CN105891484A - 一组结肠癌转移相关肿瘤间质标志物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组结肠癌转移相关肿瘤间质标志物，该组标志物存在于肿瘤间质中，随着癌变进展标志物表达异常也更显著。其中标志物Tenascin‑C是一种新的细胞外基质标志物，且在肿瘤癌变早期就已表达异常，而且在转移部位也表达异常，其中肿瘤自身分泌该标志物与其转移能力相关。该组标志物可用于制备筛查和辅助诊断结肠癌转移药物及试剂盒。

Description

一组结肠癌转移相关肿瘤间质标志物及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一组结肠癌转移相关肿瘤间质标志物及应用。

背景技术

结肠癌(colon cancer,CC)是胃肠道常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率有着明显上升趋势。在全世界范围内每年有超过上百万人深受其影响，而且发现时大部分已处于中晚期，严重威胁着人类健康。肿瘤的发生和转移与肿瘤细胞所处的微环境有着密切关系。因此从结肠癌癌变过程中微环境中筛选关键蛋白质对深入理解癌变机制、寻找诊断和治疗靶标、预防肿瘤发生具有十分重要意义。

目前，结肠癌诊断和治疗还依赖于组织形态学手段，缺乏有效的分子诊断技术。从而导致诊断不及时，或确诊时大多数已是晚期，对早期转移和微转移无法及时发现，导致治疗延误。为此筛选早期和转移标志物对提高结肠癌治疗效果具有重要意义。

发明内容

因此，本发明旨在克服现有技术中诊断分子不够特异、不能准确早期诊断的问题。提供一组新的细胞外基质标志物，可用于结肠癌转移的诊断和早期筛查。其中所述结肠癌转移相关肿瘤间质标志物为所述标志物为Tenascin-C(TNC),Protein S100-A9(S100A9),Protein S100-A8(S100A8),Pyruvate kinase PKM(PKM),Endoplasmin(HSP90B1),Calumenin(CALU),Calreticulin(CALR),Galectin-1(LGALS1),Dermcidin(DCD),Chromogranin-A(CHGA),Tryptase alpha/beta-1(TPSAB1),Nidogen-1(NID1),Lamininsubunit alpha-4(LAMA4),Serum amyloid P-component(APCS)，该标志物存在于肿瘤间质中，且在肿瘤癌变早期就已表达异常，而且在转移部位也表达异常。其中肿瘤自身分泌该标志物与其转移能力相关。这些标志物还可用于制备筛查和辅助诊断结肠癌转移药物及试剂盒。

所述标志物是通过前期采用定量蛋白质组学技术，比较分析结肠癌癌变不同阶段的间质表达蛋白质的变化规律，筛选与癌变显著相关的蛋白质分子。并进一步通过分析临床样本核实最终确定的。

本发明的研究主要包括四个方面的内容：肿瘤间质标志物的筛选，胞外基质标志物Tenascin-C的表达验证，Tenascin-C与临床病理特征的关系，肿瘤自分泌Tenascin-C与其转移的关系。

具体的技术方案如下：

结肠癌起源于正常结肠上皮细胞，为此我们收集了结肠癌癌变过程中四个典型阶段的结肠组织(正常结肠上皮，腺瘤，原位癌和浸润癌)，通过激光显微切割搜集结肠上皮细胞周围的间质成分，抽提间质蛋白质后，酶解后采用iTRAQ标记试剂分别标记这四种蛋白质样品。将标记后的样品等量混合后，采用离子交换色谱法分离为10个组分，每一组分通过LC-MS/MS进行检测，生物信息学鉴定和定量蛋白质。筛选差异表达蛋白质。根据差异表达蛋白质的亚细胞定位进一步筛选出7个分泌蛋白和7个细胞外基质蛋白为结肠癌转移相关标志物。Protein S100-A9，Tenascin-C，Protein S100-A8，Pyruvate kinase PKM,Endoplasmin,Calumenin,Calreticulin在癌变早期表达上调。而Galectin-1,Dermcidin,Chromogranin-A，Tryptase Alpha/beta-1,Nidogen-1,Laminin subunit alpha-4,Serumamyloid P-component.表达水平在癌变早期即低表达。

采用免疫组织化学技术分析不同阶段的石蜡包埋组织中Tenascin-C的表达情况，证实Tenascin-C主要表达于肿瘤间质中。经半定量分析确认Tenascin-C表达规律与蛋白质组学发现结果一致。

进一步统计分析Tenascin-C表达水平与临床病理特征的相关性进行了分析，发现Tenascin-C表达水平与肿瘤TNM分期，转移相关。

采用Western-blot分析了不同转移潜能的结肠癌细胞株中Tenascin-C表达，发现高转移潜能结肠癌细胞中Tenascin-C弱表达，而其分泌物中大量Tenascin-C。而低转移或无转移能力结肠癌细胞中Tenascin-C几乎无表达。而进一步采用免疫组织化学对结肠癌转移淋巴结中Tenascin-C分析发现转移淋巴结中高表达。而无转移的淋巴结中无表达。再次证实肿瘤细胞自身分泌Tenascin-C与其转移潜能密切相关。

总之，本发明申请人采用激光显微切割(LCM)技术纯化获取正常结肠粘膜上皮、腺瘤性息肉、原位癌和浸润癌等各阶段的间质细胞(stromal cells)，然后采用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)联合液相色谱-串联质谱(Nano LC-MS/MS)技术分离鉴定从正常上皮细胞到浸润癌细胞癌变各阶段的间质间差异表达的蛋白质,进一步对这些差异蛋白筛选获得了存在于细胞外的间质蛋白质，可作为结肠癌间质标志物。发现基质蛋白Tenascin-C与肿瘤转移相关。肿瘤细胞自分泌Tenascin-C与其转移潜能相关。转移性淋巴结中Tenascin-C同样高表达，与转移相关。多阶段研究发现在癌变早期Tenascin-C已表达异常。因此我们发现了一个预测转移和协助早期转移诊断的分子Tenascin-C，为结肠癌诊断、转移筛查提供了手段。

附图说明

图1：采用激光显微切割技术(LCM)分离纯化结肠癌癌变不同阶段结肠上皮细胞间质组分；图中所示为结肠癌癌变四个阶段(正常结肠粘膜NCM，腺瘤性息肉ACP，原位癌CIS，浸润癌ICC)显微切割前后的组织，以及相应的切割部分的组织照片；

图2：采用重复实验变异度累积函数曲线确定显著性差异倍数阈值。图中在累积频率大于90％时变异度为50％，表明90％的蛋白其差异变化小于50％，即大于1.5或小于0.67为差异表达标准；

图3：采用定量蛋白质组学技术分析结肠癌癌变不同阶段间质标志物表达情况；A为7个表达上调标志物各阶段表达水平，B为7个表达下调的标志物各阶段的表达水平；

图4：采用免疫组织化学技术分析靶标蛋白在不同阶段组织中的表达情况；A为NCM，B为ACP，C为CIS，D为ICC；

图5：western-blot分析不同转移能力结肠癌细胞总蛋白及分泌上清中靶标蛋白表达情况；图中上部为五种结肠癌细胞(HCT116-，HCT116+，SW620，SW480，HT29)及正常结肠上皮细胞NCM460总蛋白中靶标蛋白的表达；图下部为六种细胞培养上清中靶标蛋白的表达水平；

图6：免疫组织化学分析转移淋巴结中靶标蛋白的表达情况；A为有无肿瘤转移淋巴结，B为肿瘤转移淋巴结。

具体实施方式

实施例1

结肠癌癌变间质差异表达蛋白分析

搜集结肠癌癌变过程中的四个典型阶段(正常，腺瘤性息肉，原位癌，浸润癌)的病理组织。切片染色后，并经病理专家确认。将组织经冷冻切片后，贴于显微切割专用膜片上，在75％乙醇溶液中固定30秒，0.5％甲基绿染色。染色后切片空气干燥备用。染色后切片进行激光显微切割。在显微镜下选取一致性大于95％的区域进行切割，搜集切割组分。

结果如图1所示，通过显微切割，结肠上皮细胞周围的间质组织被有效分离并收集。由此说明后续鉴定蛋白均来自于间质组织。

实施例2

将搜集到的不同阶段的间质组分进行蛋白提取：将间质组分溶解于适量裂解液(7MUrea，2M Thiourea，65mM DTT，0.1mM PMSF)中4℃裂解1小时后，12000rpm离心30分钟搜集上清。采用2D定量试剂盒进行蛋白质浓度测定。将相同阶段的不同个体样本进行等量混合，形成四个阶段的混合蛋白样本进行后续标记实验。

按照iTRAQ试剂盒标准流程进行样品标记：4个混合蛋白样品，各取100ug，经还原，烷基化后37℃酶解过夜。酶解后的肽段采用采用8通道(8plex)iTRAQ试剂进行标记(标记试剂114,118标记NCM间质；试剂113,117标记ACP间质；试剂115,119标记CIS间质；试剂116,121标记ICC间质)。标记结束后将肽段混合。

混合肽段进行强阳离子交换色谱分离成10个组分。每个组分在经Triple TOF 5600质谱采集数据。上述实验重复3次。数据采集完毕后导入ProteinPilot 4.2软件中进行蛋白鉴定和定量分析。鉴定和定量结果导出到excel表格中进行后续分析。

蛋白鉴定可信度阈值设定为：unused ProtScore大于1.3(95％可信区间)。如图2采用变异度累积分布曲线确定显著性差异倍数的阈值(>1.5或<0.67)。根据实验设计可知，每次实验中每个样品进行了双标记，同时又进行了三次重复。因此每个样品产生6个测量值。对差异蛋白要求在6次测量中必需有4次>1.5或<0.67。

对差异蛋白的亚细胞定位筛选的得到仅表达于细胞外的间质蛋白，即为结肠癌间质标志物。结果如图3所示，这些标志物在结肠癌癌变不同阶段的表达水平变化情况。(见表1)。

实施例3

Tenascin-C在不同阶段组织中表达情况(见表2)

搜集50例NCM，50例ACP，30例CIS和63例ICC石蜡包埋组织切片。切片脱蜡后，与Tenascin-C抗体(1:1000)孵育过夜，与过氧化物酶标记二抗反应后，DAB显色。切片经苏木素复染。在显微镜下对每张切片阳性密度、染色强度进行计分。计分范围为0-6七级：0，1，2为无表达；3，4为低表达，5，6为高表达。染色结果如图4所示。

结果如表2所示：正常间质中74％为无表达，22％低表达，仅2％高表达。而浸润肿瘤间质中仅16％低表达，45％高表达，统计显示差异具有显著性。说明间质中Tenascin-C在癌变过程中高表达，与癌变过程相关。

实施例4

Tenascin-C在不同结肠细胞中的表达情况

培养不同结肠癌细胞系HCT116-,HCT116+,SW620,SW480,HT29及正常结肠细胞NCM460。接种细胞与培养瓶中，待生长到80％融合时，用PBS洗涤细胞，换无血清培养基培养24小时，搜集条件培养基。经0.45um滤膜过滤，经3kD滤膜浓缩。采用Bradford定量试剂盒测定蛋白质浓度。细胞经NP-40buffer(20mM TrispH7.5,150mm NaCL,1mM EDTA,1％NP-40,protein inhibitor cocktail)裂解，BCA试剂盒测定蛋白浓度。

上述样本进行常规western-blot分析Tenascin-C表达情况。

如图5所示在细胞总蛋白中仅有高转移细胞株SW620中弱表达。而在条件培养基中SW620高表达。结果显示在高转移结肠癌细胞中Tenascin-C表达，且向胞外分泌Tenascin-C，这表明肿瘤细胞分泌Tenascin-C与其转移潜能相关。

实施例5

Tenascin-C与肿瘤转移关系

通过对不同样本Tenascin-C表达情况与其临床病理资料统计汇总，并进行关联分析。结果如表所示Tenascin-C与性别、年龄无关(p-value>0.05)，与TNM分期和转移相关(p-value<0.05)。(见表3)。

为此进一步对搜集了转移性淋巴结与无转移淋巴结，免疫组织化学分析Tenascin-C在淋巴结中的表达情况。见表4。

结果如图6所示，在转移性淋巴结中Tenascin-C高表达，而无转移淋巴结中Tenascin-C为阴性。对31例转移淋巴结及10例无转移淋巴结统计。结果如表所示，55％的转移淋巴结中Tenascin-C高表达，与无转移淋巴结比较具有统计学差异(p-value<0.05)。

表1 应用蛋白质组学技术鉴定的结肠癌转移相关间质标志物

表2 免疫组织化学分析结肠癌癌变不同阶段间质Tenascin-C表达

^a与正常间质比较,b与腺瘤息肉间质比较,c与原位癌间质比较.(Mann-Whitney U test确定p-value)

表3 结肠癌Tenascin-C表达水平与临床病理因素关系

Mann-Whitney U test确定p-value

表4 Tenascin-C表达水平与结肠癌淋巴结转移的关系

Mann-Whitney U test确定p-value

Claims (3)

1.一组结肠癌转移相关肿瘤间质标志物，其特征在于，所述标志物为Tenascin-C,Protein S100-A9,Protein S100-A8,Pyruvate kinase PKM,Endoplasmin,Calumenin,Calreticulin,Galectin-1,Dermcidin,Chromogranin-A,Tryptase alpha/beta-1,Nidogen-1,Laminin subunit alpha-4,Serum amyloid P-component。

2.如权利要求1所述标志物在制备筛查和辅助诊断结肠癌转移药物中的应用。

3.如权利要求1所述标志物在制备筛查和辅助诊断结肠癌转移试剂盒中的应用。