ES2692354T3 - Procedimiento de análisis de la prodefensina-A6 para el diagnóstico in vitro del cáncer colorrectal - Google Patents

Abstract

Procedimiento de diagnóstico in vitro del cáncer colorrectal mediante la determinación del aumento de la concentración, con respecto a los valores de referencia determinados para los sujetos sanos, del marcador proteico Prodefensina-A6 en una muestra biológica procedente de un paciente sospechoso de estar afectado de cáncer colorrectal, que utiliza un anticuerpo monoclonal específico de la Prodefensina-A6 que reconoce el epítopo 1 de SEQ ID nº6.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de analisis de la prodefensina-A6 para el diagnostico in vitro del cancer colorrectal

La presente invencion se refiere al campo de la cancerologia. Mas particularmente, la presente invencion tiene por objeto un procedimiento de diagnostico in vitro del cancer colorrectal en un paciente humano por determinacion de la presencia de la prodefensina-A6 en una muestra biologica procedente de este paciente, pudiendo dicho procedimiento utilizarse tanto en el diagnostico precoz, la deteccion, el seguimiento terapeutico y el pronostico, como en el diagnostico de las recaidas en el ambito del cancer colorrectal.

El cancer colorrectal (CCR) es un problema importante de salud publica. Su incidencia mundial se ha estimado a 875000 nuevos casos en 19961. En ambos sexos, es el cancer que aparece con mas frecuencia en los paises occidentales, en los que se clasifica generalmente entre las 3 primeras causas de fallecimiento por cancer. El porcentaje de supervivencia en 5 anos en cualquier fase esta proximo al 60%.

Solo un diagnostico precoz ofrece la esperanza de un tratamiento curativo. Ahora bien, en la actualidad, no existe ningun ensayo serologico de deteccion, ni de diagnostico especifico que sea precoz.

La deteccion del cancer colorrectal se realiza actualmente en Europa con dos enfoques distintos: en primer lugar, con la ayuda de un ensayo paraclinico que consiste en buscar la presencia de sangre en las heces (Ensayo de Sangre Oculta en Heces, FOBT, comercializado por ejemplo bajo el nombre de Hemoccult®). Esta tecnica ha demostrado su utilizad clinica. Cuando se utiliza, cada 2 anos en las personas mayores de 50 a 74 anos, puede reducir del 15 al 20% la mortalidad por cancer colorrectal2. Para ello, se necesita que mas de la mitad de la poblacion en cuestion participe regularmente en la deteccion y que se realice una colonoscopia en caso de ensayo positivo, seguida eventualmente de un tratamiento adecuado.

Sin embargo, esta tecnica de deteccion sufre un cierto numero de problemas:

* el principal inconveniente de este ensayo es su mediocre sensibilidad, muy especialmente para los adenomas (lesion displasica pre-cancerosa) que, si son de gran tamano o en displasia severa, conduciran, en 1 de cada 10 casos, al desarrollo de un cancer.

* el ensayo es tambien poco especifico. La aparicion de sangre en las heces puede estar relacionada con una afeccion no tumoral: hemorragias recto-colicas, hemorroides, fistulas, etc.

En este caso, se debe realizar una investigacion por colonoscopia con los inconvenientes descritos a continuacion.

* finalmente los Hemoccult® son dificiles de interpretar, deben por lo tanto ser leidos en centros especializados, por un personal cualificado y competente.

Tambien se ha descrito unos ensayos inmunologicos especificos de la hemoglobina humana (Feca EIA®, Heme Select®, etc.). Constituyen, probablemente, un progreso con respecto a Hemoccult® pero presentan, en esencia, los mismos problemas. Es asi que InSure™, comercializado por Enterix Inc., permite detectarun 87% de los pacientes que padecen CCR y un 47% de los que tienen polipos precancerosos. Se trata de un ensayo de deteccion de la hemoglobina humana en las heces, y mas particularmente de la porcion de globina de esta molecula.

Una segunda estrategia de deteccion es la realizacion sistemica de una colonoscopia despues de la edad de 50 anos, que permite, en teoria, reducir la mortalidad por cancer colorrectal. Pero la aceptabilidad de este examen en sujetos con buena salud es demasiado baja para que una politica de deteccion que utiliza la endoscopia disminuya la mortalidad (existe una conformidad de alrededor del 2% para la colonoscopia en los paises de Europa que han establecido esta estrategia de deteccion). Existe un riesgo no insignificante (1%0) de perforacion y hemorragia de colon y de fallecimiento (1/10000), asi como un coste elevado para la salud publica. Ademas, la colonoscopia necesita una preparacion colica previa muy restrictiva, que explica en gran parte el mal cumplimiento.

Los marcadores tumorales determinables por inmunoensayos se han descrito desde hace mucho tiempo en el ambito del cancer colorrectal. Se trata, en particular, del antigeno carcinoembrionario (ACE) y del CA19-9.

El ACE se utiliza para el seguimiento. No se puede utilizar para la deteccion ni para el diagnostico precoz del cancer colorrectal, ya que su sensibilidad y su especificidad son insuficientes. En efecto, este marcador se expresa por otros tipos de canceres, y en patologias benignas. A pesar de todo, es posible ganar en sensibilidad sin perder en especificidad asociando al ACE otro marcador tumoral tal como el CA19-9 o el CA72-4.

Las causas de las variaciones fisiologicas del CA19-9 son raras, pero otras afecciones benignas (hepatobiliares, pancreaticas) o malignas pueden inducir a un aumento del CA19-9. Este marcador, tomado aisladamente, no presenta ya, por lo tanto, ningun interes para el diagnostico. Sin embargo, estando su concentracion serica

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correlacionada con el tamano del tumor y con la presencia de la metastasis, puede permitir tambien un seguimiento terapeutico o la puesta en evidencia precoz de recidivas.

Por otro lado, se han propuesto unos ensayos comerciales tales como:

Colopath®/ColorectAlertMD. comercializado por Ambrilia, es un ensayo de deteccion rapida y poco invasiva para el CCR. Colopath® detecta un plasmogeno (clase de lipidos complejos que pertenecen a los fosfolipidos) en la mucosa rectal de los individuos con una patologia colorrectal, mientras que el ColorecAltertMD detecta el antigeno T, un azucar complejo en la mucosa rectal. El ensayo Colopath®/ColorectAlertMD implica la aplicacion de mucosa rectal en una tira de ensayo y el resultado positivo o negativo se basa en una reaccion de Schiff. Ambrilia ha estudiado 1787 sujetos y demostrado que el Colopath®/ColorectAlertMD detecta el 54% de los casos de cancer colorrectal de fase precoz y el 49% en cualquier fase.

^ COLARIS, comercializado por Myriad Genetics, es un ensayo de deteccion en la sangre de mutaciones en los genes MLH1 y MSH2 para la deteccion de canceres hereditarios de colon no poliposicos (sindrome HNPCC). El resultado del ensayo esta disponible en 3 semanas. Myriad utiliza las tecnicas de secuenciacion mas sensibles y mas especificas que existen en la actualidad. El coste del ensayo es elevado.

> Dfl-70®. comercializado por AMDL, es un ensayo de deteccion de diferentes tipos de canceres (pulmon, colon,

mama, higado, estomago, etc.). Por lo tanto, no es especifico del CCR. Su principio se basa en la tecnica ELISA de doble sandwich (analisis del antigeno DR-70). La revelacion se realiza por reaccion enzimatica (anticuerpos acoplados con la biotina y la estreptavidina). Una reaccion coloreada indica la presencia de cancer.

La solicitante ha puesto ahora en evidencia, de manera sorprendente, un nuevo marcador de adenocarcinoma, el cual se libera por los tumores colicos malignos fuera de los tejidos cancerosos y es caracteristico de estos tumores, de manera que puede detectarse tanto en las muestras biologicas distantes de los tumores malignos, como en los tumores en si mismos.

Asi, la presente invencion tiene por primer objeto un procedimiento de diagnostico in vitro del cancer colorrectal por determinacion del aumento de la concentracion, con respecto a los valores de referencia determinados para los sujetos sanos, del marcador proteico prodefensina-A6 en unas muestras biologicas procedentes de pacientes sospechosos de estar afectados de cancer colorrectal, y preferentemente distantes de los tumores que utilizan un anticuerpo monoclonal especifico de la prodefensina-A6 que reconoce el epitopo 1 de SEQ ID n° 6.

Se refiere tambien a la utilizacion de este procedimiento tanto en el diagnostico precoz, la deteccion, el seguimiento terapeutico, el pronostico, como en el diagnostico de las recaidas en el ambito del cancer colorrectal.

El procedimiento de la invencion permite por lo tanto diagnosticar, de manera especifica y precoz, el cancer colorrectal mediante un ensayo simple que consiste en buscar la presencia de la prodefensina-A6 en una muestra biologica extraida en un paciente, preferentemente distante del potencial tumor. En efecto, la solicitante ha mostrado, de manera inesperada, que los tumores colicos no solo segregaban especificamente la prodefensina-A6, sino sobre todo que la liberaba fuera del tejido canceroso, como se pondra en evidencia de manera mas detallada a continuacion, y que su concentracion en la muestra biologica en la que se realiza el procedimiento de la invencion aumentaba con respecto a los valores de referencia determinados para los pacientes sanos.

La determinacion de la presencia de la prodefensina-A6 en una muestra biologica distante o no del tumor permite entonces concluir en la patologia buscada. Una de las ventajas del procedimiento de la invencion reside, por lo tanto, en la posibilidad de utilizar una muestra distante del tumor potencial a titulo de muestra de diagnostico, lo que permite un diagnostico simple y no invasivo, mientras que un diagnostico tisular necesita una biopsia extraida de manera invasiva. En efecto, el estudio de marcadores tisulares, por ejemplo sobre un corte de tejido (inmunohistoquimica), puede presentar un interes de pronostico, pero no tiene ningun interes para la deteccion o el diagnostico del cancer colorrectal.

Las defensinas son una familia de peptidos antimicrobianos implicados en la defensa del huesped contra los ataques microbianos. Estan constituidas de 30 a 40 aminoacidos y tienen la propiedad de disgregar selectivamente las membranas. Como otras proteinas eucariotas, las defensinas pueden estar presentes en forma de proteina madura o en forma de precursor.

Un precursor, tambien denominado proteina precursora, esta constituido de un propeptido y de una parte madura. Asi, la prodefensina A6 es la proteina precursora de la proteina madura defensina A6, y esta constituida de 100 aminoacidos y comprende un peptido senal (aminoacidos 1-19), el propeptido (aminoacidos 20-65) y la proteina madura defensina A6 (aminoacidos 66-100).

De manera general, las proteinas precursoras se han considerado durante mucho tiempo como siendo unicamente unas moleculas metabolicas. Sin embargo, un cierto numero de ejemplos recientes, en particular en el campo de los

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neuropeptidos, indican que, en algunas situaciones, las proteinas precursoras tienen una actividad biologica propia y disociada de la del peptido maduro que pueden generar. Claramente, la secuencia de las proteinas precursoras incluye la de las proteinas maduras, por ejemplo la secuencia de las prodefensina incluye la de las defensinas, pero sus puntos isoelectricos y pesos moleculares son diferentes. Las defensinas y prodefensinas se tienen que considerar, por lo tanto, como dos proteinas diferentes.

Las defensinas alfa 53 y alfa 64 se producen esencialmente por las celulas de Paneth del intestino delgado. Los ARNm de las defensinas alfa 5 y 6 se sobreexpresan en el tejido colico en caso de enfermedad de Crohn5. La defensina alfa 6 se ha identificado como marcador potencial del cancer de colon por Nam et a/.6. Nam et al. han desarrollado un ensayo ELISA por competicion que analiza especificamente la defensina alfa 6. Han definido un umbral (30 ng/ml) mas alla del cual los pacientes se diagnosticaban por padecer un cancer colorrectal. Durante un analisis de 18 sueros de donantes sanos y de 49 sueros de cancer, han obtenido una sensibilidad de diagnostico del 69,4% para una especificidad de diagnostico del 83,3%. No se ha hecho ninguna mencion en este documento sobre el precursor de la defensina alfa 6, la prodefensina alfa 6.

Asi, el precursor de la defensina alfa 6, la prodefensina-A6 (n° Swiss Prot Q01524), no se ha descrito jamas por ser ser util como marcador en el ambito de cancer y, en particular, del cancer colorrectal y como pudiendo analizarse en una muestra biologica distante o no del tumor maligno.

Por determinacion de la presencia de la proteina precursora, se entiende la determinacion del precursor mas alla de los valores de referencia determinados para los pacientes sanos. El precursor buscado puede ser el precursor intacto de 100 aminoacidos, la proteina precursora sin el peptido senal (aminoacidos 20 a 100), o el propeptido solo (aminoacidos 20 a 65). Puede tambien ser unos fragmentos de estos ultimos, tales como unos fragmentos del propeptido, con la exclusion de la proteina madura (aminoacidos 66-100) y de los fragmentos de esta.

Segun un modo de realizacion particular de la invencion, se determina la presencia del precursor de la prodefensina- A6, sin el peptido senal. La secuencia descrita para este precursor en la base de dato Swiss-Prot es la SEQ ID n° 1 (EPLQAEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGSTRAFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINH RFCCL; que corresponde a los aminoacidos 20-100). Preferentemente, se determina la presencia del propeptido que tiene el mismo al menos la secuencia SEQ ID n° 2 (EPLQAEDDPLQAKAYEaDaQeQRG ANDQDFAVSFAEDASSSLRALG) y como maximo la secuencia SEQ ID n° 1.

Como es bien conocido por el experto en la materia, existen unos polimorfismos proteicos, y las secuencias dadas anteriormente son solo indicativas. Son las secuencias de consenso indicadas en la base de datos Swiss-Prot, pero pueden existir unas sustituciones de aminoacidos en porcentaje que se analizara por el experto en la materia para considerar que se trata de la misma proteina. Asimismo, el sitio de escision del propeptido al aminoacido 65 es teorico y se da solo a titulo indicativo.

Por liberacion por los tumores colicos, se entiende la secrecion activa o pasiva o la liberacion, sea cual sea el mecanismo del marcador tumoral por las celulas tumorales en si o por las celulas no tumorales proximas tras lesiones o modificaciones de fenotipo celular que resulta del desarrollo tumoral.

Por muestra biologica en la que se realiza el procedimiento de la invencion, se entiende cualquier muestra biologica susceptible de contener el marcador tumoral de interes. A titulo de ejemplo de muestra biologica no distante del tumor, se pueden citar las muestras solidas tales como el tejido que proviene del tumor, de biopsias de este tumor, de ganglios linfaticos, de metastasis del paciente, y las celulas purificadas a partir de estas muestras solidas. A titulo de ejemplo de muestra biologica distante del tumor, se pueden citar los fluidos biologicos tales como la sangre total o sus derivados, por ejemplo suero o plasma, las orinas, la saliva, y los derrames, la medula osea y las heces, y las celulas purificadas a partir de estas muestras liquidas. Se prefiere la sangre o sus derivados asi como las heces, los derrames y las celulas purificadas a partir de estas muestras liquidas.

El procedimiento de la invencion se puede mejorar detectando ademas la prodefensina-A6, al menos otro marcador tumoral, llegado el caso tambien liberado por los tumores colicos fuera de los tejidos cancerosos. Asi, la combinacion de al menos dos marcadores permite mejorar la especificidad y la sensibilidad del ensayo de diagnostico del cancer colorrectal.

Asi, otro objeto de la invencion consiste tambien en determinar la presencia de al menos otro marcador tumoral seleccionado del grupo de marcadores siguientes: Inhibidor de Elastasa Leucocitaria, Ezrina, Aminoacilasa 1, Proteina de Union a Acidos Grasos del Higado, Proteina de Union a Acidos Grasos del Intestino, Apolipoproteina AI, Apolipoproteina AII, Plastina-I, Microglobulina Beta 2, Protosoma 20S, Galectina-3, Cadena B de la L-Lactato Deshidrogenasa, Calreticulina, Proteina 3 alfa Derivada de los Islotes Regeneradores, Transductor 1 de la Senal de Calcio Asociado a Tumores, Queratina tipo II Citoesqueletica 8, Queratina tipo I Citoesqueletica 18, Queratina tipo I Citoesqueletica 19, Cadherina Epitelial, ACE, Villina, CA19-9, CA 242, CA 50, CA 72-2, Testosterona, TIMP-1, Cripto-1, Proteina Disulfuro Isomerasa, Intelectina-1, Citoqueratina 20, Proteina Tumoral Controlada Traslacionalmente, (Pro)defensina-A5, MIF, Piruvato Cinasa M2-PK, Calgranulina C, CD24, CCSA-3 (antigeno especifico del cancer de colon) y CCSA-4, la deteccion de fragmentos de ADN en la sangre que tiene unas

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alteraciones especificas de su perfil de metilacion, como por ejemplo el ADN metilado del gen AXL4 (Metilacion del Gen de Homeobox-4 similar a Aristaless) o del ADN metilado del gen Septin-9, la deteccion de alteraciones especificas de fragmentos de ADN en las heces como las mutaciones especificas del ADN en las heces o alteraciones especificas del perfil de metilacion del ADN en las heces, la deteccion de hemoglobina humana en las heces.

Por marcador tumoral diferente de la prodefensina-A6, se entiende la proteina, el ARN mensajero o modificaciones especificas del gen correspondiente, como mutaciones o metilaciones. En otras palabras, solo la prodefensina-A6 se busca unicamente en forma proteica, completa o en forma de fragmento.

El marcador tumoral del Inhibidor de la elastasa (n° Swiss Prot P30740, tambien denominado LEI, Serpin B1, Inhibidor de la Elastasa de Monocitos/Neutrofilos, M/NEI o EI) se secuencio en 19927. El LEI inhibe especificamente las proteasas que tienen unas propiedades de tipo elastasa o quimotripsina por formacion de complejo no disociable bajo la accion de SDS8. Es asi que el LEI inhibe tres de las proteasas principales producidas por los neutrofilos: la lecucocito elastasa, la proteinasa-3 y la catepsina G Estas proteasas permiten al sistema inmunitario defender el organismo por proteolisis de sustratos extracelulares o fagocitados. Pero cuando estas proteasas se encuentran en exceso, son responsables de reacciones inflamatorias. El LEI podria, por lo tanto, tener un papel de regulacion y de limitacion de la accion inflamatoria inducida por las proteasas celulares. La solicitante ha mostrado, por su parte, de manera sorprendente, en la solicitud de patente WO2009/024691, que la concentracion de esta proteina se aumentaba con respecto a los valores de referencia determinados para los pacientes sanos, de manera que esta proteina es un buen marcador en las muestras biologicas procedentes de un paciente que padece un cancer colorrectal, estando dichas muestras distantes o no del tumor.

El marcador Ezrina (N° Swiss Prot P15311, tambien denominado p81, Citovilina o Vilina-2) es una proteina que asegura la union entre la membrana celular y los filamentos de actina del citoesqueleto de la celula, en particular en las microvellosidades de las celulas epiteliales intestinales9. W.G. Jiang y S. Hiscox10 han mostrado que las interleucinas IL-2, IL-8, IL-10, etc. podian inhibir la expresion de ezrina en la linea celular de cancer colorrectal humano, HT29. Los mismos autores11 han mostrado que la inhibicion de la expresion de ezrina en las lineas celulares de cancer colorrectal, HT115 y HRT18, reducia la adhesion entre celulas y aumentaba la movilidad y el comportamiento invasivo de las celulas. Han concluido que la ezrina regulaba las adhesiones celula/celula y celula/matriz, interactuando con las moleculas de adhesion celular, E-cadherina y beta-catenina. Han sugerido que la ezrina podria desempenar un papel importante en el control del potencial invasivo de las celulas cancerosas. Por otro lado T. Xiao et a/.12 han utilizado un ensayo ELISA para cuantificar la ezrina plasmatica de pacientes que padecen cancer de pulmon. Sin embargo, no han observado diferencias con respecto a sujetos de control. La solicitante ha mostrado, por su parte, de manera sorprendente, en la solicitud de patente WO2009/019365, que la concentracion de esta proteina aumentaba con respecto a los valores de referencia determinados para los pacientes sanos, de manera que esta proteina es un buen marcador en las muestras biologicas procedentes de un paciente que padece un cancer colorrectal, estando dichas muestras distantes o no del tumor.

El marcador aminoacilasa 1 (n° Swiss Prot Q03154, tambien denominado EC 3.5.1.14, N-Acil-L-Aminoacido Amidohidrolasa o ACY-1) pertenece a la familia de las aminoacilasas. Son unas enzimas que catalizan la hidrolisis de los aminoacidos acilados para dar unos acidos grasos y unos aminoacidos13. Un analisis inmunoquimico de la actividad enzimatica aminoacilasa se ha desarrollado a partir de 1975 por K. Lorentz et a/.14 y se ha utilizado para determinar diferentes tejidos y sueros15. El estudio ha mostrado un aumento de la actividad aminoacilasa en caso de patologias hepaticas, pero no en caso de cancer de colon. Por otro lado, el gen de la aminoacilasa 1 se ha modificado en el cromosoma 3p21.116. La region 3p21.1 se reduce a la homocigota durante un cancer de pulmon de pequena celula, y en este caso, la expresion de la aminoacilasa se reprime o es indetectable17. Asimismo, S. Balabanov et a/.18 han mostrado que la expresion de la aminoacilasa se reprimia en caso de cancer de rinon. La solicitante ha mostrado, por su parte, de manera sorprendente, en la solicitud de patente WO2009/019366, que la concentracion de esta proteina aumentaba con respecto a los valores de referencia determinados para los pacientes sanos, de manera que esta proteina es un buen marcador en las muestras biologicas procedentes de un paciente que padece cancer colorrectal, estando dichas muestras distantes o no del tumor.

El marcador de la Proteina de Union a acidos grasos de higado (n° Swiss Prot P07148, tambien denominado L- FABP, FABP1, FABPL, proteina Z o proteina transportadora de esterol) pertenece a la familia de FABP que comprende nueve isoformas. Cada isoforma se denomina segun el tejido en el que se ha detectado la primera vez. Estas isoformas poseen una comunidad de funcion, unas estructuras tridimensionales parecidas pero su homologia de secuencia no es elevada. La L-FABP se secuencio en 198519. Es una pequena proteina de 15 kDa, abundante en el citosol, que posee la capacidad de fijarse a los acidos grasos libres asi como a la bilirrubina Algunos estudios recientes parecen indicar que las alteraciones de la expresion de la proteina L-FABP podria inducir un proceso de tumorigenesis. Para el cancer de prostata, el nivel de expresion de los ARNm del L-FABP en las biopsias de tejido tumoral era 10 veces mas elevado que en el tejido normal20. Para el cancer de colon, varios equipos han identificado una disminucion de la expresion de la proteina L-FABP a nivel del tejido tumoral comparada con la mucosa colica normal, utilizando unas tecnicas de electroforesis en 2 dimensiones21. Este resultado se confirmo tambien mediante unas tecnicas de inmunohistoquimica. Ademas, la proteina L-FABP es un marcador de pronostico de reseccion hepatica en los pacientes que padecen cancer colorrectal con metastasis en el higado22. En la solicitud de patente

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WO00/33083, se ha sugerido que este marcador podia detectarse en fluidos biologicos de pacientes que padecen cancer de colon. La solicitante ha confirmado, por su parte, en la solicitud de patente WO2009/019368, que la concentracion de esta proteina disminuia con respecto a los valores de referencia determinados para los pacientes sanos, de manera que esta proteina es un buen marcador en las muestras biologicas procedentes de un paciente que padece cancer colorrectal, estando dichas muestras distantes del tumor.

El marcador Proteina de union a acidos grasos de intestino (n° Swiss Prot P12104, tambien denominado I-FABP, FABP-2 o FABPI) se secuencio en 198723. Es una pequena proteina de 15 kDa, abundante en el citosol, que posee la capacidad de fijarse a los acidos grasos libres asi como a la bilirrubina. La proteina I-FABP se expresa a nivel de los enterocitos del intestino delgado y puede constituir aproximadamente el 2% del contenido proteico de este tipo celular. A nivel tisular, el duodeno y el yeyuno contienen unas cantidades significativamente mas elevadas de I- FABP que el colon (yeyuno: 4,8 pg/g, colon: 0,25 pg/g)24. La I-FABP no se ha podido detectar en las muestras de plasma de sujetos sanos. Por el contrario, en algunos contextos patologicos como la isquemia intestinal, la enfermedad de Crohn o la cirrosis biliar primitiva, es posible poner en evidencia un aumento de la concentracion de I-FABP plasmatico en algunos sujetos24. Para el cancer de prostata, se ha mostrado que el nivel de expresion de los ARNm del I-FABP en las biopsias de tejido tumoral era 7 veces mas elevado que en el tejido normal20. En el modelo de induccion de tumor colorrectal por el azoximetano en la rata, el nivel de expresion de los ARNm de la I-FABP disminuye de 2,92 a 3,97 veces cuando los animales tienen una alimentacion que reduce la incidencia de cancer (proteinas de soja o hidrolizado de lactosuero)25. La solicitante ha confirmado, por ejemplo en la solicitud de patente WO2009/019366, que la concentracion de esta proteina aumentaba con respecto a los valores de referencia determinados para los pacientes sanos, de manera que esta proteina es un buen marcador en las muestras biologicas procedentes de un paciente que padece cancer colorrectal, estando dichas muestras distantes del tumor.

Las apolipoproteinas son una familia de proteinas constituidas de aminoacidos polares que permiten el transporte de los lipidos en la sangre por formacion de un complejo macromolecular hidrofilo denominado lipoproteina. Para cada una de las apoliproproteinas plasmaticas humanas existen unas isoformas procedentes de polimorfismo genetico y/o de modificaciones post-traduccionales cuya presencia en la sangre puede asociarse a algunas patologias26. La concentracion plasmatica de las apoliproproteinas no es insignificante, del orden del mg/ml27.

El marcador apoliproproteina AI (n° NCBI 490098, tambien denominado Apo A-I, Apo AI y Apo A1) es una proteina de 243 aminoacidos y de 28 kDa. Se sintetiza esencialmente por el higado y el intestino. Esta proteina se ha mostrado sub-abundante en los sueros de pacientes que padecen cancer colorrectal con respecto a los sujetos sanos, por SELDI-TOF28. Sin embargo, se precisa en este articulo que la discriminacion de los pacientes que padecen CCR con respecto a los sujetos sanos se realiza combinando Apo AI con otros marcadores proteicos. Por otro lado, este articulo precisa que el analisis por inmunoensayo turbidimetrico de Apo AI, realizado por otro equipo no confirma la sub-abundancia de esta proteina en los sueros de pacientes que padecen CCR29. Hachem et al.30, por su parte, han propuesto analizar la Apo AI en unos sueros de pacientes que han tenido cancer de higado tras metastasis de cancer colorrectal. La solicitante ha mostrado, de manera sorprendente, que un analisis por inmunoensayo permite poner en evidencia la disminucion de la concentracion de esta proteina en los pacientes que padecen cancer colorrectal, contrariamente a lo que avanzaba Engwegen et al.28, que han podido poner en evidencia esta disminucion unicamente utilizando la tecnica SELDI-TOF. El analisis por inmunoensayo de Apo AI en las muestras biologicas es un buen procedimiento de diagnostico del cancer colorrectal, estando dichas muestras distantes del tumor en la medida en la que el analisis por inmunoensayo utilizado no es la turbidimetria como se utiliza por el equipo de Zhang et al.29.

El marcador apolipoproteina AII, (n° Swiss Prot P02652, tambien denominado ApoA II, Apo-AII, y Apo A2) es una proteina de 17380 Da compuesta de dos cadenas polipeptidicas de 77 aminoacidos, cada una unida por un puente disulfuro. Como la apolipoproteina AI, la apolipoproteina AII se sintetiza esencialmente por el higado y el intestino. Hachem et al.30 tambien han determinado, ademas de Apo AI, Apo AII en sueros de pacientes que han tenido cancer de higado tras metastasis del cancer colorrectal. Sin embargo, los resultados no son significativos y no permiten una conclusion en cuanto a la patologia buscada. La solicitante ha mostrado, por su parte, de manera sorprendente, en la solicitud de patente WO2009/019370, que la concentracion de esta proteina disminuia con respecto a los valores de referencia determinados para los pacientes sanos, de manera que la disminucion de la concentracion de esta proteina en los pacientes que padecen cancer colorrectal lo hace un buen marcador en las muestras biologicas procedentes de un paciente que padece cancer colorrectal, estando dichas muestras distantes del tumor.

El marcador I-plastina (n° Swiss Prot Q14651, tambien denominado I-plastin, Plastina Especifica del Intestino o Plastin 1) pertenece a la familia de las plastinas humanas de las cuales se conocen tres representantes: la I-plastina, la L-plastina y la T-plastina. Algunos autores denominan las plastinas “fimbrinas”, otros autores reservan el nombre de fimbrina a la I-plastina. Las plastinas son unas proteinas que se unen a la actina para formar el citoesqueleto (esqueleto celular). Son unas proteinas de 70 kDa relativamente bien conservadas a lo largo de la evolucion de las eucariotas. Presentan una fuerte especificidad tisular, solo una isoforma al mismo tiempo esta presente en los tejidos normales31. La utilizacion de plastinas frente al cancer ya se ha descrito en la patente US-A-5,360,715, que propone un metodo para determinar si una celula es hematopoyetica o neoplasica, es decir cancerosa. Este metodo reivindica el analisis de la L-plastina y de la T-plastina a nivel celular, y mas particularmente el analisis de su ARNm. Sin embargo, a pesar de estas propiedades, no se ha realizado ningun trabajo anterior se ha realizado el interes de

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las plastinas en el ambito del diagnostico del cancer colorrectal a partir de una extraccion de suero o de heces. Ademas, la I-plastina no se ha considerado nunca como un marcador potencial del cancer32. La solicitante ha mostrado, de manera sorprendente, en la solicitud de patente WO2009/019369, que la concentracion de esta proteina aumentaba con respecto a los valores de referencia determinados para los pacientes sanos, de manera que esta proteina es un buen marcador en las muestras biologicas procedentes de un paciente que padece un cancer colorrectal, estando dichas muestras distantes o no del tumor.

El marcador beta 2 microglobulina (n° Swiss Prot P61769, tambien denominado p2 Microglobulina, p2M) es una proteina de baja masa molecular (de 11 a 12 kDa) encontrada en la superficie de la mayoria de las celulas humanas nucleadas. El porcentaje de p2 microglobulina serica aumenta en algunos pacientes que padecen cancer, sin que este aumento sea especifico, ni correlacionado con la naturaleza del tumor, su fase o la gravedad de la enfermedad. Se observa tambien un aumento significativo durante otras enfermedades tales como el lupus eritematoso, la artritis reumatoide, el sindrome de Sjogren, las enfermedades malignas del sistema linfoide (mieloma multiple, linfoma de celulas B), algunas enfermedades virales (hepatitis o SIDA) y en los pacientes hemofilicos. Al filtrarse la p2 microglobulina por los glomerulos renales y reabsorberse por los tubos contorneados proximales, su concentracion sanguinea puede modificarse en caso de patologias renales. Es asi que el analisis de la p2 microglobulina se reserva generalmente para el diagnostico de patologias renales, o para el seguimiento de infeccion por el virus de la inmunodeficiencia adquirida. Sin embargo, este marcador es conocido como un marcador tumoral, en particular del cancer de colon.

El marcador proteasoma 20S (tambien denominado prosoma) es la estructura central del proteasoma, que es el mismo un complejo molecular responsable de la degradacion intracelular de las proteinas ubiquitiniladas33. La proteasoma es un complejo molecular de 700 kDa constituido de 28 subunidades asociadas en 4 anillos de 7 subunidades. En el hombre, se conocen 7 unidades alfa (a1, a2, a3, a4, a5, a6 y a7) y 10 unidades beta (p1, p2, p3, p4, p5, p6, p7, (31 i, p2i y p5i). Gracias a sus propiedades cataliticas, la proteasoma tiene un papel central en los mecanismos de proliferacion de crecimiento, de regulacion y de apoptosis celular y por lo tanto en las vias de cancerizacion. La inhibicion de proteasoma por el Bortezombib (Velcade) es un tratamiento reconocido de los mielomas multiples. Unos ensayos terapeuticos de fase II o III estan en curso para unos canceres hematologicos o tumores. Lavabre-Bertrand et al.34 han mostrado que el porcentaje serico de proteasoma podia aumentar durante ciertas patologias, en particular en caso de canceres (mieloma, linfoma y tumores solidos).

El marcador Galectina-3 (n° Swiss Prot P1 7931, tambien denominado Gal-3, Lectina 3 Especifica de Galactosa, antigeno MAC-2, proteina de union a IgE, lectina de 35 kDa, proteina 35 de union a hidratos de carbono, CBP 35, proteina de union a laminina, Lectina L-29, L-31, proteina de union a galactosido o GALBP), es una lectina capaz de unirse a unas estructuras beta-galactosidicas de tipo N-acetil-lactosamina. Es una proteina con funciones multiples implicada en diversas funciones biologicas, que incluye la adhesion de las celulas tumorales, la proliferacion, la diferenciacion, la angiogenesis, la apoptosis, la progresion cancerosa metastasica35. Diferentes trabajos han mostrado que Gal-3 podia complejarse con numerosas moleculas: ACE, IgE, laminina, mucina, Mac-2BP, LAMP1, LAMP2, fibronectina, etc. Irusci et al.36 han descrito un analisis serico de Gal-3. Gal-3 se capturaba sobre unas microplacas recubiertas de proteina de union a Mac-2 (una proteina que se une a Gal-3) y despues revelada con un anticuerpo de rata anti-Gal-3. Este estudio ha mostrado una elevacion serica de Gal-3 en caso de canceres gastro- intestinales, de mama, de pulmon, de ovarios, de melanomas y de linfomas no-Hodgkinianos.

El marcador L-lactato deshidrogenasa cadena B (n° Swiss Prot P07195, tambien denominado LDH-B, Unidad Cardiaca de la LDH o LDH-H) es una proteina que puede complejarse en forma de homotetrameros. Esta proteina puede tambien complejarse con la proteina L-lactato deshidrogenasa cadena A (n° Swiss Prot P00338, tambien denominada LDH-A, lDh Muscle Unit o LDH-M) en forma de heterotetrameros. El analisis serico y/o la actividad enzimatica serica de los complejos tetramericos, bautizados LDH, aumenta en la circulacion sanguinea proporcionalmente a la masa tumoral para numerosos tumores solidos. Su utilizacion se recomienda en asociacion con la gonadotrofina corionica humana (beta-hCG) y la fosfatasa alcalina placentaria para el seguimiento de los canceres seminales. La LDH esta considerada como un marcador de interes para el pronostico de los linfomas, de la leucemia y del cancer de colon37.

El marcador Calreticulina (n° Swiss Prot P27797, tambien denominado CRP55, Calregulin, HACBP, ERp60 o grp60) es una proteina multifuncional. Es una lectina capaz de interactuar transitoriamente con la casi-totalidad de las proteinas monoglicosiladas del reticulo endoplasmico. Es asi que McCool et al.38 han mostrado que la Calreticulina estaba implicada en la maduracion de la mucina colica MUC2. Un metodo de diagnostico de CCR que utiliza un analisis de la Calreticulina en un tejido, las heces o un fluido corporal se describe en la solicitud de patente WO03/065003.

El marcador Proteina 3 alfa Derivada de Islotes Regeneradores (n° Swiss Prot Q06141, tambien denominado Reg III-alfa, Proteina 1 asociada a pancreatitis o Proteina 1 Asociada a Pancreatitis (PAP 1)) es una proteina poco expresada en el pancreas sano. Se sobreexpresa durante las fases agudas de pancreatitis y en algunos pacientes que sufren pancreatitis cronica. Aparece entonces en el liquido pancratico y en la circulacion sanguinea39. Motoo et al.40 han mostrado por ensayo ELISA que el porcentaje de PAP1 sanguineo aumentaba en algunos pacientes que padecen cancer de colon, de estomago, de higado o de pancreas, asi como en caso de insuficiencia renal. Para ello,

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han utilizado el ensayo ELISA (PANCEPAP) comercializado por la compania Dynabio (La Gaude, Francia).

El marcador Transductor 1 de la Senal de Calcio Asociado a Tumores (N° Swiss Prot P16422, egalement appele Proteina principal GA733-2 asociada a tumor gastrointestinal, antigeno de la superficie de celulas epiteliales, EpCAM, glicoproteina epitelial, EGP, antigeno asociado a adenocarcinoma, KSA, antigeno KS 1/4, glicoproteina Trop-1 de la superficie celular o antigeno CD326) se ha caracterizado en 1979 por su capacidad para ser reconocido por un anticuerpo dirigido contra unas celulas de cancer colorrectal41. Esta proteina es conocida bajo diferentes nombres, como se indica anteriormente, pero el uso mas frecuente es la denominacion EpCAM. Es una proteina transmembranaria expresada en la superficie basolateral de las celulas, en algunos epitelios y numerosos canceres42. A partir de 1982, Herlyn et al.43 han mostrado que la inyeccion de un anticuerpo monoclonal anti-EpCAM podia inhibir el crecimiento tumoral de pacientes que padecen cancer colorrectal. Estos resultados han llevado al desarrollo de un tratamiento anti-tumoral a base de un anticuerpo anti-EpCAM denominado Edrecolomab. Este tratamiento se comercializa bajo el nombre de Panorex™. Por otro lado, Abe et al.44 han mostrado, mediante ensayo ELISA, que una forma soluble de EpCAM, bautizada MK-1, aumentaba en la circulacion sanguinea en un 10% en los pacientes cancerosos estudiados.

Las citoqueratinas pertenecen a proteinas que componen los filamentos intermedios del citoesqueleto de las celulas epiteliales. Actualmente, se han identificado mas de 20 citoqueratinas humanas. Las citoqueratinas 8 (n° Swiss Prot P05787, tambien denominadas Citoqueratin-8, CK-8, queratin-8 o K8), 18 (n° Swiss Prot P05783, tambien denominada citoqueratin-18, CK-18, Queratin-18 o K18), y 19 (n° Swiss Prot P08727, tambien denominado citoqueratin-19, CK-19, Queratin-19 o K19) son las mas abundantes en las celulas epiteliales y son unas herramientas utiles para el diagnostico de patologias cancerosas45. Este interes clinico esta relacionado con la liberacion de citoqueratinas por las celulas epiteliales en fase de apoptosis o de proliferacion. En caso de apoptosis, esta liberacion se realiza en forma de fragmentos solubles que parecen aparecer bajo la accion proteolitica de caspasas. Unas formas de citoqueratinas no degradadas no se han descrito nunca en la circulacion sanguinea. Los tres analisis de citoqueratinas mas utilizados son el analisis del antigeno polipeptidico tisular (TPA), del antigeno polipeptidico tisular especifico (TPS), y el CYFRA 21-1. TPA es un ensayo de espectro amplio que mide las citoqueratinas 8, 18 y 19. Los analisis de TPS y de CYFRA 21-1 son mas especificos y miden respectivamente unos fragmentos de la citoqueratina 18 y de la citoqueratina 19. Estos 3 analisis detectan unos fragmentos solubles de citoqueratinas que pueden estar presentes aisladamente o en forma de complejos proteicos. TPA, TPS o CYFRA- 21-1 se utilizaron para el seguimiento terapeutico de los canceres colorrectales, de mama, de pulmon, de vejiga, de ovarios, de pancreas, de prostata y de algunos canceres ORL. El analisis sanguineo de los fragmentos solubles de citoqueratinas tiene, en efecto, un valor clinico para detectar las recidivas o evaluar la respuesta a la terapia en curso (radioterapia, quimioterapia, tratamiento hormonal). Un analisis regular permite en particular evaluar la progresion de la masa tumoral. El analisis de citoqueratinas sanguineas solubles tiene tambien un aspecto de pronostico frente a la fase tumoral y a la formacion de metastasis. Actualmente, el analisis sanguineo de citoqueratina mas utilizado es el CYFRA 21-1. Se recomienda altamente para el seguimiento de pacientes que padecen cancer de pulmon de celulas no pequenas. Existen varios analisis comerciales para TPA (AB Sangtec Medical Co., Byk-Roland, etc.), TPS (IDL Biotech AB, BEKI Diagnostics, etc.) y CYFRA-21-1 (Roche Diagnostics, CIS Bio-Intemational, Fujirebio Diagnostics, etc.). Por otro lado, Kim et al.46 han mostrado que el analisis de las heces de citoqueratina 19 (DiNonA Inc.) podia ser util para la deteccion de enfermedades digestivas en asociacion con un analisis de la sangre oculta en las heces.

El marcador cadherina epitelial (n° Swiss Prot P12830, tambien denominado E-cadherina, Uvomorulina, Cadherina- 1, CAM 120/80 o antigeno CD324) es una proteina transmembranaria mediadora de la adhesion celular calcio- dependiente. Se expresa especificamente en las celulas epiteliales, en las que esta implicada en el mantenimiento de su fenotipo. El dominio citoplasmico de E-cadherina se une a la p-catenina, que esta, por su parte, unida a las redes de filamentos de actina del citoesqueleto. Esta union E-cadherina/p-catenina tiene un papel critico para estabilizar las adhesiones celulas/celulas del tejido epitelial. La perdida de E-cadherina puede por lo tanto reducir la adhesion celular y aumentar el poder invasivo de las celulas cancerosas. Una reduccion de expresion de E- cadherina o de p-catenina esta generalmente asociada con una desdiferenciacion y una agresividad mas importante del tumor, en particular para los canceres del sistema digestivo. Es asi que Roca et al.47 han mostrado que los pacientes que padecen cancer colorrectal y que sub-expresan la E-cadherina tenian un pronostico mas peyorativo que los pacientes que tienen un nivel de expresion normal. A partir de 1983, Damsky et al.48 han mostrado que una forma soluble de E-cadherina podia liberarse por la linea celular del cancer de mama MCF-7. Esta forma soluble corresponde a la escision de la parte extracelular de E-cadherina. Mas tarde, Katayama et a/.49 han mostrado que la forma soluble de E-cadherina podia liberarse en la circulacion sanguinea en caso de cancer, y Willmanns et al.50 han mostrado que el aumento de la dosis de E-cadherina sanguinea estaba correlacionada con la fase tumoral para los canceres colorrectales. Se propone, por otro lado, un kit comercial por la compania Takara BioChemicals (Tokio, Japon).

El analisis de ACE (antigeno carcino-embrionario) para el diagnostico del cancer colorrectal se ha propuesto desde 1965 por Gold y Freedman51, pero un analisis sanguineo de este marcador tiene una sensibilidad mediocre para el diagnostico de canceres colorrectales en una fase poco avanzada. Es por eso que se recomienda el analisis de ACE serico, sobre todo, para evaluar el riesgo de metastasis hepaticas52 y para el seguimiento terapeutico. Ademas, es un marcador poco especifico del cancer colorrectal; en efecto, puede aumentar en numerosos otros canceres

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(pulmon, mama, etc.). Sin embargo, el analisis de ACE en las heces parece mas sensible y mas especifico que el analisis de ACE serico o que el analisis de sangre en las heces53. No obstante, este analisis no se propone todavia de forma rutinaria.

Los determinantes antigenicos 1116-NS-19-9 reactivos, mas comunmente bautizados CA19-9 (Antigeno 19.9 de Hidratos de Carbono) se llevan por unas proteinas de guisante moleculares elevadas54. El analisis sanguineo de CA 19-9 es mas especifico que el del ACE. El porcentaje de CA 19-9 sanguineo aumenta en caso de cancer colorrectal, de pancreas y de higado (colangiocarcinoma), pero tambien en caso de patologias no cancerosas (colangitis, etc.). Se recomienda su uso en asociacion con ACE tanto en el momento del diagnostico de un cancer como para el seguimiento de la patologia.

J. Holmgren et al.55 han mostrado que la dosis serica de antigeno CA 50 aumentada en caso de cancer colorrectal. El antigeno CA 50 se define por su facultad para ser reconocido por un anticuerpo monoclonal especifico.

Tratandose del marcador CA 72, T.L. Klug et al.56 han mostrado que la dosis serica de antigeno CA 72 aumentaba en caso de cancer colorrectal. El antigeno CA 72 se define por su facultad para ser reconocido por un anticuerpo monoclonal especifico.

Asimismo, P. Kuusela et al.57 han mostrado que la dosis serica de antigeno CA 242 aumentaba en caso de cancer colorrectal. El antigeno CA 242 se define por su facultad para ser reconocido por un anticuerpo monoclonal especifico.

El analisis de la testosterona para el diagnostico del cancer colorrectal se ha propuesto en el hombre por M. Holland eta/.58. Estos autores han mostrado una caida del porcentaje de testosterona sanguinea en caso de cancer colorrectal.

Tratandose del marcador TIMP-1, o Inhibidor Tisular de la Metaloproteinasa de la Matriz Tipo-1, la solicitud de patente US 2007/0020707 describe en particular el analisis de TIMP-1 para el diagnostico del cancer colorrectal con la ayuda de un analisis en un fluido corporal.

F. Model et al.59 han mostrado, en julio de 2006, durante el congreso World Congress on Gastrointestinal Cancer, que era posible detectar unas formas metiladas del gen de la septina-9 en el plasma de pacientes que padecen cancer colorrectal.

M.P. Ebert et al.60 han mostrado que el gen ALX4, o homeobox-4 similar a aristaless, se metilaba mas a menudo en los sueros de pacientes que padecen cancer colorrectal que en los sueros control (P < 0,0001). Utilizando un valor umbral de 41,4 pg/ml, han obtenido una sensibilidad del 83,3% y una especificidad del 70%.

La Vilina se describe como marcador sanguineo para el diagnostico del cancer colorrectal en la solicitud de patente FR2581456.

C. Bianco et al.61 han mostrado que la dosis serica de Cripto-1 aumentaba en caso de cancer colorrectal.

La induccion de la tumorogenesis intestinal por el Factor Inhibidor de la Migracion de Macrofagos (MIF) se describe por Wilson et al.62. Mas recientemente, se ha tambien mostrado por Lee et al.63 que el MIF era un marcador sanguineo potencial para el diagnostico precoz del cancer colorrectal.

El marcador proteina disulfuro isomerasa (n° Swiss Prot P07237, tambien denominado EC 5.3.4.1, PDI, subunidad beta de la prolil 4-hidroxilasa, proteina de union a la hormona tiroidea celular o p55) es una proteina multifuncional que cataliza la formacion, la ruptura y la reorganizacion de los puentes disulfuros intramoleculares. En la superficie de las celulas, actua como reductasa y escinde los puentes disulfuro de las proteinas enlazadas a las celulas. En el interior de las celulas, es una molecula soluble localizada en la luz del reticulo endoplasmico, en la que forma y reorganiza los puentes disulfuros de las proteinas neosintetizadas. Comprende 2 dominios cataliticos de tipo tioredoxina que tienen una unidad CXXC caracteristica. A alta concentracion, la PDI funciona como una proteina chaperona que inhibe la agregacion de las proteinas mal replegadas. A baja concentracion, tiene un papel antagonista y facilita la agregacion. La PDI forma tambien la sub-unidad estructural de diferentes enzimas como la propil-hidroxilasa que cataliza la hidroxilacion de los restos de prolina de las cadenas pro-alfa del procolageno. En la solicitud de patente EP1724586, la PDI se ha descrito como marcador de diagnostico para algunos canceres, como el cancer de colon.

El analisis de la intelectina-1 (n° Swiss Prot Q8WWA0, tambien denominado receptor de lactoferrina intestinal, lectina de union a galactofuranosa, lectina endotelial HL-1 u Omentina) para el diagnostico del cancer colorrectal se ha descrito en la solicitud de patente US2003/0082533.

La utilizacion de la Proteina Tumoral Controlada Traslacionalmente (n° Swiss Prot P13693, tambien denominado TCTP, p23, factor liberador de histamina, HRF o Fortilina) y de la prodefensina-A5 (n° Swiss Prot Q01523) como

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marcadores en el cancer colorrectal se describe respectivamente en las solicitudes de patente US2003/0172388 y US2006/0179496. Por (pro)defensina, se entiende el precursor, a saber la prodefensina antes de la escision, el propeptido, a saber la mitad N-terminal despues de la escision de la prodefensina, y la proteina madura, a saber la defensina, que corresponde a la mitad C-terminal despues de la escision.

M2-PK es una isoenzima de piruvatoquinasa que se encuentra en forma dimerica o tetramerica. La forma dimerica es predominante en las celulas tumorales y por eso se denomina M2-PK tumoral. Numerosos estudios han utilizado el ensayo ELISA de M2-PK en las heces como marcador de cancer colorrectal, como por ejemplo Hardt et a/.64.

La utilizacion de la Calgranulina C o proteina S100 A12 como marcador del cancer colorrectal se describe en la solicitud de patente WO2007/134779.

Sagiv et a/.65 han mostrado un aumento de la expresion de CD24 en caso de cancer colorrectal.

Las proteinas del antigeno especifico de cancer de colon (CCSA)-3 y -4 son unos marcadores sericos que se asociaron al cancer colorrectal por Leman etal,66.

Finalmente, se conoce el analisis de hemoglobina humana en las heces y puede llevarse a cabo como se ha descrito anteriormente.

La concentracion del marcador tumoral diferente de la prodefensina-A6 aumentara o disminuira, segun el marcador considerado, en la muestra biologica en la que se realiza el procedimiento de la invencion con respecto a los valores de referencia determinados para los pacientes sanos.

Preferiblemente, el o los marcadores diferentes de la prodefensina-A6 se seleccionan entre: Inhibidor de Elastasa Leucocitaria, Ezrina, Aminoacilasa 1, Proteina de Union a Acidos Grasos del Higado, Proteina de Union a Acidos Grasos del Intestino, Apolipoproteina AI, Apolipoproteina AII, Plastina-I, Proteina Disulfuro Isomerasa, Intelectina-1, Citoqueratina 20, Proteina Tumoral Controlada Traslacionalmente, (Pro)defensina-A5, Galectina-3, Microglobulina Beta 2, ACE, CA19-9, TIMP-1, M2-PK y MIF.

Mas preferentemente, el o los marcadores tumorales diferentes de la prodefensina-A6 se seleccionan entre los marcadores: L-FABP, Beta 2 Microglobulina, Galectina-3, ACE, CA19-9, MIF y I-plastina.

Segun un modo de realizacion particular, el procedimiento de la invencion comprende o consiste en la deteccion de los marcadores siguientes:

- Prodefensina-A6 y L-FABP,

- Prodefensina-A6, CA19-9 y ACE,

- Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina y ACE

- Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina, CA19-9 y ACE,

- Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina, L-FABP y ACE,

- Prodefensina-A6, L-FABP, CA19-9 y ACE,

- Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina, CA19-9 y ACE,

- Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina, CA19-9, L-FABP y ACE,

- Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina, CA19-9, Galectine-3, L-FABP, MIF y ACE,

- Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina, CA19-9, Galectine-3, L-FABP, MIF, Plastina I y ACE.

Por supuesto, el procedimiento de la invencion puede tambien incluir la deteccion de cualquier otro marcador del cancer colorrectal conocido por el experto en la materia.

Como se ha indicado anteriormente, se detecta el o los marcadores tumorales de interes o bien en forma de proteina, o bien en forma de ARN mensajero, o bien por alteracion del ADN correspondiente (mutacion o modificacion de las metilaciones), entendiendose que la prodefensina-A6 se detecta solo en forma proteica, completa o en forma de fragmento de proteina.

La determinacion de la presencia, en la muestra biologica, del marcador tumoral de interes “proteina” puede llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento de determinacion de la presencia de una proteina en una muestra,

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conocido por el experto en la materia, como por ejemplo mediante un ensayo bioquimico, incluyendo un analisis inmunologico, o por espectrometria de masa.

El ensayo bioquimico puede ser cualquier ensayo ampliamente conocido por el experto en la materia, que implica unas interacciones moleculares, a saber unas reacciones entre dicho marcador tumoral y uno o mas parejas de union especificas o no de dicho marcador tumoral.

Preferentemente, el ensayo bioquimico es un analisis inmunologico conocido por el experto en la materia que implica unas reacciones inmunologicas entre el marcador tumoral que es el antigeno y una o mas parejas de union especificas que son los anticuerpos dirigidos contra este antigeno.

Las parejas de union especificas o no del o de los marcadores tumorales buscadas en el procedimiento de la invencion son cualquier pareja susceptible de unirse a este o estos marcadores. Se denominan especificos cuando son capaces de unirse a estos marcadores con una especificidad elevada, incluso una especificidad del 100%. Se denominan no especificos cuando su especificidad de union a estos marcadores es debil y que son entonces capaces de unirse a otros ligandos, tales como unas proteinas. A titulo de ejemplo, se pueden citar los anticuerpos, las fracciones de anticuerpos, los receptores y cualquier otra molecula capaz de unirse a este marcador.

Los anticuerpos parejas de union son, por ejemplo, unos anticuerpos policlonales, o bien unos anticuerpos monoclonales.

La pareja de union especifica de la prodefensina-A6 es un anticuerpo monoclonal que reconoce cualquier epitopo, lineal o conformacional, comprendido en la secuencia SEQ ID n° 2.

Segun la invencion, el procedimiento utiliza un anticuerpo monoclonal especifico de la prodefensina-A6 que reconoce el epitopo 1 de SEQ ID n° 6 (epitopo 1).

Los anticuerpos monoclonales antiprodefensina-A6 que reconocen especificamente el epitopo 1 de secuencia SEQ ID n° 6 son nuevos y constituyen otro objeto de la invencion.

Otros anticuerpos monoclonales anti-prodefensina-A6 reconocen especificamente un epitopo conformacional seleccionado entre los epitopos siguientes:

- un epitopo de al menos la secuencia SEQ ID n°7, en la que X1 es V o L, X2 es T o L, X3 es P, S o C, X4 es P o S, X5 es W o T, X6 es A, Q, M, C o E, X7 es I, E o D y Xs es F, Y, S o L, y de como mucho la secuencia SEQ ID n°8, SEQ ID n°9, sEq ID n°10, SEQ ID n°11, SeQ ID n°12, tales como se indican en la figura 4 (epitopo 2),

- un epitopo de al menos la secuencia SEQ ID n°13, en la que X1est S o T, X2 es C o ausente, X3 es T, L o E, X4 es H o R, X5est I, F o E, X6 es G o V y X7 es C o N, y de como mucho la secuencia SEQ ID n°14, SEQ ID n°15 o SEQ ID n°16, tales como se indican en la figura 4 (epitopo 3),

- un epitopo de al menos la secuencia SEQ ID n°17, en la que X1est P o W, X2 es W o E, X3 es S, A, Q o W, X4 es M, L, R o P, X5 es H, F, W o G, X6 es V o A y X7 es I o V, y de como mucho la secuencia SEQ ID n°18, SEQ ID n°19, SEQ ID n°20 o SEQ ID n°21 , tales como se indican en la figura 4 (epitopo 4),

- un epitopo de al menos la secuencia SEQ ID n°22, en la que X1est Y o N, X2 es E, D o Q, X3 es T, N, R, M o K, X4 es W, H o F y X5 es P o G, y de como mucho la secuencia SEQ ID n°23, SeQ ID n°24, SEQ ID n°25, SEQ ID n°26, SEQ ID n°27, SEQ ID n°28 o SEQ ID n°29, tales como se indican en la figura 4 (epitopo 5).

Segun un modo de realizacion, el procedimiento de la invencion utiliza un anticuerpo monoclonal especifico de un epitopo 1 de secuencia SEQ ID n° 6 y un anticuerpo monoclonal especifico de un epitopo 2, 3, 4 o 5. Preferentemente, el procedimiento de la invencion utiliza un anticuerpo monoclonal especifico de un epitopo 1 y un anticuerpo monoclonal especifico de un epitopo 2 o 4. Mas preferentemente, el procedimiento de la invencion utiliza un anticuerpo monoclonal especifico de un epitopo 1 y un anticuerpo monoclonal especifico de un epitopo 2.

Por epitopo, se entiende un peptido que tiene al menos las secuencias tales como se han definido mediante las secuencias SEQ ID n° 1 a 29, y como maximo 10, 8, 6 o 4 aminoacidos suplementarios repartidos a ambos lados de la secuencia considerada, de manera homogenea o no, o bien de un solo lado, asi como sus analogos, homologos y equivalentes estructurales.

De manera general, el termino “analogo” se refiere a unos peptidos que tienen una secuencia y una estructura polipeptidica nativa que presentan una o varias adiciones, sustituciones (generalmente conservadora en terminos de naturaleza) y/o deleciones de aminoacido, con respecto a la molecula nativa, en la medida en la que las modificaciones no destruyen la reactividad antigenica.

Los analogos particularmente preferidos incluyen las sustituciones conservadoras naturalmente, es decir las

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sustituciones que tienen lugar en una familia de aminoacidos. Especificamente, los aminoacidos se dividen generalmente en 4 familias, a saber (1) los aminoacidos tales como el aspartato y el glutamato, (2) los aminoacidos basicos tales como la lisina, la arginina y la histidina, (3) los aminoacidos no polares tales como la alanina, la leucina, la isoleucina, la prolina, la fenilalanina, la metionina y el triptofano y (4) los aminoacidos no cargados polares tales como la glicina, la asparagina, la glutamina, la cisteina, la serina, la treonina y la tirosina. La fenilalanina, el triptofano y la tirosina se clasifican a veces en aminoacidos aromaticos. Por ejemplo, se puede predecir de manera razonable que una sustitucion aislada de leucina por isoleucina o valina, de un aspartato por un glutamato, de una treonina por una serina, o una sustitucion conservadora similar de un aminoacido por otro aminoacido que tiene una relacion estructural, no tendra efecto mayor sobre la actividad biologica. El experto en la materia determinara facilmente las regiones de la molecula peptidica de interes que pueden tolerar un cambio por referencia a las graficas de Hopp/Woods y Kyte-Doolite, bien conocidos en la tecnica.

Por “homologia” se entiende el porcentaje de identidad entre dos moleculas peptidicas. Dos secuencias de aminoacidos son “sustancialmente homologas” la una con respecto a la otra cuando las secuencias presentan al menos un 60%, preferentemente al menos un 75%, mas preferentemente al menos un 80-85%, mas preferentemente al menos un 90% y mas preferentemente al menos un 95-98% o mas de identidad de secuencia sobre una longitud definida de las moleculas peptidicas.

Por “equivalente estructural” se entiende cualquier secuencia peptidica, lineal o no, incluida en la proteina de interes, que presenta la misma estructura tridimensional que el epitopo conformacional de interes, tales como los epitopos de secuencias SEQ ID n° 7 a 29, conservando al mismo tiempo la reactividad antigenica. Tal “equivalente estructural” se puede obtener facilmente por el experto en la materia a partir del epitopo conformacional de interes utilizando un sistema bioinformatico que permite encontrar similitudes de estructuras o subestructuras 3D de proteinas, tales como los sistemas SuMo67 o Superimpose68.

Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse por inmunizacion de un animal con el marcador tumoral en cuestion, seguido de la recuperacion de los anticuerpos buscados en forma purificada, por extraccion del suero de dicho animal, y separacion de dichos anticuerpos de los otros constituyentes del suero, en particular por cromatografia de afinidad sobre una columna sobre la cual se fija un antigeno especificamente reconocido por los anticuerpos, en particular dicho marcador.

Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse mediante la tecnica de los hibridomas cuyo principio general se recuerda a continuacion.

En un primer tiempo, se inmuniza un animal, generalmente un raton con el marcador tumoral de interes, cuyos linfocitos B son entonces capaces de producir unos anticuerpos contra dicho antigeno. Estos linfocitos productores de anticuerpos se fusionan despues con unas celulas mielomatosas “inmortales” (murinos en el ejemplo) para dar lugar a unos hibridomas. A partir de la mezcla heterogenea de las celulas asi obtenida se efectua entonces una seleccion de las celulas capaces de producir un anticuerpo particular y multiplicarse indefinidamente. Cada hibridoma se multiplica en forma de clon, conduciendo cada uno a la produccion de un anticuerpo monoclonal cuyas propiedades de reconocimiento frente a dicho marcador tumoral podran ensayarse por ejemplo en ELISA, por inmunotransferencia (transferencia Western) en una o dos dimensiones, en inmunofluorescencia, o con la ayuda de un biosensor. Los anticuerpos monoclonales asi seleccionados se purifican despues, en particular segun la tecnica de cromatografia de afinidad descrita anteriormente.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser tambien unos anticuerpos recombinantes obtenidos por ingenieria genetica, mediante tecnicas bien conocidas por el experto en la materia.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-defensina-A6 y estan disponibles en particular en el catalogo Aloha Diagnostic International Inc., anticuerpo policlonal de conejo anti-defensina-A6, Cat. N° HDEFA61-A. Ningun anticuerpo monoclonal dirigido contra la prodefensina-A6 esta disponible en la actualidad.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti- inhibidor de la elastasa leucocitos y estan disponibles, en particular en el catalogo Abcam, anticuerpo policlonal de conejo anti-LEI, Cat. N° Ab47731. Se ha descrito un anticuerpo monoclonal anti-LEI Clon ELA-1 en el articulo de Yasumatsu et al.68.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-ezrina y estan disponibles en particular en el catalogo Abcam, anticuerpos monoclonales anti-ezrina Clon 3C12, Cat. No. Ab4069 y anticuerpo policlonal de conejo anti-Ezrina, Cat. n2 Ab47418.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-Aminoacilasa 1 y estan disponibles en particular en el catalogo Abnova, anticuerpo monoclonal anti-Aminoacilasa 1 Clon 4F1-B7, Cat. n° H00000095-M01, y en el catalogo Abcam, anticuerpo policlonal de gallina anti-Aminoacilasa 1, Cat. n° Ab26173.

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Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-proteina de union a acidos grasos y estan disponibles en particular en el catalogo Abcam, anticuerpo monoclonal anti-L-FABP clon 6B6, Cat. n° Ab10059 y anticuerpo policlonal de conejo anti-L-FABP, Cat. n° Ab7807.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-proteina de union a acidos grasos del intestino y estan disponibles en particular en el catalogo R&D Systems, anticuerpo monoclonal anti-I-FABP clon 323701, Cat. n° MAB3078, y en el catalogo Abcam, anticuerpo policlonal de conejo anti-I-FABP, Cat. n° Ab7805.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-Apolipoproteina AI y estan disponibles en particular en el catalogo Biodesign Meridian Life Sciences, anticuerpo monoclonal anti-Apo AI clon 4A90, Cat. n° H45402M y anticuerpo policlonal de cabra anti-Apo AI, Cat. n° K45252P.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-Apolipoproteina AII y estan disponibles en particular en el catalogo US Biological, anticuerpo monoclonal anti-Apo AII clon 1402, Cat. n° A2299-31C y en el catalogo Biodesign Meridian Life Sciences anticuerpo policlonal de cabra anti-Apo AII, Cat. n° K74001P.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos policlonales anti-I-plastina y estan disponibles en particular en el catalogo Santa Cruz Biotechnology. El anticuerpo policlonal de conejo H-300 (Cat. n° sc-28531) reacciona con las Plastinas-I, L y T. La Solicitante ha desarrollado unos anticuerpos monoclonales dirigidos contra la I-plastina.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-Beta2 Microglobulina, anti-ACE, anti-CA19-9 y anti-Testosterona y se utilizan en particular en los kits de ensayo de la Solicitante, respectivamente Vidas® Beta2 Microglobulin, Vidas® ACE, Vidas® CA19-9™ y Vidas® Testosterona.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-Proteasoma 20S y estan disponibles en particular en el catalogo de Affinity Research Products.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-Galectina-3, anti-L-Lactato deshidrogenasa cadena B, anti- Calreticulina, anti-transductor 1 de la senal de calcio asociada a los tumores, anti-queratina de tipo II Citoesqueleto 8, anti-queratina de tipo I Citoesqueleto 18, anti-queratina de tipo I Citoesqueleto 19, anti-Epitelial-Cadherina, anti- Villina y anti-TIMP-1 y estan disponibles en particular en el catalogo Abcam.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-Proteina 3 alfa Derivada de los Islotes Regeneradores y se utilizan en particular en los kits de ensayo de Dynabio (La Gaude, Francia).

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-CA 242, anti-CA 50, anti-CA 72-4 y estan disponibles en particular en el catalogo Fujirebio.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-intelectina-1 y estan disponibles en particular en el catalogo Alexis Biochemicals, anticuerpo monoclonal anti-intelectina-1 Clon Saly-1, Cat. n° ALX-804-850-C100 y anticuerpo policlonal de conejo anti-intelectina-1, Cat. n° ALX-210-941.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-Citoqueratina 20 y estan disponibles en particular en el catalogo Abcam, anticuerpo monoclonal anti-Citoqueratina 20 clon Ks20.8, Cat. n° Ab962 y anticuerpo policlonal de conejo anti-Citoqueratina 20, Cat. n° Ab36756.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-TCTP y estan disponibles en particular en el catalogo Abnova, anticuerpo monoclonal anti-TCTP clon 3C7, Cat. n° 157H00007178-M01 y anticuerpo policlonal anti-TCTP, Cat. n° 157H00007178-A01.

Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-Defensina-A5 y estan disponibles en particular en el catalogo Santa Cruz Biotechnology, anticuerpo monoclonal anti-Defensina-A5 clon 8C8, Cat. n° sc-53997, y en el catalogo Alpha Diagnostic International Inc., anticuerpo policlonal de conejo anti-Defensina-A5, Cat. n° HDEFA51-A.

Las parejas de union especificas o no del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invencion pueden utilizarse como reactivo de captura, como reactivo de deteccion o como reactivo de captura o de deteccion.

Segun un modo de realizacion, la pareja de union especifica de la prodefensina-A6 se utiliza para la captura de la prodefensina-A6, lo que permite mejorar la especificidad del procedimiento de diagnostico de la invencion.

Preferentemente, el anticuerpo monoclonal que reconoce especificamente un epitopo 1 se utiliza en captura y/o el anticuerpo monoclonal que reconoce especificamente un epitopo 2, 3, 4 o 5, preferentemente 2, se utiliza en deteccion.

La visualizacion de las reacciones inmunologicas, es decir la union marcador tumoral/pareja de union, se puede

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efectuar mediante cualquier medio de deteccion, tales como unos medios directos o indirectos.

En el caso de la deteccion directa, es decir sin el intermedio de un marcado, se observan las reacciones inmunologicas, por ejemplo por resonancia plasmonica de superficie o por voltametria ciclica sobre un electrodo que lleva un polimero conductor.

La deteccion indirecta se lleva a cabo por medio de un marcado, o bien de la pareja de union de dicho reactivo de revelacion, o bien del marcador tumoral de interes en si. Se habla entonces en este ultimo caso de metodo de competicion.

Por marcado, se entiende la fijacion de un reactivo marcador capaz de generar directa o indirectamente una senal detectable. Una lista no limitativa de estos reactivos marcadores consiste en:

* las enzimas que producen una senal detectable, por ejemplo por colorimetria, fluorescencia, luminiscencia, como la paroxidasa de rabano picante, la fosfatasa alcalina, la p-galactosidasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,

* los cromoforos como los compuestos fluorescentes, luminescentes, colorantes,

* las moleculas radioactivas como el 32P, el 35S o el 125I, y

* las moleculas fluorescentes tales como las Alexa o las ficocianinas.

Se pueden utilizar tambien unos sistemas indirectos de deteccion, como por ejemplo unos ligandos capaces de reaccionar con un anti-ligando. Las parejas ligando/antiligando son bien conocidas por el experto en la materia, lo que es el caso, por ejemplo, de las parejas siguientes: biotina/estreptavidina, hapteno/anticuerpo, antigeno/anticuerpo, peptido/anticuerpo, azucara/lectina, polinucleotido/complementario del polinucleotido. En este caso, es el ligando que lleva la pareja de union. El anti-ligando puede ser detectable directamente por los reactivos marcadores descritos en el parrafo anterior o ser el mismo detectable por un ligando/anti-ligando.

Estos sistemas indirectos de deteccion pueden llevar, en algunas condiciones, a una amplificacion de la senal. Esta tecnica de amplificacion de la senal es bien conocida por el experto en la materia, y se podra hacer referencia a las solicitudes de patente anteriores FR98/10084 o WO-A-95/08000 de la solicitante o al articulo de Chevalier et a/.70.

Segun el tipo de marcador utilizado, el experto en la materia anadira unos reactivos que permiten la visualizacion del marcado.

A titulo de ejemplo de ensayos inmunologicos tales como se han definido anteriormente, se pueden citar los metodos “sandwich” tales como ELISA, IRMA y RIA, los metodos denominados de competicion y los metodos de inmunodeteccion directa como la inmunohistoquimica, la inmunocitoquimica, la transferencia Western y la transferencia de punto.

Cuando la pareja de union especifica de la prodefensina-A6 se utiliza en captura en un ensayo “sandwich”, por ejemplo el anticuerpo especifico del epitopo 1, se utilizara en deteccion o bien una pareja de union especifica de la parte madura de la prodefensina-A6 (aminoacidos 66 a 100), o bien una pareja de union que reconoce un epitopo de la parte propeptido de la prodefensina-A6 (aminoacidos 20-65) diferente de aquel reconocido por la pareja de union utilizada para la captura.

La espectrometria de masa puede tambien utilizarse para la deteccion en el fluido biologico del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invencion. El principio de la espectrometria se conoce ampliamente por el experto en la materia y se describe, por ejemplo, en Patterson71.

Para hacer esto, la muestra biologica previamente tratada o no se analiza en un espectrometro de masa y se compara el espectro obtenido con aquel del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invencion. Un ejemplo de tratamiento previo de la muestra consiste en hacerlo pasar sobre un soporte de inmunocaptura, que comprende una de las parejas de union del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invencion, por ejemplo un anticuerpo dirigido contra el o los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invencion. Otro ejemplo de tratamiento previo de la muestra puede ser el pre-fraccionamiento de la muestra biologica, a fin de separar entre si las proteinas de la muestra. En unas tecnicas bien conocidas por el experto en la materia, se puede, por ejemplo, depletar en primer lugar las proteinas mayoritarias de la muestra.

La determinacion de la presencia, en la muestra biologica, del marcador tumoral de interes “ARNm” se puede realizar mediante cualquier procedimiento de determinacion de la presencia de ARNm en una muestra, o bien la deteccion directa del ARNm, o bien la deteccion indirecta del ARNm, o cualquier otro procedimiento de determinacion de la presencia de un ARN en una muestra, conocido por el experto en la materia.

Por deteccion directa del ARNm, se entiende la puesta en evidencia del ARNm en si en la muestra biologica.

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La deteccion directa del ARNm en la muestra biologica se puede llevar a cabo mediante cualquier medio conocido por el experto en la materia, como, por ejemplo, por hibridacion con una pareja de union especffica del ARNm, llegado el caso despues de la amplificacion mediante la tecnica de PCR o NASBA.

Por hibridacion, se entiende el proceso durante el cual, en condiciones apropiadas, dos fragmentos nucleotfdicos se unen con unas uniones de hidrogenos estables y especfficos para formar un complejo bicatenario. Estas uniones de hidrogeno se forman entre las bases complementarias adenina (A) y timina (T) (o uracila (U)) (se habla de union AT) o entre las bases complementarias guanina (G) y citosina (C)(se habla entonces de union G-C). La hibridacion de dos fragmentos nucleotfdicos puede ser total (se habla entonces de fragmentos nucleotfdicos o de secuencias complementarias), es decir que el complejo bicatenario obtenido durante esta hibridacion comprende unicamente unas uniones A-T y unas uniones C-G. Esta hibridacion puede ser parcial (se habla entonces de fragmentos nucleotfdicos o de secuencias suficientemente complementarias), es decir que el complejo bicatenario obtenido comprende unas uniones A-T y unas uniones C-G que permiten formar el complejo bicatenario, pero tambien unas bases no unidas a una base complementaria. La hibridacion entre dos fragmentos nucelotfdicos depende las condiciones de realizacion utilizadas, y en particular la estringencia. La estringencia se define en particular en funcion de la composicion en bases de los dos fragmentos nucleotfdicos, asf como por el grado de desapareamiento entre dos fragmentos nucleotfdicos. La estringencia puede tambien depender de los parametros de la reaccion, tales como la concentracion y el tipo de especies ionicas presentes en la solucion de hibridacion, la naturaleza y la concentracion de agentes desnaturalizantes y/o la temperatura de hibridacion. Todos estos datos son bien conocidos y las condiciones apropiadas pueden ser determinadas por el experto en la materia. En general, segun la longitud de los fragmentos nucleotfdicos que se desea hibridar, la temperatura de hibridacion esta comprendida entre aproximadamente 20 y 70°C, en particular entre 35 y 65°C en una solucion salina a una concentracion de aproximadamente 0,5 a 1 M. Las parejas de union especfficas o no del ARNm son cualquier pareja susceptible de unirse a esta ARNm. A tftulo de ejemplo, se pueden citar las sondas nucleicas, los cebadores de amplificacion, y cualquier otra molecula capaz de unirse a este ARNm.

Por sonda de hibridacion, se entiende un fragmento nucleotfdico que comprende de 5 a 100 unidades nucleicas, en particular de 10 a 35 unidades nucleicas, que poseen una especificidad de hibridacion en condiciones determinadas para formar un complejo de hibridacion con el material especffico del gen diana de interes. La sonda de hibridacion puede comprender un marcador que permite su deteccion.

En el sentido de la presente invencion, se entiende por cebador de amplificacion, un fragmento nucleotfdico que comprende de 5 a 100 unidades nucleicas, preferiblemente de 15 a 30 unidades nucleicas que permiten el inicio de una polimerizacion enzimatica, tal como, en particular, una reaccion de amplificacion enzimatica. Por reaccion de amplificacion enzimatica, se entiende un proceso que genera multiples copias de un fragmento nucleotfdico por la accion de al menos una enzima. Tales reacciones de amplificacion son bien conocidas por el experto en la materia y se pueden citar en particular las tecnicas siguientes:

- PCR (reaccion en cadena de polimerasa), tal como se describe en las patentes US 4,683,195, US 4,683,202 y US 4,800,159,

- NASBA (Amplificacion basada en la Secuencia de Acido Nucleico) con la solicitud de patente WO 91/02818, y

- TMA (Amplificacion Mediada por la Transcripcion) con la patente US 5,399,491.

Por deteccion, se entiende un metodo ffsico, o bien un metodo qufmico con un agente colorante intercalante tal como SYBR® Green I o el bromuro de etidio, o bien un metodo de deteccion con la ayuda de un marcador. Numerosos metodos de deteccion existen para la deteccion de los acidos nucleicos72. Los marcadores apropiados son tales como se han definido anteriormente.

En el sentido de la presente invencion, la sonda de hibridacion puede ser una sonda denominada de deteccion. En este caso, la sonda denominada de deteccion esta marcada mediante un marcador tal como se ha definido anteriormente. Gracias a la presencia de este marcador, se puede detectar la presencia de una reaccion de hibridacion entre una sonda de deteccion dada y el transcrito a detectar.

La sonda de deteccion puede ser, en particular, una sonda de deteccion “balizas moleculares”73. Estas “balizas moleculares” se vuelven fluorescentes durante la hibridacion. Poseen una estructura de tipo tallo-bucle y contienen un fluoroforo y un grupo “extintor”. La fijacion de la secuencia de bucle especffica con su secuencia complementaria de acido nucleico diana provoca un desarrollo del tallo y la emision de una senal fluorescente durante la excitacion a la longitud de inda que conviene.

La sonda de hibridacion puede ser tambien una sonda denominada de captura. En esta caso, la sonda denominada de captura se inmoviliza o es inmovilizable sobre un soporte solido por cualquier medio apropiado, es decir directa o indirectamente, por ejemplo por covalencia o adsorcion. Los soportes solidos apropiados son conocidos por el experto en la materia y se pueden citar a tftulo de ejemplos los materiales de sfntesis o los materiales naturales, los

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latex, las particulas magneticas, los derivados metalicos, los geles, etc. El soporte solido puede estar en forma de una placa de microtitracion, de una membrana como se ha descrito en la solicitud WO-A-94/12670, de una particula. Se puede tambien inmovilizar sobre el soporte varias sondas de captura diferentes, estando cada una especifica de un transcrito diana. En particular, se puede utilizar como soporte un biochip sobre el cual pueden ser inmovilizadas un gran numero de sondas.

La inmovilizacion de las sondas sobre el soporte es tambien conocida por el experto en la materia y se puede citar un deposito de sondas por transferencia directa, la micro-deposicion, la sintesis in situ y la fotolitograffa.

La puesta en evidencia, en la muestra biologica, de las modificaciones o anomalias de ADN a nivel del gen que codifica el marcador tumoral de interes, se puede realizar mediante cualquier procedimiento de determinacion de las alteraciones del ADN en una muestra, a saber la deteccion directa de mutaciones, o bien la puesta en evidencia de alteraciones en el perfil de metilacion de los locus de interes, o cualquier otro procedimiento de determinacion de alteraciones del ADN en una muestra, conocido por el experto en la materia.

Las mutaciones pueden incluir unas sustituciones puntuales de un nucleotido por otro, unas deleciones de uno o varios nucleotidos y unas inserciones de uno o varios nucleotidos. Las mutaciones pueden situarse en la parte que codifica el gen del marcador tumoral de interes, o en las partes 5’ y 3’ no codificante como la region promotora o la region terminadora de transcripcion.

Las estrategias de puesta en evidencia de las mutaciones se apoyan en las tecnicas de la biologia molecular y comprenden unas etapas de extraccion de ADN, de amplificacion por PCR u otra tecnica de amplificacion, de hibridacion y/o de secuenciacion. En el caso del cancer colorrectal, se ha utilizado el procedimiento siguiente con exito para realizar la deteccion de mutacion en el ADN de las heces: concentracion del ADN por precipitacion, enriquecimiento en diana utilizando unos oligonucleotidos de captura sobre bolas magnetica, amplificacion PCR de los genes de interes, secuenciacion en fase solida para identificar las mutaciones puntuales74. Las deleciones se identificaron con respecto a la diferencia de tamano entre el fragmento de referencia esperado y el fragmento mutado. Imperiale et a/.74 han descrito un panel de 21 mutaciones situadas en los genes K-ras, APC y p53 que permite detectar 16/31 de los canceres invasivos.

Otros marcadores ADN utilizados son la deteccion BAT-26, que es un marcador de inestabilidad de los microsatelites y el ADN altamente amplificable denominado ADN (L-ADN), que no es un marcador especifico pero que parece reflejar la apoptosis desordenada de las celulas tumorales exfoliadas en el lumen colico75. Estos marcadores no son satisfactorios no con respecto a su sensibilidad, no con respecto a su especificidad.

Como se ha indicado anteriormente, las alteraciones del ADN pueden tambien corresponder a una modificacion del perfil de metilacion del gen que corresponde al marcador tumoral de interes. La modificacion del perfil de metilacion puede corresponder a una hipometilacion (disminucion del numero de metilaciones) o a una hipermetilacion (aumento del numero de metilaciones). Las unidades alteradas pueden situarse en la parte codificante del gen del marcador tumoral de interes, o en las partes 5’ y 3’ no codificante como la region promotora o la region terminadora de transcripcion.

El analisis de la metilacion del ADN se puede efectuar utilizando unas tecnicas basadas en la PCR cualitativa y/o cuantitativa como la MSP (PCR especifica de metilacion), la secuenciacion bisultifo, la digestion por una enzima de restriccion sensible a las metilaciones acoplada con la PCR, COBRA (analisis de restriccion combinado con bisulfito) et Ms-SNuPE (extension de los cebadores del nucleotido simple sensible a la metilacion). El conjunto de estas tecnicas se repaso en detalle y de manera comparada en un articulo de methodologie76.

En la bibliografia, se han detallado varios genes hipermetilados en caso de cancer colorrectal. A titulo de ejemplo, se puede citar el gen ALX4 (homeobox-4 similar a Aristaless)60, la region promotora del gen TPEF/HHP1 (proteina transmembranica que contiene el factor de crecimiento epidermico y el dominio de follistatina)77 o tambien el gen Septina-978.

Cuando, en el procedimiento de la invencion, se detecta al menos dos marcadores, estos pueden ponerse en evidencia de manera separada, por ejemplo con la ayuda de analisis de inmunoensayos diferentes, o bien de manera simultanea, en analisis multiplex.

Cuando, en el procedimiento de la invencion, se detectan dos marcadores de naturaleza diferente, por ejemplo un marcador proteico y un marcador ARNm, se pueden utilizar dos procedimientos de deteccion diferentes seleccionados entre los descritos anteriormente. Se pueden detectar tambien simultaneamente, en el mismo medio de deteccion y en las mismas condiciones de reaccion, como se describe en la solicitud de patente WO03/104490. Las etapas del procedimiento de deteccion descrito en esta solicitud de patente, que consisten en detectar simultaneamente unas reacciones de hibridacion e inmunologicas en una muestra susceptible de contener unos analitos dianas constituidos de al menos un acido nucleico y de al menos otro ligando de naturaleza diferente, consisten en:

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(i) depositar una cantidad conocida en volumen de la muestra diluida en un tampon de reaccion, sobre una superficie de captura previamente revestida de las parejas de captura de dichos analitos dianas, consistiendo dichas parejas de captura en al menos una sonda nucleica y al menos un anti-ligando,

(ii) poner a reaccionar a una temperatura comprendida entre 15°C y 60°C, y

(iii) visualizar las reacciones de hibridacion e inmunologicas asi obtenidas.

La muestra biologica puede necesitar un tratamiento particular ya que puede contener el o los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invencion como tales, o bien puede contener unas celulas tumorales circulantes que contienen los marcadores buscados en el procedimiento de la invencion y/o unas celulas tumorales circulantes que son capaces de segregar el o los marcadores buscados en el procedimiento de la invencion.

Asi, segun un modo de realizacion de la invencion, la muestra biologica se trata previamente para aislar las celulas tumorales circulantes contenidas en dicho fluido.

Por aislar las celulas tumorales circulantes, se entiende obtener una fraccion celular enriquecida en celulas tumorales circulantes.

El tratamiento de la muestra biologica para aislar las celulas tumorales circulantes se puede efectuar por clasificacion celular en un citometro de flujo, por enriquecimiento sobre Ficoll, por enriquecimiento por bolas magneticas recubiertas de anticuerpos especificos, o por cualquier otro metodo de enriquecimiento especifico conocido por el experto en la materia.

En el caso de la sangre a titulo de muestra biologica, las celulas tumorales circulantes pueden aislarse gracias a una tecnica de separacion celular sobre Ficoll asociada a una deplecion de las celulas sanguineas utilizando unos anticuerpos anti-CD45 acoplados a bolas magneticas (Dynal Biotech ASA, Noruega).

La deteccion del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invencion puede entonces efectuarse directamente a partir de celulas tumorales circulantes aisladas de la muestra biologica, por ejemplo por marcado inmunocitoquimico de las celulas con un anticuerpo anti-marcador(es) tumoral(es) buscado(s) en el procedimiento de la invencion, despues de depositar las celulas tumorales circulantes sobre una lamina por citospina. La deteccion del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invencion puede tambien efectuarse directamente en las celulas tumorales circulantes utilizando el metodo de citometria de flujo tal como se describe en Metezeau et al.79.

En estas condiciones, dichas celulas circulantes pueden tratarse en condiciones que permiten el bloqueo del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invencion en el interior de dichas celulas. Tal tratamiento se describe por ejemplo en Mathieu et al.80.

La deteccion del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invencion se realiza entonces despues de haber hecho permeable la membrana de las celulas para hacer entrar las parejas de union especifica del o de los marcadores buscados en el procedimiento de la invencion.

La deteccion directa del o de los marcadores tumorales utilizados en el procedimiento de la invencion a partir de las celulas circulantes puede tambien efectuarse con la ayuda de un procedimiento ELISPOT, por ejemplo con la ayuda del procedimiento descrito en la solicitud de patente WO03/076942 depositada por la solicitante. Este procedimiento es un procedimiento de deteccion y/o cuantificacion de celulas tumorales circulantes de una muestra biologica, las cuales son capaces de liberar o segregar in vitro uno o varios marcadores tumorales, que comprenden las etapas que consisten en:

(i) depositar una cantidad de dichas celulas en el fondo de una superficie de cultivo sobre la cual se fija al menos una pareja de union especifica de dicho o dichos marcadores tumorales,

(ii) cultivar dichas celulas en condiciones tales que liberen o segreguen dichos marcadores tumorales que se inmunocapturan en el fondo de la superficie de cultivo,

(iii) eliminar las celulas por lavado,

(iv) anadir al menos un conjugado marcado especifico de dichos marcadores tumorales.

(v) visualizar el marcado asi obtenido.

La deteccion directa del o de los marcadores tumorales utilizados en el procedimiento de la invencion en las celulas tumorales se puede efectuar tambien en el medio de cultivo de dichas celulas despues de haberlas cultivado en condiciones tales que segregan uno o mas marcadores tumorales utilizados en el procedimiento de la invencion.

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Las condiciones de cultivo para la liberacion o la expresion de los marcadores tumorales son unas condiciones clasicas tales como 37°C bajo atmosfera humeda y a 5% de CO2.

Cuando la muestra biologica es una muestra solida, la presencia del o de los marcadores tumorales puede tambien mostrarse in vivo, in situ en los tumores.

Para mostrar la presencia de un marcador tumoral dentro de un tumor in vivo, se puede utilizar cualquier metodo de procesamiento de imagenes conocido por el experto en la materia. Para ello, se puede acoplar una pareja de union de dicho marcador tumoral con un trazador de procesamiento de imagenes.

Por acoplamiento de las parejas de union a un trazador de procesamiento de imagenes, se entiende la fijacion de un trazador capaz de detectarse mediante cualquier metodo de procesamiento de imagenes conocido por el experto en la materia, y generar directa o indirectamente una senal detectable. Asi, el trazador puede ser un trazador radioactivo como el tecnecio-99. En este caso, el organo que padece cancer primitivo o metastasis fijara el marcador tumoral y su trazador. La radiacion emitida por el organo puede ser grabada por una camara especial, por ejemplo una camara gamma. El aparato recoge los centelleos generados por la sustancia radioactiva y permite asi visualizar el organo.

En otro procedimiento de la invencion, el trazador puede comprender un cuerpo radioactivo que emite unos positrones (fluor 18). Las imagenes se adquiriran por un sistema de tomografia por emision de positrones.

En otro procedimiento preferido de la invencion, la pareja del o de los marcadores tumorales puede acoplarse a nanoparticulas. A titulo de ejemplo, puede tratarse de nanoparticulas supramagneticas. Por ejemplo, unas nanoparticulas magneticas anionicas para la aplicacion al marcador celular directo y a la deteccion in vivo por procesamiento de imagenes por resonancia magnetica nuclear. Puede tambien tratarse de nanoparticulas de oro.

Gracias a los procedimientos de la invencion que permiten la deteccion del marcador tumoral in vivo, se podran visualizar las zonas del organismo en las que hubo fijacion de la pareja de union del marcador tumoral, produciendo los canceres un marcador tumoral, y en particular el cancer colorrectal, asi como las localizaciones de sus metastasis a distancia y las afecciones ganglionares.

El procedimiento de la invencion se puede utilizar tanto para el diagnostico precoz, como para la deteccion, el seguimiento terapeutico, el pronostico y el diagnostico de las recaidas en el ambito del cancer colorrectal ya que solo las celulas cancerosas segregan prodefensina-A6 y que esta produccion depende del grado del cancer, lo que constituye otro objeto de la invencion.

La invencion se entendera mejor con la ayuda de los ejemplos siguientes, dados a titulo ilustrativo y no limitativo, asi como con la ayuda de las figuras 1 a 6 anexas, en las que:

- la figura 1 representa la comparacion mediante la tecnica de transferencia western de los 9 anticuerpos monoclonales anti-prodefensina-A6. Los graficos muestran las senales que corresponden al volumen de la banda (en intensidad*mm2) para el peptido prodefensina-A6 (SEQ ID n° 1, 7 ng/pocillo) (figura 1A) y para la proteina prodefensina-A6 segregada en los sobrenadantes de cultivo 293T transfectados (figura 1B). Los valores exactos de los volumenes de banda se indican en la tabla (figura 1C);

- la figura 2 representa la comparacion mediante la tecnica dla transferencia de punto de los 9 anticuerpos monoclonales anti-prodefensina-A6. Los graficos muestran las senales que corresponden al volumen medio de 2 puntos (en intensidad*mm2) para el peptido prodefensina-A6 (SEQ ID n° 1) (figura 2A) y para el propeptido prodefensina-A6 (SEQ ID n° 3) (figura 2B). Los valores exactos de los volumenes de banda se indican en la tabla (figura 2C). La relacion*100 dada en esta tabla se calcula segun la formula: senal propeptido prodefensina A6/senal peptido prodefensina-A6*100;

- la figura 3 es un grafico relativo al analisis del reconocimiento del propeptido prodefensina-A6 mediante la tecnica de ELISA indirecta. Los valores exactos de la senal ELISA en unidad de absorbencia se indican en la tabla al lado del grafico;

- la figura 4 recapitula las secuencias reconocidas para cada uno de los anticuerpos anti-prodefensina-A6 1H8C9, 11B2D2, 11E8C9, 13E7F3. La secuencia en aminoacidos de cada unidad llevada por banco de fago y que se fija sobre el anticuerpo estudiado se da en la casilla “unidades inmunorreactivas”. Para cada anticuerpo, estas unidades inmunorreactivas se alinean a fin de determinar la secuencia de consenso que se indica en negrita;

- la figura 5 representa el analisis de la reactividad por ELISA sandwich de los 5 anticuerpos monoclonales anti- prodefensina-A6 dirigidos contra el epitopo 1 con el anticuerpo de deteccion 1H8C9. El antigeno utilizado es el sobrenadante de cultivo 293T transfectado que contiene la prodefensina-A6 segregada. Este sobrenadante se ha diluido al 1/100 o 1/200. Los valores exactos de la senal ELISA en RFV se indican en la tabla al lado del grafico;

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- la figura 6 es un grafico relativo al ensayo por ELISA de la prodefensina-A6, en pg/ml, en el suero de pacientes que presentan un adenocarcinoma colorrectal (CCR+), de sujetos sanos (CCR-), de pacientes que tienen una enfermedad digestiva inflamatoria (MDI) y de pacientes que presentan un adenoma colorrectal;

- la figura 7 representa la optimizacion del fraccionamiento SPE sobre cartuchos MCX para el peptido EPLQAEDDPLQAK (SEQ ID n°30) de la Prodefensina A6. Los graficos representan el area del pico que corresponde a la transicion 727/556 del peptido en funcion del pH del tampon utilizado para efectuar el fraccionamiento sobre cartucho MCX. Figura 7A: prodefensina-A6 puesta en solucion en agua; Figura 7B: prodefensina-A6 puesta en solucion en un suero humano de sujetos sanos.

Ejemplo 1: Clonacion de los genes que codifican los marcadores tumorales y expresion de las protei'nas recombinantes

Para los marcadores tumorales Aminoacilasa-1, LEI, L-FABP, Ezrina, I-plastina, Gal-3, Villina, I-FABP y Calreticulina, la amplificacion de ADNc y clonacion, la construccion de los vectores de expresion, asi como la expresion y la purificacion de las proteinas recombinantes se han descrito en detalle en la solicitud de patente WO2009/024691.

1. Expresion de la proteina Prodefensina-A6 en celulas humanas por transfeccion

Se ha comprado un vector de expresion que contiene elADNc del gen Prodefensina A6 (pCMV6-XL5 DEFA6) de la compania Origene (Cat. No SC303095). Este vector permite expresar la proteina Prodefensina-A6 bajo el control del promotor CMV despues de la introduccion en unas celulas de mamiferos.

Las celulas humanas de rinon embrionario HEK 293T se mantuvieron en cultivo en un medio DMEM que contiene un 10% SVF, a 37°C con un 5% de CO2. Las alfombras celulares entre el 50% y el 70% de confluencia se transfectaron con el plasmido de expresion pCMV6-XL5 DEFA6 utilizando uno de los dos reactivos de transfeccion siguientes: la Lipofectamina LTX comercializada por Invitrogen (Cat n° 15338-100) o TransIT LT-1 (Cat n° MIR2300) comercializada por Euromedex. En los 2 casos, las transfecciones se realizaron segun el modo de realizacion proporcionado por los fabricantes del reactivo. Despues de la transfeccion, los cultivos se incubaron durante 48h para permitir la produccion de la proteina Prodefensina-A6. Despues, el sobrenadante de cultivo se recoge, se centrifuga y despues se filtra para quitar los restos celulares. La proteina Prodefensina segregada en el sobrenadante de cultivo ha sufrido todas las modificaciones post-traduccionales necesarias para su repliegue, es nativa. Es este sobrenadante que se ha utilizado como fuente de proteina Prodefensina-A6 durante el cribado de los anticuerpos monoclonales anti-Prodefensina-A6 y durante la caracterizacion de estos anticuerpos.

2. Sintesis quimica de peptidos

Tres peptidos que corresponden a diferentes partes de la proteina Prodefensina-A6 se obtuvieron por sintesis quimica segun los procedimientos bien conocidos por el experto en la materia (NeoMPS). El peptido cuya secuencia se indica en la SEQ ID 1 corresponde a la totalidad de la secuencia de la Prodefensina-A6 sin el peptido senal que se escinde durante la translocacion de la cadena polipeptidica hacia el reticulo endoplasmico. Este peptido se denomina peptido Prodefensina-A6 o precursor Prodefensina-A6. El peptido cuya secuencia se indica en la SEQ ID 2 corresponde a la totalidad de la parte propeptida del precursor Prodefensina-A6. Este peptido se denomina propeptido Prodefensina-A6 o parte propeptido de la Prodefensina-A6. El peptido cuya secuencia se indica en la SEQ ID 3 corresponde a la casi totalidad de la parte propeptido del precursor Prodefensina-A6. Cuatro aminoacidos del extremo N-terminal no se incluyen en la secuencia. Este peptido es mas facil de producir en gran cantidad que el peptido de secuencia SED ID°2 y se ha utilizado en sustitucion cuando la presencia de los cuatro aminoacidos no es critica.

SEQ ID 1 : EPLQAEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGSIRAFT CHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL

SEQ ID 2: EPLQAEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGS

SEQ ID 3: AEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGS

Ejemplo 2: Obtencion de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los marcadores tumorales

1. Modelo animal

Los experimentos de inmunizacion se realizaron en ratones BALB/c (H-2d) hembras de 6 a 8 semanas de edad en el momento de la primera inmunizacion.

2. Inmunogenos e inmunizaciones

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A fin de aumentar las respuestas inmunes obtenidas en los ratones y poder generar unos anticuerpos monoclonales, los marcadores tumorales se han producido en forma de proteinas recombinantes o de peptidos de sintesis producidos segun los modos de realizacion descritos en el ejemplo 1. La proteina LDH se ha obtenido de la compania SciPac (Cat. n° 103-133). Cuando los peptidos de sintesis se han utilizado como inmunogeno, estan acoplados sobre unas proteinas portadoras como la albumina serica bovina (BSA) o la KLH (Hemocianina de lapa californiana). Estas proteinas se mezclaron volumen por volumen con el adyuvante de Freund (Sigma), preparado en forma de emulsion agua en aceite y del cual se conoce que presenta un buen poder inmunogeno. Para cada marcador tumoral, se han inmunizado 3 ratones. Los ratones han recibido 3 dosis sucesivas de 10 gg de los inmunogenos a 0, 2 y 4 semanas. Todas las inyecciones se realizaron por via subcutanea. La primera inyeccion se realiza en mezcla con el adyuvante de Freund completo, las dos siguientes se realizan en mezcla con el adyuvante de Freund incompleto. Entre D50 y D70 despues de la primera inyeccion, las respuestas humorales se reestimularon con una inyeccion intravenosa de 100 gg de la proteina recombinante. Para la Prodefensina-A6, se han realizado dos diferentes series de inmunizacion. Un primer grupo de raton ha recibido el peptido Prodefensina A6 (SEQ ID 1) acoplado a la BSA y a la KLH (en alternancia segun las inyecciones). Un segundo grupo de raton ha recibido el propeptido Prodefensina-A6 (SEQ ID 2) acoplado con la BSA y la KLH (en alternancia segun las inyecciones). Unos anticuerpos anti-Prodefensina-A6 se obtuvieron a partir de los animales que pertenecen a cada uno de los dos grupos.

3. Seguimiento de la aparicion de la respuesta humoral

Con el fin de seguir la aparicion de los anticuerpos, se efectua regularmente sobre los ratones unas extracciones de sangre. La presencia de anticuerpos anti-marcador tumoral se ensaya utilizando un ELISA. La proteina de interes se utiliza en captura (1 gg/pocillo), despues de la saturacion se hace reaccionar con el antigeno diferentes diluciones de sueros a ensayar (incubacion a 37°C, durante 1h). Los anticuerpos especificos presentes en el suero se revelan por un anticuerpo de cabra anti-IgG de raton AffiniPure conjugado con la fosfotasa alcalina (H+L, Jackson Immunoresearch, Cat n° 115-055-146), que se une a los anticuerpos buscados (0,1 gg/pocillo).

4. Obtencion de anticuerpos monoclonales

Tres dias despues de la ultima inyeccion, para cada marcador tumoral, uno de los ratones inmunizado se sacrifica; la sangre y el bazo se extraen. Los esplenocitos obtenidos a partir del bazo se ponen en cultivo con las celulas de mieloma Sp2/0-Ag14 para que fusionen y se inmortalicen, segun el protocolo descrito por Kohler y Milstein8182. Despues de un periodo de incubacion de 12-14 dias, los sobrenadantes de los hibridomas obtenidos se han cribado para determinar la presencia de anticuerpos anti-marcador tumoral utilizando el ensayo ELISA descrito en el punto 3 de este ejemplo. Cuando unos peptidos de sintesis acoplados sobre la BSA o la KLH se han utilizado como inmunogeno, los clones dirigidos contra la BSA y la KLH se eliminan efectuando un cribado ELISA con, en captura, la BSA o la KLH no acoplada. Las colonias de hibridoma positivas se sub-clonaron dos veces segun la tecnica de la dilucion limite, bien conocida por el experto en la materia.

5. Caracterizacion de los anticuerpos monoclonales por inmunotransferencia

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra los marcadores tumorales Aminoacilasa-1, LEI, Ezrina, I-plastina, Gal-3, Calreticulina y LDH se describen en la solicitud de patente WO2009/024691.

Los anticuerpos monoclonales 1H8C9, 11B2D2, 13E7F3, 11E8C9, 6E1B4, 10C2G3, 12F3F2, 12F8E4, 12H4E1 se dirigen contra la Prodefensina-A6 y se obtuvieron realizando las tecnicas descritas en los puntos 1 a 4 de este ejemplo.

5.1. Metodologia

Los extractos de cultivo celulares de lineas 293T transfectados se preparan lisando directamente el residuo celular por 600 gl de PBS que contiene Triton X-100 0,5% y unos inhibidores de proteasas, despues tratados segun el protocolo de preparacion de muestra de los geles NuPAGE Novex (Invitrogen). Para obtener los extractos de tejido, las biopsia tumor y mucosa del paciente CLSP105 se disociaron con escalpelo, despues sufrieron 10 ciclos de extraccion en el sistema Medimachine (Becton Dickinson) utilizando unos Medicons 50 gm con 1 ml de tampon PBS, 2,5 mM EDTA, inhibidores de las proteasas (pastillas Roche complete™). Se agrupan estos 10 ml de suspension celular, complementados al 25 ml y despues centrifugados 15 min a 600g. el sobrenadante corresponde al extracto de tejido que se trata segun el protocolo de preparacion de muestra de los geles NuPAGE Novex. Se utilizan unas muestras reducidas, a una concentracion final en proteina total de 0,4 mg/ml. El volumen de deposito es de 20 gl por pocillo, sobre un gel NuPAGE Novex Bis-Tris 4-12%, tampon de migracion MES. Despues de la migracion (bajo 200V, durante 1 hora) y transferencia sobre membrana de PVDF (bajo 400 mA, durante 45 min), la calidad de la transferencia se aprecia por una coloracion con Amidoblack.

Las membranas estan saturadas por 5% de leche desnatada (Regilait) En una solucion de TNT (Tris 15 mM, NaCl 0,14M, Tween 20 0,5% pH8) a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de la saturacion, las membranas se incuban durante 1 hora con los diferentes anticuerpos a ensayar diluidos a 10 gg/ml en la solucion de saturacion.

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Despues del aclarado con TNT, las membranas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente con un conjugado anti-raton-peroxidasa de rabano picante diluido al 1:5000, (Cat n° 115-035-062, Jackson Immunoresearch) en la solucion de saturacion. Despues del aclarado, la revelacion se realiza con el kit Substrat Supersignal West Dura Extended (Cat n° 34076, Pierce) segun los datos de utilizacion recomendados. El tiempo de exposicion ha sido de 2 minutos para el experimento presentado en la figura 1 y de 100 segundo spara el experimento presentado en la tabla 1.

La senal de quimioluminescencia sobre las membranas se ha medido con el sistema de procesamiento de imagenes VersaDoc 5000 de BioRad. A partir de la imagen de la transferencia Western, los volumenes de las bandas que corresponden a los diferentes marcadores tumorales se evaluaron con el programa QuantityOne (Bio-Rad). El volumen corresponde a la intensidad de la senal de quimioluminescencia multiplicada por la superficie de la banda.

5.2. Resultados

Los resultados de Transferencia Western recapitulados en la Figura 1 y la tabla 1 dan el volumen de las bandas que corresponden al marcador tumoral de interes sobre los analisis por transferencia Western, en funcion de las diferentes muestras ensayadas. El sobrenadante de cultivo 293T transfectadas por el plasmido pCMX-XL5- Prodefensina-A6 que contiene Prodefensina-A6 segregada y el peptido Prodefensina-A6 (7 ng por pocillo) se han utilizado para evaluar la reactividad en Transferencia Western de los nueve anticuerpos anti-Prodefensina A6 (Figura 1). Todos los anticuerpos reconocen el peptido Prodefensina A6. Todos los anticuerpos, salvo el monoclonal 11E8C9, reconocen la Prodefensina-A6 segregada en el sobrenadante de cultivo en las condiciones experimentales utilizadas. Sin embargo, la intensidad de las senales obtenidas es muy dispar, mostrando que todos los anticuerpos no tienen la misma reactividad. Los resultados presentados en la tabla 1 muestran que los marcadores tumorales ensayados se expresan bien en el tejido tumoral obtenido a partir de los pacientes. La Prodefensina-A6 no se expresa por las lineas celulares de colon Caco-2 o HT-29, por esta razon estos lisados no se han incluido en los analisis.

La intensidad de la senal obtenida con un anticuerpo sobre una muestra se puede comparar con las senales obtenidas con las otras muestras e incluso el mismo anticuerpo. La tecnica utilizada permite confirmar la presencia o la ausencia del marcador en el tejido (muestra no distante) y la especificidad de los anticuerpos frente a marcadores. Esta tecnica no se ha llevado a cabo en este ejemplo en las muestras distantes ya que no permitiria concluir a la presencia o no del marcador tumoral en las muestras distantes, ni determinar si su concentracion aumentaria o disminuiria en estas. Ademas, el esquema experimental utilizado no permite comparar la reactividad de un anticuerpo a otro.

Tabla 1

Anticuerpo anti- ProDEFA6

Sobrenadante de cultivo 293T/ProDEFA6 Tejido mucosa CLSP105 Tejido tumor CLSP105

1H8C9

2475 Negativo 457

11B2D2

556 Negativo 140

13E7F3

134 Negativo Negativo

11E8C9

Negativo Negativo Negativo

6. Analisis del reconocimiento del propeptido Prodefensina A6 por los anticuerpos monoclonales por dot- blot

6.1. Metodologia

El analisis por dot-blot se ha realizado utilizando el peptido Prodefensina-A6 (SEQ ID°1, concentracion 0,1 mg/ml) y el propeptido Prodefensina A6 (SEQ ID°3, concentracion 2,38 mg/ml). Se ha depositado una gota de cada muestra por duplicado sobre unas membranas de nitrocelulosa (medio de transferencia Transblot, Bio-rad) despues se han dejado secar al aire libre.

El protocolo de revelacion inmunologico es identico a aquel descrito en el parrafo 5.1 de este ejemplo. El tiempo de exposicion utilizado para este experimento fue de 1 minuto.

6.2. Resultados

Todos los anticuerpos ensayados reconocen el peptido Prodefensina-A6 (SEQ ID°1) en dot-blot (Figura 2). El anticuerpo mas reactivo en esta tecnica es el clon 10C2G3. Los anticuerpos 6E1B4, 12F3F2, 12F8E4, 12H4E1 forman un grupo homogeneo, menos reactivo que el 10C2G3 pero mas que el grupo 1H8C9, 11B2D2, 13E7F3, 11E8C9 que es el mas heterogeneo. De hecho, las reactividades en transferencia Western y en dot-blot no correlacionan siempre: los anticuerpos 6E1B4, 12F3F2, 12F8E4, 12H4E1 tienen una reactividad similar en dot-blot mientras que las intensidades de las senales obtenidas en transferencia Western son diferentes (Figuras 1 y 2). Le

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Transferencia Western se ha realizado en condiciones desnaturalizantes, mientras que los peptidos se ven directamente sin desnaturalizacion para la transferencia de punto.

Solo los anticuerpos 6E1B4, 10C2G3, 12F3F2, 12F8E4, 12H4E1 reconocen el propeptido Prodefensina-A6 (SEQ ID°3) en dot-blot. Los anticuerpos 1H8C9, 11B2D2, 13E7F3, 11E8C9 no muestran reactividad significativa con el propeptido Prodefensina-A6 (SEQ ID°3), indica que su epitopo se situa en la parte Defensina-A6 madura del precursor Prodefensina-A6. Entre los 5 anticuerpos que reaccionan con el propeptido Prodefensina-A6 (SEQ ID°3), cuyo epitopo minimo esta contenido en esta secuencia, los clones 6E1B4, 10C2G3, 12F3F2 y 12F8E4 presentan todos el mismo pewrfil de reactividad: la relacion de las senales obtenidas (propeptido Prodefensina-A6/ peptido Prodefensina-A6* 100, Figura 2) esta entre 29 y 31 para todos estos anticuerpos. El clon 12H4E1 se distingue de estos otros anticuerpos anti-propeptido Prodefensina-A6 por que esta relacion es de 6. Reconoce el propeptido menos bien que los 4 otros anticuerpos.

7. Analisis del reconocimiento del propeptido Prodefensina-A6 por los anticuerpos monoclonales por ELISA indirecta

7.1. Metodologia

Se han recubierto unas placas de 96 pocillos (del tipo Nunc, Maxisorp) con el propeptido Prodefensina-A6 (SEQ ID°3) diluido en PBS a 2 gg por pocillo, durante una noche a temperatura ambiente. Las placas se saturan por 10% de leche en PBS-Tween 20 0,05% (PBS-T) durante 1h a 37°C. Se efectuan 3 lavados en PBS-T, se deposita sobre las placas 0,2 gg/pocillo del anticuerpo biotinilado a ensayar diluido en PBS-T 1% BSA y se incuba 1h a 37°C. Despues de 3 lavados por PBS-T, se anade estreptavidina acoplada con la peroxidasa de rabano picante (Jackson Immunoresearch Cat. n° 016-030-084, dilucion 1/20000 en PBS-T 1% BSA, 100 gl/pocillo). Despues de 1h de incubacion a 37°C y 3 lavados con PBS-T, se anade el sustrato OPT EIA (BD), 100 gl/pocillo. Al final de 20 min, cuando el desarrollo de la coloracion tiene lugar, se detiene la reaccion mediante acido sulfurico 5N y se mide la absorbancia a 450 nm. Los resultados presentados son la media de 2 mediciones, el ruido de fondo medio (0,02 unidades de densidad optica) no se ha sustraido.

7.2. Resultados

Los resultados del ensayo ELISA indirecto se presentan en la Figura 3. En las condiciones experimentales utilizadas, solo 4 anticuerpos 6E1B4, 10C2G3, 12F3F2 y 12F8E4 se fijan sobre el propeptido prodefensina-A6 absorbido en la fase solida. Los otros 5 anticuerpos, incluyendo el 12H4E1, no se fijan sobre el propeptido en este formato. Este experimento confirma los resultados de dot-blot (Figura 2) y establece definitivamente que incluso si el monoclonal 12H4E1 reconoce el propeptido prodefensina-A6, su reactividad es mucho menor en comparacion con los 4 otros monoclonales 6E1B4, 10C2G3, 12F3F2 y 12F8E4.

8. Caracterizacion de los epi'topos reconocidos por los anticuerpos monoclonales utilizando las tecnicas del Spotscan y cribado de banco de peptidos portados por unos fagos

8.1. Metodologia

La tecnica del Spotscan, adaptada de Frank y Doring78, permite sintetizar de manera simultanea un gran numero de peptidos fijados sobre membrana de celulosa. Estos peptidos reproducen la secuencia del antigeno diana en forma de peptidos de 8 a 12 aminoacidos, que se solapan de 1 a 4 restos. Estos peptidos se ponen despues en contacto con el anticuerpo a estudiar en un ensayo colorimetrico de tipo Blot, y la identificacion de los peptidos inmunoreactivos permite deducir la secuencia minima del epitopo del anticuerpo y localizarlo mas precisamente sobre el antigeno.

La sintesis se efectua sobre una membrana de celulosa que lleva uniformemente unos brazos de polietilenglicol (PEG) de una longitud de 8 a 10 unidades, que presenta una funcion NH2 libre en final de cadena. Se desarrolla del extremo C-terminal hacia el extremo N-terminal de los peptidos. Los aminoacidos tienen su funcion aminada protegida por un grupo Fmoc (9-fluoremetiloxicarbonilo), y sus cadenas laterales, susceptibles de reaccionar durante la sintesis, se protegen tambien por unos grupos tritilo, t-butilo o t-butileter. Las soluciones madres de aminoacidos se preparan a una concentracion de 0,33 M en NMP (N-metil-pirrolidona) que contiene 0,5 M de HOBt (hidroxibenzotriazol). El deposito de los aminoacidos se efectua con la ayuda del robot ASP 222 (Abimed, Langenfeld, Alemania), controlado por medio del programa AutoSpot XL. La utilizacion de este robot permite realizar simultaneamente hasta 4 membranas de 96 puntos, es decir 384 peptidos.

Para un ciclo de acoplamiento de un aminoacido, el robot deposita 0,7 gl de la solucion de aminoacido activado extemporaneamente (un volumen de solucion de diisopropil-carbodiimida 1,1 M diluido en NMP para 3 volumenes solucion-madre de aminoacido) sobre las membranas. Este deposito se repite una segunda vez, despues se aclaran las membranas en DMF (N,N-dimetilformamido). Los grupos NH2 que no han reaccionado se acetilan despues por 4 a 6 incubaciones de 10 minutos en una solucion de anhidrido acetico 10% en DMF, a fin de evitar la aparicion de peptidos abortivos o truncados. Despues de 3 lavados de 2 minutos en DMF, los grupos Fmoc que protegen la

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funcion aminada de los aminoacidos se escinden por una incubacion de 5 minutos en una solucion de piperidina 20% en DMF. Despues de 4 lavados en DMF, los puntos se colorean con la ayuda de una solucion de azul de bromofenol 1% en DMF, despues la membrana se aclara 3 veces al aire libre antes del ciclo de acoplamiento siguiente.

Este protocolo se repite para la adicion de cada nuevo aminoacido. Despues del acoplamiento del ultimo aminoacido, los peptidos se acetilan a fin de permitir el bloqueo de todos los grupos NH2 libres, impidiendo asi la adicion de otro aminoacido. Despues, las cadenas laterales de todos los peptidos se desprotegen mediante la incubacion de membranas en un bano de acido trifluoroacetico / diclorometano / triisobutilsilano (5: 5: 0,3) durante 1 hora. Las membranas se aclaran despues 4 veces en diclorometano, 3 veces en DMF y 3 veces en metanol antes de secarse al aire libre y conservadas a -20°C hasta la inmunorrevelacion.

Para inmunorrevelar los puntos con un anticuerpo monoclonal, las membranas se aclaran en primer lugar en metanol, despues se lavan en TBS (Tris-HCL 50 mM pH 8,0, NaCl 140 mM, KCl 3 mM) antes de ser incubadas durante una noche a temperatura ambiente en la solucion de saturacion (solucion concentrada 10X a base de caseina (Western Blocking reagent, Roche) diluida en TBS-Tween 20 0,05% (TBS-T) y que contiene un 5% de sacarosa). Despues de un lavado de 10 minutos en TBS-T, las membranas se incuban durante 1h30 a 37°C con el anticuerpo monoclonal diluido a 20 pg/ml en solucion de saturacion. Las membranas se lavan despues 3 veces en TBS-T, despues se incuban con el conjugado anti-raton acoplado a la fosfatasa alcalina (Jacksin Immunoresearch), diluida al 1/20008 en solucion de saturacion. Despues 2 lavados de 10 minutos en TBS-T, despues 2 lavados en CBS (acido citrico 10 mM pH 7, NaCl 140 mM, KCl 3 mM), el revelador, preparado extemporaneamente (5-bromo, 4- cloro, 3-indol, fosfato 600 pM, bromuro de azul de tiazolil tetrazolio 720 pM, y MgCl2 5 mM en CBS), se pone en contacto con la membrana durante 30 a 45 minutos en la oscuridad. Los peptidos inmunorreactivos aparecen en azul-violeta. Despues de 3 aclarados en agua destilada, las membranas se escanean y despues se conservan en agua hasta la regeneracion.

La regeneracion permite eliminar los anticuerpos y conjugarlos fijados sobre los peptidos, lo que permite asi realizar un nuevo ensayo de inmunorreactividad frente a otro anticuerpo. Las membranas sufren una serie de lavados de 10 minutos cada una: 1 lavado en agua destilada, 6 lavados en DMF, 3 lavados en tampon de regeneracion A (urea 8 M, SDS (dodecilsulfato de sodio) 35 mM, p-mercaptoetanol 0,1%), 3 lavados en tampon de regeneracion B (agua destilada / etanol / acido acetico 4: 5: 1), despues 2 lavados en metanol. Las membranas se secan despues al aire libre antes de almacenarse a -20°C.

La caracterizacion de los epitopos por cribado de bancos de peptidos portados por unos fagos se ha realizado utilizando el kit comercial PhD12 Phage Display Peptide Library Kit (Cat. n° E#8110S) de New England Biolabs, siguiendo las instrucciones proporcionadas con el kit, version 2.7 del protocolo que data de noviembre de 2007.

8.2. Resultados

La tabla 2 recapitula los epitopos reconocidos por cinco anticuerpos anti-propeptido Prodefensina-A6 cuyo epitopo se ha analizado por la tecnica del Spotscan. Todos estos anticuerpos reconocen la misma region del precursor Prodefensina-A6, situada entre les aminoacidos 25 y 30 segun la numeracion que empieza en la metionina inicial (epitopo 1). Por el contrario, la secuencia exacta reconocida por los diferentes monoclonales no es identica. Asi, el clon 10C2G3 reconoce una secuencia minima de 2 aminoacidos (DP) mientras que los clones 12H4E1 y 6E1B4 necesitan una secuencia minima de 6 aminoacidos (EDDPLQ) para fijarse. Los resultados presentados en las Figuras 2 y 3 han mostrado que es el clon 10C2G3 que permite obtener la senal mas elevada en transferencia de punto y ELlSA indirecta para el reconocimiento de los peptidos Prodefensina-A6. De manera sorprendente, el clon 12H4E1 se distingue de los otros anticuerpos dirigidos contra el epitopo 1 de la Pro-Defensina-A6 (Figuras 2 y 3) incluso si la secuencia minima reconocida es identica con el anticuerpo 6E1B4. El clon 12H4E1 reconoce mejor la secuencia EDDPLQ (SEQ ID n°6) en el contexto de la proteina precursora total (SEQ ID n°1) que en el contexto del propeptido prodefensina-A6 (SEQ ID n°3).

Tabla 2

Anticuerpo

N° epitopo Secuencia del epitopo3 (SEQ ID n°)

10C2G3

1 DP (27-28) (SEQ ID n°4)

12F3F2

1 DPL (27-29) (SEQ ID n°5)

12F8E4

1 DPL (27-29) (SEQ ID n°5)

12H4E1

1 EDDPLQ (25-30) (SEQ ID n°6)

6E1B4

1 EDDPLQ (25-30) (SEQ ID n°6)

aSecuencia en aminoacido de la region de fijacion de la Prodefensina-A6 al anticuerpo ensayado. Los numeros entre parentesis corresponden a la posicion del epitopo sobre la secuencia en aminoacidos de la Prodefensina A6, empezando la numeracion en la metionina inicial.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Los epitopos reconocidos por los anticuerpos 1H8C9, 11B2C2, 13E7F3 y 11E8C9 no se han podido determinar mediante la tecnica del Spotscan, lo que indica que no son lineales. El cribado de los bancos de peptidos portados por unos fagos ha permitido seleccionar 5, 3, 7 y 4 mimotopos (secuencia lineal que mimetiza un epitopo) que reaccionan respectivamente con los anticuerpos 1H8C9, 11B2C2, 11E8C9 y 13E7F3. Las secuencias de estos mimotopos se presentan en la Figura 4. Para cada anticuerpo las secuencias de los mimotopos reconocidos o inmunorreactivos se alinearon a fin de determinar una secuencia de consenso que se indica en negrita en la Figura 4, que representa la secuencia minima reconocida por el anticuerpo. No ha sido posible encontrar una sola de estas secuencias de consenso en la estructura primaria (o secuencia peptidica) de la Prodefensina-A6. Asi, estas secuencias de consenso corresponden a unos restos dispersos en la estructura primaria de la proteina pero que comparten una proximidad en su estructura tridimensional a fin de formar un epitopo conformacional.

9. Deteccion de la Prodefensina-A6 por ELISA sandwich

9.1. Metodologia

La Prodefensina-A6 se ha detectado en inmunoensayo de tipo sandwich utilizando par ejemplo el automata de ELISA Vidas® (bioMerieux). Este tipo de ensayo puede tambien realizarse en microplaca, de manera automatizada o manual. Para ello, el ensayo ELISA se ha construido utilizando los reactivos del kit Vidas® HBs Ag Ultra (bioMerieux, Cat. n° 30315). Los reactivos se han utilizado tales como se describen en el prospecto correspondiente (ref. 11728 D - FR - 2005/05), modificada asi:

1. Se han sensibilizado unos conos con los 9 anticuerpos de captura a ensayar a una concentracion de 10 gg/ml.

2. El contenido del segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra se ha sustituido por 300 gl de anticuerpo de revelacion a ensayar (1H8C9 y 11E8C9) acoplados con biotina, diluidos a 1 gg/ml en el tampon (sin suero de cabra) del segundo pocillo del kit Vidas® HBs Ag Ultra.

3. El sobrenadante de cultivo 293T transfectadas por el plasmido pCMX-XL5-Prodefensina A6 que contiene la Prodefensina-A6 segregada se anade puro o diluido en PBS directamente en el segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra (50 gl).

4. La reaccion ELISA se ha realizado con la ayuda del automata Vidas® y del protocolo HBsAg ULTRA cuya etapa de incubacion de la muestra con los anticuerpos de captura y de revelacion se habia llevado a 100 ciclos.

5. Los resultados se han obtenido en forma de valores brutos. La senal esta en RFV, valor de fluorescencia relativa.

9.2. Resultados

La tabla 3 recapitula la reactividad de las diferentes combinaciones de anticuerpo sobre una dilucion al / del sobrenadante de cultivo 293T transfectadas por el plasmido pCMX-XL5-Prodefensina-A6 y que contiene la proteina Prodefensina-A6 nativa.

Tabla 3a _____________________________________________________________________________

Anticuerpo de captura _________Anticuerpo de deteccion biotinilado_________

1H8C9 11E8C9

1H8C9 (epitopo 2)

- 43

11B2D2 (epitopo 3)

955* 11

13E7F3 (epitopo 5)

1088* 2881

11 E8C9 (epitopo 4)

4015* -

6E1B4 (epitopo 1)

11646 3407

10C2G3 (epitopo 1)

11583 7420

12F3F2 (epitopo 1)

11481 6440

12F8E4 (epitopo 1)

11436 3064

12H4E1 (epitopo 1)

11868 11037

aSenal en inmunoensayo sandwich VIDAS, en RFV (unidad relativa de fluorescencia). *: senal para sobrenadante determinado puro. Los otros sobrenadantes se diluyeron a la mitad._____

Los resultados presentados en la tabla 3 muestran que es posible detectar la Prodefensina-A6 utilizando unas ELISA sandwich basadas en diferentes combinaciones de epitopos: par ejemplo epitopos n° 5 y 4, epitopos n° 1 y 4, o tambien de manera preferida una combinacion del epitopo 2, con cualquiera de los otros epitopos identificados (1,3, 4, 5). De manera aun mas preferida, el epitopo 2 se utiliza en deteccion. Por el contrario, las combinaciones de los epitopos n° 2 y 4 o tambien n° 3 y 4 no permiten detectar la Prodefensina-A6.

Un analisis mas fino de la reactividad de los anticuerpos dirigidos contra el epitopo 1, utilizados en captura, y combinados con el clon 1H8C9 se presenta en la figura 5. El clon 12H4E1 es el mejor anticuerpo de captura, en segunda posicion estan los clones 10C2G3 y 12F3F2. Las senales menos elevadas se obtienen con los anticuerpos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

6E1B4 y 12F8E4. Este resultado es muy sorprendente, ya que los clones 6E1B4 y 12H4E1 reconocen la misma secuencia minima.

Ejemplo 3: Evaluaciones sericas de los marcadores tumorales

1. Pacientes y extracciones

La recogida de las muestras de sangre se realiza a nivel de una red de 8 centros clinicos repartidos en toda Francia, en el ambito de 2 protocolos de la ley de Huriet.

Para la obtencion de suero, la extraccion sanguinea se realiza sobre tubo seco. Para la obtencion del plasma, la extraccion sanguinea se realiza sobre tubo EDTA. Despues de la coagulacion, el tubo se centrifuga 10 min a 1000 g, se extrae el suero, se alicuota y se conserva a -80°C. El tubo de plasma se centrifuga directamente 10 min a 1000 g, se extrae el plasma, se alicuota y se conserva a -80°C. Las muestras se documentan perfectamente para el historial clinico de los pacientes.

2. Analisis serico del marcador tumoral ProDefensine-A6

La proteina precursora ProDefensine-A6 se ha evaluado con la ayuda de unos anticuerpos descritos en detalle en el ejemplo 2 y de un ensayo ELISA que utiliza el automata Vidas® (bioMerieux). Para ello, el ensayo ELISA se ha construido utilizando los reactivos del kit Vidas® HBs Ag Ultra (bioMerieux, Cat. n° 30315). Se utilizaron los reactivos tales como se describen en el prospecto correspondiente (ref. 11728 D - FR - 2005/05), con las modificaciones siguientes:

1. Los conos se sensibilizaron con el anticuerpo de captura 12H4E1 a una concentracion de 15 gg/ml.

2. El contenido del segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra se ha sustituido por 300 gl de anticuerpo de revelacion 1H8C9, acoplado a la biotina, diluido al 1 gg/ml en el tampon (sin suero de cabra) del segundo pocillo del kit Vidas® HBs Ag Ultra.

3. Las muestras de suero o de plasma (50gl) se diluyeron directamente en el segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra.

4. La reaccion ELISA se ha realizado con la ayuda del automata Vidas® y del protocolo HBS AG ULTRA cuya etapa de incubacion de la muestra con los anticuerpos de captura y de revelacion se habia llevado a 100 ciclos.

5. Los resultados se han obtenido en forma de valores brutos despues de la sustraccion del ruido de fondo (lectura del sustrato antes de la reaccion). Se ha establecido una curva patron analizando una gama de concentraciones del peptido sintetico Prodefensina A6 (SEQ ID°1). La curva patron se ha trazado detallando en las abscisas la concentracion del marcador tumoral y en las ordenadas la senal leida por Vidas® (RFV o Valor de Fluorescencia Relativa). La concentracion del marcador tumoral presente en el fluido corporal a analizar (sangre, suero, plasma) se ha calculado detallando la concentracion que corresponde a la senal RFV leida por Vidas®.

Los resultados del analisis de Prodefensina-A6 serica en los pacientes por ELISA sobre el automata Vidas se dan en la tabla 4. Las concentraciones sericas de Prodefensina-A6 se situan entre 0 y 10 pg/ml en los pacientes que tienen un adenocarcinoma colorrectal (CCR+) y entre 0 y 2 pg/ml en los sujetos sanos (CCR-), lo que necesita un ensayo ELISA extremadamente sensible para poder realizar la invencion en un fluido biologico o muestra distante. Los unicos ensayos ELISA de la Prodefensina-A6 que permiten alcanzar un limite de deteccion tan baja se basan en la combinacion de los anticuerpos que reconocen los epitopos 1 y 4. Es preferible capturar la Prodefensina-A6 por el epitopo 1. La combinacion que da el analisis mas sensible es la que se ha utilizado aqui con el anticuerpo 12H4E1 en captura y el anticuerpo 1H8C9 en deteccion.

Tabla 4

Patologi'aa

Identificador del paciente Fase TNMb Edad Sexo Prodefensina A6 (pg/ml)

MDI

CLSP046 43 Varon 0,40

MDI

CLSP049 30 Mujer 1,11

MDI

CLSP051 47 Muier 0,61

MDI

CLSP056 23 Muier 2,16

MDI

CLSP065 41 Mujer 1,60

MDI

CLSP084 34 Mujer 0,10

MDI

CLSP134 59 Varon 0,77

MDI

CLSP135 47 Muier 0,44

MDI

CLSP137 35 Mujer 0,23

MDI

CLSP151 55 Varon 0,44

MDI

CLSP152 36 Varon 4,06

CCR +

CBSE011 0 TisN0M0 76 Varon 1,91

CCR +

CLSP059 0 TisN0M0 72 Varon 0,49

CCR +

CLSP104 0 TisN0M0 48 Varon 0,41

CCR +

CBSE001 I T1N0M0 69 Muier 1,44

CCR +

CBSE016 I T1N0M0 74 Varon 2,19

CCR +

CBSE022 I T1N0M0 78 Varon 0,29

CCR +

CBSE025 I T2N0M0 81 Muier 1,45

CCR +

CLSP047 I T1N0M0 76 Mujer 0,59

CCR +

CLSP062 I T2N0M0 83 Varon 0,56

CCR +

CLSP067 I T2N0M0 61 Varon 0,45

CCR +

CLSP080 I T2N0M0 74 Muier 1,29

CCR +

CLSP085 I T2N0M0 74 Mujer 3,26

CCR +

CLSP086 I T2N0M0 61 Varon 0,23

CCR +

CLSP093 I T2N0M0 71 Varon 0,39

CCR +

CLSP100 I T3N0M0 53 Varon 0,41

CCR +

CLSP118 I T2N0M0 60 Muier 0,76

CCR +

CLSP145 I T1N0M0 71 Varon 1,38

CCR +

CLSP146 I T2N0M0 55 Muier 0,24

CCR +

CLSP150 I T2N0M0 61 Varon 0,24

CCR +

CBSE004 II T3N0M0 85 Varon 0,07

CCR +

CBSE017 II T3N0M0 74 Varon 1,00

CCR +

CBSE018 II T4N0M0 82 Varon 0,26

CCR +

CLSP043 II T3N0M0 75 Varon 1,25

CCR +

CLSP060 II T4N0M0 84 Varon 1,26

CCR +

CLSP069 II T3N0M0 46 Varon 1,07

CCR +

CLSP075 II T3N0M0 65 Varon 1,20

CCR +

CLSP087 II T3N0M0 75 Varon 1,52

CCR +

CLSP088 II T3N0M0 88 Muier 0,72

CCR +

CLSP096 II T3N0M0 79 Muier 0,40

CCR +

CLSP105 II T3N0M0 73 Varon 1,61

CCR +

CLSP107 II T3N0M0 79 Varon 0,38

CCR +

CLSP110 II T3N0M0 67 Muier 0,39

CCR +

CLSP113 II T3N0M0 50 Varon 0,69

CCR +

CLSP115 II T3N0M0 65 Muier 3,62

CCR +

CLSP117 II T3N0M0 78 Muier 1,62

CCR +

CLSP119 II T3N0M0 78 Varon 0,80

CCR +

CLSP122 II T3N0MX 54 Varon 0,81

CCR +

CLSP133 II T3N0M0 78 Muier 0,83

CCR +

CLSP136 II T3N0M0 67 Muier 0,22

CCR +

CLSP143 II T3N0M0 76 Muier 1,25

CCR +

CLSP147 II T3N0M0 83 Varon 0,77

CCR +

CLSP154 II T3N0M0 76 Muier 0,86

CCR +

CLSP157 II T3N0 45 Muier 0,42

CCR +

GHBD020 II T3N0M0 75 Varon 1,01

CCR +

GHBD023 II T3N0M0 57 Varon 0,23

CCR +

GHBD025 II T3N0M0 73 Varon 0,73

CCR +

GHBD029 II T3N0M0 75 Muier 2,22

CCR +

CBSE005 III T3N1 M0 73 Varon 4,27

CCR +

CBSE006 III T3N1 M0 84 Varon 9,24

CCR +

CBSE007 III T3N1 M0 77 Muier 2,02

CCR +

CBSE010 III T4N2M0 67 Varon 9,17

CCR +

CBSE013 III T3N1 M0 82 Varon 4,50

CCR +

CBSE023 III T4N2M0 76 Varon 2,04

CCR +

CLSP044 III T3N1M0 80 Varon 0,47

CCR +

CLSP050 III T2N1M0 88 Muier 2,18

CCR +

CLSP072 III T3N1M0 79 Varon 2,17

CCR +

CLSP073 III T2N1M0 77 Varon 1,59

CCR +

CLSP074 III T3N2M0 79 Muier 0,64

CCR +

CLSP089 III T4N2M0 84 Muier 0,81

CCR +

CLSP090 III T1N1M0 65 Muier 1,47

CCR +

CLSP091 III T3N1M0 55 Varon 0,29

CCR +

CLSP094 III T3N1M0 72 Varon 0,47

CCR +

CLSP097 III T3N1M0 71 Muier 0,74

CCR +

CLSP098 III T3N2M0 61 Varon 0,69

CCR +

CLSP103 III T2N1 MX 60 Varon 0,40

CCR +

CLSP106 III T4N2M0 85 Muier 1,90

CCR +

CLSP121 III T3N2M0 76 Varon 0,49

CCR +

CLSP123 III T4N1 MX 68 Varon 1,81

CCR +

CLSP138 III T3N1 MX 78 Varon 1,03

CCR +

CLSP141 III T3N1M0 70 Varon 1,21

CCR +

CLSP144 III T3N1M0 52 Mujer 0,93

CCR +

CLSP153 III T3N2MX 85 Varon 5,09

CCR +

GHBD019 III T3N1M0 74 Varon 0,92

CCR +

CBSE012 IV T4N3M1 37 Muier 0,50

CCR +

CBSE019 IV T3N2M1 58 Varon 1,52

CCR +

CBSE026 IV T4N1M1 72 Varon 0,61

CCR +

CBSE027 IV T4N2M1 78 Muier 1,04

CCR +

CLSP042 IV T3N2M1 56 Varon 1,39

CCR +

CLSP057 IV T3N2M1 61 Muier 0,27

CCR +

CLSP068 IV TXNXM1 60 Mujer 1,29

CCR +

CLSP079 IV T3N0M1 81 Muier 0,81

CCR +

CLSP083 IV T3N1 M1 67 Muier 0,79

CCR +

CLSP095 IV T3N1 M1 64 Varon 0,65

CCR +

CLSP109 IV T3N1 M1 60 Varon 0,88

CCR +

CLSP132 IV T3N1 M1 62 Varon 2,80

CCR +

CLSP156 IV T4N0M1 59 Varon 1,25

CCR +

CLSP159 IV T3N0M1 68 Muier 0,89

CCR +

CLSP160 IV TXNXM1 70 Varon 2,77

CCR +

CLSP161 IV T3N2M1 78 Muier 0,64

Adenoma

CLSP055 73 Varon 0,55

Adenoma

CLSP058 55 Muier 0,58

Adenoma

CLSP061 61 Muier 0,62

Adenoma

CLSP099 T0N0M0 62 Varon 0,13

Adenoma

CLSP116 63 Varon 0,66

Adenoma

CLSP120 56 Muier 0,30

Adenoma

CLSP142 T0 21 Varon 1,77

Adenoma

CLSP148 TisN0M0 50 Muier 1,07

Adenoma

CLSP149 T1N0M0 50 Muier 1,69

CCR -

N00656 47 Muier 0,22

CCR -

N006615 43 Muier 0,45

CCR -

N00664- 44 Varon 0,13

CCR -

N006658 48 Varon 0,46

CCR -

N009901 52 Varon 0,65

CCR -

N011147 50 Varon 0,87

CCR -

N011155 51 Varon 0,61

CCR -

N011243 52 Varon 0,33

CCR -

N017218 44 Muier 0,49

CCR -

N017234 37 Varon 0,47

CCR -

N017250 48 Muier 0,48

CCR -

N017269 40 Varon 0,82

CCR -

N017365 44 Muier 0,54

CCR -

N017402 25 Varon 0,65

CCR -

N017410 37 Varon 0,53

CCR -

N018552 42 Varon 0,33

CCR -

N041082 58 Varon 1,16

CCR -

N041138 58 Varon 0,97

CCR -

N044703 54 Varon 0,37

CCR -

N045730 50 Varon 0,57

CCR -

N14397- 58 Varon 0,71

CCR -

N143988 62 Varon 0,49

CCR -

N144358 61 Muier 0,67

CCR -

N146601 57 Varon 0,81

CCR -

N14661- 61 Muier 1,14

CCR -

N146695 52 Varon 0,91

CCR -

N14813- 57 Varon 0,72

CCR -

N148279 55 Varon 1,04

CCR -

N148340 51 Varon 1,05

CCR -

N314164 48 Varon 1,00

CCR -

N318050 56 Varon 0,64

CCR -

N318077 56 Varon 1,02

CCR -

N318368 60 Varon 0,50

CCR -

N318384 58 Muier 0,69

CCR -

N318421 60 Muier 0,64

CCR -

N325015 42 Varon 0,44

CCR -

N329630 59 Mujer 0,39

CCR -

N370529 57 Varon 0,40

CCR -

N376461 58 Varon 0,26

CCR -

N376488 63 Mujer 0,22

CCR -

N37663- 62 Varon 0,40

CCR -

N376760 58 Muier 0,57

CCR -

N376912 64 Muier 0,57

CCR -

N418599 56 Muier 0,23

CCR -

N418687 28 Mujer 0,19

CCR -

N418716 53 Muier 0,65

CCR -

N418740 54 Varon 0,75

CCR -

N418759 49 Muier 0,84

CCR -

N418804 54 Muier 0,24

CCR -

N440216 60 Muier 0,40

CCR -

N440478 60 Muier 0,49

CCR -

N440507 64 Varon 1,02

CCR -

N469775 36 Varon 0,47

CCR -

N491028 50 Varon 0,59

CCR -

N491191 52 Muier 1,16

CCR -

N491247 58 Varon 0,35

CCR -

N491386 58 Varon 0,71

CCR -

N491685 56 Varon 0,52

CCR -

N511463 52 Muier 0,46

CCR -

N511471 59 Muier 0,68

CCR -

N511498 55 Muier 0,58

CCR -

N518059 0 Varon 0,69

CCR -

N518518 58 Muier 0,78

CCR -

N518542 60 Varon 0,81

CCR -

N519086 59 Varon 0,80

CCR -

N527135 56 Muier 0,39

CCR -

N527450 56 Muier 0,38

CCR -

N557699 55 Varon 1,40

CCR -

N557701 57 Varon 1,66

CCR -

N557736 56 Varon 0,41

CCR -

N557760 60 Varon 1,68

CCR -

N593116 52 Muier 0,29

CCR -

N593167 53 Varon 1,12

CCR -

N593183 52 Muier 0,25

CCR -

N593255 51 Varon 1,88

CCR -

N593351 57 Varon 1,34

CCR -

N744056 51 Varon 0,61

CCR -

N748022 50 Muier 0,33

CCR -

N835966 45 Varon 0,62

CCR -

N836299 52 Muier 1,13

CCR -

N857704 52 Muier 0,29

CCR -

N858037 63 Muier 1,15

CCR -

N858248 62 Varon 1,72

CCR -

N862239 53 Varon 0,24

CCR -

N862298 63 Varon 0,42

CCR -

N862300 51 Varon 1,81

a: MDI = Enfermedades digestivas inflamatorias (Crohn y Rectocolito hemorragico) CCR+ = pacientes que padecen cancer colorrectal (Adenocarcinoma), CCR- = sujetos sanos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

b: TNM: fase de invasion tisular (T), ganglionar (nodos linf., N) y a distancia (metastasis, M)

los analisis obtenidos para los pacientes analizados se detallan en la Figura 6. Cabe senalar en esta figura y en la tabla 4 que 2, 2, 10 y 2 pacientes que padecen cancer colorrectal respectivamente de fase I, II, III o IV muestran un claro aumento de su dosis de Prodefensina-A6 serica, estrictamente superior al valor mas elevado observado en el grupo de los sujetos sanos (1,88 pg/ml). En el grupo Adenoma, ninguna dosis observada supera este valor, mientras que en el grupo MDI, hay 2.

Ejemplo 4: Utilizacion de las dosis sericas de los marcadores tumorales en combinacion

La Solicitante ha mostrado en el ejemplo 3 que unas dosis anormalmente elevadas de proteina precursora Prodefensina-A6 podian observarse en la circulacion sanguinea de algunos pacientes que padecen cancer colorrectal. Por otro lado, la Solicitante ha mostrado en las solicitudes de patente WO2009/024691, WO2009019365, WO2009019368, WO2009019369, WO2009019366, WO2009019370, WO2009019367 que unas dosis

anormalmente elevadas o anormalmente disminuidas de otros marcadores tumorales como LEI, Ezrina, Aminoacilasa-1, L-FABP, Apo A1, Apo A2, Plastina I, Beta2 Microglobulina, ACE, CA19-9, Testosterona, Galectina- 3, LDH-B, Proteasoma 20S, E-Caderina, Proteina 3 alfa Derivada de Islotes Regeneradores, denominado de otra manera Proteina Asociada a Pancreatitis (PAP1) podian observarse en la circulacion sanguinea de algunos pacientes que padecen cancer colorrectal. Los procedimientos de analisis de estos marcadores tumorales se han descrito en las solicitudes de patentes antes citadas. El procedimiento de analisis de MIF se realizo con el kit ELISA human MIF Quantikine de R&D Systems (Cat n° DMF00) segun las instrucciones del fabricante.

De manera sorprendente, el aumento o la disminucion de la dosis sanguinea de dos marcadores dados no se observa sistematicamente en los mismos pacientes. De este modo, la combinacion de varios marcadores tumorales permite aumentar el numero de pacientes identificados como que tienen cancer colorrectal. Es asi que un paciente A puede presentar un aumento o una disminucion de uno o varios marcadores tumorales (grupo X), pudiendo dichos marcadores del grupo X ser normales en un paciente B; en este mismo paciente B uno u otros varios marcadores tumorales (grupo Y) pueden elevarse o disminuirse, pudiendo dichos marcadores del grupo Y ser normales en el paciente A.

Los diferentes marcadores tumorales analizados por el Solicitante pueden combinarse asi mediante diversos algoritmos matematicos bien conocidos por el experto en la materia. A titulo ilustrativo, y sin que este ejemplo tenga un caracter exhaustivo, se ha realizado el procedimiento siguiente:

1. Se ha fijado un valor umbral para cada marcador tumoral.

2. Cuando la dosis sanguinea del marcador tumoral aumentaba en caso de cancer colorrectal, la dosis sanguinea obtenida para un paciente dado se dividio por su valor umbral. Cuando la dosis sanguinea del marcador tumoral disminuia en caso de cancer colorrectal, la dosis sanguinea obtenida para un paciente dado se invertia y despues se multiplicaba por su valor umbral.

3. Cuando la relacion dosis sanguinea dividida por el valor umbral era superior a 1, la relacion se multiplicaba por un coeficiente, por ejemplo 10. El valor asi obtenido se bautizo “resultado” para el paciente estudiado del marcador tumoral considerado.

4. Los resultados obtenidos para diferentes marcadores tumorales se anadieron en ponderandolos de un factor propio de cada marcador. En el caso del ejemplo a continuacion, todos los factores de ponderacion se han fijado a 1.

5. La suma de los resultados se ha dividido por el numero total de resultados sumados y el valor asi obtenido se ha bautizado “resultado total”.

6. El paciente se diagnostica como que tiene cancer colorrectal cuando su resultado total aumentaba con respecto a un resultado umbral.

Los resultados totales para una seleccion de 2, 3, 4, 5, 7 y 8 marcadores que comprenden la Prodefensina-A6 se dan en la tabla 5.

La asociacion de los marcadores tumorales Prodefensina-A6 y ACE permite asi obtener, para el mismo grupo de 78 pacientes unos resultados “2a” aumentados en 41 pacientes que padecen adenocarcinoma colorrectal mientras que el unico analisis de Prodefensina-A6 y de ACE aumentaba respectivamente en 17 y 28 pacientes solamente.

La asociacion de los marcadores tumorales Prodefensina-A6 y CA19-9 permite asi obtener, para el mismo grupo de 78 pacientes unos resultados “2b” aumentados en 28 pacientes que padecen adenocarcinoma colorrectal mientras que el unico analisis de Prodefensina-A6 y de ACE aumentaba respectivamente en 17 y 15 pacientes solamente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La asociacion de los marcadores tumorales Prodefensina-A6 y Beta-2 Microglobulina permite asi obtener, para el mismo grupo de 78 pacientes unos resultados “2c” aumentados en 49 pacientes que padecen adenocarcinoma colorrectal mientras que el unico analisis de Prodefensina-A6 y de Beta-2 Microglobulina aumentaba respectivamente en 17 y 43 pacientes solamente.

La asociacion de los marcadores tumorales Prodefensina-A6 y L-FABP permite asi obtener, para el mismo grupo de 78 pacientes unos resultados “2d” aumentados en 41 pacientes que padecen adenocarcinoma colorrectal mientras que el unico analisis de Prodefensina-A6 y de L-FABP aumentaba respectivamente en 17 y 35 pacientes solamente.

La asociacion de los marcadores tumorales Prodefensina-A6, CA19-9 y ACE permite asi obtener, para el mismo grupo de 78 pacientes unos resultados “3e” aumentados en 46 pacientes que padecen adenocarcinoma colorrectal mientras que el unico analisis de Prodefensina-A6, de CA19-9 y de ACE aumentaba respectivamente en 17, 15 y 28 pacientes solamente.

La asociacion de los marcadores tumorales Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina y ACE permite asi obtener, para el mismo grupo de 78 pacientes unos resultados “3f” aumentados en 60 pacientes que padecen adenocarcinoma colorrectal mientras que el unico analisis de Prodefensina-A6, de Beta-2 Microglobulina y de ACE aumentaba respectivamente en 17, 43 y 28 pacientes solamente.

La asociacion de los marcadores tumorales Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina, CA19-9 y ACE permite asi obtener, para el mismo grupo de 78 pacientes unos resultados “4g” aumentados en 63 pacientes que padecen adenocarcinoma colorrectal mientras que el unico analisis de Prodefensina-A6, de Beta-2 Microglobulina, de CA19-9 y de ACE aumentaba respectivamente en 17, 43, 15 y 28 pacientes solamente.

La asociacion de los marcadores tumorales Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina, L-FABP y ACE permite asi obtener, para el mismo grupo de 78 pacientes unos resultados “4h” aumentadas en 69 pacientes que padecen adenocarcinoma colorrectal mientras que el unico analisis de Prodefensina-A6, de Beta-2 Microglobulina, de L-FABP y de ACE aumentaba respectivamente en 17, 43, 35 y 28 pacientes solamente.

La asociacion de los marcadores tumorales Prodefensina-A6, CA19-9, L-FABP y ACE permite asi obtener, para el mismo grupo de 78 pacientes unos resultados “4i” aumentados en 59 pacientes que padecen adenocarcinoma colorrectal mientras que el unico analisis de Prodefensina-A6, de CA19-9, de L-FABP y de ACE aumentaba respectivamente en 17, 15, 35 y 28 pacientes solamente.

La asociacion de los marcadores tumorales Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina, CA19-9, L-FABP y ACE permite asi obtener, para el mismo grupo de 78 pacientes unos resultados “5j” aumentados en 71 pacientes que padecen adenocarcinoma colorrectal mientras que el unico analisis de Prodefensina-A6, de Beta-2 Microglobulina, de CA19-9, de L-FABP y de ACE aumentaba respectivamente en 17, 43, 15, 35 y 28 pacientes solamente.

La asociacion de los marcadores tumorales Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina, CA19-9, Galectine-3, L-FABP, MIF y ACE permite asi obtener, para el mismo grupo de 78 pacientes unos resultados “7k” aumentados en 74 pacientes que padecen adenocarcinoma colorrectal mientras que el unico analisis de Prodefensina-A6, de Beta-2 Microglobulina, de CA19-9, de Galectine-3, de L-FABP, de MIF y de ACE aumentaba respectivamente en 17, 43, 15, 13, 35, 23 y 28 pacientes solamente.

La asociacion de los marcadores tumorales Prodefensina-A6, Beta-2 Microglobulina, CA19-9, Galectine-3, L-FABP, MIF, Plastina I y ACE permite asi obtener, para el mismo grupo de 78 pacientes unos resultados “8l” aumentados en 75 pacientes que padecen adenocarcinoma colorrectal mientras que el unico analisis de Prodefensina-A6, de Beta-2 Microglobulina, de CA19-9, de Galectine-3, de L-FABP, de MIF, de Plastina I y de ACE aumentaba respectivamente en 17, 43, 15, 13, 35, 23, 3 y 28 pacientes solamente.

Tabla 5

Patol ogfa

Identific acion pacient e Result ado 2a Result ado 2b Result ado 2c Result ado 2d Result ado 3e Result ado 3f Result ado 4g Result ado 4h Result ado 4' Result ado 5j Result ado 7k Result ado 8'

CCR

N01115 5 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32

CCR

N01124 3 0,18 0,18 0,18 0,14 0,18 0,18 0,18 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14

CCR

N14661 0,61 0,61 0,61 0,39 0,61 0,61 0,61 0,39 0,39 0,39 0,39 0,39

CCR

N04470 3 0,20 0,20 0,20 0,21 0,20 0,20 0,20 0,21 0,21 0,21 0,21 0,21

CCR

N31805 0 0,34 0,34 0,34 0,31 0,34 0,34 0,34 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31

CCR

N41859 0,12 0,12 0,12 0,23 0,12 0,12 0,12 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23

-

9

CCR

N01741 0 0,28 0,28 0,28 0,27 0,28 0,28 0,28 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27

CCR

N32963 0 0,21 0,21 0,21 0,33 0,21 0,21 0,21 0,33 0,33 0,33 0,33 0,33

CCR

N04573 0 0,30 0,30 0,30 0,32 0,30 0,30 0,30 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32

CCR

N59311 6 0,15 0,15 0,15 0,27 0,15 0,15 0,15 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27

CCR

N01855 2 0,18 0,18 0,18 0,27 0,18 0,18 0,18 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27

CCR

N01721 8 0,26 0,26 0,26 0,38 0,26 0,26 0,26 0,38 0,38 0,38 0,38 0,38

CCR

N01114 7 0,46 0,46 0,46 0,43 0,46 0,46 0,46 0,43 0,43 0,43 0,43 0,43

CCR

N01736 5 0,29 0,29 0,29 0,33 0,29 0,29 0,29 0,33 0,33 0,33 0,33 0,33

CCR

N44021 6 0,21 0,21 0,21 0,33 0,21 0,21 0,21 0,33 0,33 0,33 0,33 0,33

CCR

N37691 2 0,30 0,30 0,30 0,38 0,30 0,30 0,30 0,38 0,38 0,38 0,38 0,38

CCR

N52745 0 0,20 0,20 0,20 0,34 0,20 0,20 0,20 0,34 0,34 0,34 0,34 0,34

CCR

N74802 2 0,18 0,18 0,18 0,26 0,18 0,18 0,18 0,26 0,26 0,26 0,26 0,26

CCR

N59318 3 0,13 0,13 0,13 0,32 0,13 0,13 0,13 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32

CCR

N00990 1 0,35 0,35 0,35 0,46 0,35 0,35 0,35 0,46 0,46 0,46 0,46 0,46

CCR

N01726 9 0,44 0,44 0,44 0,49 0,44 0,44 0,44 0,49 0,49 0,49 0,49 0,49

CCR

N37646 1 0,14 0,14 0,14 0,37 0,14 0,14 0,14 0,37 0,37 0,37 0,37 0,37

CCR

N86230 0 0,96 0,96 0,96 0,77 0,96 0,96 0,96 0,77 0,77 0,77 0,77 0,77

CCR

N37648 8 0,12 0,12 0,12 0,42 0,12 0,12 0,12 0,42 0,42 0,42 0,42 0,42

CCR

N01723 4 0,25 0,25 0,25 0,47 0,25 0,25 0,25 0,47 0,47 0,47 0,47 0,47

CCR

N52713 5 0,21 0,21 0,21 0,44 0,21 0,21 0,21 0,44 0,44 0,44 0,44 0,44

CCR

N44047 8 0,26 0,26 0,26 0,44 0,26 0,26 0,26 0,44 0,44 0,44 0,44 0,44

CCR

N01740 2 0,35 0,35 0,35 0,56 0,35 0,35 0,35 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56

CCR

N49119 1 0,62 0,62 0,60 0,62 0,62 0,60 0,60 0,60 0,62 0,60 0,55 0,55

CCR

N83596 6 0,33 0,33 0,56 0,25 0,33 0,56 0,56 0,43 0,25 0,43 0,45 0,45

CCR

N01725 0 0,21 0,22 0,26 0,29 0,20 0,21 0,20 0,25 0,23 0,23 0,23 0,23

CCR

N14435 8 0,36 0,36 0,49 0,28 0,36 0,49 0,49 0,39 0,28 0,39 0,40 0,40

CCR

N14398 8 0,26 0,26 0,51 0,33 0,26 0,51 0,51 0,47 0,33 0,47 0,48 0,48

CCR

N51149 8 0,30 0,23 0,51 0,35 0,25 0,44 0,37 0,43 0,29 0,37 0,34 0,33

CCR

N31838 4 0,44 0,19 0,49 0,31 0,30 0,50 0,38 0,44 0,29 0,35 0,37 0,33

CCR

N14834 0 0,32 0,33 0,62 0,54 0,24 0,44 0,35 0,46 0,32 0,39 0,42 0,39

CCR

N49138 6 0,20 0,20 0,48 0,44 0,14 0,32 0,25 0,37 0,23 0,30 0,33 0,29

CCR

N51851 8 0,49 0,29 0,59 0,48 0,38 0,59 0,48 0,57 0,42 0,49 0,44 0,39

CCR

N51854 2 0,32 0,22 0,57 0,22 0,22 0,45 0,34 0,34 0,16 0,27 0,28 0,29

CCR

N85824 8 0,61 0,63 0,87 0,72 0,52 0,68 0,60 0,65 0,53 0,59 0,55 0,48

CCR

N49124 7 0,35 0,19 0,42 0,35 0,30 0,46 0,39 0,47 0,36 0,42 0,43 0,39

CCR

N14827 0,38 0,35 0,70 0,46 0,30 0,53 0,44 0,49 0,32 0,42 0,44 0,40

-

9

CCR

N41868 7 0,26 0,06 0,45 0,23 0,18 0,44 0,33 0,42 0,22 0,34 0,41 0,36

CCR

N85770 4 0,22 0,33 0,44 0,22 0,32 0,39 0,42 0,37 0,31 0,39 0,46 0,41

CCR

N59325 5 0,65 0,54 0,97 0,72 0,46 0,74 0,58 0,67 0,45 0,55 0,50 0,43

CCR

N86229 8 0,37 0,15 0,22 0,22 0,27 0,37 0,27 0,37 0,27 0,27 0,41 0,33

CCR

N31842 1 0,58 0,21 0,67 0,47 0,41 0,72 0,56 0,69 0,46 0,57 0,56 0,49

CCR

N51147 1 0,29 0,21 0,53 0,47 0,22 0,43 0,33 0,46 0,31 0,38 0,38 0,36

CCR

N32501 5 0,40 0,48 0,50 0,33 0,51 0,52 0,58 0,50 0,49 0,55 0,54 0,47

CCR

N14669 5 0,27 0,30 0,54 0,46 0,22 0,38 0,32 0,39 0,27 0,34 0,36 0,32

CCR

N31807 7 0,47 0,32 0,64 0,59 0,35 0,56 0,44 0,58 0,42 0,48 0,51 0,46

CCR

N85803 7 0,40 0,32 0,71 0,50 0,28 0,53 0,41 0,49 0,30 0,40 0,47 0,42

CCR

N51146 3 0,16 0,20 0,46 0,29 0,16 0,33 0,29 0,34 0,20 0,30 0,43 0,40

CCR

N59316 7 0,45 0,62 0,59 0,47 0,51 0,49 0,53 0,46 0,47 0,50 0,50 0,55

CCR

N55773 6 0,57 0,14 0,41 0,23 0,40 0,58 0,45 0,50 0,36 0,41 0,41 0,39

CCR

N31416 4 0,36 0,46 0,58 0,56 0,37 0,45 0,43 0,48 0,42 0,46 0,54 0,47

CCR

N86223 9 0,31 0,29 0,44 0,24 0,36 0,46 0,46 0,43 0,36 0,44 0,46 0,40

CCR

N49168 5 0,26 0,17 0,64 0,42 0,20 0,51 0,40 0,52 0,29 0,43 0,49 0,44

CCR

N51805 9 0,27 0,22 0,55 0,58 0,20 0,42 0,34 0,52 0,35 0,43 0,47 0,48

CCR

N51908 6 0,31 0,32 0,56 0,52 0,28 0,44 0,38 0,48 0,36 0,43 0,43 0,45

CCR

N37663 0,33 0,61 0,55 0,35 0,55 0,52 0,64 0,51 0,54 0,61 0,62 0,55

CCR

N44050 7 0,43 0,28 0,76 0,54 0,30 0,61 0,47 0,59 0,36 0,48 0,53 0,46

CCR

N37676 0 0,65 0,52 0,53 0,43 0,68 0,69 0,70 0,65 0,65 0,67 0,64 0,59

CCR

N46977 5 0,24 0,17 0,50 0,39 0,20 0,41 0,33 0,44 0,28 0,37 0,47 0,41

CCR

N49102 8 0,26 0,20 0,54 0,35 0,20 0,43 0,34 0,42 0,25 0,35 0,44 0,39

CCR

N14660 1 0,51 0,42 0,63 0,48 0,47 0,61 0,56 0,59 0,49 0,55 0,62 0,54

CCR

N55770 1 0,55 0,68 0,83 0,75 0,52 0,63 0,59 0,63 0,55 0,59 0,57 0,50

CCR

N55776 0 0,56 0,56 0,80 0,95 0,45 0,60 0,51 0,70 0,58 0,61 0,58 0,56

CCR

N55769 9 0,60 0,72 0,82 0,56 0,63 0,70 0,70 0,62 0,57 0,63 0,63 0,61

CCR

N59335 1 0,76 0,48 0,63 0,59 0,59 0,68 0,58 0,63 0,56 0,55 0,55 0,61

CCR

N74405 6 0,30 0,48 0,47 0,28 0,42 0,41 0,47 0,36 0,37 0,42 0,49 0,42

CCR +

CBSE0 11 5,13 5,12 12,17 5,43 3,45 8,15 6,13 6,29 2,76 5,05 6,17 5,30

CCR +

CLSP0 59 0,35 0,18 0,44 5,71 0,27 0,44 0,35 3,12 2,99 2,51 3,45 3,04

CCR +

CLSP1 04 0,27 7,10 0,44 0,48 4,85 0,40 3,80 0,49 3,82 3,19 5,63 4,96

CCR +

CBSE0 01 0,77 0,77 0,77 10,28 0,77 0,77 0,77 10,28 10,28 10,28 10,28 10,28

CCR +

CBSE0 16 19,26 5,83 12,92 6,18 12,85 17,57 13,18 13,35 9,81 10,69 9,02 7,73

CCR +

CBSE0 22 0,20 0,08 8,62 0,38 0,14 5,83 4,38 4,53 0,26 3,62 6,91 5,93

CCR

CBSE0 0,72 0,50 8,93 0,87 0,55 6,18 4,69 4,87 0,65 3,94 5,58 4,80

+

25

CCR +

CLSP0 47 0,29 0,17 5,46 0,37 0,20 3,73 2,80 2,90 0,26 2,33 1,84 1,66

CCR +

CLSP0 62 0,37 5,28 6,47 0,40 3,67 4,46 5,91 3,47 2,88 4,83 5,23 4,66

CCR +

CLSP0 67 0,21 0,14 0,54 7,28 0,16 0,42 0,33 3,90 3,70 3,13 2,40 2,16

CCR +

CLSP0 80 0,40 0,46 5,77 0,69 0,35 3,89 2,97 3,89 0,35 2,97 2,19 1,88

CCR +

CLSP0 85 8,75 8,75 9,14 9,00 5,89 6,15 4,65 4,78 4,58 3,86 2,95 2,61

CCR +

CLSP0 86 168,1 0,24 0,35 0,31 112,2 112,3 84,30 84,34 84,29 67,54 48,35 42,34

CCR +

CLSP0 93 0,24 0,26 0,42 8,93 0,26 0,37 0,36 4,69 4,61 3,81 2,85 2,52

CCR +

CLSP1 00 0,44 0,19 6,86 7,48 0,35 4,79 3,63 7,28 3,95 5,86 4,32 3,79

CCR +

CLSP1 18 0,21 0,22 0,63 0,44 0,15 0,42 0,33 0,44 0,23 0,36 0,40 2,32

CCR +

CLSP1 45 0,51 0,42 7,10 0,78 0,38 4,83 3,65 3,83 0,49 3,09 2,41 2,11

CCR +

CLSP1 46 0,17 0,23 0,36 7,47 0,22 0,31 0,32 3,94 3,87 3,22 3,99 3,50

CCR +

CBSE0 04 0,37 0,27 7,18 0,18 0,41 5,02 3,89 3,85 0,39 3,18 9,53 8,19

CCR +

CBSE0 17 17,51 0,36 7,89 0,74 11,73 16,76 12,61 12,80 9,03 10,28 8,72 7,47

CCR +

CBSE0 18 0,19 0,17 0,42 0,26 0,19 0,36 0,32 0,36 0,24 0,33 2,80 2,40

CCR +

CLSP0 43 0,54 0,56 5,38 0,66 0,51 3,72 2,90 3,72 0,51 2,90 4,01 3,45

CCR +

CLSP0 60 0,64 0,66 8,88 6,69 0,65 6,13 4,76 7,77 3,66 6,35 5,39 4,66

CCR +

CLSP0 87 0,59 0,45 7,11 0,66 0,43 4,87 3,67 3,78 0,45 3,04 2,32 2,03

CCR +

CLSP0 88 13,90 7,95 0,67 5,87 14,44 9,58 11,07 10,03 13,67 11,13 8,01 7,01

CCR +

CLSP0 96 19,94 0,29 8,65 0,44 13,42 18,99 14,34 14,41 10,23 11,60 8,42 7,37

CCR +

CLSP1 05 23,90 0,88 7,46 0,73 16,23 20,62 15,69 15,61 12,32 12,67 10,82 9,47

CCR +

CLSP1 07 0,44 0,47 0,36 5,91 0,54 0,47 0,54 3,26 3,31 2,75 2,07 1,83

CCR +

CLSP1 13 0,31 0,29 0,49 8,43 0,28 0,41 0,36 4,43 4,33 3,59 2,66 2,33

CCR +

CLSP1 15 9,90 9,72 18,17 26,81 6,66 12,29 9,27 17,81 13,59 14,29 11,93 10,44

CCR +

CLSP1 17 0,75 0,57 8,98 7,36 0,60 6,20 4,72 8,12 3,92 6,55 6,25 5,48

CCR +

CLSP1 19 0,22 0,26 7,33 5,92 0,18 4,89 3,69 6,52 2,99 5,24 3,94 3,47

CCR +

CLSP1 22 0,66 0,40 0,68 0,47 0,56 0,75 0,65 0,69 0,55 0,62 3,60 3,15

CCR +

CLSP1 36 0,26 0,25 0,47 0,48 0,31 0,45 0,43 0,55 0,44 0,52 0,62 0,56

CCR +

CLSP1 43 7,99 0,40 0,80 0,82 5,37 5,64 4,26 4,47 4,27 3,60 2,69 2,37

CCR +

CLSP1 47 0,39 0,22 8,75 0,48 0,27 5,96 4,48 4,60 0,34 3,69 4,34 3,81

CCR +

CLSP1 54 9,94 0,43 6,34 0,49 6,76 10,70 8,13 8,16 5,20 6,60 4,93 4,31

CCR +

GHBD0 20 0,32 0,38 5,61 0,76 0,29 3,78 2,89 3,08 0,46 2,51 1,93 1,72

CCR +

GHBD0 25 0,27 0,25 6,97 0,46 0,21 4,69 3,55 3,65 0,29 2,94 2,29 2,00

CCR +

GHBD0 29 5,94 6,09 6,28 6,27 4,08 4,21 3,25 3,34 3,24 2,74 2,09 1,82

CCR +

CBSE0 05 11,39 11,65 17,84 18,52 7,78 11,91 9,07 12,51 9,42 10,12 12,87 11,28

CCR +

CBSE0 06 24,67 24,68 49,15 24,98 16,52 24,67 16,52 16,71 12,59 12,59 12,59 10,10

CCR

CBSE0 5,49 5,45 10,74 25,72 3,71 5,49 3,71 17,23 12,96 12,96 12,96 10,38

+

07

CCR +

CBSE0 10 30,57 73,65 30,99 32,35 53,22 24,78 43,22 22,56 43,90 37,76 34,94 29,99

CCR +

CBSE0 13 12,31 17,52 20,52 18,49 11,91 13,91 13,20 13,69 12,19 13,17 12,77 10,95

CCR +

CBSE0 23 5,78 5,68 5,84 5,83 4,02 4,13 3,22 3,30 3,22 2,74 2,42 2,11

CCR +

CLSP0 44 103,9 0,25 0,53 0,29 69,37 69,55 52,23 52,25 52,11 41,85 30,04 26,32

CCR +

CLSP0 50 5,97 5,86 13,93 11,14 4,03 9,40 7,09 9,73 5,70 7,81 7,77 6,84

CCR +

CLSP0 72 11,33 14,86 14,32 11,06 13,61 13,25 14,48 12,58 12,85 13,70 9,96 8,73

CCR +

CLSP0 73 0,67 14,22 7,20 6,00 9,65 4,96 10,62 6,51 10,02 10,73 7,76 6,81

CCR +

CLSP0 74 0,29 0,41 6,82 0,66 0,36 4,63 3,59 3,71 0,51 3,07 2,31 2,07

CCR +

CLSP0 89 25,65 0,62 9,83 0,41 17,37 23,51 17,84 17,73 13,13 14,35 10,39 9,11

CCR +

CLSP0 91 5,55 0,27 0,39 6,43 3,83 3,91 3,03 6,11 6,05 4,96 3,71 3,26

CCR +

CLSP0 94 6,67 0,36 0,25 0,31 4,61 6,67 4,61 4,57 3,54 3,54 2,89 2,44

CCR +

CLSP0 97 0,31 0,30 0,64 0,55 0,27 0,50 0,42 0,55 0,38 0,48 0,46 0,40

CCR +

CLSP1 06 5,05 5,13 12,36 11,50 3,42 8,24 6,22 9,40 5,78 7,55 5,53 4,84

CCR +

CLSP1 21 0,22 0,23 0,51 0,41 0,21 0,40 0,35 0,44 0,30 0,39 1,93 1,69

CCR +

CLSP1 23 0,63 0,62 9,03 14,97 0,51 6,12 4,66 11,83 7,63 9,52 11,26 9,85

CCR +

CLSP1 38 9,60 0,30 8,82 0,56 6,42 12,10 9,09 9,22 4,96 7,39 5,43 4,76

CCR +

CLSP1 41 0,43 0,38 0,63 10,19 0,32 0,49 0,40 5,30 5,18 4,27 3,31 2,90

CCR +

CLSP1 53 33,40 23,59 21,96 29,87 28,97 27,88 25,93 29,08 29,89 27,28 19,56 17,12

CCR +

GHBD0 19 7,06 0,24 0,68 0,60 4,71 5,00 3,75 3,93 3,71 3,14 2,34 2,08

CCR +

CBSE0 12 5,81 12,11 0,47 0,30 11,85 4,10 9,06 3,16 8,98 7,32 6,19 5,30

CCR +

CBSE0 19 6,40 0,63 0,88 7,05 4,42 4,58 3,55 6,76 6,64 5,50 4,71 4,04

CCR +

CBSE0 26 195,7 119,8 8,71 6,43 210,2 136,2 161,9 105,3 160,8 132,1 95,87 83,92

CCR +

CBSE0 27 175,0 0,55 5,36 5,79 175,0 120,0 120,0 92,78 120,3 92,78 68,71 61,25

CCR +

CLSP0 42 153,8 0,76 5,43 8,15 102,8 105,9 79,62 83,31 80,98 66,81 50,00 43,77

CCR +

CLSP0 57 15,32 0,19 0,40 10,84 10,30 10,44 7,89 13,21 13,11 10,62 12,94 12,80

CCR +

CLSP0 68 337,0 120,0 5,60 7,64 304,4 228,2 231,0 174,8 232,0 187,7 138,3 121,2

CCR +

CLSP0 79 0,43 25,92 0,59 0,60 25,92 0,59 17,53 0,65 17,54 13,34 9,16 7,91

CCR +

CLSP0 83 0,37 0,46 0,46 0,54 0,41 0,42 0,43 0,48 0,47 0,48 0,44 0,39

CCR +

CLSP0 95 150,8 0,59 0,59 5,56 100,8 100,8 75,81 78,29 78,29 62,80 46,47 40,69

CCR +

CLSP1 09 0,47 9,79 0,63 34,00 9,79 0,63 6,79 22,93 29,04 21,97 17,37 14,96

CCR +

CLSP1 32 7,74 7,84 15,99 17,61 5,42 10,86 8,34 13,23 9,15 10,74 9,52 8,36

CCR +

CLSP1 56 45,79 24,26 8,49 0,73 46,47 35,97 38,94 27,17 35,05 31,31 28,46 24,92

CCR +

CLSP1 59 67,36 33,80 6,71 0,66 67,28 49,22 53,70 37,13 50,67 43,13 32,70 28,61

CCR +

CLSP1 60 7,86 7,49 7,73 42,10 5,32 5,48 4,17 21,48 21,36 17,23 12,46 10,90

CCR +

CLSP1 61 18,00 0,52 8,72 0,61 12,23 17,70 13,45 13,49 9,40 10,94 7,99 6,99

Umbral

0,96 0,96 0,97 0,95 0,96 0,96 0,96 0,77 0,77 0,77 0,77 0,77

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Especificidad(%)

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Sensibilidad (%)

52,56 35,90 62,82 89,13 58,97 76,92 80,77 88,46 75,64 91,03 94,87 96,15

CCR + superior al umbral

41 28 49 41 46 60 63 69 59 71 74 75

Resultado 2a: asociacion ACE, Prodefensina-A6

Resultado 2b: asociacion CA19-9, Prodefensina-A6

Resultado 2c: asociacion Beta-2 Microglobulina, Prodefensina-A6

Resultado 2d: asociacion L-FABP, -Prodefensina A6

Resultado 3e: asociacion ACE, CA19-9, Prodefensina-A6

Resultado 3f: asociacion ACE, Beta-2 Microglobulina, Prodefensina-A6

Resultado 4g: asociacion ACE, Beta-2 Microglobulina, CA19-9, Prodefensina-A6

Resultado 4h: asociacion ACE, Beta-2 Microglobulina, L-FABP, Prodefensina-A6

Resultado 4i: asociacion ACE, CA19-9, L-FABP, Prodefensina-A6

Resultado 9: asociacion ACE, Beta-2 Microglobulina, CA19-9, L-FABP, Prodefensina-A6

Resultado 7k: asociacion ACE, Beta-2 Microglobulina, CA19-9, Galectina 3, Prodefensina-A6, L-FABP, MIF

Resultado 8': asociacion ACE, Beta-2 Microglobulina, CA19-9, Prodefensina-A6, Galectina-3, L-FABP, MIF, Plastina I

CCR+ = pacientes que padecen cancer colorrectal (Adenocarcinoma), CCR- = sujetos sanos.

Ejemplo 5: Deteccion de los marcadores tumorales mediante la tecnica LC-MRM-MS

1. Metodoloai'a

A fin de poder disminuir el limite de deteccion a algunos ng/ml, se ha realizado un procedimiento mejorado de MRM- MS. Las etapas sucesivas de este procedimiento son: 1) inmunodeplecion de las proteinas abundantes, 2) digestion tripsica, 3) fraccionamiento SPE (extraccion en fase solida) de los peptidos, 4) cromatografia liquida (LC) acoplada a la MRM-MS.

El desarrollo se ha realizado sobre unas muestras sobrecargadas (spike) anadiendo el peptido sintetico Prodefensina-A6 (SEQ ID°1).

Inmunodeplecion. La deplecion de las proteinas abundantes del suero se ha realizado utilizando el kit comercial Vivapure anti-HSA de Vivascience. Alternativamente, se ha utilizado tambien el kit Proteoextract Albumin/IgG de Calbiochem y el Aurum™ serum Protein Minikit de Bio-Rad. Es tambien posible producir las resinas especificas en laboratorio, acoplando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteina a depletar sobre una resina sefarosa 4B activada con CNBr (Amersham Bioscience), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Digestion enzimatica. Las muestras de sueros depletados se desnaturalizan en una solucion de urea 6M tamponada por 10 mM de Tris pH 8 y que contiene 30 mM de ditiotreitol, durante 40 minutos a 40°C, despues alquiladas por yodoacetamida 50 mM, a temperatura ambiente, durante 40 minutos, en la oscuridad. Se diluyen 6 veces en agua, despues se realiza la digestion tripsica a 37°C, durante la noche, utilizando una relacion enzima sustrato de 1:30 (Promega). La digestion se detiene mediante adicion de acido formico a una concentracion final de 0,5%. Las muestras digeridas se desalan por extraccion sobre fase solida (SPE, extraccion en fase solida) utilizando los cartuchos en fase inversa Oasis HLB 3cc (60 mg) (Waters). Despues de la aplicacion de la muestra, los cartuchos se lavan mediante 1 ml de acido formico al 0,1%, despues se ha realizado la elucion mediante una mezcla metanol/agua (80/20 v/v) que contiene 0,1% de acido formico. Los eluatos se secan a vacio.

Fraccionamiento SPE. Las muestras secas se recogen en 1 ml de tampon acetato y se cargan sobre los cartuchos mixtos (hidrofobo e intercambio de cation) Oasis MCX (intercambio cationico mixto) 60 mg (Waters) equilibrados previamente en tampon acetato y metanol. Los cartuchos se lavan mediante 1 ml de tampon acetato y 1 ml de metanol. Los peptidos de interes (tabla 6) se eluyen mediante 1 ml de una mezcla metanol/tampon acetato (50/50 v/v)). El pH del tampon acetato se selecciona en funcion del punto isoelectrico del peptido de interes. Los eluatos se secan a vacio, se disuelven en 200 pl de una solucion de acetonitrilo/agua (3/97 v/v) que contiene un 0,1% de acido formico. Se ha inyectado un alicuota de 50 pl en la LC acoplada con un sistema MS-MS.

Cromatografia liquida y espectrometria de masa. Se ha efectuado el analisis LC-MS sobre un sistema cromatografico de alta presion (HPLC) de tipo HP 1100 series con bomba binaria e inyector (Agilent Technologies) acoplado a un espectrometro de masa, o bien un Sciex API 2000 triple cuadripolo, o bien un Sciex API 4000 Qtrap (MS hibrido triple cuadripolo - trampilla ionica) (MDS Sciex) para una mejor sensibilidad. La separacion LC se ha efectuado sobre una columna C18Symmetry (Waters), a un caudal de elucion de 300 pl/min. (Eluent A = 0,1% acido formico en agua, eluyente B = 0,1% acido formico en acetonitrilo, gradiente lineal de 5%B a 50%B en 25 min, despues de 50%B a 100%B en 3 min). El analisis MS se realiza en modo de ionizacion positiva a una tension de 5500 V aplicada en la aguja que permite la ionizacion en la fuente. El control del instrumento y la adquisicion de los datos se realizan con el programa Analyst 1,4,1. Los caudales del gas de nebulizacion (aire) y del gas cortina (nitrogeno) son de 30 y 20 psi, respectivamente. La fuente ionica Turbo V™ se ajusta a 400°C, el flujo de nitrogeno auxiliar a 40 psi. Las transiciones MRM registradas para cada peptido se resumen en la tabla 6. La energia de colision (CE), la tension de orificio (DP, potencial de deagregacion) y la tension en la salida de la celula de colision

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

(CXP, potencial de salida de la celda de colision) se optimizan para cada una de las transiciones MRM seleccionadas.

2. Resultados

La lista de las transiciones MRM teoricas de la secuencia SEQ ID°1 se ha generado utilizando el programa MIDAS (Deteccion y Secuenciacion Iniciada por MRM). Esta lista comprende todos los iones parientes di- o tri- cargados de los peptidos tripticos teoricos en un intervalo de masa que va de 800 a 3000 Da y todos los iones fragmentos posible de tipo y o b. Para cada proteina, se ha ensayado cada transicion posible a fin de determinar las transiciones mas sensibles y mas especificas. El resultado de esta seleccion se recapitula en la tabla 6. Un ejemplo de optimizacion de la etapa SPE para la transicion 727/556 del peptido EPLQAEDDPLQAK (SEQ ID n°30) se presenta en la Figura

7. La separacion cromatografica MCX se ha realizado a diferentes pH, siendo el pH seleccionado para la continuacion de los experimentos el pH que permite obtener el area del pico mas elevado.

Ademas, utilizando un peptido pesado de tipo AQUA (Sigma) o tambien una proteina recombinante pesada que serviran de patron de analisis, es posible cuantificar de manera absoluta el marcador tumoral de interes en un medio biologico complejo.

Tabla 6

Prodefensina-A6

Secuencia (SEQ ID n°)

pI Q1 Q3 DP CE CXP

EPLQAEDDPLQAK (SEQ ID n°30)

3,57 727,4 556,4 50 40 28

218,2

50 35 8

915,4

50 30 25

986,4

50 35 27

AYEADAQEQR (SEQ ID n°31)

3,93 590,8 746,4 100 30 11

817,4

100 30 18

631,3

100 30 11

560,3

100 30 11

946,4

100 35 20

Referencias biblioqraficas

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Claims (7)

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   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de diagnostico in vitro del cancer colorrectal mediante la determinacion del aumento de la concentracion, con respecto a los valores de referencia determinados para los sujetos sanos, del marcador proteico Prodefensina-A6 en una muestra biologica procedente de un paciente sospechoso de estar afectado de cancer colorrectal, que utiliza un anticuerpo monoclonal especifico de la Prodefensina-A6 que reconoce el epitopo 1 de SEQ ID n°6.
2. 2. Procedimiento de diagnostico segun la reivindicacion 1, en el que dicho anticuerpo se utiliza para la captura de la Prodefensina-A6.
3. 3. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que la muestra biologica es una muestra distante del tumor.
4. 4. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que consiste tambien en determinar la presencia en una o varias muestras biologicas procedentes de un paciente sospechoso de estar afectado de cancer colorrectal, de al menos otro marcador tumoral seleccionado entre los marcadores siguientes: Inhibidor de Elastasa Leucocitaria, Ezrina, Aminoacilasa 1, Proteina de Union a Acidos Grasos del Higado, Proteina de Union a Acidos Grasos del Intestino, Apolipoproteina AI, Apolipoproteina AII, Plastina-I, Microglobulina Beta 2, Protosoma 20S, Galectina-3, Cadena B de la L-Lactato Deshidrogenasa, Calreticulina, Proteina 3 alfa Derivada de los Islotes Regeneradores, Transductor 1 de la Senal de Calcio Asociado a Tumores, Queratina tipo II Citoesqueletica 8, Queratina tipo I Citoesqueletica 18, Queratina tipo I Citoesqueletica 19, Cadherina Epitelial, ACE, Villina, CA19-9, CA 242, CA 50, CA 72-2, Testosterona, TIMP-1, Cripto-1, Proteina Disulfuro Isomerasa, Intelectina- 1, Citoqueratina 20, Proteina Tumoral Controlada Traslacionalmente, (Pro)defensina-A5, MIF, Piruvato Cinasa M2- PK, Calgranulina C, CD24, CCSA-3 (antigeno especifico del cancer de colon) y CCSA-4, la deteccion de ADN metilado en la sangre, preferiblemente el ADN metilado del gen AXL4 o el aDn metilado del gen Septin-9, la deteccion de alteraciones especificas de fragmentos de ADN en las heces como unas mutaciones especificas del ADN en las heces o unas alteraciones especificas del perfil de metilacion del ADN en las heces, la deteccion de hemoglobina humana en las heces.
5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 4, caracterizado por que dicho al menos otro marcador es o son:

   - L-FABP,

   - CA19-9 y ACE,

   - Beta-2 Microglobulina y ACE

   - Beta-2 Microglobulina, CA19-9 y ACE,

   - Beta-2 Microglobulina, L-FABP y ACE,

   - L-FABP, CA19-9 y ACE,

   - Beta-2 Microglobulina, CA19-9 y ACE,

   - Beta-2 Microglobulina, CA19-9, L-FABP y ACE,

   - Beta-2 Microglobulina, CA19-9, Galectina-3, L-FABP, MIF y ACE, o

   - Beta-2 Microglobulina, CA19-9, Galectina-3, L-FABP, MIF, Plastina I y ACE.
6. 6. Utilizacion del procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el diagnostico precoz, la deteccion, el seguimiento terapeutico, el pronostico y el diagnostico de las recaidas en el ambito del cancer colorrectal.
7. 7. Anticuerpo monoclonal anti-Prodefensina-A6 que reconoce especificamente el epitopo 1 de secuencia SEQ ID n°6.