｃ９抗体によって認識されるエピトープはスポットスキャン技術によって決定されない可能性があり、それはそれらが直線状でないことを示す。ファージディスプレイ・ペプチド・ライブラリのスクリーニングは、それぞれ１Ｈ８Ｃ９、１１Ｂ２Ｃ２、１１Ｅ８Ｃ９及び１３Ｅ７Ｆ３抗体と反応する、５つ、３つ、７つ及び４つのミモトープ（エピトープを模倣している直線状配列）を選択することを可能にする。これらのミモトープの配列は、図４に示す。各抗体について、認識されたか又は免疫反応性のミモトープの配列はコンセンサス配列を決定するために整列され、該コンセンサス配列は図４で太字で示されており、それは抗体によって認識される最小限配列を表す。プロディフェンシン−Ａ６の一次構造（またはペプチド配列）のこれらのコンセンサス配列のうちの１つさえ見いだすことは、可能でなかった。したがって、これらのコンセンサス配列は、タンパク質の一次構造上に分散している残基に対応するが、立体構造エピトープを形成するために、その三次元構造では近接性を共有している。

９． サンドイッチＥＬＩＳＡによるプロデフェンシン−Ａ６の検出
９．１．方法論
プロデフェンシン−Ａ６は、例えば、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＥＬＩＳＡ自動化システム（ビオメリュー）を使用しているサンドイッチ・イムノアッセイによって検出された。この種のテストは、マイクロプレートで、自動化又は手動の方法で実施されてもよい。これを行うため、ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇ Ｕｌｔｒａキットの試薬を使用して構成された（ビオメリュー、Cat.No.30315）。試薬は、対応している情報シート（ref.11728D-FR-2005/05）にて説明されている通りに使用したが、以下の修飾を加えた：
１．コーンは、試験される９つの捕捉抗体によって抗原に、１０μｇ／ｍｌの濃度で、感作された。
２．ＨＢｓ Ａｇ Ｕｌｔｒａ カートリッジの第２ウェルの内容物は、ビオチンに結合された試験される露出用抗体（１Ｈ８Ｃ９と１１Ｅ８Ｃ９）（Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇ Ｕｌｔｒａキットの第２ウェルのバッファー（ヤギ血清なし）１μｇ／ｍｌに希釈されたもの）の３００μｌと置き換えた。
３．分泌されたプロディフェンシン−Ａ６を含む、ｐＣＭＸ−ＸＬ５−プロディフェンシン−Ａ６プラスミドによってトランスフェクションされた２９３Ｔｓの培養液上清は、純粋なままで又はＰＢＳに希釈して、ＨＢｓ Ａｇ Ｕｌｔｒａカートリッジ（５０μｌ）の第２ウェルに直接加えた。
４．ＥＬＩＳＡ反応はＶｉｄａｓ（登録商標）自動化システム及びＨＢｓ Ａｇ Ｕｌｔｒａプロトコルを使用して実施され、そのうちのインキュベーション工程は、捕獲及び露出用抗体を有する試料は１００サイクルにした。
５．結果は、粗値の形で得られた。シグナルは、ＲＦＶ（相対的蛍光値）である。

９．２．結果
表３は、ｐＣＭＸ−ＸＬ５−プロディフェンシン−Ａ６プラスミドによってトランスフェクションされており天然プロディフェンシン−Ａ６タンパク質を含有する２９３Ｔｓの培養液上清の１／２希釈物における抗体のさまざまな組合せの反応性を示す。
表３ａ

^ａＲＦＶ（相対的蛍光単位）で示すＶＩＤＡＳサンドイッチ・イムノアッセイの信号。^＊：純粋で検定される上清の信号。他の上清は、１／２に希釈された。

表３に提出される結果は、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、エピトープのさまざまな組合せに基づいてプロディフェンシン−Ａ６を検出することが可能であることを示す：例えば、エピトープＮｏ．５及び４、エピトープＮｏ．１及び４、または選択的にはエピトープ２と任意の他の同定されたエピトープ（１、３、４、５）の組合せである。よりさらに選択的には、エピトープ２が検出のために使われる。一方では、エピトープＮｏ．２と４または他にＮｏ．３と４の組合せは、プロディフェンシン−Ａ６の検出を可能にしない。
エピトープ１に対して向かう抗体（捕獲のために使用する）の反応性のより微細な解析及び１Ｈ８Ｃ９クローンとの組合せは図５に示される。１２Ｈ４Ｅ１クローンは最高の捕捉抗体であり、第二位は、１０Ｃ２Ｇ３及び１２Ｆ３Ｆ２はクローンである。最も低い信号は、６Ｅ１Ｂ４及び１２Ｆ８Ｅ４抗体によって得られる。６Ｅ１Ｂ４及び１２Ｈ４Ｅ１クローンが同じ最小限配列を認識するので、この結果は非常に驚くべきである。

実施例３：腫瘍マーカーの血清アッセイ

１．患者と標本
Ｈｕｒｉｅｔ法の２つの規約に関連して、血液サンプルは、フランス中に分布する８つの臨床センターのネットワークから収集される。
血清を得るために、血液サンプルは乾燥管へ取り出される。血漿を得るために、血液サンプルはＥＤＴＡ管へ取り出される。凝固後、管は、１０００ｇで１０分間遠心分離機にかけられ、血清がとられて、等分されて−８０℃で保存される。血漿のチューブは、１０００ｇで１０分間直接遠心分離機にかけられ、血漿がとられて、等分されて−８０℃で保存される。試料は、患者の病歴について完全に記録される。

２．プロデフェンシン−Ａ６腫瘍マーカーのための血清アッセイ
プロデフェンシン−Ａ６前駆体タンパク質は、実施例２で詳述する抗体とＶｉｄａｓ（登録商標）自動化システム（ビオメリュー）を使用するＥＬＩＳＡアッセイを使用してアッセイされた。これを行うため、ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇ Ｕｌｔｒａキット（ビオメリュー、Cat.No.30315）の試薬を使用して構成された。試薬は、対応している情報シート（ref.11728D-FR-2005/05）で説明されている通りに使用したが、以下の修飾を加えた：
１．コーンは、捕捉抗体１２Ｈ４Ｅ１によって、１５μｇ／ｍｌの濃度で、感作された。
２．ＨＢｓ Ａｇ Ｕｌｔｒａ カートリッジの第２ウェルの内容物は、ビオチンに結合された露出用抗体１Ｈ８Ｃ９（Ｖｉｄａｓ（登録商標）ＨＢｓ Ａｇ Ｕｌｔｒａキットの第２ウェルのバッファー（ヤギ血清なし）に１μｇ／ｍｌで希釈されたもの）の３００μｌと置き換えた。
３．血清または血漿試料（５０μＬ）は、ＨＢｓ Ａｇ Ｕｌｔｒａカートリッジの第２ウェルに直接希釈された。
４．ＥＬＩＳＡ反応はＶｉｄａｓ（登録商標）自動化システム及びＨＢｓ Ａｇ Ｕｌｔｒａプロトコルを使用して実施され、そのうちのインキュベーション工程は、捕獲及び露出用抗体を有する試料は１００サイクルにした。
５．結果は、バックグラウンド・ノイズ（反応前に基質中で読みとっている）の減算後、粗値の形で得られた。標準曲線は、合成プロディフェンシン−Ａ６ペプチド（配列番号１）の濃度の範囲を検定することによって確立された。標準曲線は、ｘ軸に沿って腫瘍マーカーの濃度及びｙ軸に沿ってＶｉｄａｓ（登録商標）（によって読みとられる信号ＲＦＶまたは相対的蛍光値）が記録されることによってプロットされた。検定される体液（血液、血清、血漿）に存在する腫瘍マーカーの濃度は、Ｖｉｄａｓ（登録商標）によって読みとられるＲＦＶ信号に対応する濃度を記録することによって算出された。
Ｖｉｄａｓ自動化システム上のＥＬＩＳＡによる患者の血清プロ・デフェンシン−Ａ６アッセイの結果は、表４に示される。プロディフェンシン−Ａ６の血清中濃度は、結腸直腸腺癌（ＣＲＣ＋）を有する患者において０から１０ｐｇ／ｍｌであり、正常な個体（ＣＲＣ−）で０から２ｐｇ／ｍｌであり、体液または遠隔試料において、本発明を実施することができるように極めて感度が高いＥＬＩＳＡアッセイが必要とされる。上記ような低い検出限界を達成することを可能にするプロデフェンシン−Ａ６ ＥＬＩＳＡアッセイは、エピトープ１と４を認識する抗体の組合せに基づく。エピトープ１を介してプロディフェンシン−Ａ６を捕獲することが好ましい。最も感度が高いアッセイを与える組合せは、捕獲のための１２Ｈ４Ｅ１抗体と検出のための１Ｈ８Ｃ９抗体によって本実施例で使用された使われた組合せである。
表４

ａ：ＩＤＤ＝炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）
ＣＲＣ＋＝結腸直腸癌（腺癌）を有する患者、
ＣＣＲ−＝健康な個体。
ｂ：ＴＮＭ：組織浸潤（Ｔ）、リンパ節浸潤（Ｎ）及び遠隔浸潤（転移、Ｍ）のステージ。

分析される患者で得られた量は、図６に記録される。この図及び表４において、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの結腸直腸癌をそれぞれ有する２人、２人、１０人及び２人の患者は、血清プロディフェンシン−Ａ６の量の明確な増加を示し、厳密には健康な患者（１．８８ｐｇ／ｍｌ）の群で観察される最も高い値より上である。アデノーマ群において、観察される量はこの値を上回らないが、その一方で、ＩＤＤ群では２がある。

実施例４：腫瘍マーカーの組合せでの血清アッセイの使用
出願人は、実施例３において、プロディフェンシン−Ａ６前駆体タンパク質の異常な上昇量が結腸直腸癌を有する特定の患者の血流において観察される可能性を示した。さらに、出願人は、特許出願ＷＯ２００９／０２４６９１、ＷＯ２００９／０１９３６５、ＷＯ２００９／０１９３６８、ＷＯ２００９／０１９３６９、ＷＯ２００９／０１９３６６、ＷＯ２００９／０１９３７０及びＷＯ２００９０１９３６７において、他の腫瘍マーカー、例えばＬＥＩ、エズリン、アミノアシラーゼ−１、Ｌ−ＦＡＢＰ、Ａｐｏ Ａ１、Ａｐｏ Ａ２、Ｉ−プラスチン、ベータ２−ミクログロブリン、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、テストステロン、ガレクチン−３、ＬＤＨ−Ｂ、プロテアソーム２０Ｓ、Ｅ−カドヘリンまたは再生膵島由来タンパク質３α（別名膵臓炎関連タンパク質（ＰＡＰ１））の量の異常な上昇及び異常な減少が、結腸直腸癌を有する特定の患者の血流において観察される可能性を示した。これらの腫瘍マーカーを検定する方法は、上述した特許出願に記載されている。ＭＩＦアッセイの方法は、Ｒ＆Ｄシステム（Cat.No.DMF00）のヒトＭＩＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットで、製造者の指示に従って、実施された。
驚くべきことに、血液において、２つの所与のマーカー量の増加または減少は、同じ患者において体系的に観察されない。その結果、いくつかの腫瘍マーカーの組 合せは、結腸直腸癌を有すると同定される患者数を増加させることが可能である。したがって、患者Ａは一つ以上の腫瘍マーカー（グループＸ）の減少又は増加を示すが、患者ＢではグループＸの前記マーカーで正常である場合がある；この同じ患者Ｂで、一つ以上の他の腫瘍マーカー（グループＹ）は、上昇または減少する場合があり、患者ＡではグループＹの前記マーカーで正常である場合がある。出願人によって分析されるさまざまな腫瘍マーカーは、したがって、当業者に よく知られているさまざまな数学的アルゴリズムによって結合されることができる。網羅的な例ではないが、具体的には、以下の方法が実施された：
１．各々の腫瘍マーカーについて、限界値が設定された。
２．結腸直腸癌のケースで血液中の腫瘍マーカーの量が増加した場合、所与の患者で得られた血液の量はその限界値によって分割された。結腸直腸癌のケースで血液中の腫瘍マーカーの量が減少した場合、所与の患者で得られた血液の量は逆数にされて、その限界値をかけられた。
３．「限界値によって分割された血液中の量」の比率が１より大きい場合、比率は係数（例えば１０）をかけられた。したがって得られる値は、研究される患者について、考慮中の腫瘍マーカーのための「スコア」と呼ばれた。
４．さまざまな腫瘍マーカーで得られたスコアは、各々のマーカーに特異的な係数によって重み付けされて加えられた。下記の実施例の場合、全ての重み付けの係数は１にセットした。
５．スコアの合計は加えられるスコアの総数によって分割され、こうして得られる値に「トータルスコア」という名前をつけた。
６．患者のトータルスコアが限界値スコアに比例して増加している場合、患者は結腸直腸癌を有すると診断される。
プロデフェンシン−Ａ６を含む２、３、４、５、７および８つのマーカーの選択のトータルスコアを表５に示す。

プロデフェンシン−Ａ６とＣＥＡの腫瘍マーカーの組合せは、７８人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する４１人の患者で上昇したトータルスコア「２^ａ」をえられる一方で、プロデフェンシン−Ａ６又はＣＥＡ単独の分析ではそれぞれ１７人および２８人の患者のみでの上昇が示された。
プロデフェンシン−Ａ６とＣＡ１９−９の腫瘍マーカーの組合せは、７８人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する２８人の患者で上昇したトータルスコア「２^ｂ」をえられる一方で、プロデフェンシン−Ａ６又はＣＡ１９−９単独の分析ではそれぞれ１７人および１５人の患者のみでの上昇が示された。
プロデフェンシン−Ａ６とβ２−ミクログロブリンの腫瘍マーカーの組合せは、７８人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する４９人の患者で上昇したトータルスコア「２^ｃ」をえられる一方で、プロデフェンシン−Ａ６又はβ２−ミクログロブリン単独の分析ではそれぞれ１７人および４３人の患者のみでの上昇が示された。
プロデフェンシン−Ａ６とＬ−ＦＡＢＰの腫瘍マーカーの組合せは、７８人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する４１人の患者で上昇したトータルスコア「２^ｄ」をえられる一方で、プロデフェンシン−Ａ６又はＬ−ＦＡＢＰ単独の分析ではそれぞれ１７人および３５人の患者のみでの上昇が示された。
プロデフェンシン−Ａ６、ＣＡ１９−９及びＣＥＡの腫瘍マーカーの組合せは、７８人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する４６人の患者で上昇したトータルスコア「３^ｅ」をえられる一方で、プロデフェンシン−Ａ６、ＣＡ１９−９及びＣＥＡ単独の分析ではそれぞれ１７人、１５人および２８人の患者のみでの上昇が示された。
プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン及びＣＥＡの腫瘍マーカーの組合せは、７８人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する６０人の患者で上昇したトータルスコア「３^ｆ」をえられる一方で、プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン及びＣＥＡ単独の分析ではそれぞれ１７人、４３人および２８人の患者のみでの上昇が示された。
プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９及びＣＥＡの腫瘍マーカーの組合せは、７８人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する６３人の患者で上昇したトータルスコア「４^ｇ」をえられる一方で、プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９及びＣＥＡ単独の分析ではそれぞれ１７人、４３人、１５人および２８人の患者のみでの上昇が示された。
プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、Ｌ−ＦＡＢＰ及びＣＥＡの腫瘍マーカーの組合せは、７８人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する６９人の患者で上昇したトータルスコア「４^ｈ」をえられる一方で、プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、Ｌ−ＦＡＢＰ及びＣＥＡ単独の分析ではそれぞれ１７人、４３人、３５人および２８人の患者のみでの上昇が示された。
プロデフェンシン−Ａ６、ＣＡ１９−９、Ｌ−ＦＡＢＰ及びＣＥＡの腫瘍マーカーの組合せは、７８人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する５９人の患者で上昇したトータルスコア「４^ｉ」をえられる一方で、プロデフェンシン−Ａ６、ＣＡ１９−９、Ｌ−ＦＡＢＰ及びＣＥＡ単独の分析ではそれぞれ１７人、１５人、３５人および２８人の患者のみでの上昇が示された。
プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、Ｌ−ＦＡＢＰ及びＣＥＡの腫瘍マーカーの組合せは、７８人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する７１人の患者で上昇したトータルスコア「５^ｊ」をえられる一方で、プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、Ｌ−ＦＡＢＰ及びＣＥＡ単独の分析ではそれぞれ１７人、４３人、１５人、３５人および２８人の患者のみでの上昇が示された。
プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、ガレクチン−３、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＭＩＦ及びＣＥＡの腫瘍マーカーの組合せは、７８人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する７４人の患者で上昇したトータルスコア「７^ｋ」をえられる一方で、プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、ガレクチン−３、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＭＩＦ及びＣＥＡ単独の分析ではそれぞれ１７人、４３人、１５人、１３人、３５人、２３人および２８人の患者のみでの上昇が示された。
プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、ガレクチン−３、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＭＩＦ、Ｉ−プラスチン及びＣＥＡの腫瘍マーカーの組合せは、７８人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する７５人の患者で上昇したトータルスコア「８^ｌ」をえられる一方で、プロデフェンシン−Ａ６、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、ガレクチン−３、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＭＩＦ、Ｉ−プラスチン及びＣＥＡ単独の分析ではそれぞれ１７人、４３人、１５人、１３人、３５人、２３人、３人および２８人の患者のみでの上昇が示された。

表５

スコア２^ａ：ＣＥＡとプロディフェンシン−Ａ６の組合せ
スコア２^ｂ：ＣＡ１９−９とプロディフェンシン−Ａ６の組合せ
スコア２^ｃ：β２−ミクログロブリンとプロディフェンシン−Ａ６の組合せ
スコア２^ｄ：Ｌ−ＦＡＢＰとプロディフェンシン−Ａ６の組合せ
スコア３^ｅ：ＣＥＡ、ＣＡ１９−９とプロディフェンシン−Ａ６の組合せ
スコア３^ｆ：ＣＥＡ、β２−ミクログロブリンとプロディフェンシン−Ａ６の組合せ
スコア４^ｇ：ＣＥＡ、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９とプロディフェンシン−Ａ６の組合せ
スコア４^ｈ：ＣＥＡ、β２−ミクログロブリン、Ｌ−ＦＡＢＰとプロディフェンシン−Ａ６の組合せ
スコア４^ｉ：ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、Ｌ−ＦＡＢＰとプロディフェンシン−Ａ６の組合せ
スコア５^ｊ：ＣＥＡ、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、Ｌ−ＦＡＢＰとプロディフェンシン−Ａ６の組合せ
スコア７^ｋ：ＣＥＡ、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、ガレクチン３、プロディフェンシン−Ａ６、Ｌ−ＦＡＢＰとＭＩＦの組合せ
スコア８^ｌ：ＣＥＡ、β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、プロディフェンシン−Ａ６、ガレクチン３、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＭＩＦとＩ−プラスチンの組合せ
ＣＲＣ＋＝結腸直腸癌（腺癌）を有する患者、ＣＲＣ−＝健康な個体。

実施例５：ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ技術による腫瘍マーカーの検出
１．方法論
検出限界を数ｎｇ／ｍｌまで下げることを可能にするために、改良されたＭＲＭ−ＭＳ方法が用いられた。この方法の連続した工程は：１）大量のタンパク質の免疫除去、２）トリプシン消化、３）ペプチドのＳＰＥ（固相抽出）分画化、４）ＭＲＭ−ＭＳと組合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）である。
セッティングは、プロディフェンシン−Ａ６合成タンパク質（配列番号１）に加えることによって、スパイク試料上で実施された。
（免疫除去）血清中の大量のタンパク質の除去は、ビバサイエンスのＶｉｖａｐｕｒｅ抗−ＨＳＡキットを使用して実施された。あるいは、CalbiochemのProteoextract アルブミン／ＩｇＧおよびバイオラドのＡｕｒｕｍ^ＴＭ血清タンパク質ミニキットを使用した。製造業者の指示に従って、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ樹脂（アマシャム・バイオサイエンス）に、除去するタンパク質を目的とするモノクローナル抗体を結合させることによって、実験室で特異的樹脂を製造することもできる。
（酵素消化）除去された血清試料は、３０ｍＭのジチオスレイトールを含有する６Ｍ尿素の１０ｍＭトリス溶液（ｐＨ８）で、４０℃で４０分間変性され、次に４０分間、暗所、周囲温度で、５０ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化される。それらは水で６倍希釈され、トリプシン消化は１：３０の酵素／基質比率を使用して３７℃で一晩実施される（プロメガ）。消化は、０．５％の最終濃度でギ酸を加えることによって停止される。消化された試料は、オアシスＨＬＢ ３ｃｃ 逆相カートリッジ（６０ｍｇ）（Waters）を使用して固相抽出（ＳＰＥ）によって脱塩される。試料の適用の後、カートリッジを０．１％のギ酸１ｍｌによって洗浄し、次に溶出は０．１％のギ酸を含むメタノール／水混合液（８０／２０ ｖ／ｖ）で実施される。溶出液は減圧下で乾燥される。
（ＳＰＥ分画）乾燥試料は、１ｍｌの酢酸バッファーに溶解され、酢酸バッファーとメタノールで前もって平衡化されたオアシスＭＣＸ（混合陽イオン交換）６０ｍｇ混合カートリッジ（疎水性および陽イオン交換）（Ｗａｔｅｒｓ）上にロードされる。カートリッジは、１ｍｌの酢酸バッファーと１ｍｌのメタノールによって洗浄される。興味があるペプチド（表６）は、メタノール／酢酸バッファー混合物（５０／５０ ｖ／ｖ）の１ｍｌによって溶出される。酢酸バッファーのｐＨは、興味があるペプチドの等電点に応じて選択される。溶出液は減圧下で乾燥され、０．１％のギ酸を含むアセトニトリル／水（３／９７ ｖ／ｖ）溶液の２００μｌに溶解する。５０μｌのアリコートは、ＭＳ−ＭＳシステムに接続するＬＣに注入された。
（液体クロマトグラフィーおよび質量分析法）ＬＣ−ＭＳ分析は、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ２０００トリプル四重極、またはより感受性のよいＳｃｉｅｘ ＡＰＩ４０００Ｑｔｒａｐ（複合型トリプル四重極−イオントラップＭＳ）（MDS Sciex）のどちらかの質量分析計に接続されている、バイナリーポンプとインジェクター（Agilent Technologies）を有するＨＰ１１００シリーズ高圧クロマトグラフィーシステム（ＨＰＬＣ）において実施された。ＬＣ分離は、３００μｌ／分の溶出流速で、Ｃ_１８シンメトリーカラム（Waters）において実施した。（溶出液Ａ＝０．１％ギ酸水溶液、溶出液Ｂ＝０．１％のギ酸アセトニトリル溶液、２５分間で５％Ｂから５０％Ｂ、次に３分間で５０％Ｂから１００％Ｂの直線濃度勾配）。ＭＳ分析は５５００Ｖ電圧で陽性イオン化法で実施され、ニードル電位として適応され、源のイオン化を可能にする。計測器照合とデータ収集は、アナリスト１．４．１ソフトウェアにより実施された。霧状ガス（空気）およびカーテン・ガス（窒素）流は、それぞれ３０と２０ｐｓｉである。ターボＶＴＭイオン源は４００℃に、補助窒素流は４０ｐｓｉに合わせる。各ペプチドで記録されたＭＲＭ遷移を表６に示す。衝突エネルギー（ＣＥ）、デクラスタリング・ポテンシャル（ＤＰ）およびコリジョンセルエクジットポテンシャル（ＣＸＰ）は、選択されたＭＲＭ遷移について最適化される。

２．結果
配列番号１の配列の理論上のＭＲＭ遷移のリストは、ＭＩＤＡＳ（ＭＲＭ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ検出およびシークエンシング）ソフトウェアを使用して生成された。このリストは、８００から３０００Ｄａの質量範囲および全てのあり得るｙまたはｂ型の断片イオンの、理論上のトリプシンペプチドの全ての二重荷電あるいは三重荷電親イオンを含む。各タンパク質について、各々の可能な遷移は、最も感受性があり、最も特異的な遷移を決定するために試験された。この選択の結果を表６に示す。ペプチドＥＰＬＱＡＥＤＤＰＬＱＡＫ（配列番号３０）の遷移７２７／５５６のためのＳＰＥステップの最適化の例を、図７に与える。ＭＣＸクロマトグラフ分離はさまざまなｐＨで実施され、ｐＨはピークが最も高い領域を得ることを可能にするｐＨを実験の残りについて選択した。
さらに、ＡＱＵＡ型の重ペプチド（シグマ）、あるいは、重組換えタンパク質をアッセイ基準として使用して、複雑な生物媒質において興味がある腫瘍マーカーを絶対値で定量化することが可能である。

表６

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Claims (14)

1. 結腸直腸癌を有することが疑われる患者から取られた生物試料中のプロディフェンシン−Ａ６マーカーの存在を決定することによる結腸直腸癌のインビトロ診断法。
2. 少なくとも配列番号２の配列及び多くとも配列番号１の配列を有するペプチドの存在を決定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 配列番号２の配列に特異的な結合パートナーを使用することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. 結合パートナーが少なくとも配列番号４の配列、好ましくは少なくとも配列番号６の配列（エピトープ１）及び多くとも配列番号２の配列を有するエピトープに特異的なモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 結合パートナーがプロディフェンシン−Ａ６を捕獲するために使われることを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
6. 以下のエピトープから選択されるエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の方法：
   −少なくとも配列番号７［式中、Ｘ_１はＶまたはＬ、Ｘ_２はＴまたはＬ、Ｘ_３はＰ、ＳまたはＣ、Ｘ_４はＰまたはＳ、Ｘ_５はＷまたはＴ、Ｘ_６はＡ、Ｑ、Ｍ、ＣまたはＥ、Ｘ_７はＩ、ＥまたはＤ、及びＸ_８はＦ、Ｙ、ＳまたはＬ］及び多くても配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２（エピトープ２）の配列のエピトープ、
   −少なくとも配列番号１３［式中、Ｘ_１はＳまたはＴ、Ｘ_２はＣまたは無し、Ｘ_３はＴ、ＬまたはＥ、Ｘ_４はＨまたはＲ、Ｘ_５はＩ、ＦまたはＥ、Ｘ_６はＧまたはＶ、及びＸ_７はＣまたはＮ］及び多くても配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６（エピトープ３）の配列のエピトープ、
   −少なくとも配列番号１７［式中、Ｘ_１がＰまたはＷ、Ｘ_２はＷまたはＥ、Ｘ_３はＳ、Ａ、ＱまたはＷ、Ｘ_４はＭ、Ｌ、ＲまたはＰ、Ｘ_５はＨ、Ｆ、ＷまたはＧ、Ｘ_６はＶまたはＡ、及びＸ_７はＩまたはＶ］及び多くても配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１（エピトープ４）の配列のエピトープ、
   −少なくとも配列番号２２［式中、Ｘ_１がＹまたはＮ、Ｘ_２はＥ、ＤまたはＱ、Ｘ_３はＴ、Ｎ、Ｒ、ＭまたはＫ、Ｘ_４はＷ、ＨまたはＦ及びＸ_５はＰまたはＧ］及び多くても配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８又は配列番号２９（エピトープ５）の配列のエピトープ。
7. エピトープ１に特異的なモノクローナル抗体及びエピトープ２、３、４または５、好ましくは２に特異的なモノクローナル抗体を使用することを特徴とする請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
8. 生物試料が腫瘍から離れた試料であることを特徴とする請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
9. 結腸直腸癌を有することが疑われる患者から取られた１又は複数の生物試料において、以下のマーカーから選択される少なくとも一つの他の腫瘍マーカーの存在を決定することを含む請求項１から８の何れか一項に記載の方法：白血球エラスターゼ・インヒビター、エズリン、アミノアシラーゼ１、肝臓脂肪酸結合タンパク質、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ、Ｉ−プラスチン、β２−ミクログロブリン、プロテアソーム２０Ｓ、ガレクチン−３、Ｌ−乳酸脱水素酵素Ｂ鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質３α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１、ＩＩ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１８、Ｉ型ケラチンＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ１９、上皮カドヘリン、ＣＥＡ、ビリン、ＣＡ１９−９、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＡ７２−２、テストステロン、ＴＩＭＰ−１、Ｃｒｉｐｔｏ−１、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、インテレクチン−１、サイトケラチン２０、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、（プロ）デフェンシン−Ａ５、ＭＩＦ、ピルビン酸キナーゼＭ２−ＰＫ、カルグラニュリンＣ、ＣＤ２４、ＣＣＳＡ−３（結腸癌特異的抗原）及びＣＣＳＡ−４、血液中のメチル化ＤＮＡ断片の検出、好ましくはＡＸＬ４遺伝子のメチル化ＤＮＡまたはセプチン−９遺伝子のメチル化ＤＮＡ、糞便ＤＮＡ断片の特異的な変性の検出、例えば糞便ＤＮＡの特異的な変異又は糞便ＤＮＡのメチル化プロフィールの特異的な変性、ヒト糞便のヘモグロビンの検出。
10. プロディフェンシン−Ａ６の存在及び以下のマーカーの存在を決定することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法：
    − Ｌ−ＦＡＢＰ、
    − ＣＡ１９−９とＣＥＡ、
    − β２−ミクログロブリンとＣＥＡ、
    − β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９とＣＥＡ、
    − β２−ミクログロブリン、Ｌ−ＦＡＢＰとＣＥＡ、
    − Ｌ−ＦＡＢＰ、ＣＡ１９−９とＣＥＡ、
    − β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９とＣＥＡ、
    − β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、Ｌ−ＦＡＢＰとＣＥＡ、− β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、ガレクチン−３、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＭＩＦとＣＥＡ、または− β２−ミクログロブリン、ＣＡ１９−９、ガレクチン−３、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＭＩＦ、Ｉ−プラスチンとＣＥＡ。
11. 結腸直腸癌に関する早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療、予後診断及び再発診断における、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法の使用。
12. プロディフェンシン−Ａ６のプロペプチド部分を特異的に認識するモノクローナル抗体。
13. 少なくとも配列番号４の配列、好ましくは少なくとも配列番号６の配列及び多くとも配列番号２の配列を有するエピトープに特異的に認識する、請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
14. 以下のエピトープから選択されるエピトープを特異的に認識する抗プロデフェンシン−Ａ６モノクローナル抗体：
    −少なくとも配列番号７［式中、Ｘ_１はＶまたはＬ、Ｘ_２はＴまたはＬ、Ｘ_３はＰ、ＳまたはＣ、Ｘ_４はＰまたはＳ、Ｘ_５はＷまたはＴ、Ｘ_６はＡ、Ｑ、Ｍ、ＣまたはＥ、Ｘ_７はＩ、ＥまたはＤ及びＸ_８はＦ、Ｙ、ＳまたはＬ］及び多くても配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２の配列のエピトープ、
    −少なくとも配列番号１３［式中、Ｘ_１はＳまたはＴ、Ｘ_２はＣまたは無し、Ｘ_３はＴ、ＬまたはＥ、Ｘ_４はＨまたはＲ、Ｘ_５はＩ、ＦまたはＥ、Ｘ_６はＧまたはＶ及びＸ_７はＣまたはＮ］及び多くても配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６の配列のエピトープ、
    −少なくとも配列番号１７［式中、Ｘ_１がＰまたはＷ、Ｘ_２はＷまたはＥ、Ｘ_３はＳ、Ａ、ＱまたはＷ、Ｘ_４はＭ、Ｌ、ＲまたはＰ、Ｘ_５はＨ、Ｆ、ＷまたはＧ、Ｘ_６はＶまたはＡ及びＸ_７はＩまたはＶ］及び多くても配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１の配列のエピトープ、
    −少なくとも配列番号２２［式中、Ｘ_１がＹまたはＮ、Ｘ_２はＥ、ＤまたはＱ、Ｘ_３はＴ、Ｎ、Ｒ、ＭまたはＫ、Ｘ_４はＷ、ＨまたはＦ及びＸ_５はＰまたはＧ］及び多くても配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８又は配列番号２９の配列のエピトープ。

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