JP2012162483A - ステロール−ｏ−アシルトランスフェラーゼ抑制剤 - Google Patents

Abstract

【課題】ＳＯＡＴは別名ＡＣＡＴ（アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ）とも呼ばれ、これまでにＳＯＡＴ１とＳＯＡＴ２の存在が知られている。ＳＯＡＴ１はほとんどの組織、特にマクロファージで強く発現しており、ＳＯＡＴ２は肝臓と腸で主に発現している。本発明は、ＳＯＡＴの発現抑制剤を提供する。すなわち、脂質異常症を解決し、脂質異常症に起因する動脈硬化症などの様々な病態の予防・治療剤を提供することを目的とする。
【解決手段】グァーガム分解物を含むことを特徴とするＳＯＡＴの発現抑制剤を提供することにより上記課題を解決する。
【選択図】なし

Description

本発明は、グァーガム分解物を含有することを特徴とするヒト又は動物のステロール−Ｏ‐アシルトランスフェラーゼ（以下、ＳＯＡＴ）の発現抑制剤に関するものである。

コレステロールは、ヒトのあらゆる組織の細胞膜を構成する成分である。また、ビタミンＤ、コルチゾール、エストロゲン、テストステロンなど、各種ステロイドの出発原料となっており、生体にとって重要な脂質である。
コレステロールは脂溶性であり、水にはわずかしか溶けない。そのため、コレステロールは、血液中で主にリポタンパク質がミセルを形成したミセル化コレステロールの状態で存在している。ミセル化コレステロールはその比重の違いにより、低比重リポタンパクコレステロール（ＬＤＬコレステロール）や、高比重リポタンパクコレステロール（ＬＤＬコレステロール）などに分類される。

動脈が肥厚し硬化した状態を動脈硬化といい、これによって引き起こされる様々な病態を動脈硬化症という。血液中のコレステロールや中性脂肪が増え過ぎる状態を脂質異常症（高脂血症）といい、動脈硬化を引き起こす大きな要因になると考えられている。
食事を通して体内に入ったコレステロールは、肝臓でつくられた胆汁酸と十二指腸で一緒になり、吸収されやすい形になって小腸へ送られる。そして小腸から吸収されると、ＳＯＡＴによりエステル化が起こる。エステル化されたコレステロールはカイロミクロンに取り込まれ吸収される。また、コレステロールは細胞内の小胞体でアセチルＣｏＡを出発原料として合成される。
プラバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチンなどの総称であるスタチンは高コレステロール血症の治療薬として世界各国で使用されている。体内に吸収されたスタチンは、主に肝臓に分布し、肝臓でのコレステロール生合成を低下させる。
ＳＯＡＴは別名ＡＣＡＴ（アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ）とも呼ばれ、これまでにＳＯＡＴ１とＳＯＡＴ２の存在が知られている。ＳＯＡＴ１はほとんどの組織、特にマクロファージで強く発現しており、ＳＯＡＴ２は肝臓と腸で主に発現している。

脂質異常症の発症を日常的に予防する為には血中コレステロール値を正常域へ減少させ、その領域で維持することが望ましい。血中コレステロールを減少させるためには、１．コレステロールの腸での吸収抑制、２．コレステロールの生合成抑制を、コレステロール値を減少させたい人の状態に応じて、単独または両方行うことが望ましい。コレステロールの吸収抑制には種々の方法が考えられ、１−１．コレステロール輸送体の活性抑制、１−２．ＳＯＡＴ酵素活性の抑制、１−３．ミセル化コレステロールの形成抑制、が知られていた。（例えば、特許文献１、２、３参照。）。また、コレステロールの生合成抑制については、スタチン様の活性を持つ食品が知られていた（例えば、特許文献４参照。）。しかしながら、経口摂取することによりＳＯＡＴの発現を抑制する食品は全く知られていなかった。

特表２０１０−５０３６７３号公報（第１−２０８頁） 特開２００９−５０２７４４号公報（第１−２３頁） 特開２００３−１４７０２５号公報（第１−１２頁） 特開２００９−２５６２５６号公報（第１−１５頁）

本発明は、これまで全く知られていなかったＳＯＡＴの発現抑制剤、もしくはＳｏａｔ遺伝子のｍＲＮＡの発現抑制剤を提供することを目的とするものである。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意努力した結果、ガラクトマンナン多糖を主成分とするグァーガム分解物を経口摂取することにより、Ｓｏａｔ遺伝子のｍＲＮＡの発現が抑制され、そのことによりＳＯＡＴが減少することを見出し、本発明の完成に至った。
すなわち、本発明はＳＯＡＴの発現抑制剤、もしくはＳｏａｔ遺伝子のｍＲＮＡの発現抑制剤である。本発明の発現抑制剤は単独で用いることもできるが、血中コレステロールの抑制という点よりスタチンとの併用が好ましい。

本発明のＳＯＡＴ抑制剤は、Ｓｏａｔ遺伝子のｍＲＮＡを発現抑制できるという利点がある。本発明のＳＯＡＴ抑制剤を用いることにより血中コレステロール値の低減が可能となる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本願発明におけるグァーガム分解物は、水溶性の食物繊維で、インド・パキスタン等で食用にされている一年生豆科植物グァー（学名 Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ）由来の豆を原料とし、その胚乳に含まれるガラクトマンナン多糖を加水分解し低分子化することにより得られるものである。加水分解の方法としては、酵素分解法、酸分解法など、特に限定するものではないが、分解物の分子量が揃い易い点から酵素分解法が好ましい。酵素分解法に用いられる酵素は、マンノース直鎖を加水分解する酵素であれば市販のものでも天然由来のものでも特に限定されるものではないが、アスペルギルス属菌やリゾップス属菌などに由来するβ−マンナナーゼが好ましい。また、グァーガム分解物の平均分子量分布は、上限値が１．８×１０^５以下であり、好ましくは、１．０×１０^５以下、さらに好ましくは、２．５×１０^４以下である。グァーガム分解物の平均分子量分布の下限値は５×１０^２以上であり、好ましくは、３．０×１０^３以上、さらに好ましくは、１．０×１０^４以上である。平均分子量分布が５×１０^２以下では本願発明のＳＯＡＴ抑制剤を供することが不可能となり、平均分子量が１．８×１０^５を超えると、粘度が高く飲食品に含有させる場合に不都合が生じる。平均分子量分布の測定方法は、特に限定するものではないが、例えばポリエチレングリコール（平均分子量：２×１０^２、２×１０^３、２×１０^４及び１×１０^５）をマーカーに高速液体クロマトグラフ法（カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−１２０（ワイエムシイ社製、検出器：示差屈折計）を用いて、平均分子量分布を測定する方法等を用いることにより求めることができる。
本願発明のグァーガム分解物は、特に限定するものではないが、上記平均分子量分布のものが７０％以上、好ましくは８０％以上含まれるものが用いられる。市販品としては、サンファイバー（太陽化学社製）、ファイバロン（大日本住友製薬社製）、グアファイバー（明治フードマテリアル社製）などが挙げられる。

以下、調製例及び実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定するものではない。

調製例１−１
水９００ｇに０．１Ｎ塩酸を加えてｐＨ４．５に調整し、これにアスペルギルス属細菌由来のβ−マンナナーゼ（ノボノルディスクバイオインダストリー社製）０．２ｇとグァーガム粉末（太陽化学株式会社製）１００ｇを添加、混合し、４０〜４５℃で２４時間に渡り、グァーガムの酵素分解を行った。反応後、９０℃で１５分間加熱して酵素を失活させた。濾過分離（吸引濾過）して、不溶物を除去して得られた透明な溶液を減圧濃縮（Ｙａｍａｔｏ製エバポレーター）した後（固形分量：２０重量％）、噴霧乾燥装置〔大川原化工機（株）製〕により乾燥し、グァーガム分解物を粉末として６５ｇ得た。
グァーガム分解物を水に溶解させて得た、グァーガム分解物量換算で０．５（ｗ／ｖ）％濃度の水溶液をポリエチレングリコール（平均分子量：２×１０^２、２×１０^３、２×１０^４及び１×１０^５）を分子量マーカーとする高速液体クロマトグラフィー〔（株）ワイエムシイ製カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−１２０〕に供して平均分子量を求めたところ約２０，０００であった。

調製例１−２
水９００ｇに０．１Ｎ塩酸を加えてｐＨ３に調整し、これにアスペルギルス属細菌由来のβ−マンナナーゼ（ノボノルディスクバイオインダストリー社製）０．１５ｇとグァーガム粉末（太陽化学株式会社製）１００ｇを添加、混合し、４０〜４５℃で２４時間に渡り、グァーガムの酵素分解を行った。反応後、９０℃で１５分間加熱して酵素を失活させた。濾過分離（吸引濾過）して、不溶物を除去して得られた透明な溶液を減圧濃縮（Ｙａｍａｔｏ製エバポレーター）した後（固形分量：２０重量％）、噴霧乾燥装置〔大川原化工機（株）製〕により乾燥し、グァーガム分解物を粉末として６８ｇ得た。
得られたグァーガム分解物について、調製例１−１と同様にして平均分子量を求めたところ約２５，０００であった。

調製例１−３
水９００ｇに０．１Ｎ塩酸を加えてｐＨ４に調整し、これにアスペルギルス属細菌由来のβ−マンナナーゼ（ノボノルディスクバイオインダストリー社製）０．２５ｇとグァーガム粉末（太陽化学株式会社製）１００ｇを添加、混合し、５０〜５５℃で１２時間に渡り、グァーガムの酵素分解を行った。反応後、９０℃で１５分間加熱して酵素を失活させた。濾過分離（吸引濾過）して、不溶物を除去して得られた透明な溶液を減圧濃縮（Ｙａｍａｔｏ製エバポレーター）した後（固形分量：２０重量％）、噴霧乾燥装置〔大川原化工機（株）製〕により乾燥し、グァーガム分解物を粉末として７０ｇ得た。
得られたグァーガム分解物について、調製例１−１と同様にして平均分子量を求めたところ約１５，０００であった。

調製例１−４
前記特開平５−１１７１５６号公報の実施例（第４頁第３行〜第４頁第１０行）の記載に従ってグァーガム分解物の調製を行った。調製例１−１に準じて平均分子量を求めたところ５，５００であった。当該加水分解物中、グァーガム分解物は９１重量％含まれており、タンパク質が０．１重量％含まれていた。

調製例１−５
調製例１−４で分子量測定のために高速液体クロマトグラフィーを行った際に、低分子量のピークを分取した。再度、高速液体クロマトグラフィーを行い、平均分子量を求めたところ約８００であった。

実施例１
実験動物は、ＢＫＳ．Ｃｇ−Ｄｏｃｋ７^ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ^ｄｂ／Ｊマウス（４週齢、オス）を、１週間、ＡＩＮ−９３Ｇ標準飼料で予備飼育して、異常のない個体を選別し、対照群（以下、ａ群）およびグァーガム分解物群（ｂ群およびｃ群）の計３群（１群３匹）に分け、実験に供した。予備飼育が終了した日から試験終了日（摂取期間２８日間）まで、ａ群にはＡＩＮ−９３Ｇ標準飼料（組成は表１を参照）を、ｂ群にはＡＩＮ−９３Ｇ標準飼料中のセルロースパウダー５％の内、２．５％を調製例１−１〜１−５で調製したグァーガム分解物に置換した実験飼料を、ｃ群にはＡＩＮ−９３Ｇ標準飼料中のセルロースパウダー５％を調製例１−１〜１−５で調製したグァーガム分解物に置換した実験飼料を自由摂取させた。

飼料の組成については表１に示した。表１における「％」は、全て「重量％」を表す。

摂取期間終了後、麻酔下にてマウスを解剖し、小腸を摘出した。小腸を洗浄後、３等分し、最も盲腸に近い部位をハサミで切り開いた。スライドグラスを用いて腸の粘膜組織を削りとった。Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポン・ジーン製）を用い、全ＲＮＡを粘膜組織から抽出して、その一部をＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、２５０ｎｇをサンプル調整して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＭｏｕｓｅＧｅｎｅ１．０ＳＴＡｒｒａｙ（アフィメトリクス社）にハイブリダイゼーション、およびスキャンを行った。スキャンしたデータを、ＰａｒｔｅｋＧｅｎｏｍｉｃｓＳｕｉｔｅ（Ｐａｒｔｅｋ社）にインポートし、Ａｒｒａｙ間補正（ＲＭＡ法使用）後、指定された組み合わせにて比較解析、有意差検定（ＡＮＯＶＡ）を行った。

ａ群に対してｂ群、ａ群に対してｃ群の各遺伝子の発現量を比較して、発現量がａ群の方がともに１．１倍以上高い遺伝子を抽出した。その結果、グァーガム分解物を摂取して発現量が減少する遺伝子として、Ｓｏａｔ１が確認された。Ｓｏａｔ１の発現量は特に調製例１−１で示したグァーガム分解物では、ａ群に対してｂ群、ａ群に対してｃ群の遺伝子の発現量がともに１．５倍以上減少しており、最も強い効果が確認された。調製例１−２と調製例１−３で示したグァーガム分解物では、ａ群に対してｃ群の遺伝子の発現量が１．５倍以上減少し、調製例１−１で示したグァーガム分解物に次いで強い効果を示した（表２）。

実施例２
グァーガム分解物は調製例１−１で示したものを用い、実施例１と同様の方法で、マウスを飼育した。ただし、予備飼育終了後から摂取期間終了後まで毎日２００ｍｇ／ｋｇのプラバスタチンを経口投与した。摂取期間終了後、麻酔下でヘパリンを通した注射針を用いて採血を行った。遠心（３，０００ｒｐｍ、１０分）後、上清を回収し、血漿とした。

血漿中の総コレステロール値を分析した結果、グァーガム分解物を摂取することにより、血漿中の総コレステロール値は減少し、プラバスタチンを併用することにより、さらに減少することが確認された（表３）。

本発明のＳＯＡＴ抑制剤は様々な食品に応用することができ、コレステロール低減剤を含む食品を提供することが可能となり、産業上貢献大である。

Claims (4)

1. グァーガム分解物を含有することを特徴とするＳＯＡＴ発現抑制剤。
2. Ｓｏａｔ ｍＲＮＡ発現抑制を特徴とする請求項１記載のＳＯＡＴ発現抑制剤。
3. グァーガム分解物の平均分子量が、５×１０^２〜１．８×１０^５である請求項１又は２記載のＳＯＡＴ発現抑制剤。
4. 請求項１〜３いずれか記載のＳＯＡＴ発現抑制剤とスタチンとの併用剤。