CN102439042A - 用于结肠直肠癌体外诊断的防卫素原-a6测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于结肠直肠癌体外诊断的方法，其通过确定取自怀疑患有结肠直肠癌患者的生物样品中防卫素原-A6肿瘤标记物的存在，其中所述方法可用于与结肠直肠癌有关的早期诊断，筛查，治疗随访和预后，以及用于复发诊断。

Description

用于结肠直肠癌体外诊断的防卫素原-A6测定方法
本发明涉及癌学领域。更具体地，本发明的主题是通过确定取自患者的生物样品中防卫素原-A6(prodefensin-A6)的存在而用于在人类患者中对结肠直肠癌进行体外诊断的方法，所述方法可用于与结肠直肠癌有关的早期诊断、筛查、治疗随访和预后、以及复发诊断。
结肠直肠癌(CRC)是主要的公共健康问题。其世界范围的发病率在1996年据估计为875000例新病例。考虑到两种性别，在西方国家中它是发生最频繁的癌症，它通常被归类为因癌症而死亡的前3个最普遍的原因。考虑到所有阶段，5年生存率在60％的范围。
只有早期诊断提供了治愈性治疗的希望。然而，目前没有早期的血清学的筛查测试也没有特异性的诊断测试。
目前在欧洲，结肠直肠癌的筛查使用两种不同的途径来进行：第一，使用临床奇异性测试，其在于寻找粪便中血液的存在(粪便潜血试验，FOBT，例如以商品名Hemoccult
Figure BPA00001464659800011
名义上市的)。此技术已显示了其临床的实用性。当其每2年被用于年龄在50和74之间的个体时，能减少15-20％因结肠直肠癌的死亡率。为此，有必要对超过一半的相关群体定期筛查，并如果发生阳性测试则对其进行结肠镜检查，任选地随后进行合适的治疗。
然而，此筛查技术受制于若干不利条件：
●此测试最主要的缺点是其一般的灵敏度，尤其对腺瘤(癌前异型增生病变)，若其尺寸大或代表严重发育异常，10例中有1例会导致癌症的发展。
●此测试也病不很特异。粪便中血液的出现可能涉及非肿瘤情况：溃疡性结肠炎、痔、肛瘘等。如果这样的话，必需进行结肠镜检查调查，缺点将在下文中描述。
●最后，Hemoccult
Figure BPA00001464659800012
测试很难被解读；因此它们必需在专业中心，由有资格的合格人员来解读。
特异性针对人血红蛋白的免疫学测试(Feca EIA
Figure BPA00001464659800013
Heme Select
Figure BPA00001464659800014
等)也已被描述。与Hemoccult
Figure BPA00001464659800015
相比，它们可能构成了进步，但它们本质上显示出相同的问题。因此，由Enterix Inc.所上市的InSureTM使得可以探测出87％的患结肠直肠癌的患者和47％有癌前息肉的人。它是探测人粪便中血红蛋白的测试，更具体地，是此分子的球蛋白部分。
第二个筛查策略是在50岁之后系统地进行结肠镜检查，这使得可以在理论上降低因结肠直肠癌的死亡率。然而，使用内窥镜检查来降低死亡率的筛查方针在健康良好的个体中对此检查的可接受性太低(在设立此筛查策略的欧洲国家中，对结肠镜检查的依从水平在2％左右)。存在不可忽略的穿孔的风险(0.1％)和结肠出血并死亡(1/10000)，它对于公共健康也太昂贵。此外，结肠镜检查要求非常限制性的先行结肠准备，这在很大程度解释了不佳的顺从性。
能被免疫测定检验的肿瘤标记物长久以来在结肠直肠癌的背景下被描述。它们尤其是癌胚抗原(CEA)和CA19-9。
CEA被用作随访。它不能被用于结肠直肠癌的筛查或早期诊断，因为它的灵敏度和特异性不够。这是因为此标记物被其它类型的癌症表达，而且在良性病理学中。无论如何，通过结合CEA和另一肿瘤标记物诸如CA19-9或CA72-4，有可能增加灵敏度而不丧失特异性。
CA19-9中生理变异的原因很罕见，但其它良性疾病(肝胆管的、胰腺的)，或恶性疾病会导致CA19-9的增加。因此，此单独的标记物对诊断也没有意义。尽管如此，因其血清浓度与肿瘤大小和转移的存在相关联，它也能实现治疗随访或复发的早期证实。
此外，商业上可获得的测试已被提出，诸如：
Figure BPA00001464659800021
由Ambrilia上市的
Figure BPA00001464659800022
是对CRC的快速和相对非损伤性的测试筛查。Colopath
Figure BPA00001464659800023
检测有结肠直肠病理状况的个人的直肠黏液中的缩醛磷脂(一类复合脂类，是磷脂的一部分)，ColorectAlertMD检测T-抗原，直肠黏液中的复合糖类。Colopath/ColorectAlertMD测试包含将直肠黏液应用于测试条，阳性或阴性的结果基于希夫反应。Ambrilia研究了1787名个体，并证实Colopath
Figure BPA00001464659800025
/ColorectAlertMD探测出54％的早期结肠直肠癌和49％的各期结肠直肠癌。
Figure BPA00001464659800026
由Myriad Genetics上市的COLARIS，是探测血液中MLH1和MSH2基因的突变测试，来筛查遗传性非息肉性结肠癌(HNPCC症)。测试的结果能在3周内得到。Myriad使用目前可用的最灵敏和最特异的测序技术。该测试是昂贵的。
由AMDL上市的
Figure BPA00001464659800032
是筛查不同种类型癌症的测试(肺、结肠、乳房、肝脏、胃等)。因此它对CRC不是特异的。所述测试的原理是基于双夹心酶连免疫吸附技术(检验DR-70抗原)。通过酶反应(偶联于生物素和链霉亲和素的抗体)来完成显示。显色反应指示癌症的存在。
申请人如今令人吃惊地显示出一种腺癌的特异标记物，其由恶性结肠肿瘤的癌组织释放并是这些肿瘤的特征，使其能在远离恶性肿瘤的生物样品和肿瘤自身中被检测到。
因此，本发明的第一个主题是体外诊断结肠直肠癌的方法，通过确定从怀疑患有结肠直肠癌的患者中采集的，优选远离肿瘤的生物学样本中防卫素原-A6的存在。
本发明也涉及此方法在与结肠直肠癌相关的早期诊断、筛查、治疗随访、预后、以及复发诊断中的用途。
因此，本发明的方法使得可以对结肠直肠癌进行特异的和早期的诊断，借助于简单的测试，表现为搜寻从患者内采集的生物样品中防卫素原-A6的存在，所述样品优选远离潜在的肿瘤。事实上，申请人出乎意料地显示，结肠肿瘤不仅特异地分泌防卫素原-A6，而且特别地从癌组织中释放它，如同将在下文中以更多细节显示的，它在使用本发明方法的生物样品中的浓度与健康患者中确定的参考值相比较是增加了。
可在远离或不远离肿瘤的生物样品中确定防卫素原-A6的存在，因此使确认成为可能，考虑到所寻找的病理状况。因此，本发明方法的一个优点在于使用远离潜在的肿瘤的样品作为诊断样品的可能性，因而使简单和非侵入性诊断成为可能，而组织诊断需要侵入性的活组织检查。事实上，研究组织标记物，例如在组织切片上(免疫组织化学)，也许有预测意义，但对于结肠直肠癌的筛查和诊断没有意义。
防卫素是一类参与宿主防御微生物攻击的抗菌肽。它们由30到40个氨基酸组成，具有选择性分解膜的特性。类似其它的真核蛋白，防卫素能以成熟蛋白的形式或前体的形式存在。
前体，也称前体蛋白，由前肽和成熟部分组成。因此，防卫素原-A6是成熟的防卫素-A6蛋白的前体蛋白，由100个氨基酸组成，包含信号肽(氨基酸1-19)、前肽(氨基酸20-65)和成熟的防卫素-A6蛋白(氨基酸66-100)。
通常，前体蛋白长久以来被认为仅仅是代谢分子。然而，若干近来的实例，尤其是在神经肽领域，指出在某些情况下，前体蛋白具有生物活性，其是特异的并与其能生成的成熟蛋白分离的。诚然，前体蛋白的序列包括成熟蛋白，例如防卫素原的序列包括防卫素，但它们的等电点和分子量是不同的。因此，防卫素和防卫素原被认为是两种不同的蛋白。
防卫素α5和α6基本上是小肠帕内特细胞产生的。在克罗恩病中，防卫素α5和α6的mRNA在结肠组织中过表达。Nam等人鉴定防卫素α6是结肠癌的潜在标记物。Nam等人发展了竞争性ELISA测定，其特异地检验防卫素α6。他们确定了阀值(30ng/ml)，超过此值，患者被诊断为患有结肠直肠癌。在分析18份来自健康供者和49份癌症的血清中，他们获得了69.4％的诊断灵敏度，83.3％的诊断特异性。所述文件中没有提及防卫素α6的前体，防卫素原α6。
因此，防卫素α6的前体，防卫素原-A6(Swiss Prot No.Q01524)从未被描述为可被使用作与癌症尤其是结肠直肠癌相关的标记物，且从未在远离或不远离恶性肿瘤的生物样品中被检测过。
表述“确定前体蛋白的存在”适用于表示确定超过对健康患者设定的参考值。寻找的前体可为完整的100个氨基酸的前体，没有信号肽的前体蛋白(氨基酸20到100)或单独的前肽(氨基酸20到65)。它也可以是后者的片段，诸如排除成熟蛋白(氨基酸66到100)的前肽的片段，和其片段。
依照本发明的特定实施方案，没有信号肽的防卫素原-A6的前体的存在被确定。此前体在Swiss-Prot数据库中的被描述的序列是SEQ ID No.1(EPLQAEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGSTRAFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL；相当于氨基酸20-100)。优选地，前体本身的存在至少有序列SEQ ID No.2(EPLQAEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALG)，最多有序列SEQ ID No.1被确定。
正如本领域技术人员所熟知，存在蛋白多态性，上述给出的序列只不过是指示性的。它们是Swiss-Prot数据库中指出的共有序列，但氨基酸置换以可以由本领域技术人员评估的百分比存在，以考虑其是否是相同的蛋白。类似地，前肽氨基酸65位的切割位点是理论上的，仅仅以指示的形式给出。
表述“被结肠肿瘤释放”适用于表示不论机制的主动或被动分泌，由肿瘤细胞自身或因肿瘤发展导致细胞表型病变或修饰的临近非肿瘤细胞释放的肿瘤标记物。
表述“以本发明方法完成的生物样品”适用于表示任何有可能含有感兴趣的肿瘤标记物的生物样品。在非远离肿瘤的生物样品的例子中，可提及固态样品诸如源自肿瘤，肿瘤活体组织检查，淋巴结，患者肿瘤转移的组织，以及从这些固态样品中纯化的细胞。在远离肿瘤的生物样品的例子中，可提及生物液体诸如全血或其衍生物，例如血清或血浆，尿液，唾液和渗出液，骨髓和粪便，以及从这些液态样品纯化的细胞。血液或其衍生物，粪便，并且从这些液态样品纯化的细胞是优选的。
本发明的方法可被改善，通过探测除防卫素原-A6外，至少一个其它的肿瘤标记物，其也恰当地由结肠肿瘤的癌组织释放。因此，合并至少两个标记物使得可以改善结肠直肠癌诊断测试的特异性和灵敏度。
因此，本发明的另一个主题也在于确定至少一个选自以下标记物的其它肿瘤标记物的存在：白细胞弹性蛋白酶抑制剂、埃兹蛋白、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪酸结合蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白(apolipoprotein)AI、载脂蛋白AII，I-丝束蛋白、β2-微球蛋白、蛋白酶体20S、半乳凝集素-3、L-乳酸脱氢酶链B、钙网蛋白、再生性胰岛衍生蛋白3α、肿瘤相关钙信号转导蛋白1、II型角蛋白细胞骨架8、I型角蛋白细胞骨架18、I型角蛋白细胞骨架19、上皮钙黏着蛋白、CEA、绒毛蛋白、CA 19-9、CA 242、CA 50、CA 72-2、睾酮、TIMP-1、cripto-1、蛋白二硫化物异构酶、内凝集蛋白-1(intelectin-1)、细胞角蛋白20、翻译控制性肿瘤蛋白、防卫素(原)-A5、MIF、丙酮酸激酶M2-PK、钙粒蛋白C、CD24、CCSA-3(结肠癌特异抗原)、和CCSA-4，其甲基化谱(methylation profile)具有特定变换的血液中DNA片段的探测，例如AXL4基因的甲基化DNA(无芒样同源框-4基因甲基化)或隔蛋白-9基因的甲基化DNA，探测粪便DNA片段的特定变化，诸如粪便DNA的特殊突变或粪便DNA甲基化谱的特定变化，探测粪便人血红蛋白。
表述“除防卫素原-A6外的肿瘤标记物”适合于表示蛋白，信使RNA或相应基因的特殊修饰，诸如突变或甲基化。换言之，仅有防卫素原-A6是单独以其蛋白的形式被寻找，其可为完整的或以片段的形式。
白细胞弹性蛋白酶抑制剂肿瘤标记物(Swiss Prot No.P30740，也被称为LEI，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B1，单核细胞/嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，M/NEI或EI)于1992年被测序。LEI通过形成不能被SDS作用分解的复合物特异地抑制具有弹性蛋白酶型或胰凝乳蛋白酶型特性的蛋白酶。因此LEI抑制由嗜中性粒细胞产生的三种主要蛋白酶：白细胞弹性蛋白酶、蛋白酶-3和组织蛋白酶G。这些蛋白酶使免疫系统能够通过蛋白酶解胞外或吞噬的底物来防御生物。然而，当这些蛋白酶过量时，它们是造成炎症反应的原因。因此，LEI可在调节和限制由细胞蛋白酶引起的炎症反应中起作用。申请人在这一部分令人吃惊地显示，在专利申请WO2009/024691中，此蛋白的浓度相对于为健康患者确定的参考值增加了，使此蛋白成为取自患有结肠直肠癌患者生物样品中的良好标记物，所述样品尽可能远离肿瘤。
埃兹蛋白标记物(Swiss Prot No.P15311，也被称为p81，细胞绒毛蛋白或绒毛蛋白-2)是在细胞膜和细胞的细胞骨架肌动蛋白丝间，尤其是在上皮细胞的微绒毛内提供连接的蛋白。W.G.Jiang和S.Hiscox指出，白细胞介素IL-2、IL-8、IL-10等，能抑制在人结肠直肠癌细胞系HT29中埃兹蛋白的表达。同样的作者指出，在结肠直肠癌细胞系HT115和HRT18中，埃兹蛋白表达的抑制减少了细胞间的粘附，增加了细胞的运动性和侵入性行为。他们推断，埃兹蛋白通过与细胞粘附分子E-钙黏着蛋白和β-联蛋白相互作用，调节细胞/细胞和细胞/基质的粘附。他们提出，埃兹蛋白可能在控制癌细胞侵入能力中具有重要作用。此外，T.Xiao等人使用ELISA测定来量化肺癌患者的血浆埃兹蛋白。然而，他们没有观察到任何相较于对照个体的差异。申请人在这一部分令人吃惊地显示，在专利申请WO2009/019365中，此蛋白的浓度相对于为健康患者确定的参考值增加了，使此蛋白成为取自患有结肠直肠癌患者生物样品中的良好标记物，所述样品尽可能远离肿瘤。
酰化氨基酸水解酶1标记物(Swiss Prot No.Q03154，也被称为EC3.5.1.14，N-酰基-L-氨基酸酰胺水解酶)是酰化氨基酸水解酶家族的一部分。它们是催化酰化氨基酸水解生成脂肪酸和氨基酸的酶。K.Lorentz等人于1975年发展了用于氨基酰化酶酶活力的免疫化学测定，并被用来检验不同的组织和血清。研究显示在肝病理学状况的情况中，氨基酰化酶活性的增加，但不在结肠癌的情况中。此外，酰化氨基水解酶1基因被鉴定在染色体3p21.1上。3p21.1区域在小细胞肺癌中被还原为纯合性，在这种情况下，酰化氨基酸水解酶的表达被抑制或探测不到。类似地，S.Balabanov等人指出，在肾癌情况下，酰化氨基酸水解酶的表达被抑制。申请人在这一部分令人吃惊地显示，在专利申请WO2009/019366中，此蛋白的浓度相对于为健康患者确定的参考值增加了，使此蛋白成为取自患有结肠直肠癌患者生物样品中的良好标记物，所述样品尽可能远离肿瘤。
肝脂肪酸结合蛋白标记物(Swiss Prot No.P07148，也被称为L-FABP、FABP1、FABPL、Z-蛋白或固醇转运蛋白)属于包含9个同工型的FABP家族。每个同工型依照其最先被检测到的组织来命名。这些同工型具有共享的功能和相似的三维结构，但它们的序列同源性不高。L-FABP于1985年被测序。它是胞浆中丰富的15kDa的小蛋白，有结合自由脂肪酸和胆红素的能力。一些近来的研究指出L-FABP蛋白表达的损伤能引起肿瘤生成过程。对前列腺癌而言，肿瘤组织活体检查中L-FABP mRNA的表达水平比正常组织中高10倍。对结肠癌而言，几个团队使用二维电泳技术鉴定出肿瘤组织中L-FABP蛋白的表达相比正常结肠黏液中降低了。此结果也被免疫组织化学技术所证实。此外，在结肠直肠癌转移到肝脏的患者中，L-FABP蛋白是预兆肝脏切除的标记物。在专利申请WO00/33083中，提出此标记物能在患有结肠癌的患者的生物液体中被检测到。申请人在这一部分证实了在专利申请WO2009/019368中，此蛋白的浓度相对于为健康患者确定的参考值降低了，使此蛋白成为取自患有结肠直肠癌患者生物样品中的良好标记物，所述样品远离肿瘤。
肠脂肪酸结合蛋白标记物(Swiss Prot No.P12104，也被称为I-FABP，FABP-2或FABPI)于1987年被测序。它是胞液中丰富的15kDa的小蛋白，有结合自由脂肪酸和胆红素的能力。I-FABP蛋白在小肠上皮细胞中被表达，构成约2％的此类细胞类型的蛋白含量。在组织水平，十二指肠和空肠含有比结肠显著高的I-FABP量(空肠：4.8μg/g，结肠：0.25μg/g)。I-FABP能在健康个体的血浆样品中被检测到。在另一方面，在某些病理状况下，诸如肠道局部缺血、克罗恩病、原发性胆汁性肝硬化，可能在某些个体中显出血浆I-FABP浓度的增加。对前列腺癌而言，已指出肿瘤组织活体检查中的I-FABP mRNA表达水平比正常组织中的高出7倍。使用氧化偶氮甲烷在大鼠中诱导结肠直肠肿瘤的模型中，当动物具有减少癌症发生率的饮食时(大豆蛋白、乳清水解产物)，I-FABP mRNA的表达水平减少了2.92到3.97倍。申请人证实，例如在专利申请WO2009/019366中，此蛋白的浓度相对于为健康患者确定的参考值增加了，使此蛋白成为取自患有结肠直肠癌患者生物样品中的良好标记物，所述样品远离肿瘤。
载脂蛋白是由极性氨基酸组成的蛋白家族，通过形成被称为脂蛋白的亲水大分子复合物在血液中运输脂类。对每种人类血浆载脂蛋白，有从基因多态性和/或从翻译后修饰得到的同工型，其在血液中的存在能与某些病理状况相联系。载脂蛋白的血浆浓度不是低微的，在1mg/ml的等级。
载脂蛋白AI标记物(NCBI No.490098，也被称作Apo A-I、Apo AI和ApoA1)是有243个氨基酸的，28kDa的蛋白。它基本由肝脏和肠合成。通过SELDI-TOF，此蛋白在患有结肠直肠癌的患者血清中相比健康个体显示不够丰富。然而，本文中明确提出通过合并Apo AI和其它蛋白标记物来区分患有CRC的患者和健康个体。此外，本文明确提出，由另一个团队通过免疫散射比浊法检验Apo AI没有证实此蛋白在CRC患者血清中不够丰富。Hachem等人在他们的部分，检验了结肠直肠癌转移至肝癌的患者血清中的Apo AI。申请人在其部分令人吃惊地显示通过免疫测定检验使其有可能显示在患有结肠直肠癌的患者中此蛋白浓度的降低，与Engwgen等人提出的不同，他们仅通过应用SELDI-TOF技术显示了此降低。通过免疫测定检验生物样品中的Apo AI是诊断结肠直肠癌的良好方法，所述样品远离肿瘤，就如Zhang等人的团队使用的非比浊法的免疫测定检验。
载脂蛋白AII标记物(Swiss Prot No.P02652，也被称为ApoA II、Apo-AII和Apo A2)，是17380Da，由两条每条77个氨基酸的通过二硫键连接的多肽链组成的蛋白。和载脂蛋白AI相似，载脂蛋白AII基本由肝脏和肠合成。Hachem等人除了Apo AI外，也检验了结肠直肠癌转移至肝癌的患者血清中的Apo AII。然而，结果不显著，不足以就寻找病理状况下结论。申请人在这一部分令人吃惊地显示，在专利申请WO2009/019370中，此蛋白的浓度相对于为健康患者确定的参考值降低了，这种在患有结肠直肠癌患者中此蛋白浓度的降低使其成为取自患有结肠直肠癌患者生物样品中的良好标记物，所述样品远离肿瘤。
I-丝束蛋白标记物(Swiss Prot No.Q14651，也被称为肠特异性丝束蛋白或丝束蛋白1)属于人丝束蛋白家族，其已知有三个代表：I-丝束蛋白、L-丝束蛋白和T-丝束蛋白。一些作者称丝束蛋白为“微丝结合蛋白”，而其他作者为I-丝束蛋白保留微丝结合蛋白的名称。丝束蛋白是结合肌动蛋白形成细胞骨架的蛋白。它们是70kDa的蛋白，在真核进化中相对保守。它们显示出强的组织特异性，正常组织中一次只出现一个同工型。在专利US-A-5 360 715中，丝束蛋白关于癌症的使用已被描述过，其提出了方法以确定细胞是否为造血的或瘤的，例如癌的。此方法要求检验细胞水平的L-丝束蛋白和T-丝束蛋白，更具体地是检验其mRNA。然而尽管有这些特性，先前还不曾有过使用血清或粪便样品来评估丝束蛋白的重要性与结肠直肠癌诊断的关系。此外，I-丝束蛋白从未被设想过作为潜在的癌症标记物。申请人在这一部分令人吃惊地显示，在专利申请WO2009/024691中，此蛋白的浓度相对于为健康患者确定的参考值增加了，使此蛋白成为取自患有结肠直肠癌患者生物样品中的良好标记物，所述样品尽可能远离肿瘤。
β2-微球蛋白(Swiss Prot No.P61769，也被称为β2-微球蛋白，β2M)是在大多数有核的人细胞表面的低分子量蛋白(11到12kDa)。某些患有癌症的患者的血清β2-微球蛋白水平增加，但此增加不是特异的，或与肿瘤本质，病程或疾病严重程度相关的。其它疾病中也观察到了显著的增加，诸如红斑狼疮，类风湿性关节炎，舍格伦综合征，淋巴系统的恶性疾病(多发性骨髓瘤，B细胞淋巴瘤)，某些病毒疾病(肝炎或艾滋病)和在血友病患者中。由于β2-微球蛋白通过肾小球被过滤，被近曲小管重吸收，它在血液中的浓度在肾脏病理状况下可被修饰。因此在肾脏病理状况下或作为获得性免疫缺陷病毒感染的随访，检验β2-微球蛋白通常对诊断有保留。然而，此标记物被认为是肿瘤标记物，尤其是结肠癌的。
蛋白酶体20S标记物(也被称为蛋白酶体)是蛋白酶体的中心结构，其自身是负责细胞内泛素化蛋白降解的分子复合物。蛋白酶体是700kDa的分子复合物，由28个亚基组成，以4个7个亚基的环相关联。在人中，已知有7个α基(α1，α2，α3，α4，α5，α6和α7)和10个β基(β1，β2，β3，β4，β5，β6，β7，β1i，β2i和β5i)。通过其催化特性的效能，蛋白酶体在细胞增殖，生长，调节和凋亡的机制中，也因此在癌化通路中起中心作用。用硼替佐米(万珂)抑制蛋白酶体是对多发性骨髓瘤的认可治疗。对血癌或肿瘤的II期或III期治疗试验在进行中。Lavabre-Bertrand等人指出，血清水平的蛋白酶体在某些病理状况下，尤其是在癌症中(骨髓瘤，淋巴瘤和固态肿瘤)能升高。
半乳凝集素-3标记物(Swiss Prot No.P1793，也被称为Gal-3，半乳糖特异性凝集素3，MAC-2抗原，IgE-结合蛋白，35kDa凝集素，糖类结合蛋白35，CBP 35，层粘连蛋白结合蛋白，凝集素L-29，L-31，半乳糖苷结合蛋白或GALBP)是能结合N-乙酰氨基乳糖型的β-半乳糖苷酶的凝集素。它是具有多重功能的蛋白，参与许多生物功能，包括肿瘤细胞的粘附，增殖，分化，血管再生成，凋亡和恶性癌症的发展。不同研究显示Gal-3能与许多分子形成复合物：CEA，IgE，层粘连蛋白，粘蛋白，Mac-2BP，LAMP1，LAMP2，纤连蛋白等。Gal-3的血清测定被Iurisci等人描述过。Gal-3在覆盖有Mac-2-结合蛋白(Gal-3-结合蛋白)的微板上被捕获，随后使用大鼠的抗Gal-3抗体来显示。此研究显示在肠道癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，黑色素瘤和非何杰金淋巴瘤的情况下升高了的血清Gal-3。
L-乳酸脱氢酶链B标记物(Swiss Prot No.P07195，也被称为LDH-B，LDH心单位或LDH-H)是能形成复合物以形成同源四聚体的蛋白。此蛋白也能与L-乳酸脱氢酶A链蛋白(Swiss Prot No.P00338，也被称为LDH-A，LDH肌单位或LDH-M)以异源四聚体的形式形成复合物。在许多固态肿瘤的血液中，四聚体复合物，被称为LDH的血清水平和/或血清酶活力与肿瘤块成比例增加。推荐它与人绒毛膜促性腺激素(β-hGC)和胎盘碱性磷酸酶结合使用，用于精囊癌的随访。LDH被认为是预测淋巴癌，白血病和结肠癌的感兴趣的标记物。
钙网蛋白标记物(Swiss Prot No.P27797，也被称CRP55，calregulin，HACBP，ERp60或grp60)是有多种功能的蛋白。它是能短暂地与几乎内质网所有单糖基化蛋白相互作用的凝集素。McCool等人因此指出钙网蛋白参与结肠粘蛋白MUC2的成熟化。使用组织，粪便或体液中钙网蛋白的检验用于诊断CRC的方法在专利申请WO03/065003中被描述。
再生性胰岛衍生蛋白3α标记物(Swiss Prot No.Q06141，也被称为RegIII-α，胰腺炎相关蛋白1或胰腺相关蛋白I(PAP 1))是在健康胰脏中微弱表达的蛋白。它在胰腺炎急性期和某些患有慢性胰腺炎的患者中过表达。在此情况下，它出现在胰液和血流中。Motoo等人通过ELISA测定指出，某些患有结肠癌，胃癌，肝癌或胰腺癌的患者血液中的PAP 1增加了，也在肾功能不全的情况下。为此，他们使用了由Dynabio公司(La Gaude，France)出售的ELISA测定(PANCEPAP)。
肿瘤相关钙信号转导蛋白1标记物(Swiss Prot No.P16422，也被称为主要胃肠肿瘤相关蛋白GA733-2，上皮细胞表面抗原，EpCAM，上皮糖蛋白，EGP，腺癌相关抗原，KSA，KS 1/4抗原，细胞表面糖蛋白Trop-1或CD326抗原)于1979年通过其能被直接抗结肠直肠癌细胞的抗体识别的能力被表征。如上所示，此蛋白有不同的名字，但最通常使用的是称它EpCAM。它是跨膜蛋白，在某些上皮细胞和许多癌症中的细胞基底外侧表面表达。早在1982年，Herlyn等人指出在患有结肠直肠癌的患者中注射抗EpCAM单抗能抑制肿瘤的生长。这些结果导致了基于被称为依决可单抗的抗EpCAM抗体的抗肿瘤治疗的发展。此外，Abe等人通过ELISA测定指出，被称为MK-1的EpCAM的可溶形式在被研究的癌症患者血流内增加了10％。
细胞角蛋白是组成上皮细胞细胞骨架中间纤维的一部分蛋白。目前，超过20种人细胞角蛋白已被鉴定。细胞角蛋白8(Swiss Prot No.P05787，也被称为细胞角蛋白-8，CK-8，角蛋白-8或K8)，18(Swiss Prot No.P05783，也被称为细胞角蛋白-18，CK-18，角蛋白-18或K18)，19(Swiss Prot No.P08727，也被称为细胞角蛋白-19，CK-19，角蛋白-19或K19)是上皮细胞中最丰富的，是癌症病理状况诊断的有用工具。此临床重要性与上皮细胞凋亡或增殖期释放的细胞角蛋白相联系。在凋亡情况下，此以可溶性片段形式的释放似乎是在胱天蛋白酶的蛋白水解作用下发生的。未降解的细胞角蛋白形式从未在血流中被描述过。临床上最常使用的三种细胞角蛋白测定是组织多肽抗原(TPA)测定，组织多肽特异性抗原(TPS)测定和CYFRA 21-1测定。TPA是测量细胞角蛋白8，18和19的广谱测试。TPS和CYFRA 21-1测定更特异些，特异地测量细胞角蛋白18和细胞角蛋白19的片段。这三种测定检测以它们自身形式或以蛋白复合物形式存在的可溶性的细胞角蛋白片段。TPA，TPS或CYFRA-21-1已被用作结肠直肠癌，乳腺癌，肺癌，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌和某些ENT癌症的治疗随访。血液中可溶性细胞角蛋白片段的检验事实上在复发的筛查或评估对使用疗法(放射疗法，化学疗法，激素治疗)的反应上有临床价值。常规检验尤其使评估肿瘤块的发展成为可能。关于肿瘤阶段和转移的形成，可溶性血液细胞角蛋白的量也有预测的一面。目前，最常用的细胞角蛋白血液测定是CYFRA 21-1。它被极度推荐用做患有非小细胞性肺癌患者的随访。存在不同商业可获得的对TPA(AB SangtecMedical Co.，Byk-Roland，等)，TPS(IDL Biotech AB，BEKI Diagnostics，等)和CYFRA 21-1(Roche Diagnostics，CIS Bio-International，FujirebioDiagnostics，等)的测定。此外，Kim等人指出粪便细胞角蛋白19(DiNonA Inc.)的检验结合粪便潜血试验可对肠胃疾病的筛查有用。
上皮钙黏着蛋白标记物(Swiss Prot No.P12830，也被称为上皮细胞钙粘蛋白，桑椹(胚)粘着蛋白，钙粘蛋白-1，CAM 120/80或CD324抗原)是一促成钙依赖性细胞粘附的跨膜蛋白。它特异地在上皮细胞中表达，其参与维持它们的表型。上皮细胞钙粘蛋白的胞质域结合β-连环蛋白，其自身结合细胞骨架的肌动蛋白纤维网。此上皮细胞钙粘蛋白/β-连环蛋白的结合在稳固上皮组织的细胞/细胞粘附中起必须作用。因此，上皮细胞钙粘蛋白的缺失能减少细胞粘附，增加癌细胞的侵入能力。上皮细胞钙粘蛋白或β-连环蛋白表达的减少通常与肿瘤的更大的侵略性和去分化相联系，尤其在胃肠癌症中。Roca等人指出患有结肠直肠癌的患者中，比起有正常表达水平的患者，上皮细胞钙粘蛋白低表达的有更不利的预测。早在1983年，Damsky等人指出，可溶性形式的上皮细胞钙粘蛋白可由MCF-7乳腺癌细胞系释放。此可溶性形式等同于上皮细胞钙粘蛋白胞外部分的切割。后来，Katayma等人指出可溶性形式的上皮细胞钙粘蛋白在癌症情况下可被释放到血流中，Willmanns等人指出血液中上皮细胞钙粘蛋白量的增加在结肠直肠癌中与肿瘤的时期相关。此外，商业试剂盒由Takara BioChemicals公司(Tokyo，Japan)提出。
CEA(癌胚抗原)的检验用来诊断结肠直肠癌自1965年由Gold和Freedman提出，但对此标记物的血液测定灵敏度差，对用来诊断结肠直肠癌处在相对落后的阶段。血清CEA的检验因此特别被推荐用于评估肝癌转移的风险和治疗随访。此外，它是结肠直肠癌的不很特异的标记物，事实上，它在许多其它癌症(肺，乳腺，等)中可增加。在另一方面，粪便CEA的检验似乎比血清CEA或粪便潜血的检验更灵敏更特异。然而，此检验还未被常规地提出。
反应性抗原决定簇1116-NS-19-9，更通常被称为CA19-9(糖抗原19.9)，被高分子量蛋白携带。血液中CA19-9的检验比CEA的检验更特异。血液中CA19-9的水平在结肠直肠癌，胰腺癌和肝癌(胆管癌)的情况中，也在非癌性病理状况下(胆管炎等)增加。它的使用结合CEA在癌症的诊断时期和病理状况的随访被推荐。
J.Holmgren等人指出，血清中CA50抗原的量在结肠直肠癌情况下增加。CA50抗原通过其被特异单克隆抗体识别的能力而被定义。
至于CA72标记物，T.L.Klug等人指出，血清中CA72抗原的量在结肠直肠癌情况下增加。CA72抗原通过其被特异单克隆抗体识别的能力而被定义。
类似地，P.Kuusela等人指出，血清中CA242抗原的量在结肠直肠癌情况下增加。CA242抗原通过其被特异单克隆抗体识别的能力而被定义。
人中用于结肠直肠癌诊断的睾酮检验由M.Holland等人提出。这些作者指出血液中睾酮水平在结肠直肠癌情况下下降。
至于TIMP-1，或基质金属蛋白酶组织抑制剂1型标记物，专利申请US2007/0020707尤其描述了通过检验体液来检验TIMP-1，用于结肠直肠癌的诊断。
F.Model等人在2006年7月的国际胃肠癌大会期间指出，有可能探测患有结肠直肠癌患者血浆中隔蛋白-9基因的甲基化形式。
M.P.Ebert等人指出ALX4基因，或无芒样同源框-4基因比起对照血清，在患有结肠直肠癌患者的血清中更经常性地甲基化(P＜0.0001)。使用41.4pg/ml的阀值，他们获得了83.3％的灵敏度和70％的特异性。
绒毛蛋白作为结肠直肠癌的血液标记物在专利申请FR2581456中被描述。
C.Bianco等人指出，结肠直肠癌情况下血清中cripto-1的量增加。
通过巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)诱导肠肿瘤发生被Wilson等人描述。近来，Lee等人也指出，MIF是结肠直肠癌早期诊断的潜在血液标记物。
蛋白质二硫化物异构酶标记物(Swiss Prot No.P07237，也被称为EC5.3.4.1，PDI，脯氨酰4-羟化酶亚基β，细胞甲状腺激素结合蛋白或p55)是多功能的蛋白，其催化分子内二硫键的形成，打破和重排。在细胞表面，它作为还原酶切割连接细胞的蛋白的二硫键。在这些细胞中，它是可溶性分子，位于内质网腔内，形成和重排新合成蛋白的二硫键。它含2个硫还氧蛋白催化结构域，有特征性的CXXC模体。在高浓度，PDI以伴侣蛋白行使功能，其抑制错误折叠蛋白的聚集。在低浓度，它有对抗性作用，促使聚集。PDI也形成不同酶的结构亚基，诸如催化原胶原前α链脯氨酸残基羟基化的脯氨酰羟化酶。在专利申请EP1724586中，PDI被描述为某些癌症的诊断标记物，诸如结肠癌。
用于结肠直肠癌诊断的内凝集蛋白-1(Swiss Prot No.Q8WWA0，也被称为肠乳铁蛋白受体，呋喃半乳糖结合凝集素，内皮凝集素HL-1或网膜素)检验在专利申请US2003/0082533中被描述。
使用翻译控制性肿瘤蛋白(Swiss Prot No.P13693，也被称为TCTP，p23，组胺释放因子，HRF或fortilin)和防卫素原-A5(Swiss Prot No.Q01523)作为结肠直肠癌中的标记物分别在专利申请US2003/0172388和US2006/0179496中被描述。术语“防卫素(原)((Pro)defensin)”适用于表示前体，即切割前的防卫素原，多肽，即防卫素原切割后的N-端部分和成熟的蛋白，即防卫素，对应于切割后的C-端部分。
M2-PK是丙酮酸激酶的异构酶，以二聚体或四聚体形式存在。二聚体形式在肿瘤细胞中是主导的，为此，被称为肿瘤M2-PK。许多研究使用通过ELISA检验粪便M2-PK作为结肠直肠癌的标记物，例如Hardt等人。
使用钙粒蛋白C或S100 A12蛋白作为结肠直肠癌的标记物在专利申请WO2007/134779中被描述。
Sagiv等人指出在结肠直肠癌情况下CD24表达的增加。
结肠癌特异抗体(CCSA)-3和-4蛋白是血清标记物，Leman等人将其与结肠直肠癌相关联。
最后，检验人粪便血红蛋白在实践中已知，能如先前描述那样实施。
除防卫素原-A6外的肿瘤标记物浓度，取决于所考虑的标记物，在使用本发明方法的生物样品中，相对于为健康患者确定的参考值增加或减少。
优选地，除防卫素原-A6外的肿瘤标记物选自白细胞弹性蛋白酶抑制剂、埃兹蛋白、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪酸结合蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、I-丝束蛋白、蛋白二硫化物异构酶、内凝集蛋白-1、细胞角蛋白20、翻译控制性肿瘤蛋白、防卫素(原)-A5、半乳凝集素-3、β2-微球蛋白、CEA、CA19-9、TIMP-1、M2-PK和MIF。
更优选地，除防卫素原-A6外的肿瘤标记物选自标记物L-FABP、β2-微球蛋白、半乳凝集素-3、CEA、CA19-9、TIMP-1、MIF和I-丝束蛋白。
依照特定的实施方案，本发明的方法包括探测以下标记物或由探测以下标记物组成：
-防卫素原-A6和L-FABP，
-防卫素原-A6、CA19-9和CEA，
-防卫素原-A6、β2-微球蛋白和CEA，
-防卫素原-A6、β2-微球蛋白、CA19-9和CEA，
-防卫素原-A6、β2-微球蛋白、L-FABP和CEA，
-防卫素原-A6、L-FABP、CA19-9和CEA，
-防卫素原-A6、β2-微球蛋白、CA19-9和CEA，
-防卫素原-A6、β2-微球蛋白、CA19-9、L-FABP和CEA，
-防卫素原-A6、β2-微球蛋白、CA19-9、半乳凝集素-3、L-FABP，MIF和CEA，
-防卫素原-A6、β2-微球蛋白、CA19-9、半乳凝集素-3、L-FABP、MIF、I-丝束蛋白和CEA。
当然，本发明的方法也包括检测任何其它本领域技术人员所知的结肠直肠癌标记物。
如先前所指出的，感兴趣的肿瘤标记物以蛋白形式、或以信使RNA形式、或相对应DNA的修饰(突变或甲基化修饰)而被检测，可理解防卫素原-A6仅以蛋白的形式被检测，其可以是全蛋白或蛋白片段形式。
确定生物样品中感兴趣的蛋白肿瘤标记物的存在，能通过被本领域技术人员所知的任何方法，确定样品中蛋白的存在，诸如生化测试，包括免疫测定或质谱。
生化测试可是本领域技术人员普遍所知的任何测试，涉及分子相互作用，例如，所述肿瘤标记物和一个或多个与所述肿瘤标记物特异或非特异的结合配偶体间的反应。
优选地，生化测试是本领域技术人员所知的免疫测定，涉及作为抗原的肿瘤标记物和一个或多个特异结合配偶体，即直接抗此抗原的抗体间的免疫反应。
本发明的方法中寻找的肿瘤标记物特异或非特异的结合配偶体是任何有能力与此或其它标记物结合的配偶体。当它们有能力以高特异性与这些标记物结合，或甚至是100％的特异性则将它们称为特异的。当它们结合这些标记物的特异性低且它们因此有能力结合其它配体，诸如蛋白，则将它们称为非特异的。作为举例，可提及抗体，抗体结合段，受体和任何其它有能力结合此标记物的分子。
抗体结合配偶体是，例如，多克隆抗体或单克隆抗体。
依照特定实施方案，本发明的方法使用防卫素原-A6的特异结合配偶体，序列SEQ ID No.2。优选地，防卫素原-A6的特异结合配偶体是单克隆抗体，能识别包括在序列SEQ ID No.2中的任何线性或构象表位。
优选地，单克隆抗体特异地识别线性表位，至少是序列DP(SEQ IDNo.4)，优选地至少是序列EDDPLD(SEQ ID No.6)，至多是序列SEQ IDNo.2，或其特异地识别选自下列表位中的构象表位：
-至少是序列X1X2X3X4X5X6X7X8R(SEQ ID No.7)的表位，其中X1是V或L，X2是T或L，X3是P、S或C，X4是P或S，X5是W或T，X6是A、Q、M、C或E，X7是I、E或D，以及X8是F、Y、S或L，并且最多是序列SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12的表位，如附图4中所示，
-至少是序列X1X2X3X4X5X6HX7(SEQ ID No.13)的表位，其中X1是S或T，X2是C或不存在，X3是T、L或E，X4是H或R，X5是I、F或E，X6是G或V，以及X7是C或N，并且最多是序列SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ IDNo.16的表位，如附图4中所示，
-至少是序列X1HPX2X3X4X5X6X7(SEQ ID No.17)的表位，其中X1是P或W，X2是W或E，X3是S、A、Q或W，X4是M、L、R或P，X5是H、F、W或G，X6是V或A，以及X7是I或V，并且最多是序列SEQ ID No.18、SEQ IDNo.19、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21的表位，如附图4中所示，
-至少是序列X1HX2X3X4X5(SEQ ID No.22)的表位，其中X1是Y或N，X2是E、D或Q，X3是T、N、R、M或K，X4是W、H或F，以及X5是P或G，并且最多是序列SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28或SEQ ID No.29的表位，如附图4中所示。
特异地识别防卫素原-A6前肽部分的单克隆抗体是新颖的，构成本发明的另一个主题。
依照实施方案，本发明的单克隆抗体特异地识别至少是序列SEQ IDNo.4的表位，优选至少是序列SEQ ID No.6(表位1)，并且最多是序列SEQ IDNo.2的表位。
依照另一实施方案，本发明的抗防卫素原-A6单克隆抗体特异地识别选自以下表位的表位：
-至少是序列SEQ ID No.7的表位，其中X1是V或L，X2是T或L，X3是P、S或C，X4是P或S，X5是W或T，X6是A、Q、M、C或E，X7是I、E或D，以及X8是F、Y、S或L，并且最多是序列SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12的表位(表位2)，
-至少是序列SEQ ID No.13的表位，其中X1是S或T，X2是C或不存在，X3是T、L或E，X4是H或R，X5是I、F或E，X6是G或V，以及X7是C或N，并且最多是序列SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16的表位(表位3)，
-至少是序列SEQ ID No.17的表位，其中X1是P或W，X2是W或E，X3是S、A、Q或W，X4是M、L、R或P，X5是H、F、W或G，X6是V或A，以及X7是I或V，并且最多是序列SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21的表位(表位4)，
-至少是序列SEQ ID No.22的表位，其中X1是Y或N，X2是E、D或Q，X3是T、N、R、M或K，X4是W、H或F，以及X5是P或G，并且最多是序列SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28或SEQ ID No.29的表位(表位5)。
依照另一实施方案，本发明的方法使用对表位1特异的单克隆抗体，和对表位2、3、4、或5特异的单克隆抗体。优选地，本发明的方法使用对表位1特异的单克隆抗体和对表位2或4特异的单克隆抗体。更优选地，本发明的方法使用对表位1特异的单克隆抗体和对表位2特异的单克隆抗体。
术语“表位”适合于表示肽段具有至少由序列SEQ ID No.s 1到29定义的序列，至多有10，8，6或4个额外的氨基酸以均一的或非均一的方式分布于所考虑序列的两边中的一边，或仅在一边，也可是其类似物，同源物和结构等价物。
通常，术语“类似物”指的是肽，其具有序列和相对于天然分子有一个或多个氨基酸添加、取代(通常本质上说是保守的)和/或缺失的天然多肽结构，只要修饰不破坏抗原反应性。
尤其优选的类似物包括本质上保守的取代，例如，在氨基酸家族中发生的取代。具体地，氨基酸通常被分成4族，即(1)酸性氨基酸，诸如天门冬氨酸和谷氨酸，(2)碱性氨基酸，诸如赖氨酸，精氨酸和组氨酸，(3)非极性氨基酸，诸如丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸和色氨酸，(4)不带电荷的极性氨基酸，诸如甘氨酸，门冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有时被划分为芳香族氨基酸。例如，能合理地预测单独的用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸替代天门冬氨酸，或用丝氨酸替代苏氨酸或用一个结构相关的氨基酸替代另一氨基酸的类似保守替代，在生物活性上不会有很大影响。本领域的技术人员参考领域中熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolite划分方法容易地决定能经受改变的感兴趣的肽分子区域。
术语“同源性”适合于表示两个肽分子间的同一性百分比。两个氨基酸序列相互本质上同源，当序列显示出至少60％，优选地至少75％，更优选地至少80-85％，更优选地至少90％，更优选地至少95-98％或在定义的肽分子长度中更多的序列同一性。
术语“结构等价物”适合于表示包含在感兴趣的蛋白内的任何线性或非线性的肽序列，具有和感兴趣的构象表位相同的三维结构，诸如序列SEQ IDNo.s 7到29的表位，同时保留抗原反应性。这样的“结构等价物”可通过本领的技术人员从感兴趣的构象表位中容易地获得，通过使用生物信息系统，诸如SuMo或Superimposé系统，使找到蛋白中的三维结构或亚结构类似性成为可能。
多克隆抗体能通过使用关注的肿瘤标记物免疫动物获得，接着以纯化的形式回收要求的抗体，通过采集所述动物的血清，将所述抗体从其它血清成分中分离，尤其是通过柱子的亲和层析，其连接有被抗体特异识别的抗原，尤其是所述标记物。
单克隆抗体能通过杂交瘤技术获得，其一般原则在下文中被总结。
首先，动物，通常是小鼠，被感兴趣的肿瘤标记物免疫，所述动物的B淋巴细胞能够产生抗此抗原的抗体。这些抗体产生淋巴细胞被与永生具有分裂能力的骨髓瘤细胞(例子中是鼠源的)融合以产生杂交瘤。使用因此获得的细胞的异质混合，选择有能力产生特定抗体的无限分裂的细胞就此完成。每一个杂交瘤以克隆的形式分裂，每一个导致单克隆抗体的产生，其就所述肿瘤标记物的识别特性可被测试，例如，通过ELISA，单向或双向蛋白印迹，免疫荧光，或生物感应器的方式。因此选择的单克隆抗体尤其依照上面描述的亲合层析技术被后继纯化。
单克隆抗体也可是通过基因工程获得的重组抗体，通过使用本领域技术人员熟知的技术。
抗防卫素-A6分子的例子已知，尤其可在Alpha Diagnostic InternationalInc.的产品目录中获得。兔抗防卫素-A6多克隆抗体，Cat.No.HDEFA61-A。至今没有直接抗防卫素原-A6的单克隆抗体。
抗白细胞弹性蛋白酶抑制剂抗体的例子已知，尤其可在Abcam的产品目录中获得，兔抗LEI多克隆抗体，Cat.No.Ab47731。抗LEI单克隆抗体，克隆ELA-1，在Yasumatsu等人的文章中被描述。
抗埃兹蛋白抗体的例子已知，尤其可在Abcam的产品目录中获得，抗埃兹蛋白单克隆抗体，克隆3C12，Cat.No.Ab4069和兔抗埃兹蛋白多克隆抗体，Cat.No.Ab47418。
抗酰化氨基酸水解酶1抗体的例子已知，尤其可在Abnova的产品目录中获得，抗酰化氨基酸水解酶1单克隆抗体，克隆4F1-B7，Cat.No.H00000095-M01，和Abcam产品目录中，鸡抗酰化氨基酸水解酶1多克隆抗体，Cat.No.Ab26173。
抗肝脂肪酸结合蛋白抗体的例子已知，尤其可在Abcam的产品目录中获得，抗L-FABP单克隆抗体，克隆6B6，Cat.No.Ab10059，和兔抗L-FABP多克隆抗体，Cat.No.Ab7807。
抗肠脂肪酸结合蛋白抗体的例子已知，尤其可在R&D Systems的产品目录中获得，抗I-FABP单克隆抗体，克隆323701，Cat.No.MAB3078和Abcam产品目录中，兔抗I-FABP多克隆抗体，Cat.No.Ab7805。
抗载脂蛋白AI抗体的例子已知，尤其可在Biodesign Meridian LifeSciences的产品目录中获得，抗Apo AI单克隆抗体，克隆4A90，Cat.No.H45402M和羊抗Apo AI多克隆抗体，Cat.No.K45252P。
抗载脂蛋白AII抗体的例子已知，尤其可在US Biological的产品目录中获得，抗Apo AII单克隆抗体，克隆1402，Cat.No.A2299-31C和BiodesignMeridian Life Sciences产品目录中，羊抗Apo AII多克隆抗体，Cat.No.K74001P。
抗I-丝束蛋白多克隆抗体的例子已知，尤其可在Santa CruzBiotechnology的产品目录中获得。兔多克隆抗体H-300(Cat.No.sc-28531)与I-丝束蛋白，L-丝束蛋白和T-丝束蛋白反应。本申请已发展了直接抗I-丝束蛋白的单克隆抗体。
抗β2-微球蛋白，抗CEA，抗CA19-9和抗睾酮抗体的的例子已知，尤其在本申请的测定试剂盒，即Vidas
Figure BPA00001464659800191
β2-微球蛋白，Vidas
Figure BPA00001464659800192
CEA，Vidas
Figure BPA00001464659800193
CA 19-9TM和Vidas
Figure BPA00001464659800194
睾酮中被使用。
抗蛋白酶体20S抗体的例子已知，尤其可在Affinity Research Products的产品目录中获得。
抗半乳凝集素-3，抗L-乳酸脱氢酶链B，抗钙网蛋白，抗肿瘤相关钙信号转导蛋白1，抗II型角蛋白细胞骨架8，抗I型角蛋白细胞骨架18，抗I型角蛋白细胞骨架19，抗上皮钙黏着蛋白，抗绒毛蛋白和抗TIMP-1抗体的例子已知，尤其可在Abcam的产品目录中获得。
抗再生性胰岛衍生蛋白3α抗体的例子已知，尤其在Dynabio检测试剂盒(La Gaude，France)中被使用。
抗CA 242，抗CA 50和抗CA 72-4抗体的例子已知，尤其可在Fujirebio的产品目录中获得。
抗内凝集蛋白-1抗体的例子已知，尤其可在Alexis Biochemicals的产品目录中获得，抗内凝集蛋白-1单克隆抗体，克隆Saly-1，Cat.No.ALX-804-850-C100和兔抗内凝集蛋白-1多克隆抗体，Cat.No.ALX-210-941。
抗细胞角蛋白20抗体的例子已知，尤其可在Abcam的产品目录中获得，抗细胞角蛋白20单克隆抗体，克隆Ks20.8，Cat.No.Ab962和兔抗细胞角蛋白20多克隆抗体，Cat.No.Ab36756。
抗TCTP抗体的例子已知，尤其可在Abnova的产品目录中获得，抗TCTP单克隆抗体，克隆3C7，Cat.No.157H00007178-M01和抗TCTP多克隆抗体，Cat.No.157H00007178-A01。
抗防卫素A5抗体的例子已知，尤其可在Santa Cruz Biotechnology的产品目录中获得，抗防卫素A5单克隆抗体，克隆8C8，Cat.No.sc-53997，和在AlphaDiagnostic International Inc.的产品目录中，兔抗防卫素A5多克隆抗体，Cat.No.HDEFA51-A。
本发明方法寻找的肿瘤标记物特异或非特异的结合配偶体可被用作捕获试剂，检测试剂或捕获和检测试剂。
依照实施方案，防卫素原-A6特异的结合配偶体被用来捕获防卫素原-A6，使其有可能改进本发明诊断方法的特异性。
优选地，特异识别表位1的单克隆抗体在捕获中被使用，和/或特异识别表位2，3，4或5，优选2的表位的单克隆抗体在检测中被使用。
免疫反应的可视化，例如肿瘤标记物/结合配偶体，可通过诸如直接或间接的方法的任何检测方法来完成。
在直接检测的情况下，例如，不涉及标记，免疫反应，通过例如表面等离子共振或携带导电多聚物电极的循环伏安法被观察。
间接检测通过对显示试剂结合配偶体或对感兴趣的肿瘤标记物本身的标记方法来完成。在后者情况下，这被描述成竞争方法。
术语“标记”适合于表示连接有能力直接或间接生成可被检测信号的标记试剂。这些标记试剂的非限制清单包含：
●产生可被检测的信号的酶，例如通过比色法，荧光或发光，诸如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，
●发色团诸如荧光的或发光的化合物或染料，
●放射性分子诸如32P，35S或125I，和
●荧光分子诸如Alexa或藻青蛋白。
间接检测系统也可被使用，诸如，有能力与抗配体反应的配体。配体/抗配体对被本领域的技术人员所熟知，在此情况系，例如以下对：生物素/链霉亲和素，半抗原/抗体，抗原/抗体，肽/抗体，糖/凝集素，多核苷酸/多核苷酸互补序列。在此情况下，是配体携带结合配偶体。抗配体可通过先前段落中所述的标记试剂的方法被直接检测，或自身通过配体/抗配体的方法被检测。
这些间接检测系统在某些条件下可导致信号的放大。此信号放大技术被本领域的技术人员所熟知，可参考先前的专利申请FR98/10084或WO-A-95/08000应用，或Chevalier等人的文章。
取决于所使用的标记类型，本领域的技术人员会加入试剂是标记能被可视化。
经由上述定义的免疫测定例子，可提及的是“夹心”方法，诸如ELISA，IRMA和RIA，“竞争”方法和直接免疫检测方法诸如免疫组织化学，免疫细胞化学，蛋白印迹和斑点印迹。
当防卫素原-A6特异结合配偶体在“夹心”测定捕获中被使用，例如对表位1特异的抗体，检测中除了用作捕获的结合配偶体外，会使用对防卫素原-A6成熟部分(氨基酸66到100)特异的结合配偶体，或识别防卫素原-A6前肽部分的表位(氨基酸20-65)的结合配偶体。
质谱分析也能在本发明方法寻找的肿瘤标记物的生物液体中被使用，光谱测定法的原理被本领域的技术人员所普遍知道，被例如Patterson所描述。
为这么做，将经过或未经处理过的生物样品，在质谱仪中进行分析，获得的光谱与本发明方法中寻找的肿瘤标记物相比较。样品预处理的例子在于让其通过包含一个本发明方法中寻找的肿瘤标记物的结合配偶体的免疫捕获支持物，例如直接抗本发明方法中寻找的肿瘤标记物的抗体。另一个样品预处理的例子可为生物样品的初步分级分离，以分离样品中的蛋白。在本领域技术人员熟知的技术中，例如样品中的主要蛋白可首先被排除。
生物样品中感兴趣的肿瘤标记物的“mRNA”存在的确定可通过确定样品中存在mRNA的任何方法来完成，即mRNA的直接检测，或mRNA的间接检测，或本领域的技术人员所知的确定样品中RNA存在的任何其它方法。
术语“mRNA的直接检测”适合于表示生物样品中mRNA自身的显示。
生物样品中mRNA的直接检测可通过本领域中的技术人员所知的任何方法来完成，例如，通过和mRNA的特异结合配偶体的杂交，其适合通过PCR或NASBA技术扩增后。
术语“杂交”适用于表示在合适的条件下，两个核酸片段以稳定和特异的氢键相互结合形成双链复合物。这些氢键在互补的碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))间(被称为A-T键)，或在互补的碱基鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)间(被称为G-C键)形成。杂交的两个核酸片段可是完整的(参考互补的核苷酸片段或序列)，例如此杂交期间获得的双链复合物仅包含A-T键和C-G键。此杂交可是部分的(参考足够的互补的核苷酸片段或序列)，例如获得的双链复合物包含A-T键和C-G键，使其有可能形成双链复合物，但也包含不连接互补碱基的碱基。两个核酸片段间的杂交取决于被使用的操作条件，尤其是严格性。严格性尤其被定义为两个核酸片段的碱基成分的功能，也通过两个核酸片段间的错配率定义。严格性也能取决于反应参数，诸如杂交液中存在的离子种类和浓度，变性剂的本性和浓度和/或杂交温度。所有这些数据都被本领域的技术人员所熟知，合适的条件能被确定。通常，取决于希望杂交的核酸片段的长度，杂交温度在大约20和70℃间，尤其在35和65℃间，在一大约浓度为0.5到1M的盐溶液中。对mRNA特异或非特异的结合配偶体是任何有能力结合此mRNA的配偶体。经由例子，可提及的是核酸探针，扩增引物，和任何其它有能力结合此mRNA的分子。
术语“杂交探针”适合于表示包含从5到100个核单位，尤其是从10到35个核单位的核酸片段，在指定条件下具有杂交特异性，以与有重要特异性的感兴趣的目标基因形成杂交复合物。杂交探针可包含标记以使其能被检测。
出于本发明的目的，术语“扩增引物”适合于表示包含从5到100个核单位，优选地从15到30个核单位的核酸片段，能起始酶聚合作用，诸如，尤其是酶扩增反应。术语“酶扩增反应”适合于表示通过至少一种酶的作用产生核酸片段的多拷贝的过程。这样的扩增反应被本领域的技术人员所熟知，可尤其提及以下技术：
-PCR(多聚酶链式反应)，在专利US 4 683 195，US 4 683 202和US4 800 159中被描述，
-NASBA(依赖核酸序列的扩增)，专利申请WO 91/02818，和
-TMA(转录介导的扩增)，专利US 5 399 491。
术语“检测”适合于表示物理方法或使用诸如SYBR
Figure BPA00001464659800231
Green I或溴化乙锭插入染料的化学方法，或使用标记的检测方法。存在许多检测核酸的检测方法。
出于本发明的目的，杂交探针可是“检测”探针。在此情况下，“检测”探针通过如上所定义的标记方法被标记。此标记存在的功效，使其能检测给定检测探针和被检测的转录物间杂交反应的存在。
检测探针尤其可是“分子信标”检测探针。这些“分子信标”在杂交期间成为荧光的。它们有茎-环结构，含有荧光团和猝灭基团。特异环结构与其互补核酸序列的结合导致茎的伸展和在合适波长激发的荧光信号的发射。
杂交探针也可是“捕获探针”。在这种情况下，“捕获探针”被固定或能在固体支持物上通过任何合适的方法被固定，例如，直接地或间接地，例如通过共价或吸附。合适的固体支持物被本领域的技术人员所知，经由例子，可提及合成材料或天然材料，胶乳，磁性颗粒，金属衍生物，胶，等。固体支持物可是微量滴定板的形式，膜，如在申请WO-A-94/12670中所描述的，或颗粒。也有可能在支持物上固定几个不同的捕获探针，每一捕获探针特异针对一目标转录物。尤其，有可能使用固定有大量探针的生物芯片作为支持物。
探针在支持物上的固定也被本领域的技术人员所知，可提及通过直接转移，微沉积，原位合成和光刻法的探针寄存。
生物样品中DNA修饰或编码感兴趣的肿瘤标记物的基因异常可通过任何确定样品中DNA改变的方法来显示，即突变的直接检测，或感兴趣基因座甲基化特征改变的显示，或任何其它确定样品中DNA改变的方法，被本领域的技术人员所知。
突变可包括一个核苷酸点期待另一个，一个或多个核苷酸的缺失和一个或多个核苷酸的插入。突变可位于感兴趣的肿瘤标记物基因的编码区，或在5’和3’非编码区，诸如转录启动区域或转录终止区域。
显示突变的策略基于分子生物学技术，包含DNA提取，通过PCR或另一扩增技术的扩增，杂交和/或测序的步骤。在结肠直肠癌的情况下，以下方法被成功地用于粪便DNA中突变的检测：通过沉淀的DNA浓缩，在磁珠上使用捕获寡核苷酸富集目标，感兴趣基因的PCR扩增，固相测序鉴定点突变。相对于期望的参考片段和突变片段间的不同大小来鉴定缺失。Imperiale等人描述了位于K-ras，APC和p53基因中的一组21个突变，其使检测16/31的侵入性癌症成为可能。
其它使用的DNA标记物有BAT-26缺失，其是微卫星不稳定性的标记物，被称为长DNA(L-DNA)的高可扩增性DNA，其不是特异的标记物，但其似乎反应结肠腔中剥落的肿瘤细胞的紊乱凋亡。这些标记物无论在它们的灵敏度或它们的特异性上都不令人满意。
如先前所指出的，DNA的改变也可对应于感兴趣的肿瘤标记物相应基因的甲基化特征的修饰。甲基化特征的修饰可对应于低甲基化(甲基化数量的降低)或超甲基化(甲基化数量的增加)。改变的单位可位于感兴趣的肿瘤标记物基因的编码区，或在5’和3’非编码区，诸如转录启动区域或转录终止区域。
DNA甲基化的分析可使用基于定性和/或定量PCR完成，诸如MSP(甲基化特异PCR)，亚硫酸氢盐测序，使用甲基化敏感的限制性酶与PCR偶联，COBRA(结合亚硫酸氢盐的限制性分析)和Ms-SNuPE(甲基化敏感的单核苷酸引物延伸)。所有这些技术在方法学文章中被详细地比较性地综述了。
在文献中，几个超甲基化的基因在结肠直肠癌情况下被报导了。经由例子，可提及ALX4(无芒样同源框-4)基因，TPEF/HHP1(含有上皮生长因子和滤泡素抑制素结构域的跨膜蛋白)基因的启动区域或隔蛋白-9基因。
本发明的方法中当有至少两个标记物被检测时，它们可被分开显示，例如通过不同的免疫测定确定，或同时在多元测定中确定。
本发明的方法中当两个本质不同的标记物被检测时，例如蛋白标记物和mRNA标记物，从上述这些被描述的检测方法中选择两个不同的检测方法可被使用。它们也可被同时检测，在同样的检测介质和同样的反应条件下，如在专利申请WO 03/104490中描述的。此专利申请中描述的检测方法的步骤，其在于同时检测样品中的杂交和免疫反应，样品可含有由至少一个核苷酸和至少一个其它不同性质的配体的目标分析物，其在于：
(i)在事先覆盖所述目标分析物捕获配偶体的捕获表面点上已在反应缓冲液中稀释的已知量的样品，所述捕获配偶体包含至少一个核酸探针和至少一个抗配体，
(ii)在15℃和60℃的温度间反应，和
(iii)可视化因此获得的杂交和免疫反应。
生物样品可需要特别处理，因为它可含有本发明方法寻找的肿瘤标记物，同样地，或它可含有循环的肿瘤细胞，其含有本发明方法寻找的标记物和/或循环的肿瘤细胞，其有能力分泌本发明方法寻找的标记物。
因此，依照本发明的一实施方案，生物样品被预处理以分离所述液体中含有的循环的肿瘤细胞。
表述“分离循环的肿瘤细胞”适合于表示获得循环的肿瘤细胞中富集的细胞组分。
处理生物样品以分离循环的肿瘤细胞能通过流式细胞仪的细胞分选，通过Ficoll的富集，通过覆盖有特异抗体的磁珠的富集，或通过任何其它本领域技术人员所知的特异富集方法来完成。
在血液作为生物样品的情况下，循环的肿瘤细胞可通过Ficoll的细胞分离技术结合使用偶联于磁珠的抗CD45抗体(Dynal Biotech ASA，Norway)，排除血细胞的方法被分离。
本发明方法中寻找的肿瘤标记物的检测能通过直接使用从生物样品中分离的循环的肿瘤细胞来完成，例如用本抗发明方法中寻找的肿瘤标记物的抗体，通过细胞离心涂片器在涂片上点上循环的肿瘤细胞后，通过免疫细胞化学标记这些细胞。本发明方法中寻找的肿瘤标记物的检测也可通过使用流式细胞仪的方法直接得到的循环的肿瘤细胞中来完成，如Métézeau等人描述的。
在这些条件下，所述的循环细胞能在使其能屏蔽本发明方法中寻找的肿瘤细胞标记物的条件下被处理。这样的处理被Mathieu等人描述。
本发明方法中寻找的肿瘤细胞标记物的检测随后在使细胞膜可渗透，以允许对本发明方法中寻找的标记物特异的结合配偶体的进入后来完成。
本发明方法中使用的肿瘤标记物的直接检测，基于循环细胞，也可通过ELISPOT的方法来完成，例如，通过申请归档的专利申请WO 03/076942中描述的方法。此方法是检测和/或量化生物样品中循环肿瘤细胞的方法，其有能力在体外释放或分泌一种或多种肿瘤标记物，包含：
(i)在连接有至少一种对所述肿瘤标记物特异的结合配偶体的培养表面底部点上一定量的所述细胞，
(ii)在一定条件下培养所述细胞，使它们能释放或分泌所述肿瘤标记物，其在培养表面的底部被免疫捕获，
(iii)通过清洗移除细胞，
(iv)加入至少一种对所述肿瘤标记物标记的特异结合物，和
(v)可视化如此获得的标记。
在肿瘤细胞中直接检测本发明方法中使用的肿瘤标记物也可在所述细胞培养液中完成，在对它们在使其能分泌本发明方法中使用的肿瘤标记物的条件下培养之后。
释放或表达肿瘤标记物的培养条件是常规条件，如37℃，含5％CO2的湿润环境。
当生物样品为固态样品时，肿瘤标记物的存在也可在体内，在肿瘤原位被显示。
为了在体内显示肿瘤标记物的存在，任何本领域技术人员所知的成像方法可被使用。对此，所述肿瘤标记物的结合配偶体可被与成像示踪物偶联。
术语“结合配偶体与成像示踪物偶联”适合于表示有能力被本领域技术人员所知的任何成像方法检测的示踪物的连接，并直接或间接地产生可检测的信号。因此，示踪物可是放射性示踪物，诸如锝-99。在此情况下，患有原始癌症或转移的器官会结合肿瘤标记物和其示踪物。器官发出的放射能被特殊的相机拍摄，例如伽马相机。仪器收集放射性物质产生的闪烁粒从而使器官可能可视化。
在本发明的另一方法中，示踪物可包含正电子发射放射性的物质(氟18)。图像随后可通过正电子发射断层照相系统获得。
在本发明的另一优选方法中，肿瘤标记物的配偶体可被与纳米颗粒偶联。经由例子，它们可是超级磁性纳米颗粒，例如在直接细胞标记和通过核磁共振成像体内检测的阴离子磁性纳米颗粒。它们也可是纳米金颗粒。
依靠本发明的方法，使体内肿瘤标记物的检测成为可能，有可能可视化体内结合有肿瘤标记物结合配偶体的区域，癌症产生肿瘤标记物，尤其是结肠直肠癌，和它们的远处转移和涉及的淋巴结位置。
本发明的方法能被用于与结肠直肠癌相关的早期诊断、筛查、治疗随访、预后和复发诊断，由于仅仅只有癌细胞分泌防卫素原-A6，此生产取决于癌症的等级，其构成本发明的另一主题。
通过非限制性说明的方法给出的下列例子，本发明会被更清楚地理解，也通过附加的附图1到6，其中：
-附图1表现的是9个抗防卫素原-A6的单克隆抗体通过蛋白印迹技术的比较。图片显示相应于防卫素原-A6肽(SEQ ID No.1，7ng/孔)(附图1A)和分泌在转染的293T培养细胞上清中的防卫素原-A6蛋白(附图1B)的条带量的信号(强度*mm2)。条带量的准确值在表中指出(附图1C)；
-附图2表现的是9个抗防卫素原-A6的单克隆抗体通过点印迹技术的比较。图片显示防卫素原-A6肽(SEQ ID No.1)(附图2A)和防卫素原-A6肽(SEQ IDNo.3)(附图2B)相应于两个点平均量的信号(强度*mm2)。条带量的准确值在表中指出(附图2C)。此表中给出的比例*100是依照公式：防卫素原-A6前肽信号/防卫素原肽信号*100计算的；
-附图3是涉及通过间接的ELISA技术分析防卫素原-A6前肽识别的图片。以吸光度单位给出的ELISA信号的准确值在图片边上的表中被指出；
-附图4总结了被每个抗防卫素原-A6抗体1H8C9，11B2D2，11E8C9和13E7F3识别的序列。通过噬菌体文库和结合被研究的抗体显示的每个基序的氨基酸序列以“免疫反应基序”框给出。对每个抗体，这些免疫反应基序被比对，以确定用粗体显示的共有序列；
-附图5表示的是使用1H8C9检测抗体，对5个直接抗表位1的抗防卫素原-A6单克隆抗体使用夹心ELISA的反应性分析。使用的抗原是转染的293T培养细胞含有分泌的防卫素原-A6的上清。此上清被稀释到1/100或1/200。以RFV表示的ELISA的准确值在图片边上的表中被指出；
-附图6是涉及通过ELISA检验防卫素原-A6的图片，以pg/ml，在患有结肠直肠腺癌患者的血清中(CRC+)，在健康个体(CRC-)，在患有消化炎症疾病的患者(IDD)和患有结肠直肠腺瘤的患者；
-附图7表示在MCX小柱上通过固相萃取分级分离优化的防卫素原-A6肽EPLQAEDDPLQAK(SEQ ID No.30)。图片表示对应于肽727/556转换的峰面积对于在MCX小柱上实行分离分级的缓冲液pH值的函数。附图7A：溶于水的防卫素原-A6；附图7B：溶于健康个体人血清的防卫素原-A6。
实施例1：编码肿瘤标记物基因的克隆和重组蛋白的表达
对于肿瘤标记物酰化氨基酸水解酶1，LEI，L-FABP，埃兹蛋白，I-丝束蛋白，Gal-3，绒毛蛋白，I-FABP和钙网蛋白，cDNA的扩增和克隆，表达载体的构建和重组蛋白的表达和纯化在专利申请WO2009/024691中被详细描述。
1.通过转染在人细胞中表达防卫素原-A6蛋白
含有防卫素原-A6基因cDNA的表达载体(pCMV6-XL5 DEFA6)被购自Origene公司(Cat.No.SC303095)。被引入哺乳动物细胞后，此载体使在CMV启动子的控制下表达防卫素原-A6蛋白成为可能。
HEK 293T人胚肾细胞被维持在含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，37℃含5％CO2。细胞增殖至50％和70％间时使用以下两种转染试剂之一转染pCMV6-XL5 DEFA6表达质粒：Invitrogen出售的Lipofectamine LTX(CatNo.15338-100)或Euromedex出售的TransIT LT-1(Cat No.MIR2300)。在两种情况下，依照试剂的生产商提供的程序完成转染。转然后，细胞被孵育48小时以允许防卫素原-A6蛋白的生产。接着，培养液上清被收获，离心，随后过滤以除去细胞碎片。分泌到培养液上清中的防卫素原蛋白经历了所有对其折叠所必需的翻译后修饰；它是天然的。正是此上清在抗防卫素原-A6单克隆抗体的筛查和这些抗体的表征中被用作防卫素原-A6蛋白的来源。
2.肽的化学合成
对应于防卫素原-A6蛋白不同部分的三个肽依照本领域技术人员熟知的程序通过化学合成获得(NeoMPS)。序列在SEQ ID No.1中指出的肽对应于防卫素原-A6的整个序列，不含在多肽链迁移到内质网期间被切割的信号肽。此肽被称为防卫素原-A6肽或防卫素原-A6前体。序列在SEQ ID No.2中指出的肽对应于防卫素原-A6前体的整个前肽部分。此肽被称为防卫素原-A6前肽或防卫素原-A6前肽部分。序列在SEQ ID No.3中指出的肽几乎对应于防卫素原-A6前体的整个前肽部分。N-末端的4个氨基酸没有包括在序列中。此肽比起序列为SEQ ID No.2的肽更易大量生产，当4个氨基酸的存在非必需时被用作替代。
SEQ ID No.1：
EPLQAEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGSTRAFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL
SEQ ID No.2：
EPLQAEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGS
SEQ ID No.3：
AEDDPLQAKAYEADAQEQRGANDQDFAVSFAEDASSSLRALGS
实施例2：直接抗肿瘤标记物的单克隆抗体的生产
1.动物模型
免疫试验在首次免疫时年龄为6到8周的雌性BALB/c(H-2d)小鼠中完成。
2.免疫原和免疫
为了增加在小鼠中获得的免疫反应并能够产生单克隆抗体，肿瘤标记物以重组蛋白或依照实施例1中描述的过程生产合成肽的方式被生产。LDH蛋白从SciPac公司获得(Cat.No.103-133)。当合成肽被用作免疫原时，它们与携带蛋白偶联，诸如牛血清白蛋白(BSA)或KLH(钥孔血蓝蛋白)。这些蛋白被与Freund佐剂(Sigma)体积混合，以油包水乳剂的形式被制备，其已知具有良好的免疫原能力。三只小鼠被用每种肿瘤标记物免疫。小鼠在0，2，4周连续接受三次10μg剂量的免疫原。所有注射均为皮下的。首次注射给以完整的Freund佐剂混合物，接下来的两次给予不完整的Freund佐剂混合物。首次注射后在D50和D70间，体液反应使用静脉注射100μg重组蛋白被再次刺激。对于防卫素原-A6，两个不同系列的免疫被完成。第一组小鼠接受偶联于BSA和KLH的(依照注射交替)防卫素原-A6肽(SEQ ID No.1)。第二组小鼠接受偶联于BSA和KLH的(依照注射交替)防卫素原-A6肽(SEQ ID No.2)。抗防卫素原-A6抗体从分属于两组的动物中获得。
3.体液反应出现的监控
为了监测抗体的出现，血液样品定期地从小鼠中被采集。抗肿瘤标记物抗体的存在使用ELISA被测试。感兴趣的蛋白被用作捕获(1μg/孔)；饱和后，测试血清的不同稀释系列被与抗体反应(37℃孵育1小时)。血清中特异抗体的存在使用AffiniPure的偶联于碱性磷酸酶的羊抗小鼠IgG抗体(H+L，Jackson Immunoresearch，Cat No.115-055-146)来显示，其结合被寻找的抗体(0.1μg/孔)。
4.单克隆抗体的生产
末次注射三天后，对每一种肿瘤标记物，处死一只被免疫的小鼠；血液和脾被移除。从脾获得的脾细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞一起培养以使它们融合成为永生的，依照
Figure BPA00001464659800301
和Milstein描述的实验计划。在孵育12-14天后，获得的杂交瘤的上清被筛选以确定抗肿瘤标记物抗体的存在，使用此实施例第三点中描述的ELISA测定。当连接有BSA或KLH的合成肽被用作免疫原时，直接抗BSA和KLH的克隆通过完成用游离的BSA或KL用作捕捉的ELISA筛选被去除。阳性的杂交瘤克隆依照有限稀释技术被二次亚克隆，其被本领域的技术人员所熟知。
5.通过免疫印迹表征单克隆抗体
直接抗酰化氨基酸水解酶1，LEI，埃兹蛋白，I-丝束蛋白，Gal-3，钙网蛋白和LDH肿瘤标记物的单克隆抗体在专利申请WO2009/024691中被描述。
1H8C9，11B2D2，13E7F3，11E8C9，6E1B4，10C2G3，12F3F2，12F8E4和12H4E1单克隆抗体直接抗防卫素原-A6通过完成此实施例第1到第4点中描述的技术被获得。
5.1方法学
转染的293T细胞系培养提取物通过直接用600μl含0.5％Triton X-100和蛋白酶抑制剂的PBS裂解，随后依照NuPAGE Novex胶样品制备实验计划(Invitrogen)来制备。为获得组织提取物，患者CLSP105的肿瘤和粘膜活组织使用解剖刀被分离，随后受到10轮提取，在Medimachine系统(BectonDickinson)中使用50μm Medicon，在含有2.5mM EDTA和蛋白酶抑制剂(Roche completeTM药片)的1ml PBS缓冲液中。10ml的这些细胞上清被集中，补足到25ml，随后600g离心15分钟。上清对应于依照NuPAGE Novex胶样品制备实验计划处理的组织提取物。减缩的样品被使用，终总蛋白浓度为0.4mg/ml。在NuPAGE Novex bis-tris 4-12％胶上，上样量为每孔20μl，使用MES电泳缓冲液。迁移后(200V，1小时)，转到PVDF膜上(400mA，45分钟)，转膜质量通过酰胺黑染色检验。
膜用TNT(15mM Tris，0.14M NaCl，0.5％Tween 20，pH 8)溶液配的5％的脱脂奶(Régilait)在室温饱和1小时。饱和后，膜与不同被稀释到10μg/ml测试抗体在饱和溶液中孵育1小时。用TNT漂洗后，膜与1∶5000稀释的抗小鼠偶联辣根过氧化物酶(Cat No.115-035-062，Jackson Immunoresearch)在饱和溶液中室温孵育1小时。漂洗后，显影通过Substrate Supersignal WestDura Extended试剂盒(Cat No.34076，Pierce)依照使用推荐信息完成。附图1中展示的实验曝光时间为2分钟，表1中展示的实验曝光时间为100秒。
膜上的化学发光信号使用BioRad的VersaDoc 5000成象系统被测量。基于蛋白印迹的影像，对应于不同肿瘤标记物的带体积使用QuantityOnesoftware(Bio-Rad)被评估。体积对应于化学发光信号的强度乘以带的表面积。
5.2结果
附图1和表1中再现的蛋白印迹结果给出了带体积对应于用于蛋白印迹分析的感兴趣的肿瘤标记物，作为被测试的不同样品的函数。含有分泌的防卫素原-A6和防卫素原-A6肽(7ng每孔)的转染有pCMX-XL5-防卫素原-A6质粒的293T细胞培养液上清被使用，来评估9个抗防卫素原-A6抗体蛋白印迹的反应性(附图1)。所有抗体识别防卫素原-A6肽。所有抗体，除了单克隆11E8C9，识别在被使用的实验条件下分泌到培养液上清中的防卫素原-A6。然而获得的信号强度非常不同。显示并非所有抗体具有同样的反应性。表1中展示的结果显示，被测试的肿瘤标记物在从患者获得的肿瘤组织中很好地表达。防卫素原-A6不被Caco-2或HT-29结肠细胞系表达；因此，这些裂解液未被包括在分析中。
样品中使用抗体获得的信号强度能被与其它使用同一抗体的样品获得的信号相比较。所使用的技术使可能确认组织中(非远离样品)标记物的存在或缺失，以及与标记物有关的抗体的特异性。此技术在此实施例中未被使用在远离的样品中，因为它不能就远离的样品中的肿瘤标记物的存在或缺失得出结论，也不能确定所述肿瘤标记物的浓度在所述样品中是否增加或降低。另外，使用的实验方案使其不能就一种抗体的反应性和另一种比较。
表1
Figure BPA00001464659800321
6.通过点印记分析单克隆抗体识别防卫素原-A6前肽
6.1方法学
点印迹分析使用防卫素原-A6肽(SEQ ID No.1，浓度0.1mg/ml)和防卫素原-A6前肽(SEQ ID No.3，浓度2.38mg/ml)完成。每种样品滴被双份点样在硝酸纤维素膜上(Transblot transfer medium，Bio-rad)，随后在敞开空气中被干燥。
免疫显影实验计划与在此实施例5.1段落中描述的一致。此实验的曝光时间是1分钟。
6.2结果
所有被测试的抗体在点印迹中识别防卫素原-A6肽(SEQ ID No.1)(附图2)。此技术中最具反应性的抗体是10C2G3克隆。6E1B4，12F3F2，12F8E4和12H4E1抗体形成同质组，反应性小于10C2G3，但比1H8C9，11B2D2，13E7F3和11E8C9组大些，其更为不同质。另外，蛋白印迹和点印迹的反应性不总相一致：在点印迹中，6E1B4，12F3F2，12F8E4和12H4E1抗体具有相似的反应性，而在蛋白印迹中获得的信号强度是不同的(附图1和2)。蛋白印迹是在变性条件下完成的，而对于点印迹，肽未被变性直接点样。
仅6E1B4，10C2G3，12F3F2，12F8E4和12H4E1抗体在点印迹中识别防卫素原-A6前肽(SEQ ID No.3)。1H8C9，11B2D2，13E7F3和11E8C9抗体未显示任何与防卫素原-A6前肽(SEQ ID No.3)的显著反应性，表明它们的表位位于防卫素原-A6前体的成熟的防卫素-A6部分。因此，在与防卫素原-A6前肽(SEQ ID No.3)反应的5个抗体中，其最小表位含有在此序列中，6E1B4，10C2G3，12F3F2和12F8E4抗体都展示出相同的反应性特性：对所有这些抗体，获得的信号比率(防卫素原-A6前肽/防卫素-A6肽*100，附图2)在29和31之间。12H4E1克隆与这些其它的抗防卫素原-A6前肽抗体不同，因为此比率是6。它识别前肽相比其它4个抗体要不好些。
7.通过间接ELISA分析单克隆抗体识别防卫素原-A6前肽
7.1方法学
96孔板(为Nunc，Maxisorp型)使用PBS稀释至2μg每孔的防卫素原-A6前肽(SEQ ID No.3)覆盖，室温过夜。板子用PBS-0.05％Tween 20(PBS-T)配的10％的牛奶于37℃饱和1小时。在PBS-T中完成3次清洗，稀释在含有1％BSA的PBS-T中的生物素标记的测试抗体以0.2μg/孔被放置到板上，孵育于37℃，1小时。PBS-T洗三次后，偶联有辣根过氧化物酶的链霉亲和素(Jackson Immunoresearch Cat.No.016-030-084，在含有1％BSA的PBS-T中稀释1/20000，100μl/孔)被加入。37℃孵育1小时和三次PBS-T清洗后，加入OPT EIA底物(BD)，100μl/孔。20分钟后，当显色产生后，用5N硫酸的终止反应，测量450nm的吸收。展示的结果是两次测量的平均值，平均背景噪声(0.02光密度单位)未被扣除。
7.2结果
间接ELISA测定的结果在附图3中被展示。在使用的实验条件下，仅4个抗体，6E1B4，10C2G3，12F3F2和12F8E4结合吸附到固相上的防卫素原-A6前肽。其它5个抗体，包括12H4E1，不以此形式结合前肽。此实验证实了点印迹的结果(附图2)，并确证了即便12H4E1单克隆抗体识别防卫素原-A6前肽，它的反应性相比其它4个单克隆6E1B4，10C2G3，12F3F2和12F8E4要小很多。
8.使用光点扫描和噬菌体显示肽文库筛选技术表征被单克隆抗体识别 的表位
8.1方法学
依照Frank和
Figure BPA00001464659800331
改良的光点扫描技术，使同时合成结合于纤维素膜的大量肽成为可能。这些肽再现了以8到12个氨基酸肽形式的目标抗原序列，重叠1到4个残基。这些肽随后被与在印迹类型比色试验中研究的抗体接触，有免疫反应性的肽的鉴定使其可能推测抗体表位的最小序列和将其精确定位在抗原上。
合成在纤维素膜上完成，其均匀地携带有长度为8到10个单位的聚乙二醇(PEG)臂，在链的末端具有自由NH2功能。其从肽的C-末端向N-末端发生。氨基酸的氨基功能使用Fmoc(9-氟甲氧羰基)基来检测，它们的侧链，在合成期间能进行反应，也被三苯甲基，叔丁基或叔丁乙醚基保护。氨基酸母液以0.33M的浓度在含有0.5M HOBt(羟基苯并三唑)的MNP(N-甲基吡咯烷酮)中制备。氨基酸使用ASP 222自动控制装置加样(Abimed，Langenfeld，Germany)，通过AutoSpot XL软件来控制。此自动控制装置的使用使同时完成4张96孔膜成为可能。例如384个肽。
对一个氨基酸偶联循环，自动控制装置在膜上点0.7μl即时活化的氨基酸溶液(一个体积的NMP稀释的1.1M的二异丙基碳二亚胺溶液用于三个体积的氨基酸储备溶液)。此点样被重复第二次，随后，膜用DMF(二甲基甲酰胺)漂洗。没有反应的NH2基团随后被乙酰化，在含有10％乙酸酐溶液的DMF中通过4到6次10分钟的孵育，以防止异常的或截断的肽的出现。在DMF中三次2分钟的清洗后，保护氨基酸氨基功能的Fmoc基团通过含有20％哌啶溶液的DMF被剪切。在DMF中清洗四次后，样品点使用含1％溴酚蓝溶液的DMF染色，随后膜在甲醇中被三次漂洗，在后继的偶联循环前在敞开空间中被干燥。
对每个新的氨基酸的添加此实验计划被重复。在偶联最后的氨基酸后，肽被乙酰化以使能屏蔽所有自由的NH2基团，从而防止另一个氨基酸的添加。所有氨基酸的侧链随后通过把膜在三氟乙酸/二氯甲烷/三异乙基硅烷(5∶5∶0.3)中孵育1小时被去保护。膜随后在敞开空气中被干燥并贮存于-20℃直至免疫显影，之前在二氯甲烷中被漂洗四次，DMF中三次，甲醇中三次。
为使用单克隆抗体来免疫显影样品点，膜首先在甲醇中被漂洗，随后在TBS(50mM Tris-HCl，pH 8.0，140mM NaCl，3mM KCl)中被清洗，在被于饱和溶液中(用TBS-0.05％Tween 20(TBS-T)和含有5％蔗糖的酪蛋白10x浓缩溶液(蛋白印迹封闭试剂，Roche)稀释)室温过夜孵育前。在TBS-T中洗一次10分钟后，膜与用饱和溶液稀释到20μg/ml的单克隆抗体在37℃孵育1小时30分钟。膜随后再TBS-T中被洗三次，再与碱性磷酸酶偶联的抗小鼠偶联物孵育(Jackson Immunoresearch)，在饱和溶液中稀释到1/2000。在两次10分钟于TBS-T中清洗，随后两次于CBS(10mM柠檬酸，pH 7，140mM NaCl，3mM KCl)中清洗后，即时准备的显影剂(600μM 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，720μM溴化噻唑蓝四唑和5mM MgCl2在CBS中)与膜在暗处接触30到45分钟。免疫反应性的肽出现蓝紫色。双蒸水中漂洗三次后，膜被扫描随后保存于水中直至再生。
再生使其可能移除结合于肽的抗体和偶联物，从而使其可能完成与另一个抗体相关的进一步的免疫反应性测试。膜历经一系列的清洗，每次10分钟：一次在双蒸水中，六次在DMF中，三次在再生缓冲液A中(8M尿素，35mM SDS(十二烷基硫酸钠)，0.1％β-巯基乙醇)，三次在再生缓冲液B中(双蒸水/乙醇/醋酸4∶5∶1)，两次在甲醇中。膜随后于贮存前在敞开空气中被干燥。
通过噬菌体展示肽库筛选对表位的表征，使用New England Biolabs的商业PhD12噬菌体展示肽库试剂盒(Cat.No.E#8110S)完成，依照试剂盒提供的指示，日期为2007年11月，版本为2.7的实验计划。
8.2结果
表2再现了被五个抗防卫素原-A6前肽抗体识别的表位，其表位通过光点扫描技术被分析。所有这些抗体识别防卫素原-A6前体的相同区域，坐落于依照从起始甲硫氨酸(表位1)编号的氨基酸25和30之间。在另一方面，被不同单克隆识别的确切序列是不一致的。因此，10C2G3克隆识别两个氨基酸(DP)的最小序列，而12H4E1和6E1B4克隆需要有六个氨基酸(EDDPLQ)的最小序列来结合。附图2和3中展示的结果显示10C2G3克隆使其可能在识别防卫素原-A6肽的点印迹和间接ELISA中获得最高的信号。令人吃惊的是，12H4E1克隆与其它直接抗防卫素原-A6的抗体不同(附图2和3)，虽然识别的最小序列与6E1B4抗体一致。12H4E1抗体在总前体蛋白(SEQ ID No.1)的情况下比起在防卫素原-A6前肽(SEQ ID No.3)的情况下更好地识别EDDPLQ序列(SEQ ID No.6)
表2
Figure BPA00001464659800351
Figure BPA00001464659800361
a防卫素原-A6结合被测试抗体区域的氨基酸序列。圆括号间的数字相应于防卫素原-A6氨基酸序列上的表位位置，编号始于起始甲硫氨酸。
被1H8C9，11B2C2，13E7F3和11E8C9抗体识别的表位不能通过光点扫描技术被确定，其指出它们不是线性的。噬菌体展示肽库筛选使其可能选择分别与1H8C9，11B2C2，11E8C9和13E7F3抗体反应的5，3，7和4模拟位。这些模拟位的序列在附图4中给出。对每一个抗体，被识别的或免疫反应性模拟位的序列被比对，以确定一致序列，其在附图4中以粗体指出，其代表了被抗体识别的最小序列。在防卫素原-A6的一级结构(或肽序列)中不能发现即便一个这样的一致序列。因此，这些一致序列对应于分散在蛋白一级结构的残基，其在它们的三维结构上享有近似，以形成构象表位。
9.通过夹心ELISA检测防卫素原-A6
9.1方法学
防卫素原-A6通过例如Vidas
Figure BPA00001464659800362
ELISA自动系统(bioMérieux)的夹心免疫测定的使用被检测。此类测试也能在微板上以自动或手动的方式完成。要这样做，ELISA测定使用Vidas
Figure BPA00001464659800363
HBs Ag Ultra试剂盒(bioMérieux，Cat.No.30315)的试剂来构建。试剂如在相应的产品信息(ref.11728D-FR-2005/05)中描述的被使用，外加以下修饰：
1.锥体使用九个用于测试的捕获抗体来敏化，浓度为10μg/ml。
2.HBs Ag Ultra柱的第二孔中的内含物被300μl用于测试的偶联于生物素，在Vidas
Figure BPA00001464659800364
HBs Ag Ultra试剂盒的第二孔的缓冲液中(无羊血清)稀释到1μg/ml的揭示抗体(1H8C9和11E8C9)替换。
3.转染有pCMX-XL5-防卫素原-A6质粒，含有分泌的防卫素原-A6的293T的培养液上清被直接单纯的或用PBS稀释后加入到HBs Ag Ultra柱的第二孔中(50μl)。
4.ELISA反应使用Vidas
Figure BPA00001464659800365
自动系统和HBs Ag Ultra实验计划完成，其孵育样品和捕获及揭示抗体采用100个循环。
5.结果以粗值的形式获得。信号以RFV，相对荧光值。
9.2结果
表2再现了转染有pCMX-XL5-防卫素原-A6质粒和含有天然防卫素原-A6蛋白的293T培养液上清中以1/2稀释的不同抗体组合的反应性。
表3a
Figure BPA00001464659800371
aVIDAS夹心免疫测定中的信号，以RFV(相对荧光单位)。
*：单纯上清检验信号。其它的上清被稀释到1/2。
表2展示的结果显示其可能使用基于不同表位组合的夹心ELISA来探测防卫素原-A6：例如，表位No.5和4，表位No.1和4，或优选地表位2和任何其它被鉴定的表位(1，3，4，5)的组合。更优选地，表位2被用于检测。在另一方面，表位No.2和4或No.3和4的组合使其不能检测防卫素原-A6。
用于捕获的，直接抗表位1的抗体反应性的更精细的分析，结合1H8C9克隆，在附图5中被展示。12H4E1克隆是最佳的捕获抗体，处于第二位置的是10C2G3和12F3F2克隆。最低信号被从6E1B4和12F8E4抗体获得。此结果很令人吃惊，因为6E1B4和12H4E1克隆识别相同的最小序列。
实施例3：肿瘤标记物的血清测定
1.患者和样品
血液样品从分布于法国的八个临床中心网被收集，在两个Huriet-law实验计划的情况下。
为了获得血清，血液样品被采集到干燥的试管中。为了获得血浆，血液样品被采集到EDTA试管中。凝固后，试管于1000g离心10分钟，血清被移除，分装并贮存于-80℃。样品被完成地记录下患者的临床史。
2.防卫素原-A6肿瘤标记物的血清测定
防卫素原-A6前体蛋白使用实施例2中详细描述的抗体和使用Vidas自动系统(bioMérieux)的ELISA测定被检验。要这样做，ELISA测定使用Vidas
Figure BPA00001464659800382
HBs Ag Ultra试剂盒(bioMérieux，Cat.No.30315)的试剂来构建。试剂如在相应的产品信息(ref.11728 D-FR-2005/05)中描述的被使用，外加以下修饰：
1.锥体使用捕获抗体12H4E1来敏化，浓度为5μg/ml。
2.HBs Ag Ultra柱的第二孔中的内含物被300μl用于测试的偶联于生物素，在Vidas
Figure BPA00001464659800383
HBs Ag Ultra试剂盒的第二孔的缓冲液中(无羊血清)稀释到1μg/ml的揭示抗体1H8C9替换。
3.血清或血浆样品(50μl)直接在HBs Ag Ultra柱的第二孔中被稀释。
4.ELISA反应使用Vidas
Figure BPA00001464659800384
自动系统和HBs Ag Ultra实验计划完成，其孵育样品和捕获及揭示抗体采用100个循环。
5.结果以粗值的形式在扣除背景噪声后(反应前先读底物)获得。标准曲线通过检验一系列合成的防卫素原-A6肽(SEQ ID No.1)的浓度建立。标准曲线通过沿x-轴报导肿瘤标记物的浓度和沿y-轴通过Vidas(RFV或相对荧光值)读信号来作图。在被检验的体液中(血液，血清，血浆)存在的肿瘤标记物的浓度通过报导由Vidas
Figure BPA00001464659800386
读值的对应于RFV信号的浓度来计算。
患者中血清防卫素原-A6测定的结果通过在Vidas自动系统中的ELISA，在表4中给出。防卫素原-A6的血清浓度在患有结肠直肠腺癌的患者(CRC+)中，在0和10pg/ml之间，在正常个体(CRC-)中，在0到2pg/ml之间，其要求极其敏感的ELISA测定，以能把发明落实到生物液体或远程的样品中。使其能可能如此低极限检测的唯一防卫素原-A6 ELISA测定基于识别表位1和4的抗体的组合。优选通过表位1来捕获防卫素原-A6。给出最灵敏测定的组合在此被使用的是12H4E1抗体用来捕获，1H8C9抗体用来检测。
表4
Figure BPA00001464659800387
Figure BPA00001464659800391
Figure BPA00001464659800451
a：IDD＝炎性肠疾病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)
CRC+＝患有结肠直肠癌的患者(腺癌)
CRC-＝健康个体
b：TNM：组织入侵时期(T)，淋巴结入侵(N)和远程入侵(转移，M)
被分析的患者获得的剂量在附图6中被报导。可注意，在此附图和表4中，2，2，10和2位分别患有I，II，III或IV期结肠直肠癌的患者，他们血清中防卫素原-A6的量显示清晰的增加，绝对高于健康个体组中观察到的最高值(1.88pg/ml)。在腺瘤组中，没有观察到超过此值，而在IDD组中有2例。
实施例4：合并使用肿瘤标记物的血清测定
申请人在实施例3中指出，防卫素原-A6前体蛋白的异常升高量可在某些患有结肠直肠癌的患者血流中观察到。此外，申请人在专利申请WO2009/024691，WO2009019365，WO2009019368，WO2009019369，WO2009019366，WO2009019370和WO2009019367中指出其它肿瘤标记物量的异常升高或减少，诸如LEI，埃兹蛋白，氨基酰化酶-1，L-FABP，ApoA1，Apo A2，I-丝束蛋白，β2-微球蛋白，CEA，CA19-9，睾酮，半乳凝集素-3，LDH-B，蛋白酶体20S，上皮钙黏着蛋白或再生性胰岛衍生蛋白3α，或被称为胰腺炎相关蛋白(PAP1)，也可在患有结肠直肠癌的患者血流中观察到。检验这些肿瘤标记物的方法在上述提及的专利申请中被描述。检测MIF的方法使用来自R&D Systems的人MIF Quantikine ELISA试剂盒(CatNo.DMF00)，依照生产商的使用说明完成。
令人吃惊地，同一患者血液中两个给定标记物量的增加或减少未被系统地观察到。因此，几个肿瘤标记物的组合使其可能增加被鉴定为患有结肠直肠癌患者的数量。因此，患者A可在一个或多个肿瘤标记物(X组)展现出增加或减少，可能在患者B中，X组的所述标记物是正常的；同样在此患者B中，一个或多个其它肿瘤标记物(Y组)可能升高或降低，可能在患者A中Y组的所述标记物是正常的。
因此通过申请人检验的不同的肿瘤标记物可通过本领域技术人员熟知的不同数学算法被组合。通过说明的方式，此实施例不用在本质上被详尽说明，以下方法被完成：
1.对每一个肿瘤标记物设置阀值。
2.在结肠直肠癌情况下，当血液中的肿瘤标记物的量增加时，对一给定的患者获得的血液中的量被除以其阀值。在结肠直肠癌情况下，当血液中的肿瘤标记物的量减少时，对一给定的患者获得的血液中的量被倒置，随后乘以其阀值。
3.当“血液中的量除以阀值”的比值大于1时，比值被乘以系数，例如10。对于所研究的患者，对于被考虑的肿瘤标记物，因此获得的值被命名为“分数”。
4.不同肿瘤标记物获得的分数被相加，其被对每一个标记物特定的因子加权。在以下实施例的情况下，所有的权重因子被设为1。
5.分数的和除以相加的分数的总数，因此获得的值被命名为“总分数”。
6.当所述患者的总分数相对于阀值的分数增加时，患者被诊断为患有结肠直肠癌。
包含防卫素原-A6的选择的2，3，4，5，7和8个标记物的总分数在表5中给出。
因此防卫素原-A6和CEA肿瘤标记物的组合因此使其可能获得，对78位同一组的患者，41位患有结肠直肠腺癌的患者的增加的总分数“2a”，而单独检测防卫素原-A6和CEA仅分别在17和28位患者中显示增加。
因此防卫素原-A6和CA19-9肿瘤标记物的组合因此使其可能获得，对78位同一组的患者，28位患有结肠直肠腺癌的患者的增加的总分数“2b”，而单独检测防卫素原-A6和CA19-9仅分别在17和15位患者中显示增加。
因此防卫素原-A6和β2-微球蛋白肿瘤标记物的组合因此使其可能获得，对78位同一组的患者，49位患有结肠直肠腺癌的患者的增加的总分数“2c”，而单独检测防卫素原-A6和β2-微球蛋白仅分别在17和43位患者中显示增加。
因此防卫素原-A6和L-FABP肿瘤标记物的组合因此使其可能获得，对78位同一组的患者，41位患有结肠直肠腺癌的患者的增加的总分数“2d”，而单独检测防卫素原-A6和L-FABP仅分别在17和35位患者中显示增加。
因此防卫素原-A6，CA19-9和CEA肿瘤标记物的组合因此使其可能获得，对78位同一组的患者，46位患有结肠直肠腺癌的患者的增加的总分数“3e”，而单独检测防卫素原-A6，CA19-9和CEA仅分别在17，15和28位患者中显示增加。
因此防卫素原-A6，β2-微球蛋白和CEA肿瘤标记物的组合因此使其可能获得，对78位同一组的患者，60位患有结肠直肠腺癌的患者的增加的总分数“3f”，而单独检测防卫素原-A6，β2-微球蛋白和CEA仅分别在17，43和28位患者中显示增加。
因此防卫素原-A6，β2-微球蛋白，CA19-9和CEA肿瘤标记物的组合因此使其可能获得，对78位同一组的患者，63位患有结肠直肠腺癌的患者的增加的总分数“4g”，而单独检测防卫素原-A6，β2-微球蛋白，CA19-9和CEA仅分别在17，43，15和28位患者中显示增加。
因此防卫素原-A6，β2-微球蛋白，L-FABP和CEA肿瘤标记物的组合因此使其可能获得，对78位同一组的患者，69位患有结肠直肠腺癌的患者的增加的总分数“4h”，而单独检测防卫素原-A6，β2-微球蛋白，L-FABP和CEA仅分别在17，43，35和28位患者中显示增加。
因此防卫素原-A6，CA19-9，L-FABP和CEA肿瘤标记物的组合因此使其可能获得，对78位同一组的患者，59位患有结肠直肠腺癌的患者的增加的总分数“4i”，而单独检测防卫素原-A6，CA19-9，L-FABP和CEA仅分别在17，15，35和28位患者中显示增加。
因此防卫素原-A6，β2-微球蛋白，CA19-9，L-FABP和CEA肿瘤标记物的组合因此使其可能获得，对78位同一组的患者，71位患有结肠直肠腺癌的患者的增加的总分数“5j”，而单独检测防卫素原-A6，β2-微球蛋白，CA19-9，L-FABP和CEA仅分别在17，43，15，35和28位患者中显示增加。
因此防卫素原-A6，β2-微球蛋白，CA19-9，半乳凝集素-3，L-FABP，MIF和CEA肿瘤标记物的组合因此使其可能获得，对78位同一组的患者，74位患有结肠直肠腺癌的患者的增加的总分数“7k”，而单独检测防卫素原-A6，β2-微球蛋白，CA19-9，半乳凝集素-3，L-FABP，MIF和CEA仅分别在17，43，15，13，35，23和28位患者中显示增加。
因此防卫素原-A6，β2-微球蛋白，CA19-9，半乳凝集素-3，L-FABP，MIF，I-丝束蛋白和CEA肿瘤标记物的组合因此使其可能获得，对78位同一组的患者，75位患有结肠直肠腺癌的患者的增加的总分数“8l”，而单独检测防卫素原-A6，β2-微球蛋白，CA19-9，半乳凝集素-3，L-FABP，MIF，I-丝束蛋白和CEA仅分别在17，43，15，13，35，23，3和28位患者中显示增加。
表5
Figure BPA00001464659800501
分数2a：CEA和防卫素原-A6的组合
分数2b：CA19-9和防卫素原-A6的组合
分数2c：β2-微球蛋白和防卫素原-A6的组合
分数2d：L-FABP和防卫素原-A6的组合
分数3e：CEA，CA19-9和防卫素原-A6的组合
分数3f：CEA，β2-微球蛋白和防卫素原-A6的组合
分数4g：CEA，β2-微球蛋白，CA19-9和防卫素原-A6的组合
分数4h：CEA，β2-微球蛋白，L-FABP和防卫素原-A6的组合
分数4i：CEA，CA19-9，L-FABP和防卫素原-A6的组合
分数5j：CEA，β2-微球蛋白，CA19-9，L-FABP和防卫素原-A6的组合
分数7k：CEA，β2-微球蛋白，CA19-9，半乳凝集素-3，防卫素原-A6，L-FABP和MIF的组合
分数8l：CEA，β2-微球蛋白，CA19-9，防卫素原-A6，半乳凝集素-3，L-FABP，MIF和I-丝束蛋白的组合
CRC+＝患有结肠直肠癌(腺癌)的患者，CRC-＝健康个体
实施例5：通过LC-MRM-MS技术检测肿瘤标记物
1.方法学
为能把检测极限降低到几ng/ml，改进的MRM-MS方法被使用。此方法的相继步骤是：1)大量蛋白的免疫耗竭，2)胰酶消化，3)肽的SPE(固相萃取)分离，4)偶联于MRM-MS的液相层析(LC)。
设置通过加入防卫素原-A6合成肽(SEQ ID No.1)穿透样品完成。
免疫耗竭.血清中大量蛋白的耗竭使用Vivascience的商业Vivapureanti-HAS试剂盒完成。可选择地，Calbiochem的Proteoextract Albumin/IgG试剂盒和Bio-Rad的AurumTM serum Protein Minikit被使用。也可能在实验室中生产特殊的树脂，通过依照生产商的使用说明，偶联直接抗被耗竭蛋白的单克隆抗体到CNBr-活化的琼脂糖4B树脂(Amersham Bioscience)上。
酶消化.被耗竭的血清样品在含有30mM二硫苏糖醇，用10mM Tris，pH 8缓冲的6M尿素溶液中40℃变性40分钟，随后室温，避光，用50mM的碘乙酰胺烷基化40分钟。它们在水中被稀释6倍，随后使用1/30的酶/底物比率(Promega)37℃过夜完成胰酶消化。消化通过加入终浓度0.5％的甲酸终止。被消化的样品使用Oasis HLB 3cc反相柱(60mg)(Waters)通过固相萃取(SPE)去盐。柱用1ml 0.1％的甲酸清洗，随后的洗脱用含0.1％甲酸的甲醇/水混合物(80/20v/v)完成。洗脱物在真空中被干燥。
SPE分离.干燥的样品在1ml醋酸缓冲液中，被上到醋酸缓冲液和甲醇预平衡的Oasis MCX(混合阳离子交换)60mg混合柱(疏水和阳离子交换)(Waters)上。柱使用1ml醋酸缓冲液和1ml甲醇清洗。感兴趣的肽(表6)用甲醇/醋酸缓冲液混合物(50/50v/v)洗脱。醋酸缓冲液的pH依照感兴趣的肽的等电点被选择。洗脱物在真空中被干燥，溶解于200μl含有0.1％甲酸的乙腈/水(3/97v/v)溶液中。50μl的液体被注射入偶联于MS-MS系统的LC。
液相层析和质谱.LC-MS分析在有双泵和进样器的HP 1100系列高压层析系统(HPLC)上完成，其偶联与质谱仪，Sciex API 2000三重四极或为更好地灵敏度，Sciex API 4000Qtrap(杂交三重四极离子阱式质谱)(MDS Sciex)。LC分离在C18 Symmetry柱上(Waters)完成，洗脱流速为300μl/分钟(洗脱液A＝含0.1％甲酸的水，洗脱液B＝含0.1％甲酸的乙腈，线性梯度在25分钟内从5％的B到50％的B，随后3分钟内从50％的B到100％的B)。MS分析在应用针电压，5500V电压的正向离子化模式下完成，使能在源处离子化。仪器检定和数据采集使用Analyst 1.4.1软件完成。雾化气体(空气)和帘气(氮气)流分别为30和20psi。Turbo VTM离子源被调整到400℃，辅助氮气流为40psi。每一个肽的MRM跃迁记录在表6中再现。解离电压(CE)，去簇电压(DP)和碰撞池出口电压(CXP)对每一个选择的MRM跃迁被优化。
2.结果
序列SEQ ID No.1的理论MRM跃迁表使用MIDAS(MRM-发起的探测和测序)软件生成。此表包含所有的在800到3000Da质量范围内，理论胰蛋白酶肽段的二重带电或三重带电母离子，和所有y或b型的可能离子片段。对每一个蛋白，每一个可能的跃迁被测试以确定最灵敏和最特异的跃迁。此选择的结果在表6中再现。肽EPLQAEDDPLQAK(SEQ ID No.30)727/556跃迁的SPE步骤的优化例子在附图7中给出。MCX层析分离在不同的pH完成，对剩余试验的pH选择是使其能获得最高峰面积的pH。
此外，使用AQUA型的重肽(Sigma)或者重重组蛋白可用作测定标准，使能以绝对方式定量在复合生物培养基中感兴趣的肿瘤标记物。
表6
Figure BPA00001464659800541
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Figure ISB00000696644900021
Figure ISB00000696644900031
Figure ISB00000696644900041
Figure ISB00000696644900061
Figure ISB00000696644900081
Figure ISB00000696644900091
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Figure ISB00000696644900111
Figure ISB00000696644900121
Figure ISB00000696644900131
Figure ISB00000696644900141

Claims (14)

1.用于体外诊断结肠直肠癌的方法，其通过在取自怀疑患有结肠直肠癌患者的生物样品中确定防卫素原-A6标记物的存在而进行。
2.权利要求1的方法，特征在于确定至少具有序列SEQ ID No.2和最多具有序列SEQ ID No.1的肽的存在。
3.任意一项前述权利要求的方法，特征在于其使用特异于序列SEQ IDNo.2的结合配偶体。
4.权利要求3的方法，特征在于所述结合配偶体是单克隆抗体，所述单克隆抗体特异于具有至少序列SEQ ID No.4、优选具有至少SEQ ID No.6(表位1)且最多具有序列SEQ ID No.2的表位。
5.权利要求3和4任一项的方法，特征在于所述结合配偶体被用于捕获防卫素原-A6。
6.权利要求1到5中任一项的方法，特征在于其使用单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性识别选自以下表位的表位：
-至少是序列SEQ ID No.7的表位，其中X1是V或L，X2是T或L，X3是P、S或C，X4是P或S，X5是W或T，X6是A、Q、M、C或E，X7是I、E或D，以及X8是F、Y、S或L，且最多是序列SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12的表位(表位2)，
-至少是序列SEQ ID No.13的表位，其中X1是S或T，X2是C或不存在，X3是T、L或E，X4是H或R，X5是I、F或E，X6是G或V，以及X7是C或N，并且最多是序列SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16的表位(表位3)，
-至少是序列SEQ ID No.17的表位，其中X1是P或W，X2是W或E，X3是S、A、Q或W，X4是M、L、R或P，X5是H、F、W或G，X6是V或A，以及X7是I或V，并且最多是序列SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20或SEQID No.21的表位(表位4)，
-至少是序列SEQ ID No.22的表位，其中X1是Y或N，X2是E、D或Q，X3是T、N、R、M或K，X4是W、H或F，以及X5是P或G，并且最多是序列SEQ IDNo.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQID No.28或SEQ ID No.29的表位(表位5)。
7.前述权利要求中任一项的方法，特征在于其使用特异于表位1的单克隆抗体以及特异于表位2、3、4或5、优选表位2的单克隆抗体。
8.权利要求1至7中任一项的方法，特征在于所述生物样品是远离肿瘤的样品。
9.权利要求1至8中任一项的方法，特征在于其在取自怀疑患有结肠直肠癌患者的一个或多个生物样品中确定至少一个其它肿瘤标记物的存在，所述其它肿瘤标记物选自如下标记物：白细胞弹性蛋白酶抑制剂、埃兹蛋白、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪酸结合蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、I-丝束蛋白、β2-微球蛋白、蛋白酶体20S、半乳凝集素-3、L-乳酸脱氢酶链B、钙网蛋白、再生性胰岛衍生蛋白3α、肿瘤相关钙信号转导蛋白1、II型角蛋白细胞骨架8、I型角蛋白细胞骨架18、I型角蛋白细胞骨架19、上皮钙黏着蛋白、CEA、绒毛蛋白、CA 19-9、CA 242、CA50、CA 72-2、睾酮、TIMP-1、cripto-1、蛋白二硫化物异构酶、内凝集蛋白-1、细胞角蛋白20、翻译控制性肿瘤蛋白、防卫素(原)-A5、MIF、丙酮酸激酶M2-PK、钙粒蛋白C、CD24、CCSA-3(结肠癌特异抗原)和CCSA-4，血液中甲基化DNA、优选AXL4基因的甲基化DNA和隔蛋白-9基因的甲基化DNA的探测，检测粪便DNA片段的特定变化，诸如粪便DNA的特定突变或粪便DNA的甲基化谱的特定变化，以及检测粪便人血红蛋白。
10.权利要求9的方法，特征在于其包括确定防卫素原-A6和以下标记物的存在：
-L-FABP，
-CA19-9和CEA，
-β2-微球蛋白和CEA，
-β2-微球蛋白、CA19-9和CEA，
-β2-微球蛋白、L-FABP和CEA，
-L-FABP、CA19-9和CEA，
-β2-微球蛋白、CA19-9和CEA，
-β2-微球蛋白、CA19-9、L-FABP和CEA，
-β2-微球蛋白、CA19-9、半乳凝集素-3、L-FABP、MIF和CEA，或
-β2-微球蛋白、CA19-9、半乳凝集素-3、L-FABP、MIF、I-丝束蛋白和CEA。
11.权利要求1至10任一项的方法在与结肠直肠癌相关的早期诊断、筛查、治疗随访、预后和复发诊断中的用途。
12.特异性识别防卫素原-A6前肽部分的单克隆抗体。
13.权利要求12的单克隆抗体，其特异性地识别具有至少序列SEQ IDNo.4，优选具有至少序列SEQ ID No.6，并且最多具有序列SEQ ID No.2的表位。
14.抗防卫素原-A6单克隆抗体，其特异性识别选自以下表位的表位：-至少是序列SEQ ID No.7的表位，其中X1是V或L，X2是T或L，X3是P、S或C，X4是P或S，X5是W或T，X6是A、Q、M、C或E，X7是I、E或D，以及X8是F、Y、S或L，并且最多是序列SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12的表位，
-至少是序列SEQ ID No.13的表位，其中X1是S或T，X2是C或不存在，X3是T、L或E，X4是H或R，X5是I、F或E，X6是G或V，以及X7是C或N，并且最多是序列SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16的表位，
-至少是序列SEQ ID No.17的表位，其中X1是P或W，X2是W或E，X3是S、A、Q或W，X4是M、L、R或P，X5是H、F、W或G，X6是V或A，以及X7是I或V，并且最多是序列SEQ ID No.18，SEQ ID No.19，SEQ ID No.20或SEQID No.21的表位，
-至少是序列SEQ ID No.22的表位，其中X1是Y或N，X2是E、D或Q，X3是T、N、R、M或K，X4是W，H或F，以及X5是P或G，并且至多是序列SEQ IDNo.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQID No.28或SEQ ID No.29的表位。
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