JP2019516786A - 生理活性化合物を保有する脂質系を含む配合物、癌又は免疫障害を有する患者に対する免疫療法増強剤又はアジュバントとしての使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、消化時の安定性及び経口バイオアベイラビリティを安全かつ効果的な形で改善する、超臨界ローズマリー抽出物（ＳＲＥ）と、ラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）、又はラットフィッシュ肝油を用いた化学的若しくは酵素的グリセロール分解プロセスの生成物を含有する脂質系とを含む組成物に関する。本発明は、癌又は免疫障害を有する患者に対する免疫療法における組成物の使用にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は食品、栄養及び健康の分野に関する。より具体的には、本発明は、機能性食品及び栄養補給剤等の特定健康用途のための食品の部分分野に関する。

過去１０年間に、スペイン及びヨーロッパの多くの公的資金及び私用資金が、特に天然源からの抗癌の可能性を有する機能性食品の開発につぎ込まれている。しかしながら、期待される有効性は大抵の場合、達成されず、その臨床用途は極めて限られている。機能性食品に組み込まれる新たな生理活性成分は多くの場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて有望な効果を示すが、臨床研究においてｉｎ ｖｉｖｏで同じ有効性をもたらすことはできない。これは通常、これらの化合物の水への低い溶解性に起因するが、これにより該化合物の摂取後の管腔での（luminal）可溶化及び溶解が制限され、胃内消化時の低い安定性がもたらされ、それらの析出及び分解が高まる可能性がある。上記の全てが、これらの新たな生理活性成分が胃腸内（ＧＴＩ）レベルでの低い生体可給性（可溶性の、ひいては吸収が可能な腸管内の生成物の量）、及び低いバイオアベイラビリティ（腸細胞によって吸収され、血流中に移動して細胞及び器官によって使用される生成物の能力）を有する原因となる。

これにより、ｉｎ ｖｉｖｏで効果的な生理活性配合物を得るために、これら２つの側面を改善することを目的とする新たな配合戦略の開発をより深く探求することの重要性が明らかに示される。

本発明者らは、様々な生理活性化合物の消化時の安定性及び経口バイオアベイラビリティを安全かつ効果的な形で改善するだけでなく、多くの場合、該化合物の効果を高める脂質系を提供することによって上述の技術的課題を解決する。

具体的には、本発明の脂質系は、消化時に胆汁酸塩及びリン脂質と共にマイクロエマルションを形成し、消化時に生理活性構成成分を安定化する混合ミセルを形成し、それらの析出又は吸収阻害物質との相互作用を防ぎ、それによりそれらの生体可給性、バイオアベイラビリティ、またそれに応じてそれらの生理活性を増大する自己乳化系である。

さらに、この系は殆ど水に溶けない分子の親油性化を可能にし、それらの分子を種々の食品中の成分として適用することを容易にする。

さらに、本発明の脂質系は、送達される化合物の生理活性を、その消化率に大きな影響を及ぼすことなく、相乗的にも増大することが可能な遊離又は非エステル化アルキルグリセロール（ＡＫＧ）を生じるのに好適な割合のグリセロールエーテルを含む。この意味で、本発明者らは、高い生理活性アルキルグリセロール（ＡＫＧ）含量によるヒト結腸癌細胞に対する上記脂質系のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性を実証し、生理活性脂質ビヒクルの抗増殖活性と送達される化合物の抗増殖活性との間に相乗効果が観察された。

付加的に、本発明者らは、癌又は免疫障害を有する患者に対して免疫療法増強剤又はアジュバントとして使用される、生理活性化合物を保有する脂質系を含む配合物又は組成物を提供する。

２５％（ｗ／ｗ）を超えるＭＡＧ含量をもたらす反応条件下でグリセロール分解プロセスを用いて得られるグリセリド及びアルキルグリセロールの混合物のＬＣ−ＥＬＳＤを用いて得られるクロマトグラフプロファイルを示す図である。１＝ＤＡＧＥ；２＝２−ＭＡＧＥ＋１，３−ＤＡＧ；３＝１，２−ＤＡＧ；４＝ＭＡＧ ＬＣ−ＥＬＳＤを用いて決定される元のＲＬＯ（Ａ）、ＲＬＯ＋ＭＯ（Ｂ）及びＧＰ（Ｃ）の消化の最終生成物の脂質混合物の組成を示す図である。 油相（ＯＰ）、ミセル相（ＭＰ）及び析出相（ＰＰ）の間の元のＲＬＯ（Ａ）、ＲＬＯ＋ＭＯ（Ｂ）及びＧＰ（Ｃ）の消化の最終生成物中に存在する全ての脂質生成物の分布を示す図である。 元のＲＬＯ（Ａ）、ＲＬＯ＋ＭＯ（Ｂ）及びＧＰ（Ｃ）の消化の最終生成物の遠心分離後に得られる種々の相（ＯＰ、ＭＰ及びＰＰ）の脂質組成を示す図である。 免疫機能バイオマーカーにおける平均値の相対的変動を考慮した主成分分析（ＰＣＡ）を示す図である。どちらの構成成分も固有値を有する寄与差を示し（ＰＣＡ１、１．２１及びＰＣＡ２、０．７９）、処理群と対照との応答差の分離において最も関連するパラメーターは、ＩＬ４（ＳＲＥ−ＲＬＯ介入により減少する）、ＩＬ１０及びＩＦＮｇ（ＳＲＥ−ＲＬＯ介入により増大する）である。 ＳＲＥによる介入期間後の健常個体における白血球集団の比較分析を示す図である（ｎ＝７）。統計的有意差をＣＤ５６＋ＣＤ４−集団及びＣＤ４＋ＣＤ３＋集団について算出した。分析変数において得られる傾向は、エフェクター細胞（単球及びＮＫ細胞）の好適な潜在的発生及び成熟、並びに観察されるサイトカインプロファイルと共に機能的成熟の高まりを示唆するＴ ＣＤ４＋ＣＤ３＋（Ｔｈ）増加の非存在に好都合な抗炎症状態への自然免疫系の極性化を示す。 大腸癌における炎症、免疫調節、酸化ストレス、ローズマリー分子標的及び脂質の代謝に関して分析した遺伝子パネルを示す図である。 結腸癌腫瘍株ＤＬＤ１の臨床研究における介入により調節される遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ検証を示す図である。

定義
本発明では、「生体可給性」は、可溶性であり、ひいては吸収が可能な腸管内の生成物の量として理解される。

本発明では、「バイオアベイラビリティ」は、腸細胞によって吸収され、血流中に移動して細胞及び器官によって使用される生成物の能力として理解される。

本発明では、「送達ＳＲＥ」という用語は、本発明の脂質系のいずれかと組み合わせた又はそれに組み込まれた超臨界ローズマリー抽出物を指す。

本発明では、「配合成分（formula）又は配合物」という用語は、本発明の脂質系と食品成分又は薬物のいずれかである生理活性化合物との組合せを指す。

本発明では、「消化非送達ＳＲＥ」という用語は、本発明の脂質系のいずれかと組み合わせていないか又はそれに組み込まれておらず、その生体可給性及び抗増殖活性の研究前にｉｎ ｖｉｔｒｏ胃腸内消化に供される超臨界ローズマリー抽出物を指す。

本発明では、「非消化及び非送達ＳＲＥ」という用語は、本発明の脂質系のいずれかと組み合わせていないか又はそれに組み込まれておらず、その抗増殖活性の研究前にｉｎ ｖｉｔｒｏ胃腸内消化に供されない超臨界ローズマリー抽出物を指す。

本発明では、「トリグリセリド（ＴＡＧ）」という用語は、一般式ＣＨ_２ＯＲ_１−ＣＨＯＲ_２−ＣＨ_２ＯＲ_３（式中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は互いに独立して、二重結合を有する又は有しない、飽和した又は不飽和の直鎖又は分岐の共役又は非共役Ｃ_１〜Ｃ_２４アシル基を表す）の分子を指す。

本発明では、「ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）」という用語は、一般式ＣＨ_２ＯＲ_１−ＣＨＯＲ_２−ＣＨ_２ＯＲ_３（式中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は互いに独立して水素、又は二重結合を有する若しくは有しない、飽和した若しくは不飽和の直鎖若しくは分岐の共役若しくは非共役Ｃ_１〜Ｃ_２４アシル基を表し、Ｒ_１、Ｒ_２又はＲ_３の少なくとも１つが水素を表す）の分子を指す。

本発明では、「モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）」という用語は、一般式ＣＨ_２ＯＲ_１−ＣＨＯＲ_２−ＣＨ_２ＯＲ_３（式中、Ｒ_１、Ｒ_２又はＲ_３の１つが二重結合を有する又は有しない、飽和した又は不飽和の直鎖又は分岐の共役又は非共役Ｃ_１〜Ｃ_２４アシル基を表し、Ｒ_１、Ｒ_２又はＲ_３の他の２つが水素である）の分子を指す。

本発明では、「ジアシルグリセロールエーテル（ＤＡＧＥ）」という用語は、一般式ＣＨ_２ＯＲ_１−ＣＨＯＲ_２−ＣＨ_２ＯＲ_３（式中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は互いに独立して、二重結合を有する若しくは有しない、飽和した若しくは不飽和の直鎖若しくは分岐Ｃ_１〜Ｃ_２４アルキル基、又は二重結合を有する若しくは有しない、飽和した若しくは不飽和の、直鎖若しくは分岐の共役若しくは非共役Ｃ_１〜Ｃ_２４アシル基を表し、Ｒ_１又はＲ_３の少なくとも１つがアルキル基を表す）の分子を指す。

本発明では、「モノアシルグリセロールエーテル（ＭＡＧＥ）」という用語は、一般式ＣＨ_２ＯＲ_１−ＣＨＯＲ_２−ＣＨ_２ＯＲ_３（式中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は互いに独立して、水素；二重結合を有する若しくは有しない、飽和した若しくは不飽和の直鎖若しくは分岐Ｃ_１〜Ｃ_２４アルキル基；又は二重結合を有する若しくは有しない、飽和した若しくは不飽和の直鎖若しくは分岐の共役若しくは非共役Ｃ_１〜Ｃ_２４アシル基を表し、Ｒ_１又はＲ_３の少なくとも１つがアルキル基を表し、Ｒ_１、Ｒ_２又はＲ_３の別の１つが水素である）の分子を指す。

本発明では、「遊離又は非エステル化アルキルグリセロール（ＡＫＧ）」という用語は、一般式ＣＨ_２ＯＲ_１−ＣＨＯＲ_２−ＣＨ_２ＯＲ_３（式中、Ｒ_１又はＲ_３の１つが二重結合を有する又は有しない、飽和した又は不飽和の直鎖又は分岐の共役又は非共役Ｃ_１〜Ｃ_２４アルキル基を表し、Ｒ_１、Ｒ_２又はＲ_３の他の２つが水素である）の分子を指す。

本発明では、「グリセリン」という用語は、一般式ＣＨ_２ＯＲ_１−ＣＨＯＲ_２−ＣＨ_２ＯＲ_３（式中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は互いに独立して、水素を表す）の分子を指す。

説明
経口投与される物質の生理活性は、その摂取後の胃腸内レベルでの生体可給性（可溶性であり、吸収が可能な腸内の生成物の量として測定される）、及びそのバイオアベイラビリティ（腸細胞によって吸収される能力）によって決定される。この側面は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて有望な効果を示した特定の化合物が、通常は、それらの腸内レベルでの生体可給性及びそれらのバイオアベイラビリティを制限する、胃の水性媒体中でのそれらの低い溶解性のために臨床研究においていかなる生理活性効果も示すことができないことを考えると重要である。

この意味で、本発明によって解決される課題の１つは、高度に生体可給性及び生理活性の配合物を得るための健康用途の食品成分のビヒクルとしての生理活性脂質系の使用である。

この脂質系は、ラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）をベースとしたパイロットプラントに拡張可能な酵素的グリセロール分解又は化学的グリセロール分解プロセスの生成物のみからなる。ＬＣ−ＥＬＳＤを用いて行った特性化を考えると、この生成物（以下、グリセロール分解生成物、ＧＰと称する）は、特に異なる割合のモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ジアシルグリセロールエーテル（ＤＡＧＥ）及びモノアシルグリセロールエーテル（ＭＡＧＥ）構成成分から構成される。これらの化合物は、出発トリグリセリド（ＴＡＧ）及びジアシルグリセロールエーテル（ＤＡＧＥ）よりも高い極性及び良好な乳化特性を有し、最終混合物の組成によって担体脂質として効率的に作用するＧＰの能力が決まり、ＭＡＧ含量が特に重要である。本発明の実施例に詳細に記載されるように、ＧＰの送達能を、元のＲＬＯ及び食品グレードのモノオレイン（ＭＯ）を乳化剤として１：１のモル比で含むＲＬＯ（以下、ＲＬＯ＋ＭＯと称する）のみからなる、他の２つのより容易に得られる脂質系の送達能と比較した。ＧＰとは異なり、これらの系は、主にＤＡＧＥ（８０％（ｗ／ｗ））及びＴＡＧ（２０％（ｗ／ｗ））、並びにＤＡＧＥ（５７％（ｗ／ｗ））、ＴＡＧ（１５％（ｗ／ｗ））及びＭＯ（２８％（ｗ／ｗ））のそれぞれから構成される。

本発明の脂質系を得るために選ばれた出発物質は、ヒトの健康に対して様々な有益な効果（その強い抗増殖活性が際立っている）を有する、その並外れて高いアルキルグリセロール（ＡＫＧ）含量のために、ラットフィッシュ（ハイドロラグス・コリエイ（Hydrolagus colliei））肝油であった。

本発明全体を通して説明されるように、本発明の脂質系は、担体脂質として一般に使用される植物油に対する非常に興味深い代替物となる。この興味は、担体脂質と送達される生理活性化合物との間で相乗活性が達成され得ることから、主にそれらの高い生理活性ＡＫＧ含量によるものである。さらに、このタイプの自己乳化性のＡＫＧに富んだ脂質系の生理活性担体脂質としての使用について先行研究がないことから、これらは新規の代替物でもある。

本発明の脂質系は、それらの親油性のために、生理活性食品成分又は薬物、特に水への溶解性が限られたもののビヒクルとして作用することができる。食品成分の中でも、シソ科及びキク科の植物に由来する天然抽出物が、それらの有望な抗癌特性のために際立っている。本発明では、示されるように、本発明の脂質系を種々の生理活性化合物及び薬物のビヒクルとして使用することができることから、本発明を説明することのみを目的として、抗癌活性を有し、以前の研究で広範に特性化されている超臨界ローズマリー（シソ科のロスマリヌス・オフィキナリス（Rosmarinus officinalis））抽出物（ＳＲＥ）を、異なる割合でＧＰ（以下でＧＰ＋ＳＲＥと称する配合物）及びＲＬＯ＋ＭＯ系（以下でＲＬＯ＋ＭＯ＋ＳＲＥと称する配合物）と、高圧均質化（５００バールで３回）を用いて組み合わせた。

上記に示したグリセロール分解生成物（ＧＰ）を得た後、実施例に記載のように適切に特性化することで、以下の定性的及び定量的組成が得られた：
約３０％（ｗ／ｗ）のモノグリセリド、
約１％（ｗ／ｗ）のトリグリセリド、
約２０％のジアシルグリセロールエーテル（ＤＡＧＥ）、
約２％のグリセリン、並びに、
約４７％のジアシルグリセロール及びモノアシルグリセロールエーテル（ＭＡＧＥ）の混合物。

上記組成物を用いて、実施例に記載され、生理活性物質のビヒクルとしてのこの脂質系の適合性、並びにそれらの生体可給性及びバイオアベイラビリティに対する影響を確認することを目的とする実験を行った。消化率研究から得られる結果によると、これはＧＰ消化の最終生成物中に特に豊富であり、脂質画分のほぼ９８．５％（ｗ／ｗ）が混合ミセル又はベシクルの形態であり、脂質系ＧＰの加水分解により放出される実質的に全ての生成物が潜在的に生体可給性であることが示される。対照的に、ＲＬＯ＋ＭＯ（ＲＬＯ＋モノオレイン）系、特に元のＲＬＯ（実施例を参照されたい）は、脂質画分のそれぞれ約７５％及び５４％（ｗ／ｗ）のみがＭＰ中にあり、それぞれ約２２％及び４１％（ｗ／ｗ）が、未消化ＤＡＧＥ及びＭＡＧＥから本質的に構成される油相の一部であるため、生体可給性が上記に示した脂質系（以下、ＧＰ）よりも顕著に低い。消化ＧＰ中でＭＡＧＥが主にミセル形態であり、したがって生体可給性であることが指摘されるべきである。同様に、重要なことには、ＲＬＯ＋ＭＯ系（約１％（ｗ／ｗ））及び元のＲＬＯ（約０．７％（ｗ／ｗ））のＭＰ中と比較して、消化ＧＰのＭＰ中の高い割合の遊離ＡＫＧ（約７．５％（ｗ／ｗ））も強調される（図４）。結腸癌細胞培養物を用いて以前に行われた様々な研究によると、両方のＭＡＧＥ、特に遊離ＡＫＧが潜在的にＤＡＧＥよりも生理活性である。

消化率及び生体可給性の結果に基づくと、元のＲＬＯは、ＳＲＥ（超臨界ローズマリー抽出物）等の生理活性物質の潜在的に効果的なビヒクルとして除外された。これが、ＳＲＥ配合物が本発明においてＧＰ（ＧＰ＋ＳＲＥ）及びＲＬＯ＋ＭＯ（ＲＬＯ＋ＭＯ＋ＳＲＥ）脂質系のみを用いて得られることの理由である。４％（ｗ／ｗ）及び９％（ｗ／ｗ）のＳＲＥの組込みは、脂質画分の生体可給性に顕著に影響を及ぼさず、ＳＲＥを含まないＧＰ系及びＲＬＯ＋ＭＯ系と同様の、相（ＯＰ、ＭＰ及びＰＰ）の分布及び該相の各々の脂質組成が観察される（図４）。

これに基づくと、得られた結果からＲＬＯ＋ＭＯ系、特にＧＰ系による９％ＳＲＥの送達により、消化時のＳＲＥ安定性、並びにそれに応じて腸内レベルでのその生体可給性及びその抗増殖効果が効率的に増大することが示される。

さらに、ＧＰ＋９％ＳＲＥ配合物の場合、ＩＣ５０に達するのに必要とされる濃度でのＭＰの生理活性成分（ＡＫＧ及びＳＲＥ）の含量（５０．２３μＭ ＡＫＧ_ｔ及び３．１４μｇ／ｍＬ ＳＲＥ）が、別個のＧＰ（１２４．５４μＭ ＡＫＧ_ｔ）及び非消化非送達ＳＲＥ（ＩＣ５０ 約４０μｇ／ｍＬ）についてよりも低く、脂質ビヒクルと送達ＳＲＥとの間の相乗効果が示される。

したがって、本発明の脂質系は、生理活性配合物を送達し、ｉｎ ｖｉｖｏでの該配合物の生体可給性及びバイオアベイラビリティを改善するのに特に有用な特定の定性的及び定量的組成を有する。

したがって、本発明の第１の態様は、以下のものを含む組成物又は脂質系に関する：
ａ． ２５％〜３５％（ｗ／ｗ）のモノグリセリド及び／又は遊離アルキルグリセロール等の乳化物質、
ｂ． １０％〜２５％（ｗ／ｗ）のジアシルグリセロールエーテル（ＤＡＧＥ）、並びに、
ｃ． ４０％〜６０％（ｗ／ｗ）のモノアシルグリセロールエーテル（ＭＡＧＥ）及び／又はジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ここで、脂質系中に存在するＭＡＧＥ及びＤＡＧの総量に対するＭＡＧＥの割合は少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％である）。

上記で詳細に説明される組成物に関して、重要なことには、モノグリセリド、又は遊離若しくは非エステル化アルキルグリセロール（ＡＫＧ）等の乳化能を有する構成成分が２５％未満である場合、本発明の系がその自己乳化能を失い、系の生体可給性及び消化率が深刻な影響を受けることが指摘される。したがって、第１の構成成分（モノグリセリド）を、乳化構成成分の総和が最終生成物の総重量の２５％〜３５％（ｗ／ｗ）の割合に維持される限りにおいて、モノグリセリド及び／又はＡＫＧ等の任意の他の乳化剤で置換又は補完することができる。

さらに、本発明の脂質系において確立されるＤＡＧＥのパーセンテージは、本発明者らにより２５％（ｗ／ｗ）を超える量が生成物のアクセシビリティ及び消化率に悪影響を及ぼすことが証明されたことを考慮すると、常に２５％（ｗ／ｗ）以下でなければならない。一方、ＤＡＧＥは、これらの構成成分が送達される活性成分を消化の最初の部分で保護することを考慮すると、１０％未満の量で存在すべきではない。

最後に、組成物のジアシルグリセロール及びモノアシルグリセロールエーテル（ＭＡＧＥ）の混合物は、５０：５０の割合又はＭＡＧＥがＭＡＧＥ及びジグリセリドの総和に対して５０％を超える割合でなくてはならない。ＭＡＧＥは、活性成分（例えば、フェノール化合物、フラボノイド、テルペノイド、サポニン、ステロール、ポリフェノール等に富んだ天然抽出物、又はＬｏｇ Ｐ^＊が２を超える生理活性物質若しくは薬物；ここで、Ｌｏｇ Ｐ^＊はオクタノール溶媒及び水中の非イオン化溶質の濃度間の比率のｌｏｇであり、以下の式：
ｌｏｇＰ_{オクタノール／水}＝ｌｏｇ（［溶質］_{オクタノール}／［溶質］_{非イオン化水}）
に従って決定される）の作用を（場合によっては相乗的に）増大するのに十分な割合でのＡＫＧの合成、アクセシビリティ及びバイオアベイラビリティに不可欠である。

一方、ジグリセリドは、組成物中に存在する可能性のあるトリグリセリドの消化率に有用であることを考慮すると、好ましくは本発明の脂質系中に存在すべきである。

本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、組成物又は脂質系は、
ａ． ２５％〜３５％（ｗ／ｗ）のモノグリセリド及び／又は遊離アルキルグリセロール、
ｂ． １０％〜２５％（ｗ／ｗ）のジアシルグリセロールエーテル（ＤＡＧＥ）、
ｃ． ０％〜５％（ｗ／ｗ）のトリグリセリド、
ｄ． ０％〜３％のグリセリン、並びに、
ｅ． ４０％〜６０％（ｗ／ｗ）のモノアシルグリセロールエーテル（ＭＡＧＥ）及び／又はジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ここで、脂質系中に存在するＭＡＧＥ及びＤＡＧの総量に対するＭＡＧＥの割合は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）である）を含む。

本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態では、組成物又は脂質系は、
ａ． ２８％〜３２％（ｗ／ｗ）のモノグリセリド及び／又は遊離アルキルグリセロール、
ｂ． １８％〜２２％（ｗ／ｗ）のジアシルグリセロールエーテル（ＤＡＧＥ）、
ｃ． ０％〜２％（ｗ／ｗ）のトリグリセリド、
ｄ． １％〜３％のグリセリン、並びに、
ｅ． ４０％〜５０％（ｗ／ｗ）のモノアシルグリセロールエーテル（ＭＡＧＥ）及び／又はジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ここで、脂質系中に存在するＭＡＧＥ及びＤＡＧの総量に対するＭＡＧＥの割合は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）である）を含む。

本発明の第２の態様は、組成物又は脂質系を得るプロセスであって、
ａ． ラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）、好ましくは表１に記載の定性的及び定量的特徴を有する油を容器に添加することと、
ｂ． 工程ａ）の生成物の温度を、連続撹拌（２００ｒｐｍ）しながら、好ましくは４０℃に調節することと、
ｃ． １つ以上のリパーゼを工程ｂ）の混合物に添加することと、
ｄ． 工程ｃ）の生成物を、好ましくは２００ｒｐｍのオービタル撹拌機（IKAのＫＳ ４０００ ｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ、シュタウフェン、ドイツ）内でインキュベートすることと、
ｅ． グリセロール分解反応生成物を得ることと、
を含む、プロセスに関する。

組成物又は脂質系を得るプロセスは、
ａ． ラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）、好ましくは表１に記載の定性的及び定量的特徴を有する油を、グリセロールを含む容器に好ましくは１：１のＲＬＯ：グリセロールモル比で添加すると共に、好ましくは溶媒を油及びグリセロールの混合物に添加することで、それらの混和性を改善することと、
ｂ． 工程ａ）の混合物の温度を、連続撹拌（２００ｒｐｍ）しながら、好ましくは４０℃に調節することと、
ｃ． １つ以上のリパーゼを工程ｂ）の混合物に添加することと、
ｄ． 工程ｃ）の生成物を、好ましくは２００ｒｐｍのオービタル撹拌機（IKAのＫＳ ４０００ ｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ、シュタウフェン、ドイツ）内でインキュベートすることと、
ｅ． グリセロール分解反応生成物を得ることと、
を含むのが好ましい。

具体的には、使用される脂質系を得るプロセスは、グリセロール分解反応を特定の撹拌、温度及び時間条件下（２００ｒｐｍ及び４０℃で４８時間の連続撹拌）で、以下のように、グリセロールの入った容器から出発してＣＰＮ、ＨＸＬ及びＣＰＭＥを含むＧＲＡＳ溶媒の存在下で行うことによって達成することができる。溶媒の所要容量を算出するために、１ｍｌの溶媒アリコートを、初期反応混合物中に存在するグリセロールが完全に溶解するまで連続して添加した。次に、グリセロール−溶媒溶液を、２５０ｍｌ容フラスコにおいて溶媒を含まない反応物と同じモル比（１：１のグリセロール：ＲＬＯ）でＲＬＯと混合した。ＲＬＯと混合した後、グリセロールは再び部分的に不溶性となったが、系の均一性は溶媒の非存在下よりも高いままであった。反応をリパーゼの添加により開始し、この場合、溶媒の希釈効果に対抗するために、酵素負荷（酵素：ＲＬＯの比率＝１．２５：１０ ｗ／ｗ）は、溶媒を含まない系に使用されるよりも大きくした。反応後に、ＲＶ １０ロータリーエバポレーター（IKA（商標）-Werke GmbH & Co. KG、シュタウフェン、ドイツ）及び油回転真空ポンプ（Edwards、スペインでの販売会社Iberica Vacuum、マドリード、スペイン）による真空を用いて、５０℃及び真空中（約０．１０ｋＰａ）での蒸発により、溶媒を反応生成物から除去した。

本発明の第３の態様は、本発明の第３の態様のプロセスを用いて得られる又は得ることができる組成物又は脂質系に関する。

この点で、生理活性配合物を送達し、ｉｎ ｖｉｖｏでの該配合物の生体可給性及びバイオアベイラビリティを改善するのに特に有用な特定の定性的及び定量的組成を有する本発明の脂質系に加えて、本発明のものと同様の他の脂質組成物が非常に興味深い治療可能性を示すことが本発明者らにより見出されたことが強調されるべきである。この意味で、重要なことには、平均年齢２７．９±１０．１歳の５７人の健常ボランティア（５８．６％が女性）が参加し、そのうち３０人が研究群に属し、２７人が対照群に属する８週間の二重盲検並行ランダム化研究を行った実施例７の内容が強調される。

この研究では、参加者は昼食又は夕食と共に１カプセルを摂取した。ソフトゼラチンカプセルは、以下の特徴のＲＬＯ由来のアルキルグリセロール、ローズマリー抽出物及びモノステアリンを含有するものであった：
ＲＬＯ：２０％アルキルグリセロールを含むサメ肝油（Gustav Heess）：７５０ｍｇ（１５０ｍｇのアルキルグリセロールをもたらす）
ＳＲＥ：ローズマリー抗酸化抽出物、２５％ジテルペンフェノール、型番号０２７．０２０（ロスマリヌス・オフィキナリスＬ．）：４５ｍｇ（１１．２５ｍｇのジテルペンフェノールをもたらす）
ＭＳ：食品グレードのモノステアリン酸グリセロール
組成：９１．２％ＲＬＯ＋５．２％ＳＲＥ＋３．６％ＭＳ

上記研究では、採血後にＰＢＭＣを単離し、次いで上清中のサイトカインを測定するためにＬＰＳと共に培養したが、ＩＬ１β；ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＦＮｙ、ＴＮＦαのレベルを、その目的でＨｕｍａｎ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄ Ｐａｎｅｌキットを用い、ＭａｇＰｉｘにより読取りを行って測定した。

ＣＤ（分化抗原群）計数も、ＣＤ４５＋に対する分化抗原群ＣＤ３＋、ＣＤ４＋；ＣＤ８＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋について、その目的でフローサイトメトリーに特異的なキット及び抗体を用いて行った。

人体計測制御、バイタルサインの制御、並びに寛容及び有害事象の記録に加えて、尿素、クレアチニン、肝臓酵素ＧＯＴ／ＧＰＴ／ＧＧＴ、ビリルビン及びＦＡのレベルを最初、中間及び最終の来院時に安全性及び追跡パラメーターとして評価した。

治療の免疫調節に対する影響を、末梢血から単離された単核細胞により産生されたサイトカインの血漿濃度と、免疫学的応答（Ｔｈ１、エフェクター応答及びＴｈ２、寛容応答）との間の生物学的相関を示す目的で、二変量相関（主成分分析）のアレイを生成することによって評価した。

実施例７の結果に示されるように、ＲＬＯ由来のアルキルグリセロール、ローズマリー抽出物及びモノステアリンを含有するカプセルの摂取は、以下のタイプのエフェクター細胞：腫瘍増殖を予防する貪食能及び細胞傷害活性を有する非古典的単球及びＮＫ細胞への自然免疫系極性化に対して好都合な抗炎症環境を反映する、サイトカインプロファイル及び白血球フェノタイピングの結果の傾向をもたらした。したがって、栄養補給剤を８週間摂取したボランティアにおける免疫学的パラメーター（サイトカイン及び白血球フェノタイピング）の分析により、以下からなるプラスの免疫栄養（immunonutritional）影響が示される：
先天性免疫応答の活性化及び寛容
食作用活性（単球）及び細胞傷害活性（ＮＫ細胞）を有するエフェクター細胞に対する免疫応答の中期極性化
抗炎症活性及び抗腫瘍活性を有するサイトカインプロファイルの生成

これらの結果は、アルキルグリセロール単独を用いて行われた他の研究が適応応答の刺激及び活性化しか示さなかったことを考慮すると、驚くべきものである。しかしながら、アルキルグリセロールをＳＲＥで補完する本研究では、この補完において見られる独自の効果である中期Ｍ１／Ｍ２極性化と共に、先天性応答の明らかな刺激が観察され、この先天性応答の変調は、癌及び免疫系の障害の両方において潜在的に効果的である。

したがって、これらの結果により、以下のものとしてのＳＲＥで補完されたアルキルグリセロール（好ましくはラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）に由来する）を含む組成物の使用が示唆される：
^＊限局性腫瘍を有する癌患者における転移の発生を予防する薬剤
^＊貪食能を有する成熟エフェクター細胞（単球、ＮＫ細胞）の産生、抗腫瘍活性を有するサイトカインの産生及び腫瘍抗原を標的とするＴリンパ球の機能的成熟への先天性応答の活性化が必要とされる候補患者において免疫療法を増強する薬剤
^＊免疫障害を予防する薬剤

したがって、本発明の第４の態様は、超臨界ローズマリー抽出物（ＳＲＥ）と、ラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）、又はラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）をベースとした酵素的若しくは化学的グリセロール分解プロセスの生成物を含む脂質系とを含む組成物に関する。上記組成物が単一組成物又は組み合わせ組成物であることを特徴とすることができ、組み合わせ組成物が超臨界ローズマリー抽出物を含む組成物Ａ、及びラットフィッシュ肝油、又はラットフィッシュ肝油をベースとした酵素的若しくは化学的グリセロール分解プロセスの生成物を含む組成物Ｂを含むことが指摘されるべきである。上記組み合わせ組成物は患者に同時又は順次に投与することができ、本発明においては、投与は同時であるのが好ましい。

本発明の第４の態様の好ましい実施形態では、組成物又は組み合わせ組成物は、超臨界ローズマリー抽出物、ラットフィッシュ肝油及びＭＡＧ又はモノグリセリド、好ましくは２％〜３０％（ｗ／ｗ）のＭＡＧ又はモノグリセリド、好ましくは３％〜３０％（ｗ／ｗ）のＭＡＧ又はモノグリセリド（これらの範囲の端値を含む）を含む脂質系を含み、より好ましくは、モノグリセリドはモノオレイン（ＭＯ）及びモノステアリン（ＭＳ）からなるリストから選択される。より好ましくは、本発明の第４の態様の組成物は、９１．２％（ｗ／ｗ）のＲＬＯ、５．２％（ｗ／ｗ）のＳＲＥ及び３．６％（ｗ／ｗ）のＭＳ（これらのパーセンテージに関して±３０％の変動、好ましくは±２０％の変動、より好ましくは±１０％の変動、更により好ましくは±５％の変動、更により好ましくは±２％の変動、更により好ましくは±１％の変動を含む）を含む。

本発明の第４の態様の別の好ましい実施形態では、組成物又は組み合わせ組成物は超臨界ローズマリー抽出物と、本発明の第１若しくは第３の態様、又はその好ましい実施形態のいずれかに記載される組成物を含む脂質系とを含む。

本発明の第４の態様の組成物が好ましくは癌又は免疫障害を有する患者に対する免疫療法増強剤又はアジュバントとして使用され、免疫障害が好ましくは貪食能を有する成熟エフェクター細胞（単球、ＮＫ細胞）の産生、抗腫瘍活性を有するサイトカインの産生及び腫瘍抗原を標的とするＴリンパ球の機能的成熟への先天性応答の活性化を必要とすることが指摘されるべきである。本発明の第４の態様の組成物がこれらの治療用途を有する理由は、実施例７に記載の結果に基づくものであり、治療に関する単球集団における応答の生理学的重要性により、細胞性免疫応答を延長するためのアジュバント、予防的及び／又は治療的療法の一環としてのそのプラスの影響が推定される。「免疫疲弊（Immunological exhaustion）」は腫瘍成長、及び慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス感染、（Ｂ型及びＣ型）肝炎ウイルス感染、ヒト免疫不全ウイルス感染の状況で明確に定義されている。さらに、単球に由来する細胞集団による抗原プロセシングの保存は、大きなプラスの結果を有し、自己免疫性病理（すなわち関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、乾癬、セリアック病、多発性硬化症等）の重症度及び／又はリスクを低減する可能性がある。先天性免疫応答の増大も、腎臓損傷（例えば、医療処置に使用される造影剤によって引き起こされる）の予防において極めて重要である。したがって、本発明の第４の態様の組成物は、自己免疫性免疫障害、好ましくは関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、乾癬、セリアック病及び多発性硬化症からなるリストから選択される自己免疫性免疫障害を有する患者の治療に使用することができる。さらに、本発明の第４の態様の組成物は、腫瘍成長、及び慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス感染、（Ｂ型及びＣ型）肝炎ウイルス感染又はヒト免疫不全ウイルス感染を有する患者の治療に使用することができる。最後に、本発明の第４の態様の組成物は腎臓損傷の予防に使用することができる。

腫瘍成長の治療のための本発明の第４の態様の組成物の使用に関して、以下の点が強調される。単球は、造血幹細胞に由来するマクロファージの直接前駆体である。腫瘍組織に取り入れられた後に、単球が表現型及び腫瘍促進（pro-tumor）機能に関して高度に不均質な細胞集団である腫瘍関連マクロファージへと分化し、腫瘍発生、局所進行及び遠隔転移を支持し得ることを考慮すると、好適な「覚醒（vigilant）」集団を維持することが重要である。したがって、本発明の第４の態様の組成物によって引き起こされる先天性応答の活性化は、免疫系が腫瘍を認識し、それらを攻撃することが可能であることから、全てのタイプの腫瘍の治療にとって経験的に興味深いものであり得る。このことは、不活性リンパ球を有する又は腫瘍内に任意のリンパ球を有しない不活性化腫瘍において特に興味深い。このタイプの腫瘍の基本型は大腸腫瘍であり、超突然変異型を除く他のものは免疫学的レベルで奏功しない。本発明の第４の態様の組成物が特に効果的である他の腫瘍は、消化器系（肝臓及び膵臓を含む）の腫瘍又は乳房腫瘍、並びに黒色腫、喫煙者の肺腫瘍、膀胱腫瘍及び頭頸部腫瘍であり得る。

本発明の第５の態様は、機能性食品、栄養補助食品、天然抽出物又は薬物、好ましくは抗癌剤の薬学的に許容可能な又は食品グレードのビヒクルの合成（elaboration）のための第１、第３又は第４の態様のいずれかによる組成物の使用に関する。

本発明の第５の態様の好ましい実施形態では、上記機能性食品、栄養補助食品、天然抽出物又は薬物は、２を超えるＬｏｇ Ｐ^＊を有することを特徴とし、ここで、Ｌｏｇ Ｐ^＊はオクタノール溶媒及び水中の非イオン化溶質の濃度間の比率のｌｏｇであり、以下の式：
ｌｏｇＰ_{オクタノール／水}＝ｌｏｇ（［溶質］_{オクタノール}／［溶質］_{非イオン化水}）
に従って決定される。

本発明の第５の態様の別の好ましい実施形態では、栄養補助食品はイコサペント（icosapent）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、コレカルシフェロール（ビタミンＤ）、アルファカルシドール、カルシトリオール、キサントフィル、カルシジオール、イコサペント酸エチル（ethyl icosapent）、エルゴカルシフェロール、ジホモ−γ−リノレン酸、クロピドグレル、α−リノレン酸、リポ酸及びトレチノインからなるリストから選択される。

本発明の第５の態様の別の好ましい実施形態では、薬物はビノレルビン、ベキサロテン、テストラクトン、エンザルタミド、ビカルタミド、ビンデシン、ルキソリチニブ、エストロピペート、ラパチニブ、レゴラフェニブ、プリカマイシン、アナストロゾール、ドロスタノロン、イリノテカン、イキサベピロン、バルルビシン、エルロチニブ及びレンバチニブからなるリストから選択される。

本発明の第５の態様の別の好ましい実施形態では、薬物はリトナビル、マソプロコール、エレトリプタン、テマゼパム、ベンザトロピン、テルコナゾール、ジアトリゾエート（diatrizoate）、ベンラファキシン、トラボプロスト、エトミデート、エトノゲストレル、ロピバカイン、ゾルミトリプタン、トルカポン、インドメタシン及びピメクロリムスからなるリストから選択される。

本発明の第６の態様は、第１、第３又は第４の態様のいずれかによる組成物又は脂質系を含む医薬組成物に関する。

本発明の第７の態様は、第１、第３又は第４の態様のいずれかによる組成物又は脂質系を含む食品組成物に関する。

本発明の第８の態様は、本発明の第５の態様の好ましい実施形態のいずれかにおいて特定されるリストから選択される薬物を送達する、本発明の第６の態様による医薬組成物に関する。上記組成物は癌の治療、好ましくは結腸癌の治療のための医薬品の合成に使用するのが好ましい。

本発明の第９の態様は、本発明の第５の態様の好ましい実施形態において特定されるリストから選択される栄養補助食品を送達する、本発明の第７の態様による食品組成物に関する。

本特許文献中で提示される以下の具体的な実施例は、本発明の性質を説明する働きをする。これらの実施例は例示のみを目的として含まれ、本願において特許請求される本発明を限定するものと解釈すべきではない。したがって、下記の実施例は、応用分野を限定することなく本発明を説明するものである。

材料及び方法
化学製品及び試薬
ラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）は、Rosita RatfishOil（商標）（ヘルゲラン、ノルウェー）の厚意により提供された。

食品グレードのモノオレイン（９９％）、並びにシクロペンタノン（ＣＰＮ）、ヘキサナール（ＨＸＬ）及びシクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）を含むグリセロール分解プロセスに使用した溶媒は、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手した食品グレードの香料添加剤であった。グリセロールは、ICN Biomedicals（オーロラ、オハイオ州）から入手した。Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５（Ｎｏｖ４３５）（カンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica））等の生体触媒は、Novozymes A/S（バウスベア、デンマーク）の厚意により供給された。リパーゼＰＬＧ（アルカリゲネス種）、ＳＬ（バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia））及びＴＬ（シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri））は名糖産業株式会社（東京、日本）から取得し、リパーゼＤＦ １５（リゾプス・オリゼ）は天野エンザイム株式会社（名古屋、日本）から取得した。

クロマトグラフ分析に使用する試薬に関して、純粋なオレイン酸（９９％純度）、モノオレイン（９９％純度）及びバチルアルコール（９９％純度）標準はSigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手し、純粋なオレイン酸エチル（９８％純度）標準はAcros Organics（ヘール、ベルギー）から取得した。イソオクタンはCarlo Erba Reagents（ヴァルドルイユ、フランス）から入手した。ヘキサン、メチル−ｔｅｒｔ−ブチル−エーテル（ＭＴＢＥ）及びクロロホルムは、Lab-Scan（グリヴィツェ、ポーランド）から入手し、ギ酸（９８％純度）はPanreac（バルセロナ、スペイン）から入手した。全てのこれらの溶媒はＨＰＬＣグレード溶媒であった。

出発ラットフィッシュ肝油のクロマトグラフ特性化
ＲＬＯ脂肪酸プロファイルを、サンプル中に存在するエステル化脂肪酸残基のメチル化の後に、水素炎イオン化検出器（ＧＣ−ＦＩＤ）によるガスクロマトグラフィーを用いて決定した。その目的で、５０ＭＡＧのＲＬＯを１ｍｌのｎ−ヘキサン（Lab-Scan、グリヴィツェ、ポーランド）で溶解した。次に、メタノール中の０．５Ｎ ＮａＯＨを１ｍｌサンプルのメタノリシスのために添加し、続いて１分間撹拌し、１００℃で５分間加熱し、メタノール中の１４％ＢＦ_３（Supelco、パサデナ、米国）を１ｍｌ添加することによる付加的なメチル化を行い、１分間撹拌し、１００℃で５分間インキュベートした。室温で２分間撹拌した後、得られる脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）混合物をｎ−ヘキサン（１ｍｌ）及び飽和ＮａＣｌ溶液（１ｍｌ）で抽出した。次いで、デカントしたヘキサン相を、無水硫酸ナトリウム（Panreac）を用いて２時間沈降させ、湿分を除去した。最後に、ヘキサンを蒸発乾固してＦＡＭＥ残渣を得て、これを次いで１５ＭＡＧ／ｍｌの最終濃度でｎ−ヘキサンに溶解した。ＭＡＧＥのクロマトグラフ分析を、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えるAgilent Technologiesのガスクロマトグラフ（６８５０ Ｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ ＧＣ Ｓｙｓｔｅｍ）において行った。１μｌのサンプルを、分割／非分割モード（１０：１の分割比）でＨＰ−８８キャピラリーカラム（（８８％シアノプロピル）アリール−ポリシロキサン、３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２０μｍ厚；Agilent Technologies Inc.、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）に注入した。０．９ｍｌ／分の流量のヘリウムをキャリヤガスとして使用した。注入器及び検出器の温度は、それぞれ２２０℃及び２５０℃とした。温度プログラムは以下のようにした：５０℃で開始した後、１８０℃まで２０℃／分で加熱し、続いて１８０℃から２２０℃まで１５℃／分で加熱した。最終温度（２２０℃）を１０分間維持した。定量化のために、オレイン酸エチルを用いて検量線をプロットした。データを得て、AgilentのＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ Ｒｅｂ．４Ｂ．０３．０１ソフトウェア（ウィルミントン、デラウェア州、米国）を用いて統合した。分析を二連で行い、データを平均±標準偏差（ＳＤ）で表した。

出発ＲＬＯ脂質プロファイルも、蒸発光散乱検出器と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＥＬＳＤ）を用いて評価した。サンプルの調製及び用いられるクロマトグラフ法を下記に説明する。

グリセロール分解反応
リパーゼにより触媒されるグリセロール分解を、僅かに変更したTorres et al. (2002)の方法に従って行った。要約すると、１０ｇのＲＬＯを、１ｇのグリセロールを含有する１２０ｍｌ容フラスコに添加した（１：１のＲＬＯ：グリセロールモル比）。生成物の混合物中に過剰な試薬が存在するのを防ぐために、ＲＬＯ及びグリセロールの化学量論比を用いた。混合物の温度を連続撹拌（２００ｒｐｍ）しながら４０℃に調節した。市販の種々のリパーゼを１：１０（ｗ／ｗ）の酵素：ＲＬＯ比で添加することで反応を開始した。次に、フラスコに蓋をし、２００ｒｐｍのオービタル撹拌機（IKAのＫＳ ４０００ ｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ、シュタウフェン、ドイツ）内でインキュベートした。グリセロール分解反応の進行を、反応混合物のアリコート（５０μｌ）を定期的に採取することによって決定した。全てのアッセイについて４８時間沈降させ、二連で行った。

グリセロール分解プロセスの最適化
本発明の脂質系（実施例２に記載の系）を合成する（elaborate）ために、付加的なグリセロール分解反応を同じ撹拌、温度及び時間条件下（２００ｒｐｍ及び４０℃で４８時間の連続撹拌）で以下のようにして行った：
ｉ）ＣＰＮ、ＨＸＬ及びＣＰＭＥを含むＧＲＡＳ溶媒の存在下。溶媒の所要容量を算出するために、１ｍｌの溶媒アリコートを、初期反応混合物中に存在するグリセロールが完全に溶解するまで連続して添加した。次に、グリセロール−溶媒溶液を２５０ｍｌ容フラスコにおいて溶媒を含まない反応物と同じモル比（１：１のグリセロール：ＲＬＯ）でＲＬＯと混合した。ＲＬＯと混合した後、他の著者（Damstrup et al, 2005, 2006, 2007）によると、グリセロールは再び部分的に不溶性となったが、系の均一性は溶媒の非存在下よりも高いままであった。反応をリパーゼの添加により開始し、この場合、溶媒の希釈効果に対抗するために、酵素負荷（酵素：ＲＬＯの比率＝１．２５：１０ ｗ／ｗ）は、溶媒を含まない系に使用されるよりも大きくした。反応後に、ＲＶ １０ロータリーエバポレーター（IKA（商標）-Werke GmbH & Co. KG、シュタウフェン、ドイツ）及び油回転真空ポンプ（Edwards、スペインでの販売会社Iberica Vacuum、マドリード、スペイン）による真空を用いて、５０℃及び真空中（約０．１０ｋＰａ）での蒸発により、溶媒を反応生成物から除去した。

液体クロマトグラフィーを用いたグリセロール分解混合物の分析
元のＲＬＯサンプル及びグリセロール分解プロセスにより得られるサンプル中に存在する脂質のクロマトグラフ分離及び定量化を、ＬＣ−ＥＬＳＤを用いて行った。グリセロール分解プロセス全体にわたって反応混合物から取り出された５０μｌアリコートを２ｍｌのクロロホルムに溶解し、濾過した（０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター、Symta、マドリード、スペイン）。次いで、クロロホルムを、StuartのＳＢＨ２００Ｄ／３蓄熱ヒーター（スタッフォードシャー、イギリス）を用いて、一定重量を有する残渣が得られるまで４０℃、窒素流中で蒸発させた。最後に、元のＲＬＯサンプル又は酵素的グリセロール分解により得られるサンプルを、ＨＰＬＣシステムへの注入（１μｌ、約２０μｇの全脂質）前に２０ＭＡＧ／ｍｌの最終濃度でクロロホルムを用いて希釈した。

ＧＲＡＳ溶媒の存在下で、２００μｌアリコートを１００００ｒｐｍで３分間遠心分離し、存在し得る酵素残渣を除去した。次に、５０μｌの上清を秤量し、ＨＰＬＣシステムへの注入（１μｌ、約２０μｇの全脂質）前にクロロホルムで２０倍希釈した。

ＬＣ−ＥＬＳＤ分析を、恒温カラムコンパートメント、四連（quaternary）ポンプ、オートサンプラー、真空デガッサー及び蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）（Agilentの１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）を備えるAgilent TechnologiesのＳｅｒｉｅｓ １２００ ＨＰＬＣシステム（サンタクララ、カリフォルニア州、米国）を用いて行った。ＥＬＳＤ条件は２×１０^５Ｐａ、５０℃及びゲイン４とし、微量化合物が正確に定量化されるように調整した。クロマトグラフ分離を、AgilentのＰｏｒｏｓｈｅｌｌカラム（Ｓｉｌ ２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ）において３５℃で２ｍｌ／分の流量、並びにTorres et al. (2005)によって以前に記載されている三元勾配系を形成する混合物Ａ（１００％イソオクタン）、Ｂ（イソオクタン：ＭＴＢＥ（５０：５０ ｖ／ｖ）中の０．０２％（ｖ／ｖ）ギ酸）及びＣ（ＭＴＢＥ：プロパン−２−オール（５０：５０ ｖ／ｖ））の溶離液を用いて行った。この方法論により、非常によく似た構造及び極性を有する、最大１８種類の異なる中性脂質、特に、種々の位置異性体を含む、ジアシルグリセロールエーテル（ＤＡＧＥ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、及びそれらの加水分解生成物（モノアシルグリセロールエーテル（ＭＡＧＥ）、非エステル化アルキルグリセロール（Guney, 2002）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ））の同時分析が可能となる。注入容量は１μｌ（約２０μｇの全脂質）とした。データを得て、AgilentのＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Agilent Technologies、ベーブリンゲン、ドイツ）を用いて処理した。

反応混合物中の脂質を、それらの保持時間（ｔ_Ｒ）を種々の標準脂質の保持時間と比較することによって同定した。市販のオレイン酸及びバチルアルコールを用いて、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）及びＡＫＧをそれぞれ同定した。ＤＡＧＥ及びＴＡＧは、市販のＲＬＯ及びメンヘーデン油を用いて同定した（Mbanya et al., 2003）。最後に、メンヘーデン油のグリセロール分解に由来し、半分取（semipreparative）ＨＰＬＣを用いて精製した生成物を使用してＭＡＧＥ、ＤＡＧ及びＭＡＧを同定した。外部標準法を用い、０．４ＭＡＧ／ｍｌ〜２５ＭＡＧ／ｍｌの範囲の各標準の検量線を使用して定量分析を行った。相対標準偏差値は、いずれの場合にも１０％未満であった。

定量データは、グリセロール分解プロセス中のＤＡＧＥ及びＴＡＧの変換率（Ｅ１）、並びに反応混合物の総重量に対する反応混合物の各化合物の重量パーセンテージ（Ｅ２）として表した。
１００−[（％_最終／％_初期）×１００］ ［Ｅ１］
［Ｐ_ｃｏｍｗ／Ｐ_ｒ．ｍ］×１００ ［Ｅ２］
ここで、％_最終及び％_初期は、それぞれ最終及び初期の反応混合物中のＤＡＧＥ及びＴＡＧのパーセンテージであり、Ｐ_ｃｏｍｐ及びＰ_ｒ．ｍは、それぞれ反応混合物の各化合物の重量及び反応混合物の総重量である。

最後に、下記に規定するパラメーターを用いて、ＭＡＧ産生についてのグリセロール分解効率を評価した：
ｉ）収率（１００ｇのＲＬＯ当たりのＭＡＧのｇ数）は、ＲＬＯの初期質量単位当たりのグリセロール分解中に得られるＭＡＧの質量を表す。
ｉｉ）生産性（ｇ／Ｌ／ｈ）は、反応時間単位当たりに産生されるＭＡＧの濃度を表す。

これらのパラメーターを、試験した種々のグリセロール分解条件でＭＡＧの最高濃度が達成される時点で評価した。

パイロットプラントへの拡張
特定の最適条件下でのグリセロール分解反応を、プロセス全体を通して機械的撹拌及び制御温度を用いる「キロクレーブ（kiloclave）」反応器システム（Buchi Glas Uster、Buchiglasuter、スイス）でのパイロットプラントへと拡張した。初期反応混合物の組成は１２８ｇのＲＬＯ、１２．８ｇのグリセリン及び３０４ｇのＰＣＮからなる約５００ｇの最終重量に調整した。反応中に、リパーゼ（１２ｇ）を反応器の撹拌シャフトに連結したバスケットに入れ、反応混合物を該バスケット内に循環させた。生体触媒として使用されるリパーゼの量はバスケットの容量によって限られ、酵素負荷（酵素：ＲＬＯ比＝０．９４：１０ ｗ／ｗ）は実験室規模より小さかった。実験室規模と同様、反応速度を研究するためにアリコートを定期的に反応混合物から取り出した。これらを２．５項において説明されるようにＬＣ−ＥＬＳＤを用いて分析した。４８時間の反応後に、反応器の放出弁を通して反応媒体を取り除いた。

ラットフィッシュ肝油の特性化
表１に、ＣＧ−ＤＩＬを用いて決定されたラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）の脂肪酸プロファイルを示す。観察されるように、ＲＬＯの主要脂肪酸はオレイン酸及びパルミチン酸であり、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含量は、他の魚油のＰＵＦＡ含量と比較して低い。この脂肪酸プロファイルは、他の海産油（marine oils）と比較して大きな酸化に対する安定性をもたらし得る。

同様に、ＬＣ−ＥＬＳＤ分析によると、元のＲＬＯは主に２つの化合物、すなわちジアシルグリセロールエーテル（ＤＡＧＥ、ピーク１、ｔ_Ｒ＝６．７分）及びトリアシルグリセロール（ＴＡＧ、ピーク２、ｔ_Ｒ＝７．７分）から構成されていた。ＲＬＯのＤＡＧＥ含量（８０％（ｗ／ｗ））は、ＴＡＧ含量（２０％（ｗ／ｗ））よりもはるかに高かったが、このことは、上記で論考するように、生理活性脂質放出系を設計するためのグリセロール分解プロセスにおける出発物質としてのこの油の使用を興味深いものとし、該プロセスを植物油、又は更には実質的に低いレベルではあるがアルキルグリセロールも含有するサメ肝油に基づいて以前に行われていたものから区別する。

実施例１
１ − 種々の割合のラットフィッシュ肝油とモノオレイン（脂質ビヒクル）及び超臨界ローズマリー抽出物（生理活性化合物）とから構成される配合物を得る
１：１のモル比でのラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）（Phosphotech、フランス）と食品グレードのモノオレイン（ＭＯ）（Sigma-Aldrich Chemie GmbH、シュタインハイム、ドイツ）との混合物を、市販の超臨界ローズマリー抽出物（ＳＲＥ）（ＥＳＴＡＢＩＬＯＴＯＮ ＯＳ）と４％、９％及び１６％（ｗ／ｗ）を含む種々の濃度で混合し、以下でＲＬＯ＋ＭＯ＋４％ＳＲＥ、ＲＬＯ＋ＭＯ＋９％ＳＲＥ及びＲＬＯ＋ＭＯ＋１６％ＳＲＥと称される配合物を得た。次いで、これらの混合物を５００バールの高圧ホモジナイザー（Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ５、Avestin Europe）に３回通した。

２ − ｉｎ ｖｉｔｒｏでの胃腸内消化（ＧＴＩ）の評価
胃内消化については、３ｇの配合物（ＲＬＯ＋ＭＯ＋４％ＳＲＥ、ＲＬＯ＋ＭＯ＋９％ＳＲＥ及びＲＬＯ＋ＭＯ＋１６％ＳＲＥ）を、食事性ＰＬを模擬するために６００ＭＡＧのリン脂質（ＰＬ）（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ９０Ｈ）、及び１６．４ｍＬの胃模擬溶液（ｐＨ２．５の０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ＳＧＦ）と混合した。１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨを２．５に調整した。調製した媒体を３５００ｒｐｍで２分間の均質化により予備乳化し、３７℃に温度制御し、オービタル撹拌機（IKAのＫＳ ４０００ ｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ、シュタウフェン、ドイツ）内、２００ｒｐｍで連続撹拌した。次いで、ＳＧＦ（ｐＨ２．５）中のブタ起源のペプシン（ＥＣ ３．４．２３．１、Sigma-Aldrich Chemie GmbH、シュタインハイム、ドイツ）（活性 ３３００Ｕ／ＭＡＧタンパク質）を含有する１６％（ｗ／ｖ）溶液を１：１２（ｗ：ｗ）の酵素：基質の割合で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。

腸内消化については、６ｍＬの胃内消化物を２６ｍＬの０．１Ｍトリズママレエート（trizma-maleate）バッファー（ｐＨ７．５）と混合した。調製した媒体を３５００ｒｐｍで２分間の均質化により予備乳化した。

一方、胆汁分泌物と同様の組成を有する溶液を調製した。その目的で、２００ＭＡＧの卵黄ホスファチジルコリン（Lipoid、ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）、５００ＭＡＧの胆汁酸塩、４０ＭＡＧのコレステロール（Sigma-Aldrich Chemie GmbH、シュタインハイム、ドイツ）、１ｍＬの３２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、３ｍＬの３．２５Ｍ ＮａＣｌ（Panreac Quimica S.A.U、バルセロナ、スペイン）及び２０ｍＬのトリズママレエートバッファーを混合し、全て３５００ｒｐｍで２分間均質化した。次いで、予備乳化サンプル及び模擬胆汁分泌物を混合し、共に３５００ｒｐｍで２分間均質化し、全体を３７℃に温度調節し、１０００ｒｐｍで連続撹拌しながらビーカーに移した。腸内消化は、以下のようにして調製したブタ起源のパンクレアチンの新鮮抽出物を添加することで開始した：１．１６７ｇのパンクレアチンを７ｍＬのトリズママレエートバッファーに溶解し、続いて１０分間撹拌し、１６００×ｇ、５℃で１５分間遠心分離した。得られた６ｍＬの上清水溶液を、１０ＭＡＧのホスホリパーゼＡ２（Nagase Enzymes）と共に反応媒体に添加した。経時的な消化の進行の研究及び消化エンドポイントの評価を可能にするために、反応媒体の１．５ｍＬアリコートを０分、５分、１５分、１０分、３０分及び６０分の時点で採取した。

２．１ 脂質抽出
消化中に採取された種々のアリコートから全脂質を抽出するために、サンプル：溶媒比＝１：３（ｖ／ｖ）で種々の溶媒混合物を用い、毎回１４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで３回の連続抽出を行った。混合物は、極性の低いものから高いものへ、ｉ）ｎ−ヘキサン：メチル−ｔｅｒｔ−ブチル−エーテル（ＭＴＢＥ）（５０：５０、ｖ：ｖ）；ｉｉ）ＭＴＢＥ：石油エーテル（ＰＥ）（５０：５０、ｖ：ｖ）；ｉｉｉ）ＰＥ：エタノール（１：０．６、ｖ：ｖ）であった。

各抽出の終了時に、脂質構成成分を含有する有機上相を回収し、存在し得る微量の水がサンプルから確実に除去されるように無水硫酸ナトリウム（Sigma-Aldrich）を用いて２時間沈降させ、溶媒を一定重量の残渣が得られるまで４０℃の窒素流下で蒸発させた。次いで、残渣をクロロホルムで２０ＭＡＧ／ｍＬの最終濃度まで希釈し、ＬＣ−ＥＬＳＤを用いて分析した。

ＬＣ−ＥＬＳＤ分析を、ＥＬＳＤ（Agilentの１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）に連結したAgilent Technologiesのｓｅｒｉｅｓ １２００液体クロマトグラフ（サンタクララ、カリフォルニア州、米国）を用いて行った。ＥＬＳＤ条件は２×１０^５Ｐａ、５０℃及びゲイン４とし、微量化合物が正確に定量化されるように調整した。クロマトグラフ分離を、AgilentのＰｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０カラム（Ｓｉｌ ２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ）において３５℃、２ｍＬ／分の流量で、Torres et al. (2005)によって以前に記載されている三元勾配を形成する３つの溶離液（Ａ、１００％イソオクタン；Ｂ、イソオクタン：ＭＴＢＥ（５０：５０ ｖ／ｖ）中の０．０２％（ｖ／ｖ）ギ酸、及びＣ、ＭＴＢＥ：プロパン−２−オール（５０：５０ ｖ／ｖ））を混合することによって行った。注入容量は１μＬとした。

３ − ｉｎ ｖｉｔｒｏ生体可給性の決定
３．１ 相分離
ｉｎ ｖｉｔｒｏ腸内消化プロセス中にミセル構造に組み込まれた脂質生成物から未消化脂質画分を分離するために、消化最終生成物をSoler-Rivas et al. (2010)によって行われたプロトコルに従って４０００ｒｐｍ、３７℃で４０分間遠心分離した。遠心分離後に、消化媒体は以下の３つの明らかに区別される相へと分離した：消化されなかった脂質サンプルの画分及びローズマリー抽出物の一部から構成される、油相（ＯＰ）と称される上相（ｉｎ ｖｉｖｏ条件では、この相は糞便と共に分泌されるか又は結腸微生物叢によって変換される）；消化脂質画分が、ローズマリー抽出物が組み込まれたミセル構造及びベシクルを形成して存在し得る、ミセル相（ＭＰ）と称される中間水相（これは生体可給性画分、すなわち腸内上皮細胞による吸収が可能な画分である）；並びに膵液消化中に放出される脂肪酸石鹸及び塩の残渣からなる、析出相（ＰＰ）と称される極めて僅かな不溶性下相（５）。

相を分離した後、脂質抽出、サンプル調製及びＬＣ−ＥＬＳＤ分析を、前項において説明されるように行った。

３．２ 全ポリフェノール測定
ＲＬＯ＋ＭＯ系内で送達されるＳＲＥの生体可給性画分の全ポリフェノール含量を、フォリン−チオカルト法を用いて決定した（６）。簡潔に述べると、１０μｌのサンプルを１５０μｌのフォリン−チオカルト溶液と混合し、室温で３分間放置した。次いで、５０μＬの重炭酸ナトリウム溶液（３％）を添加した。最後に、暗所、３７℃で２時間インキュベートした後、分光光度計（Ｇｅｎｅｓｉｓ １０ ＵＶ Ｓｃａｎｎｉｎｇ、Thermo Scientific）を用いて７３５ｎｍでの吸光度を測定した。ローズマリー抽出物自体及び種々の濃度（０．２ＭＡＧ／ｍＬ〜２ＭＡＧ／ｍＬ）のロスマリン酸を標準として使用した。

４ − ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性研究
配合物ＲＬＯ＋ＭＯ＋４％ＳＲＥ、ＲＬＯ＋ＭＯ＋９％ＳＲＥ及びＲＬＯ＋ＭＯ＋１６％ＳＲＥの消化後に得られる（生体可給性）ミセル相のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性を、ヒト結腸癌細胞モデルにおいて評価した。

４．１ 細胞培養物
ヒト結腸癌細胞株ＳＷ６２０を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ グルタミン、並びに１００００単位／ｍＬのベースとなる（base）ペニシリン、１００００μｇ／ｍＬのベースとなるストレプトマイシン及び２５０００ｎｇ／ｍＬのアムホテリシンＢを含有する１％抗生物質−抗真菌剤溶液を添加したＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞培養物を標準温度（３７℃）、湿度（９５％）及び二酸化炭素（５％）条件下に維持した。

４．２ 細胞生存能力アッセイ
ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）法を用いて、消化生成物の抗増殖活性を測定した。その目的で、指数増殖期の細胞を２４ウェルプレートに移したが、１ウェル当たり平均２５０００個の細胞を２００μＬの最終容量で組み入れた。３７℃で２時間インキュベートした後、培養培地を、種々の濃度（０μＬ／ｍＬ〜１１．５μＬ／ｍＬのＭＰ）でＤＭＥＭ培養培地に希釈した、アッセイされる生成物（ＲＬＯ＋ＭＯ＋４％ＳＲＥ、ＲＬＯ＋ＭＯ＋９％ＳＲＥ及びＲＬＯ＋ＭＯ＋１６％ＳＲＥ）の各々の生体可給性画分（ＭＰ）を含有する培地で置き換えた。細胞生存能力を、出発細胞集団を制御するために処理時、及び細胞成長に対する生成物の影響を決定するためにプレートを３７℃で４８時間インキュベートした後の両方で決定した。生存細胞数を決定するために、２０μＬのＭＴＴ溶液（ＦＢＳ中、５ＭＡＧ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを放置し、ホルマザン（ＭＴＴの青色の代謝生成物）を生存細胞に付着させるため３時間インキュベートした。インキュベーション後に、培地を取り出し、２００μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を添加して細胞を解離させ、ホルマザンを再懸濁させたが、その濃度（分光光度プレートリーダー（ＵＶＭ ３４０、Biochrom、ケンブリッジ）を用いて５６０ｎｍで測定される）は、生存細胞の数に直接関連する。医薬品による治療に対する応答と該医薬品の用量又は濃度との間の関係として説明される概念であるＩＣ５０（５０％の細胞生存能力の阻害）に対応する各生成物の濃度値を、ＮＩＨ規定に従い、ロジスティック回帰を用いて算出した。

実施例２
１ − 種々の割合のパイロットプラントに拡張可能な酵素的グリセロール分解プロセスを用いてＲＬＯから得られる生成物（脂質ビヒクル）と超臨界ローズマリー抽出物（生理活性化合物）とから構成される配合物を得る
材料及び方法（最適化酵素的解糖法を参照されたい）に説明される、撹拌、温度及び時間条件下（２００ｒｐｍ及び４０℃で４８時間の連続撹拌）のラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）（Phosphotech、フランス）から得られるグリセロール分解生成物（ＧＰ）混合物を、市販の超臨界ローズマリー抽出物（ＳＲＥ）（ＥＳＴＡＢＩＬＯＴＯＮ ＯＳ）と４％、９％及び１６％（ｗ／ｗ）を含む種々の濃度で混合し、以下でＧＰ＋４％ＳＲＥ、ＧＰ＋９％ＳＲＥ及びＧＰ＋１６％ＳＲＥと称される配合物を得た。次いで、これらの混合物を５００バールの高圧ホモジナイザー（Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ５、Avestin Europe）に３回通した。

本発明では、「最適反応条件」という用語は、２５％（ｗ／ｗ）を超えるモノアシルグリセロールの形成及びＲＬＯ中に存在するトリグリセリドの完全な消失をもたらす、生物触媒のタイプ、及び酵素：基質比、温度、グリセリンの割合、反応時間、及び溶媒の非存在／存在を含むグリセロール分解条件を指す。

２ − ｉｎ ｖｉｔｒｏでの胃腸内消化（ＧＴＩ）の評価
胃内消化については、３ｇの配合物（ＧＰ＋４％ＳＲＥ、ＧＰ＋９％ＳＲＥ及びＧＰ＋１６％ＳＲＥ）を、食事性ＰＬを模擬するために６００ＭＡＧのリン脂質（ＰＬ）（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ９０Ｈ）、及び１６．４ｍＬの胃模擬溶液（ｐＨ２．５の０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ＳＧＦ）と混合した。１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨを２．５に調整した。調製した媒体を３５００ｒｐｍで２分間の均質化により予備乳化し、３７℃に温度制御し、オービタル撹拌機（IKAのＫＳ ４０００ ｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ、シュタウフェン、ドイツ）内、２００ｒｐｍで連続撹拌した。次いで、ＳＧＦ中のブタ起源のペプシン（ＥＣ ３．４．２３．１、Sigma-Aldrich Chemie GmbH、シュタインハイム、ドイツ）（活性 ３３００Ｕ／ＭＡＧタンパク質）を含有する１６％（ｗ／ｖ）溶液を１：１２（ｗ：ｗ）の酵素：基質の割合で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。

腸内消化については、６ｍＬの胃内消化物を２６ｍＬの０．１Ｍトリズママレエートバッファー（ｐＨ７．５）と混合した。調製した媒体を３５００ｒｐｍで２分間の均質化により予備乳化した。

一方、胆汁分泌物と同様の組成を有する溶液を調製した。その目的で、２００ＭＡＧの卵黄ホスファチジルコリン（Lipoid、ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）、５００ＭＡＧの胆汁酸塩、４０ＭＡＧのコレステロール（Sigma-Aldrich Chemie GmbH、シュタインハイム、ドイツ）、１ｍＬの３２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、３ｍＬの３．２５Ｍ ＮａＣｌ（Panreac Quimica S.A.U、バルセロナ、スペイン）及び２０ｍＬのトリズママレエートバッファーを混合し、全て３５００ｒｐｍで２分間均質化した。次いで、予備乳化サンプル及び模擬胆汁分泌物を混合し、共に３５００ｒｐｍで２分間均質化し、全体を３７℃に温度調節し、１０００ｒｐｍで連続撹拌しながらビーカーに移した。腸内消化は、以下のようにして調製したブタ起源のパンクレアチンの新鮮抽出物を添加することで開始した：１．１６７ｇのパンクレアチンを７ｍＬのトリズママレエートバッファーに溶解し、続いて１０分間撹拌し、１６００×ｇ、５℃で１５分間遠心分離した。得られた６ｍＬの上清水溶液を、１０ＭＡＧのホスホリパーゼＡ２（Nagase Enzymes）と共に反応媒体に添加した。経時的な消化の進行の研究及び消化エンドポイントの評価を可能にするために、反応媒体の１．５ｍＬアリコートを０分、５分、１５分、１０分、３０分及び６０分の時点で採取した。

２．１ 脂質抽出
消化中に採取された種々のアリコートから全脂質を抽出するために、サンプル：溶媒比＝１：３（ｖ／ｖ）で種々の溶媒混合物を用い、毎回１４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで３回の連続抽出を行った。混合物は、極性の低いものから高いものへ、ｉ）ｎ−ヘキサン：メチル−ｔｅｒｔ−ブチル−エーテル（ＭＴＢＥ）（５０：５０、ｖ：ｖ）；ｉｉ）ＭＴＢＥ：石油エーテル（ＰＥ）（５０：５０、ｖ：ｖ）；ｉｉｉ）ＰＥ：エタノール（１：０．６、ｖ：ｖ）であった。

各抽出の終了時に、脂質構成成分を含有する有機上相を回収し、存在し得る微量の水がサンプルから確実に除去されるように無水硫酸ナトリウム（Sigma-Aldrich）を用いて２時間沈降させ、溶媒を一定重量の残渣が得られるまで４０℃の窒素流下で蒸発させた。次いで、残渣をクロロホルムで２０ＭＡＧ／ｍＬの最終濃度まで希釈し、ＬＣ−ＥＬＳＤを用いて分析した。

ＬＣ−ＥＬＳＤ分析を、ＥＬＳＤ（Agilentの１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）に連結したAgilent Technologiesのｓｅｒｉｅｓ １２００液体クロマトグラフ（サンタクララ、カリフォルニア州、米国）を用いて行った。ＥＬＳＤ条件は２×１０^５Ｐａ、５０℃及びゲイン４とし、微量化合物が正確に定量化されるように調整した。クロマトグラフ分離を、AgilentのＰｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０カラム（Ｓｉｌ ２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ）において３５℃、２ｍＬ／分の流量で、Torres et al. (2005)によって以前に記載されている三元勾配を形成する３つの溶離液（Ａ、１００％イソオクタン；Ｂ、イソオクタン：ＭＴＢＥ（５０：５０ ｖ／ｖ）中の０．０２％（ｖ／ｖ）ギ酸、及びＣ、ＭＴＢＥ：プロパン−２−オール（５０：５０ ｖ／ｖ））を混合することによって行った。注入容量は１μＬとした。

３ − ｉｎ ｖｉｔｒｏ生体可給性の決定
３．１ 相分離
ｉｎ ｖｉｔｒｏ腸内消化プロセス中にミセル構造に組み込まれた脂質生成物から未消化脂質画分を分離するために、消化最終生成物をSoler-Rivas et al. (2010)によって行われたプロトコルに従って４０００ｒｐｍ、３７℃で４０分間遠心分離した。遠心分離後に、消化媒体は以下の３つの明らかに区別される相へと分離した：消化されなかった脂質サンプルの画分及びローズマリー抽出物の一部から構成される、油相（ＯＰ）と称される上相（ｉｎ ｖｉｖｏ条件では、この相は糞便と共に分泌されるか又は結腸微生物叢によって変換される）；消化脂質画分が、ローズマリー抽出物が組み込まれたミセル構造及びベシクルを形成して存在し得る、ミセル相（ＭＰ）と称される中間水相（これは生体可給性画分、すなわち腸内上皮細胞による吸収が可能な画分である）；並びに膵液消化中に放出される脂肪酸石鹸及び塩の残渣からなる、析出相（ＰＰ）と称される極めて僅かな不溶性下相（５）。

相を分離した後、脂質抽出、サンプル調製及びＬＣ−ＥＬＳＤ分析を、前項において説明されるように行った。

３．２ 全ポリフェノール測定
ＧＰ系内で送達されるＳＲＥの生体可給性画分の全ポリフェノール含量を、フォリン−チオカルト法を用いて決定した（６）。簡潔に述べると、１０μｌのサンプルを１５０μｌのフォリン−チオカルト溶液と混合し、室温で３分間放置した。次いで、５０μＬの重炭酸ナトリウム溶液（３％）を添加した。最後に、暗所、３７℃で２時間インキュベートした後、分光光度計（Ｇｅｎｅｓｉｓ １０ ＵＶ Ｓｃａｎｎｉｎｇ、Thermo Scientific）を用いて７３５ｎｍでの吸光度を測定した。ローズマリー抽出物自体及び種々の濃度（０．２ＭＡＧ／ｍＬ〜２ＭＡＧ／ｍＬ）のロスマリン酸を標準として使用した。

４ − ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性研究
配合物ＧＰ＋４％ＳＲＥ、ＧＰ＋９％ＳＲＥ及びＧＰ＋１６％ＳＲＥの消化後に得られる（生体可給性）ミセル相のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性を、ヒト結腸癌細胞モデルにおいて評価した。

４．１ 細胞培養物
ヒト結腸癌細胞株ＳＷ６２０を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ グルタミン、並びに１００００単位／ｍＬのベースとなるペニシリン、１００００μｇ／ｍＬのベースとなるストレプトマイシン及び２５０００ｎｇ／ｍＬのアムホテリシンＢを含有する１％抗生物質−抗真菌剤溶液を添加したＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞培養物を標準温度（３７℃）、湿度（９５％）及び二酸化炭素（５％）条件下に維持した。

４．２ 細胞生存能力アッセイ
ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）法を用いて、消化生成物の抗増殖活性を測定した。その目的で、指数増殖期の細胞を２４ウェルプレートに移したが、１ウェル当たり平均２５０００個の細胞を２００μＬの最終容量で組み入れた。３７℃で２時間インキュベートした後、培養培地を、種々の濃度（０μＬ／ｍＬ〜１１．５μＬ／ｍＬのＭＰ）でＤＭＥＭ培養培地に希釈した、アッセイされる生成物（ＧＰ＋４％ＳＲＥ、ＧＰ＋９％ＳＲＥ及びＧＰ＋１６％ＳＲＥ）の各々の生体可給性画分（ＭＰ）を含有する培地で置き換えた。細胞生存能力を、出発細胞集団を制御するために処理時、及び細胞成長に対する生成物の影響を決定するためにプレートを３７℃で４８時間インキュベートした後の両方で決定した。生存細胞数を決定するために、２０μＬのＭＴＴ溶液（ＦＢＳ中、５ＭＡＧ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを放置し、ホルマザン（ＭＴＴの青色の代謝生成物）を生存細胞に付着させるため３時間インキュベートした。インキュベーション後に、培地を取り出し、２００μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を添加して細胞を解離させ、ホルマザンを再懸濁させたが、その濃度（分光光度プレートリーダー（ＵＶＭ ３４０、Biochrom、ケンブリッジ）を用いて５６０ｎｍで測定される）は、生存細胞の数に直接関連する。医薬品による治療に対する応答と該医薬品の用量又は濃度との間の関係として説明される概念であるＩＣ５０（５０％の細胞生存能力の阻害）に対応する各生成物の濃度値＊／＊／を、ＮＩＨ規定に従い、ロジスティック回帰を用いて算出した。

実施例３
１ − 種々の割合での非送達超臨界ローズマリー抽出物（生理活性化合物）のｉｎ ｖｉｔｒｏ胃腸内消化
胃内消化については、１２０ＭＡＧ、２７０ＭＡＧ及び４８０ＭＡＧの市販のＳＲＥ（それぞれ４％、９％及び１６％の送達ＳＲＥを含む配合物中に存在する量に等しい量）を、食事性ＰＬを模擬するために６００ＭＡＧのリン脂質（ＰＬ）（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ９０Ｈ）と混合し、１６．４ｍＬの胃模擬溶液（ｐＨ２．５の０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ＳＧＦ）と混合した。１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨを２．５に調整した。調製した媒体を３５００ｒｐｍで２分間の均質化により予備乳化し、３７℃に温度制御し、オービタル撹拌機（IKAのＫＳ ４０００ ｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ、シュタウフェン、ドイツ）内、２００ｒｐｍで連続撹拌した。次いで、ＳＧＦ（ｐＨ２．５）中のブタ起源のペプシン（ＥＣ ３．４．２３．１、Sigma-Aldrich Chemie GmbH、シュタインハイム、ドイツ）（活性 ３３００Ｕ／ＭＡＧタンパク質）を含有する１６％（ｗ／ｖ）溶液を１：１２（ｗ：ｗ）の酵素：基質の割合で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。

腸内消化については、６ｍＬの胃内消化物を２６ｍＬの０．１Ｍトリズママレエートバッファー（ｐＨ７．５）と混合した。調製した媒体を３５００ｒｐｍで２分間の均質化により予備乳化した。

一方、胆汁分泌物と同様の組成を有する溶液を調製した。その目的で、２００ＭＡＧの卵黄ホスファチジルコリン（Lipoid、ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）、５００ＭＡＧの胆汁酸塩、４０ＭＡＧのコレステロール（Sigma-Aldrich Chemie GmbH、シュタインハイム、ドイツ）、１ｍＬの３２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、３ｍＬの３．２５Ｍ ＮａＣｌ（Panreac Quimica S.A.U、バルセロナ、スペイン）及び２０ｍＬのトリズママレエートバッファーを混合し、全て共に３５００ｒｐｍで２分間均質化した。次いで、予備乳化サンプル及び模擬胆汁分泌物を混合し、共に３５００ｒｐｍで２分間均質化し、全体を３７℃に温度調節し、１０００ｒｐｍで連続撹拌しながらビーカーに移した。腸内消化は、以下のようにして調製したブタ起源のパンクレアチンの新鮮抽出物を添加することで開始した：１．１６７ｇのパンクレアチンを７ｍＬのトリズママレエートバッファーに溶解し、続いて１０分間撹拌し、１６００×ｇ、５℃で１５分間遠心分離した。得られた６ｍＬの上清水溶液を、１０ＭＡＧのホスホリパーゼＡ２（Nagase Enzymes）と共に反応媒体に添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。

２ − ｉｎ ｖｉｔｒｏ生体可給性の決定
２．１ 相分離
ＳＲＥの生体可給性画分を消化プロセス中の分解又は析出による非生体可給性画分から分離するために、消化最終生成物をSoler-Rivas et al. (2010)によって行われたプロトコルに従って４０００ｒｐｍ、３７℃で４０分間遠心分離した。

２．２ 全ポリフェノール測定
非送達ＳＲＥの生体可給性画分の全ポリフェノール含量を、フォリン−チオカルト法を用いて決定した（６）。簡潔に述べると、１０μｌのサンプルを１５０μｌのフォリン−チオカルト溶液と混合し、室温で３分間放置した。次いで、５０μＬの重炭酸ナトリウム溶液（３％）を添加した。最後に、暗所、３７℃で２時間インキュベートした後、分光光度計（Ｇｅｎｅｓｉｓ １０ ＵＶ Ｓｃａｎｎｉｎｇ、Thermo Scientific）を用いて７３５ｎｍでの吸光度を測定した。ローズマリー抽出物自体及び種々の濃度（０．２ＭＡＧ／ｍＬ〜２ＭＡＧ／ｍＬ）のロスマリン酸を標準として使用した。

３ − ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性研究
非送達ＳＲＥの消化後に得られる（生体可給性）ミセル相のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性を、ヒト結腸癌細胞モデルにおいて評価した。

３．１ 細胞培養物
ヒト結腸癌細胞株ＳＷ６２０を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ グルタミン、並びに１００００単位／ｍＬのベースとなるペニシリン、１００００μｇ／ｍＬのベースとなるストレプトマイシン及び２５０００ｎｇ／ｍＬのアムホテリシンＢを含有する１％抗生物質−抗真菌剤溶液を添加したＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞培養物を標準温度（３７℃）、湿度（９５％）及び二酸化炭素（５％）条件下に維持した。

３．２ 細胞生存能力アッセイ
ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）法を用いて、消化生成物の抗増殖活性を測定した。その目的で、指数増殖期の細胞を２４ウェルプレートに移したが、１ウェル当たり平均２５０００個の細胞を２００μＬの最終容量で組み入れた。３７℃で２時間インキュベートした後、培養培地を、種々の濃度（０μＬ／ｍＬ〜１１．５μＬ／ｍＬのＭＰ）でＤＭＥＭ培養培地に希釈した、アッセイされる生成物（４％のＳＲＥ、９％のＳＲＥ及び１６％非送達ＳＲＥ）の各々の生体可給性画分（ＭＰ）を含有する培地で置き換えた。細胞生存能力を、出発細胞集団を制御するために処理時、及び細胞成長に対する生成物の影響を決定するためにプレートを３７℃で４８時間インキュベートした後の両方で決定した。生存細胞数を決定するために、２０μＬのＭＴＴ溶液（ＦＢＳ中、５ＭＡＧ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを放置し、ホルマザン（ＭＴＴの青色の代謝生成物）を生存細胞に付着させるため３時間インキュベートした。インキュベーション後に、培地を取り出し、２００μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を添加して細胞を解離させ、ホルマザンを再懸濁させたが、その濃度（分光光度プレートリーダー（ＵＶＭ ３４０、Biochrom、ケンブリッジ）を用いて５６０ｎｍで測定される）は、生存細胞の数に直接関連する。医薬品による治療に対する応答と該医薬品の用量又は濃度との間の関係として説明される概念であるＩＣ５０（５０％の細胞生存能力の阻害）に対応する各生成物の濃度値を、ＮＩＨ規定に従い、ロジスティック回帰を用いて算出した。

実施例４
１ − 非消化非送達超臨界ローズマリー抽出物のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性研究
非消化非送達ＳＲＥのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性を、ヒト結腸癌細胞モデルにおいて評価した。

１．１ 細胞培養物
ヒト結腸癌細胞株ＳＷ６２０を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ グルタミン、並びに１００００単位／ｍＬのベースとなるペニシリン、１００００μｇ／ｍＬのベースとなるストレプトマイシン及び２５０００ｎｇ／ｍＬのアムホテリシンＢを含有する１％抗生物質−抗真菌剤溶液を添加したＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞培養物を標準温度（３７℃）、湿度（９５％）及び二酸化炭素（５％）条件下に維持した。

１．２ 細胞生存能力アッセイ
ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）法を用いて、消化生成物の抗増殖活性を測定した。その目的で、指数増殖期の細胞を２４ウェルプレートに移したが、１ウェル当たり平均２５０００個の細胞を２００μＬの最終容量で組み入れた。３７℃で２時間インキュベートした後、培養培地を、種々の濃度（０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ）でＳＲＥを含有する培地で置き換えた。細胞生存能力を、出発細胞集団を制御するために処理時、及び細胞成長に対する生成物の影響を決定するためにプレートを３７℃で４８時間インキュベートした後の両方で決定した。生存細胞数を決定するために、２０μＬのＭＴＴ溶液（ＦＢＳ中、５ＭＡＧ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを放置し、ホルマザン（ＭＴＴの青色の代謝生成物）を生存細胞に付着させるため３時間インキュベートした。インキュベーション後に、培地を取り出し、２００μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を添加して細胞を解離させ、ホルマザンを再懸濁させたが、その濃度（分光光度プレートリーダー（ＵＶＭ ３４０、Biochrom、ケンブリッジ）を用いて５６０ｎｍで測定される）は、生存細胞の数に直接関連する。医薬品による治療に対する応答と該医薬品の用量又は濃度との間の関係として説明される概念であるＩＣ５０（５０％の細胞生存能力の阻害）に対応する各生成物の濃度値を、ＮＩＨ規定に従い、ロジスティック回帰を用いて算出した。

実施例５
１． ｉｎ ｖｉｔｒｏでの胃腸内消化（ＧＴＩ）の評価
使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ消化ＧＴＩモデルは、２つの連続相である胃相（ｐＨ２．５、ペプシンの存在下で３７℃、１時間）及び腸相（ｐＨ７．４、パンクレアチンの存在下で３７℃、１時間）からなる。本発明では、胃相は、担体脂質の消化のためにはそれほど用いられず、送達される成分又は薬物の安定性に対する酸性ｐＨ及び胃内の水性媒体の影響の研究のために用いられる。腸相に関しては、加水分解の程度及び生成する脂質種のレベルの点で文献（Hofmann and Borgstrom, 1964）中に認められる生理学的結果を再現するために、この工程中に用いられる条件（酵素／基質比、レシチン／胆汁酸塩比、消化時間、消化液のｐＨ及びミネラル組成）は、脂質の腸内消化中の生理的条件を模擬するものである。

消化プロセス中の各々の脂質系の挙動は、その初期脂質組成に左右され、主に脂質ビヒクルとしてのその挙動、及びその生体可給性、ひいては生理活性が決定される。

各々の脂質系及び本発明のＳＲＥを含む配合物（実施例１〜４を参照されたい）の消化率を、消化プロセス中のＤＡＧＥ及びＴＡＧの加水分解並びに加水分解生成物（遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、ＤＡＧ、ＭＡＧＥ及びＭＡＧ）の形成を判定することで評価した。その目的で、消化中に回収された各々のアリコートの脂質抽出を初めに行い、続いてそれらの組成の包括的特性化をＬＣ−ＥＬＳＤを用いて行った。

消化媒体中のリパーゼの非存在のために、胃相中において、脂質プロファイルは初期脂質プロファイルに対して変化しなかった。しかしながら、腸相中では、脂質は膵リパーゼによって本質的に加水分解され、消化物は初期脂質組成とは異なる脂質組成を有する。

図２に元のＲＬＯ（図２Ａ）、ＲＬＯ＋ＭＯ（図２Ｂ）及びＧＰ（図２Ｃ）の消化の最終生成物の脂質混合物の組成を示す。いずれの場合にも、ＴＡＧは完全に加水分解されたが、消化プロセスの終了時に非加水分解ＤＡＧＥが依然として検出された。したがって、図２に認められるように、最も高い程度のＤＡＧＥ加水分解、並びにＦＦＡ、ＤＡＧ、ＭＡＧＥ及びＭＡＧの形成がＧＰ、続いてＲＬＯ＋ＭＯ系について観察された。最も高い初期ＤＡＧＥ含量を有する元のＲＬＯは、全ての研究した系で最も消化されにくかった。これらの結果から、媒体中の乳化剤の存在が消化に有利であることが更に示される。したがって、ＭＡＧ等の乳化特性を有する脂質は、消化の開始時の脂質分散をＴＡＧ及びＤＡＧＥと比較して改善し、これは加水分解の改善及び消化生成物をより容易に含めることができるミセル構造の形成の増加に有利であり得る。ＲＬＯ＋ＭＯ系及び元のＲＬＯの消化物のパーセンテージに対して、ＧＰの消化の最終生成物の遊離（非エステル化）ＡＫＧの最も高いパーセンテージも強調すべきである。これは、好ましくはＤＡＧＥよりも前に加水分解され、遊離ＡＫＧをもたらすＧＰのより高い初期ＭＡＧＥ含量に起因し得る。

ローズマリーを含む配合物の消化に関して、４％（ｗ／ｗ）及び９％（ｗ／ｗ）のＳＲＥの存在は、ローズマリーを含まない系に対して大きな違いが観察されなかったことから、脂質ビヒクル（ＧＰ及びＲＬＯ＋ＭＯ）の消化を変化させなかった。しかしながら、１６％のＳＲＥを含む配合物中では、脂質画分の消化率は顕著に低い（より小さな程度のＤＡＧＥ加水分解、並びにより少ないＦＦＡ、ＭＡＧＥ、ＤＡＧ及びＭＡＧの形成）。これは、高い割合のローズマリー抽出物の存在下での膵リパーゼの阻害によるものである。

２． ｉｎ ｖｉｔｒｏ生体可給性の決定
生体可給性研究の前に、消化の最終生成物を４０００ｒｐｍ及び３７℃で４０分間遠心分離した。遠心分離後に、消化媒体は以下の３つの明らかに区別される相へと分離した：消化されなかった脂質サンプルの画分及びローズマリー抽出物の一部から構成される、油相（ＯＰ）と称される上相（ｉｎ ｖｉｖｏ条件では、この相は糞便と共に分泌されるか又は結腸微生物叢によって変換される）；膵液消化中に放出される脂肪酸石鹸及び塩の残渣からなる、析出相（ＰＰ）と称される極めて僅かな不溶性下相；並びに膵リパーゼによって消化され、胆嚢により分泌された胆汁酸塩及びリン脂質により乳化された脂質画分が、（抽出物を含む配合物の場合に組み込まれたＳＲＥと共に）ミセル構造及びベシクルを形成して存在し得る、ミセル相（ＭＰ）と称される中間水相（これは生体可給性画分、すなわち腸内上皮細胞による吸収が可能な画分である）。

本発明の脂質系（ＲＬＯ、ＲＬＯ＋ＭＯ及びＧＰ）、ＳＲＥが組み込まれた配合物（ＲＬＯ＋ＭＯ＋ＳＲＥ及びＧＰ＋ＳＲＥ）及び非送達ＳＲＥの生体可給性を、それらの各々の生体可給性相、すなわちミセル相の画分を特性化することでＬＣ−ＥＬＳＤを用いて評価した。図３に示されるように、消化生成物（ＦＦＡ、ＭＡＧＥ、ＤＡＧ及びＭＡＧ）から本質的に構成される生体可給性相、すなわちミセル相（ＭＰ）は概して、全ての研究した消化物で主相である。しかしながら、消化率研究から得られる結果によると、ミセル相はＧＰ消化の最終生成物中に特に豊富であり、脂質画分の約９８．５％（ｗ／ｗ）が混合ミセル又はベシクルの形態であり、ＧＰの加水分解により放出される実質的に全ての生成物が潜在的に生体可給性であることが示される。ＲＬＯ＋ＭＯ系、特に元のＲＬＯは、脂質画分のそれぞれ約７５％及び５４％（ｗ／ｗ）のみがＭＰ中にあり、それぞれ約２２％及び４１％（ｗ／ｗ）が、未消化ＤＡＧＥ及びＭＡＧＥから本質的に構成される油相の一部であるため、生体可給性がＧＰよりも顕著に低い。消化ＧＰ中でＭＡＧＥが主にミセル形態であり、したがって生体可給性であることが指摘されるべきである。同様に、重要なことには、ＲＬＯ＋ＭＯ系（約１％（ｗ／ｗ））及び元のＲＬＯ（約０．７％（ｗ／ｗ））のＭＰ中と比較して、消化ＧＰのＭＰ中の高い割合の遊離ＡＫＧ（約７．５％（ｗ／ｗ））も強調される（図４）。結腸癌細胞培養物を用いて以前に行われた様々な研究によると、両方のＭＡＧＥ、特に遊離ＡＫＧが潜在的にＤＡＧＥよりも生理活性である。

消化率及び生体可給性の結果に基づくと、元のＲＬＯは、ＳＲＥの潜在的に効果的なビヒクルとして除外された。これが、ＳＲＥ配合物が本発明においてＧＰ（ＧＰ＋ＳＲＥ）及びＲＬＯ＋ＭＯ（ＲＬＯ＋ＭＯ＋ＳＲＥ）脂質系のみを用いて得られることの理由である。４％（ｗ／ｗ）及び９％（ｗ／ｗ）のＳＲＥの組込みは、脂質画分の生体可給性に顕著に影響を及ぼさず、ＳＲＥを含まないＧＰ系及びＲＬＯ＋ＭＯ系と同様の、相（ＯＰ、ＭＰ及びＰＰ）の分布及び該相の各々の脂質組成が観察される（図４）。しかしながら、１６％のＳＲＥを含む配合物では、脂質画分は、ＳＲＥを含まない系よりも明らかに生体可給性が低く、油相中の脂質化合物のより高いパーセンテージ及び顕著なＭＰの低減が観察される。これらの結果は、ＳＲＥの高いパーセンテージの結果として先にこれらの配合物において観察された脂質消化率の低減と一致する。

ＧＰ＋ＳＲＥ及びＲＬＯ＋ＭＯ＋ＳＲＥ配合物中のＳＲＥ、並びに非送達ＳＲＥの生体可給性を、ＭＰ中の全ポリフェノールをフォリン−チオカルト法に従って決定することで評価した。非送達ＳＲＥは、消化前の初期含量に対して約３９％のＭＰしか検出されないことから、腸内レベルで比較的低い生体可給性を有する。上記で論考したように、これは胃内消化段階中の抽出物の分解又は析出に起因し得る。しかしながら、両方の脂質ビヒクル（ＧＰ及びＲＬＯ＋ＭＯ）では、ＧＰ＋ＳＲＥ配合物が初期含量に対して（ＲＬＯ＋ＭＯが脂質ビヒクルである場合にＭＰ中で観察される８４％と比較して）ＭＰ中の約９１％のＳＲＥを示すことから、ＳＲＥの生体可給性は送達されない抽出物、特にＧＰに対して顕著に改善する。

３． ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性研究
本発明の脂質系（ＲＬＯ、ＲＬＯ＋ＭＯ及びＧＰ）、ＳＲＥが組み込まれた配合物（ＲＬＯ＋ＭＯ＋ＳＲＥ及びＧＰ＋ＳＲＥ）及び（消化及び非消化）非送達ＳＲＥの抗増殖活性を、ヒト結腸癌細胞培養物（ＳＷ６２０株）中でＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）法を用いて評価した。その目的で、種々の濃度（０μＬ／ｍＬ〜１１．５μＬ／ｍＬのＭＰ）でＤＭＥＭ培養培地に希釈した、脂質系の生体可給性画分（ＭＰ）、ＳＲＥを含む配合物及び非送達ＳＲＥで細胞を処理した。非消化非送達ＳＲＥの場合、細胞をＤＭＳＯ（０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ）中の種々の濃度の抽出物で処理した。細胞生存能力を、出発細胞集団を制御するために処理時、及び細胞成長に対する生成物の影響を決定するためにプレートを３７℃で４８時間インキュベートした後に決定した。生成物の抗増殖活性を推定するために用いたパラメーターは、医薬品による治療に対する応答と該医薬品の用量又は濃度との間の関係として説明されるＩＣ５０（５０％の細胞生存能力の阻害）であった。結果の検証を可能にするために、３回の独立実験を少なくとも三連で行った（ｎ＝９）。

アッセイした全ての生成物のＩＣ５０値（細胞生存能力を５０％阻害するＭＰの濃度（μＬ／ｍＬ））を表３に示す。

ＧＰは、元のＲＬＯ及びＲＬＯ＋ＭＯ系よりも顕著に低いＩＣ５０を示した。かかる結果から、ＧＰについて観察されるより大きな生体可給性、及びそれに応じたミセル形態、すなわち生体可給性形態の全生理活性アルキルグリセロール（ＡＫＧ_ｔ）及び本質的に遊離ＡＫＧのより高いパーセンテージと直接関連するＧＰの生体可給性画分のより大きな抗増殖効果が示される（図４）。重要なことには、ＲＬＯ＋ＭＯ系の場合、ＲＬＯへのＭＯの添加が全アルキルグリセロール含量の希釈を必然的に伴い、これが観察されるより低い抗増殖効果と関連し得ることも指摘される。

４％のＳＲＥを含む配合物（ＧＰ＋４％ＳＲＥ及びＲＬＯ＋ＭＯ＋４％ＳＲＥ）で処理した細胞の生存能力は別個の脂質系と同様であり、ＩＣ５０値に有意差は観察されない（表１）。

しかしながら、別個の脂質系よりも低いＩＣ５０値を示す９％のＳＲＥを含む配合物（ＧＰ＋９％ＳＲＥ及びＲＬＯ＋ＭＯ＋９％ＳＲＥ）について観察された結果は特に興味深く、これはＧＰ＋９％ＳＲＥ配合物の場合に特に顕著である（表１）。非送達ＳＲＥの生体可給性画分（９％の送達ＳＲＥを含む配合物と同様のＳＲＥの初期量を有する）は、その腸内レベルでの生体可給性の低減（初期含量の僅か３９％）の結果として、細胞生存能力に影響を有しなかった（適用したＭＰ濃度のいずれについてもＩＣ５０に達しない）。これに基づくと、得られた結果からＲＬＯ＋ＭＯ系、特にＧＰ系による９％ＳＲＥの送達により、消化時のＳＲＥ安定性、並びにそれに応じて腸内レベルでのその生体可給性及びその抗増殖効果が効率的に増大することが示される。

さらに、ＧＰ＋９％ＳＲＥ配合物の場合、ＩＣ５０に達するのに必要とされる濃度でのＭＰの生理活性成分（ＡＫＧ及びＳＲＥ）の含量（５０．２３μＭ ＡＫＧ_ｔ及び３．１４μｇ／ｍＬ ＳＲＥ）が、別個のＧＰ（１２４．５４μＭ ＡＫＧ_ｔ）及び非消化非送達ＳＲＥ（ＩＣ５０ 約４０μｇ／ｍＬ）についてよりも低く、脂質ビヒクルと送達ＳＲＥとの間の相乗効果が示される。

最後に、ＧＰへの１６％のＳＲＥの組込みは、この配合物中の脂質画分の消化率及び生体可給性がＳＲＥの高い割合、観察されるＭＰ中のより低い生理活性アルキルグリセロール含量の結果として損なわれることから、抗増殖効果の増大を生じない。

実施例６． ヒト膵癌細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抗増殖活性研究
脂質系（ＲＬＯ、ＲＬＯ＋ＭＯ及びＧＰ）、ＳＲＥが組み込まれた配合物（ＲＬＯ＋ＭＯ＋９％ＳＲＥ及びＧＰ＋９％ＳＲＥ）及び（消化及び非消化）非送達ＳＲＥの抗増殖活性をヒト膵癌細胞培養物（ＭｉａＰａｃａ−２株）においてＭＴＴ法を用いて評価した。

３回の独立実験を、種々の細胞株を用いて異なる日付で行った。細胞生存能力に対する処理の影響に関して観察される傾向は３回の実験で同様であった。

研究した脂質系の中でも、ＧＰは、元のＲＬＯ及びＲＬＯ＋ＭＯと比較して細胞生存能力に対してより低濃度でより大きな影響を示した。ＳＲＥを含む配合物に関しては、細胞生存能力に対するＲＬＯ＋ＭＯ＋９％ＳＲＥの影響は、ローズマリーを含まないＲＬＯ＋ＭＯ系で観察されるものと同様であったが、ＧＰ＋９％ＳＲＥ配合物は、ＳＲＥを含まないＧＰよりも効果的に細胞生存能力を阻害した。１％シクロペンタノンで処理した細胞の生存能力は変化しなかったため、ＧＰ及びＧＰ＋９％ＳＲＥによる細胞生存能力の阻害は処理の生理活性成分によるものであったと推定することができる。

細胞生存能力に対する化合物の影響を評定するために用いられるパラメーターは、細胞生存能力を５０％阻害する生成物の濃度である平均阻害濃度（ＩＣ５０）であり、化合物のＩＣ５０がより低いほど、その影響は大きくなる。より低いＩＣ５０値を有し、したがってより効果的な２つの処理は、ＧＰ及びＧＰ＋９％ＳＲＥであった。元のＲＬＯ、並びにＳＲＥを含む及び含まないＲＬＯ＋ＭＯは顕著により高いＩＣ５０値を示し、非送達ＳＲＥは細胞生存能力に対して何の影響も有しなかった（研究したいずれの濃度でも生存能力を５０％阻害しなかった）。

研究した他の２つの脂質系に対してより大きなＧＰの抗増殖効果は、おそらくはそのより大きな消化率及び生体可給性、並びにそれに応じたミセル形態、すなわち生体可給性形態の全生理活性ＡＫＧ（ＡＫＧ_ｔ）及び本質的に遊離ＡＫＧのより高いパーセンテージによるものである。重要なことには、ＲＬＯ＋ＭＯ系の場合、ＲＬＯへのＭＯの添加が全アルキルグリセロール含量の希釈を必然的に伴い、これがＧＰの影響と比較して観察されるより低い抗増殖効果と関連し得ることが指摘される。

ＧＰ＋９％ＳＲＥ配合物に関して、観察されるこのような低いＩＣ５０値により、両方の成分の活性成分間の相乗効果が示唆される。

消化非送達ＳＲＥの生体可給性画分（９％ＳＲＥを含むＧＰ配合物と同様のＳＲＥの初期量を有する）は、細胞生存能力に影響を有しなかった（適用したＭＰ濃度のいずれについてもＩＣ５０に達しない）。これは、腸内レベルでの非送達ローズマリーの生体可給性の低減（初期含量の僅か３９％）によるものである。これに基づくと、得られる結果から、ＧＰによる９％ＳＲＥの送達が消化時のＳＲＥ安定性、並びにそれに応じた腸内レベルでのその生体可給性及びその抗増殖効果を効率的に増大することが示される。

アッセイした全ての生成物のＩＣ５０値（細胞生存能力を５０％阻害するＭＰの濃度（μＬ／ｍＬ））を表４に示す。

実施例７． − 免疫調節剤補完（先天性応答増強剤）
７．１． 方法論
平均年齢２７．９±１０．１歳の５７人の健常ボランティア（５８．６％が女性）が参加し、そのうち３０人が研究群に属し、２７人が対照群に属する８週間の二重盲検並行ランダム化研究を行った。

参加者は昼食又は夕食と共に１カプセルを摂取した。ソフトゼラチンカプセルは、以下の特徴のアルキルグリセロール、ローズマリー抽出物及びモノステアリンを含有するものであった：
ＲＬＯ：２０％アルキルグリセロールを含むサメ肝油（Gustav Heess）：７５０ｍｇ（１５０ｍｇのアルキルグリセロールをもたらす）
ＳＲＥ：ローズマリー抗酸化抽出物、２５％ジテルペンフェノール、型番号０２７．０２０（ロスマリヌス・オフィキナリスＬ．）：４５ｍｇ（１１．２５ｍｇのジテルペンフェノールをもたらす）
ＭＳ：食品グレードのモノステアリン酸グリセロール
組成：９１．２％ＲＬＯ＋５．２％ＳＲＥ＋３．６％ＭＳ

採血後にＰＢＭＣを単離し、次いで上清中のサイトカインを測定するためにＬＰＳと共に培養したが、ＩＬ１β；ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＦＮｙ、ＴＮＦαのレベルを、その目的でＨｕｍａｎ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄ Ｐａｎｅｌキットを用い、ＭａｇＰｉｘにより読取りを行って測定した。

ＣＤ（分化抗原群）計数も、ＣＤ４５＋に対する分化抗原群ＣＤ３＋、ＣＤ４＋；ＣＤ８＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋について、その目的でフローサイトメトリーに特異的なキット及び抗体を用いて行った。

人体計測制御、バイタルサインの制御、並びに寛容及び有害事象の記録に加えて、尿素、クレアチニン、肝臓酵素ＧＯＴ／ＧＰＴ／ＧＧＴ、ビリルビン及びＦＡのレベルを最初、中間及び最終の来院時に安全性及び追跡パラメーターとして評価した。

治療の免疫調節影響を、末梢血から単離された単核細胞により産生されたサイトカインの血漿濃度と、免疫学的応答（Ｔｈ１、エフェクター応答及びＴｈ２、寛容応答）との間の生物学的相関を示す目的で、二変量相関（主成分分析）のアレイを生成することによって評価した。

７．２． 結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した単核細胞のサイトカインプロファイルを示す図５に示されるように、主成分分析ではＩＬ４の減少、並びに方法論に詳細に記載される栄養補給剤と関連するＩＬ１０及びＩＦＮｇの適度な増加への傾向が示され、これは一方で先天性免疫応答活性化及び寛容の好適な応答を、Ｍ１／Ｍ２マクロファージの中期極性化及びエフェクター細胞（食作用活性を有する単球、細胞傷害活性を有するＮＫ細胞）の成熟に有利なサイトカインプロファイルと共に示す。

付加的に、白血球集団のフェノタイピング（ＣＤ分化マーカー）は、ＲＬＯの独立投与による他の研究では観察されない事象である、おそらくはローズマリー抽出物ＳＲＥの使用による白血球集団（ＣＤ４５^＋）の増加（２４％）を示す（Palmieri B, Penneli A, Di Cerbo A. Jurassic surgery and immunity enhancement by alkylglycerols of shark liver oil. Lipids in Health and Disease 2014, 13:178）。この増加は、成熟エフェクター集団である単球（より大きな食作用活性への機能分化を有する）及びＮＫ細胞（腫瘍細胞に対して潜在的な細胞傷害活性を有する）のマーカーの大きな変化と関連する。

一方、ＩＬ−１０の増加とＩＬ−４の減少との組合せにより、制御性Ｔ細胞の増加及び該Ｔ細胞のより成熟した機能状態が存在しない（したがって腫瘍促進過程と関連する未成熟状態から逸脱する）ことが示唆される（図６）。

まとめると、得られたサイトカインプロファイル及び白血球フェノタイピングの傾向は、以下のタイプのエフェクター細胞：腫瘍増殖を予防する貪食能及び細胞傷害活性を有する非古典的単球及びＮＫ細胞への自然免疫系極性化に対して好都合な抗炎症環境を反映する。したがって、栄養補給剤を８週間摂取したボランティアにおける免疫学的パラメーター（サイトカイン及び白血球フェノタイピング）の分析により、以下からなるプラスの免疫栄養影響が示される：
先天性免疫応答の活性化及び寛容
食作用活性（単球）及び細胞傷害活性（ＮＫ細胞）を有するエフェクター細胞に対する免疫応答の中期極性化
抗炎症活性及び抗腫瘍活性を有するサイトカインプロファイルの生成

これらの結果は、アルキルグリセロール単独を用いて行われた他の研究が適応応答の刺激及び活性化しか示さなかったことを考慮すると、驚くべきものである。しかしながら、アルキルグリセロールをＳＲＥで補完する本研究では、この補完において見られる独自の効果である中期Ｍ１／Ｍ２極性化と共に、先天性応答の明らかな刺激が観察され、この先天性応答の変調は、癌及び免疫系の障害の両方において潜在的に効果的である。

したがって、これらの結果により、以下のものとしてのこの補完の使用が示唆される：
^＊限局性腫瘍を有する癌患者における転移の発生を予防する薬剤
^＊貪食能を有する成熟エフェクター細胞（単球、ＮＫ細胞）の産生、抗腫瘍活性を有するサイトカインの産生及び腫瘍抗原を標的とするＴリンパ球の機能的成熟への先天性応答の活性化が必要とされる候補患者において免疫療法を増強する薬剤
^＊免疫障害を予防する薬剤

一方、ＪＡＫ１遺伝子の顕著な減少が、８週間にわたって方法論に示されるような補完を受けたボランティアの血球中で観察された（図７を参照されたい）。

ＪＡＫ１は、或る特定のＩ型及びＩＩ型サイトカインのシグナル伝達、並びにインターフェロンＩＦＮ−α／β／γ及びＩＬ１０−Ｒファミリーのメンバーのシグナル伝達に不可欠なチロシンキナーゼタンパク質である。したがって、栄養学的介入後のその減少は、全身炎症応答を軽減する可能性がある（これは軽度炎症の場合に潜在的に有用である）。

一方、癌におけるＪＡＫ１遺伝子の過剰発現は転移の促進と関連付けられている。癌の状況下では、本発明は、その免疫調節活性及び抗炎症活性の結果としてだけでなく、ＪＡＫ１経路阻害に対するその特定の効果の結果としても腫瘍及び転移の進行の停止に更に寄与し得る。

ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子の発現も治療群で顕著に減少した。Ｎｒｆ２は、損傷及び炎症の場合の酸化ストレスを低減する抗酸化タンパク質の発現と関連する転写因子である。

さらに、ＢＭＰ２遺伝子の発現も治療群で顕著に減少することが観察された。ＢＭＰ２はＴＮＦスーパーファミリーに属し、薬物耐性の増大と併せて多能性細胞マーカー（ＣＤ１３３＋及びＥｐＣＡＭ＋）の増加に反映されるＣＳＣ発生を促進することから、結腸癌の発生及び増殖に寄与する。したがって、ＢＭＰ２の循環レベルを低減することが可能な介入は、結腸癌促進幹細胞の数の低減に寄与し得る。

ヒト結腸癌腫瘍細胞（ＳＷ６２０）においてローズマリー抽出物及びＲＬＯ及びＭＳを用いて行ったｉｎ ｖｉｔｒｏ研究により、遺伝子ＪＡＫ１、ＣＨＯＫＡ及びＢＭＰ２の発現の低減におけるＳＲＥの特異的効果が実証される（図８）。

最後に、ＣＨＫＡの阻害が８週間にわたって補完、すなわち方法論に記載の抽出物を受けたボランティアの血球において観察された。ＣＨＫＡは、腫瘍過程だけでなく代謝恒常性にも関与するホスファチジルコリン生合成のケネディ経路の最初の酵素であり、その変更は肥満又はメタボリックシンドローム等の癌と関連する種々の代謝性疾患と関連付けられている（図７）。

Claims (16)

1. 超臨界ローズマリー抽出物（ＳＲＥ）と、ラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）、又はラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）をベースとした酵素的若しくは化学的グリセロール分解プロセスの生成物を含む脂質系とを含む組成物。
2. ラットフィッシュ肝油（ＲＬＯ）とＳＲＥとを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. モノグリセリド、好ましくは２％〜３０％（ｗ／ｗ）のモノグリセリドを更に含む、請求項２に記載の組成物。
4. 前記モノグリセリドがモノオレイン（ＭＯ）及びモノステアリン（ＭＳ）からなるリストから選択される、請求項３に記載の組成物。
5. 前記モノグリセリドがＭＳである、請求項４に記載の組成物。
6. 以下のものを含む±３０％の組成物からなる、請求項５に記載の組成物：
   ａ． ９１．２％（ｗ／ｗ）のＲＬＯ、
   ｂ． ５．２％（ｗ／ｗ）のＳＲＥ、及び、
   ｃ． ３．６％（ｗ／ｗ）のＭＳ。
7. 前記脂質系が、前記ラットフィッシュ肝油をベースとした酵素的又は化学的グリセロール分解プロセスの生成物であり、以下のものを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物：
   ａ． ２５％〜３５％（ｗ／ｗ）のモノグリセリド及び／又は遊離アルキルグリセロール、
   ｂ． １０％〜２５％（ｗ／ｗ）のジアシルグリセロールエーテル（ＤＡＧＥ）、並びに、
   ｃ． ４０％〜６０％（ｗ／ｗ）のモノアシルグリセロールエーテル（ＭＡＧＥ）及び／又はジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ここで、前記脂質系中に存在するＭＡＧＥ及びＤＡＧの総量に対するＭＡＧＥの割合は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）である）。
8. 前記脂質系が、前記ラットフィッシュ肝油をベースとした酵素的又は化学的グリセロール分解プロセスの生成物であり、以下のものを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物：
   ａ． ２５％〜３５％（ｗ／ｗ）のモノグリセリド及び／又は遊離アルキルグリセロール、
   ｂ． １０％〜２５％（ｗ／ｗ）のジアシルグリセロールエーテル（ＤＡＧＥ）、
   ｃ． ０％〜５％（ｗ／ｗ）のトリグリセリド、
   ｄ． ０％〜３％のグリセリン、並びに、
   ｅ． ４０％〜６０％（ｗ／ｗ）のモノアシルグリセロールエーテル（ＭＡＧＥ）及び／又はジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ここで、前記脂質系中に存在するＭＡＧＥ及びＤＡＧの総量に対するＭＡＧＥの割合は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）である）。
9. 前記脂質系が、前記ラットフィッシュ肝油をベースとした酵素的又は化学的グリセロール分解プロセスの生成物であり、以下のものを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物：
   ａ． ２８％〜３２％（ｗ／ｗ）のモノグリセリド及び／又は遊離アルキルグリセロール、
   ｂ． １８％〜２２％（ｗ／ｗ）のジアシルグリセロールエーテル（ＤＡＧＥ）、
   ｃ． ０％〜２％（ｗ／ｗ）のトリグリセリド、
   ｄ． １％〜３％のグリセリン、及び、
   ｅ． ４０％〜５０％（ｗ／ｗ）のモノアシルグリセロールエーテル（ＭＡＧＥ）及び／又はジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ここで、前記脂質系中に存在するＭＡＧＥ及びＤＡＧの総量に対するＭＡＧＥの割合は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）である）。
10. 癌又は免疫障害を有する患者に対し、免疫療法増強剤又はアジュバントとして使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、乾癬、セリアック病及び多発性硬化症からなるリストから選択される自己免疫性免疫障害を有する患者の治療に使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
12. 腫瘍成長、慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス感染、（Ｂ型及びＣ型）肝炎ウイルス感染又はヒト免疫不全ウイルス感染を有する患者の治療に使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
13. 腎臓損傷の予防に使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
14. 機能性食品、栄養補助食品、天然抽出物又は薬物、好ましくは抗癌剤の薬学的に許容可能な又は食品グレードのビヒクルの合成のための請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
15. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物を含む食品組成物。
16. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物と、任意に薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。