JP2019516786A - 生理活性化合物を保有する脂質系を含む配合物、癌又は免疫障害を有する患者に対する免疫療法増強剤又はアジュバントとしての使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明では、「生体可給性」は、可溶性であり、ひいては吸収が可能な腸管内の生成物の量として理解される。
経口投与される物質の生理活性は、その摂取後の胃腸内レベルでの生体可給性(可溶性であり、吸収が可能な腸内の生成物の量として測定される)、及びそのバイオアベイラビリティ(腸細胞によって吸収される能力)によって決定される。この側面は、in vitroアッセイにおいて有望な効果を示した特定の化合物が、通常は、それらの腸内レベルでの生体可給性及びそれらのバイオアベイラビリティを制限する、胃の水性媒体中でのそれらの低い溶解性のために臨床研究においていかなる生理活性効果も示すことができないことを考えると重要である。
約30%(w/w)のモノグリセリド、
約1%(w/w)のトリグリセリド、
約20%のジアシルグリセロールエーテル(DAGE)、
約2%のグリセリン、並びに、
約47%のジアシルグリセロール及びモノアシルグリセロールエーテル(MAGE)の混合物。
a. 25%〜35%(w/w)のモノグリセリド及び/又は遊離アルキルグリセロール等の乳化物質、
b. 10%〜25%(w/w)のジアシルグリセロールエーテル(DAGE)、並びに、
c. 40%〜60%(w/w)のモノアシルグリセロールエーテル(MAGE)及び/又はジアシルグリセロール(DAG)(ここで、脂質系中に存在するMAGE及びDAGの総量に対するMAGEの割合は少なくとも50%(w/w)、より好ましくは少なくとも60%、70%、80%、85%、90%又は95%である)。
logPオクタノール/水=log([溶質]オクタノール/[溶質]非イオン化水)
に従って決定される)の作用を(場合によっては相乗的に)増大するのに十分な割合でのAKGの合成、アクセシビリティ及びバイオアベイラビリティに不可欠である。
a. 25%〜35%(w/w)のモノグリセリド及び/又は遊離アルキルグリセロール、
b. 10%〜25%(w/w)のジアシルグリセロールエーテル(DAGE)、
c. 0%〜5%(w/w)のトリグリセリド、
d. 0%〜3%のグリセリン、並びに、
e. 40%〜60%(w/w)のモノアシルグリセロールエーテル(MAGE)及び/又はジアシルグリセロール(DAG)(ここで、脂質系中に存在するMAGE及びDAGの総量に対するMAGEの割合は、少なくとも50%(w/w)である)を含む。
a. 28%〜32%(w/w)のモノグリセリド及び/又は遊離アルキルグリセロール、
b. 18%〜22%(w/w)のジアシルグリセロールエーテル(DAGE)、
c. 0%〜2%(w/w)のトリグリセリド、
d. 1%〜3%のグリセリン、並びに、
e. 40%〜50%(w/w)のモノアシルグリセロールエーテル(MAGE)及び/又はジアシルグリセロール(DAG)(ここで、脂質系中に存在するMAGE及びDAGの総量に対するMAGEの割合は、少なくとも50%(w/w)である)を含む。
a. ラットフィッシュ肝油(RLO)、好ましくは表1に記載の定性的及び定量的特徴を有する油を容器に添加することと、
b. 工程a)の生成物の温度を、連続撹拌(200rpm)しながら、好ましくは40℃に調節することと、
c. 1つ以上のリパーゼを工程b)の混合物に添加することと、
d. 工程c)の生成物を、好ましくは200rpmのオービタル撹拌機(IKAのKS 4000 ic Control、シュタウフェン、ドイツ)内でインキュベートすることと、
e. グリセロール分解反応生成物を得ることと、
を含む、プロセスに関する。
a. ラットフィッシュ肝油(RLO)、好ましくは表1に記載の定性的及び定量的特徴を有する油を、グリセロールを含む容器に好ましくは1:1のRLO:グリセロールモル比で添加すると共に、好ましくは溶媒を油及びグリセロールの混合物に添加することで、それらの混和性を改善することと、
b. 工程a)の混合物の温度を、連続撹拌(200rpm)しながら、好ましくは40℃に調節することと、
c. 1つ以上のリパーゼを工程b)の混合物に添加することと、
d. 工程c)の生成物を、好ましくは200rpmのオービタル撹拌機(IKAのKS 4000 ic Control、シュタウフェン、ドイツ)内でインキュベートすることと、
e. グリセロール分解反応生成物を得ることと、
を含むのが好ましい。
RLO:20%アルキルグリセロールを含むサメ肝油(Gustav Heess):750mg(150mgのアルキルグリセロールをもたらす)
SRE:ローズマリー抗酸化抽出物、25%ジテルペンフェノール、型番号027.020(ロスマリヌス・オフィキナリスL.):45mg(11.25mgのジテルペンフェノールをもたらす)
MS:食品グレードのモノステアリン酸グリセロール
組成:91.2%RLO+5.2%SRE+3.6%MS
先天性免疫応答の活性化及び寛容
食作用活性(単球)及び細胞傷害活性(NK細胞)を有するエフェクター細胞に対する免疫応答の中期極性化
抗炎症活性及び抗腫瘍活性を有するサイトカインプロファイルの生成
*限局性腫瘍を有する癌患者における転移の発生を予防する薬剤
*貪食能を有する成熟エフェクター細胞(単球、NK細胞)の産生、抗腫瘍活性を有するサイトカインの産生及び腫瘍抗原を標的とするTリンパ球の機能的成熟への先天性応答の活性化が必要とされる候補患者において免疫療法を増強する薬剤
*免疫障害を予防する薬剤
logPオクタノール/水=log([溶質]オクタノール/[溶質]非イオン化水)
に従って決定される。
化学製品及び試薬
ラットフィッシュ肝油(RLO)は、Rosita RatfishOil(商標)(ヘルゲラン、ノルウェー)の厚意により提供された。
RLO脂肪酸プロファイルを、サンプル中に存在するエステル化脂肪酸残基のメチル化の後に、水素炎イオン化検出器(GC−FID)によるガスクロマトグラフィーを用いて決定した。その目的で、50MAGのRLOを1mlのn−ヘキサン(Lab-Scan、グリヴィツェ、ポーランド)で溶解した。次に、メタノール中の0.5N NaOHを1mlサンプルのメタノリシスのために添加し、続いて1分間撹拌し、100℃で5分間加熱し、メタノール中の14%BF3(Supelco、パサデナ、米国)を1ml添加することによる付加的なメチル化を行い、1分間撹拌し、100℃で5分間インキュベートした。室温で2分間撹拌した後、得られる脂肪酸メチルエステル(FAME)混合物をn−ヘキサン(1ml)及び飽和NaCl溶液(1ml)で抽出した。次いで、デカントしたヘキサン相を、無水硫酸ナトリウム(Panreac)を用いて2時間沈降させ、湿分を除去した。最後に、ヘキサンを蒸発乾固してFAME残渣を得て、これを次いで15MAG/mlの最終濃度でn−ヘキサンに溶解した。MAGEのクロマトグラフ分析を、水素炎イオン化検出器(FID)を備えるAgilent Technologiesのガスクロマトグラフ(6850 N Network GC System)において行った。1μlのサンプルを、分割/非分割モード(10:1の分割比)でHP−88キャピラリーカラム((88%シアノプロピル)アリール−ポリシロキサン、30m×0.25mm×0.20μm厚;Agilent Technologies Inc.、サンタクララ、カリフォルニア州、米国)に注入した。0.9ml/分の流量のヘリウムをキャリヤガスとして使用した。注入器及び検出器の温度は、それぞれ220℃及び250℃とした。温度プログラムは以下のようにした:50℃で開始した後、180℃まで20℃/分で加熱し、続いて180℃から220℃まで15℃/分で加熱した。最終温度(220℃)を10分間維持した。定量化のために、オレイン酸エチルを用いて検量線をプロットした。データを得て、AgilentのChemStation Reb.4B.03.01ソフトウェア(ウィルミントン、デラウェア州、米国)を用いて統合した。分析を二連で行い、データを平均±標準偏差(SD)で表した。
リパーゼにより触媒されるグリセロール分解を、僅かに変更したTorres et al. (2002)の方法に従って行った。要約すると、10gのRLOを、1gのグリセロールを含有する120ml容フラスコに添加した(1:1のRLO:グリセロールモル比)。生成物の混合物中に過剰な試薬が存在するのを防ぐために、RLO及びグリセロールの化学量論比を用いた。混合物の温度を連続撹拌(200rpm)しながら40℃に調節した。市販の種々のリパーゼを1:10(w/w)の酵素:RLO比で添加することで反応を開始した。次に、フラスコに蓋をし、200rpmのオービタル撹拌機(IKAのKS 4000 ic Control、シュタウフェン、ドイツ)内でインキュベートした。グリセロール分解反応の進行を、反応混合物のアリコート(50μl)を定期的に採取することによって決定した。全てのアッセイについて48時間沈降させ、二連で行った。
本発明の脂質系(実施例2に記載の系)を合成する(elaborate)ために、付加的なグリセロール分解反応を同じ撹拌、温度及び時間条件下(200rpm及び40℃で48時間の連続撹拌)で以下のようにして行った:
i)CPN、HXL及びCPMEを含むGRAS溶媒の存在下。溶媒の所要容量を算出するために、1mlの溶媒アリコートを、初期反応混合物中に存在するグリセロールが完全に溶解するまで連続して添加した。次に、グリセロール−溶媒溶液を250ml容フラスコにおいて溶媒を含まない反応物と同じモル比(1:1のグリセロール:RLO)でRLOと混合した。RLOと混合した後、他の著者(Damstrup et al, 2005, 2006, 2007)によると、グリセロールは再び部分的に不溶性となったが、系の均一性は溶媒の非存在下よりも高いままであった。反応をリパーゼの添加により開始し、この場合、溶媒の希釈効果に対抗するために、酵素負荷(酵素:RLOの比率=1.25:10 w/w)は、溶媒を含まない系に使用されるよりも大きくした。反応後に、RV 10ロータリーエバポレーター(IKA(商標)-Werke GmbH & Co. KG、シュタウフェン、ドイツ)及び油回転真空ポンプ(Edwards、スペインでの販売会社Iberica Vacuum、マドリード、スペイン)による真空を用いて、50℃及び真空中(約0.10kPa)での蒸発により、溶媒を反応生成物から除去した。
元のRLOサンプル及びグリセロール分解プロセスにより得られるサンプル中に存在する脂質のクロマトグラフ分離及び定量化を、LC−ELSDを用いて行った。グリセロール分解プロセス全体にわたって反応混合物から取り出された50μlアリコートを2mlのクロロホルムに溶解し、濾過した(0.45μmのPVDFフィルター、Symta、マドリード、スペイン)。次いで、クロロホルムを、StuartのSBH200D/3蓄熱ヒーター(スタッフォードシャー、イギリス)を用いて、一定重量を有する残渣が得られるまで40℃、窒素流中で蒸発させた。最後に、元のRLOサンプル又は酵素的グリセロール分解により得られるサンプルを、HPLCシステムへの注入(1μl、約20μgの全脂質)前に20MAG/mlの最終濃度でクロロホルムを用いて希釈した。
100−[(%最終/%初期)×100] [E1]
[Pcomw/Pr.m]×100 [E2]
ここで、%最終及び%初期は、それぞれ最終及び初期の反応混合物中のDAGE及びTAGのパーセンテージであり、Pcomp及びPr.mは、それぞれ反応混合物の各化合物の重量及び反応混合物の総重量である。
i)収率(100gのRLO当たりのMAGのg数)は、RLOの初期質量単位当たりのグリセロール分解中に得られるMAGの質量を表す。
ii)生産性(g/L/h)は、反応時間単位当たりに産生されるMAGの濃度を表す。
特定の最適条件下でのグリセロール分解反応を、プロセス全体を通して機械的撹拌及び制御温度を用いる「キロクレーブ(kiloclave)」反応器システム(Buchi Glas Uster、Buchiglasuter、スイス)でのパイロットプラントへと拡張した。初期反応混合物の組成は128gのRLO、12.8gのグリセリン及び304gのPCNからなる約500gの最終重量に調整した。反応中に、リパーゼ(12g)を反応器の撹拌シャフトに連結したバスケットに入れ、反応混合物を該バスケット内に循環させた。生体触媒として使用されるリパーゼの量はバスケットの容量によって限られ、酵素負荷(酵素:RLO比=0.94:10 w/w)は実験室規模より小さかった。実験室規模と同様、反応速度を研究するためにアリコートを定期的に反応混合物から取り出した。これらを2.5項において説明されるようにLC−ELSDを用いて分析した。48時間の反応後に、反応器の放出弁を通して反応媒体を取り除いた。
表1に、CG−DILを用いて決定されたラットフィッシュ肝油(RLO)の脂肪酸プロファイルを示す。観察されるように、RLOの主要脂肪酸はオレイン酸及びパルミチン酸であり、多価不飽和脂肪酸(PUFA)含量は、他の魚油のPUFA含量と比較して低い。この脂肪酸プロファイルは、他の海産油(marine oils)と比較して大きな酸化に対する安定性をもたらし得る。
1 − 種々の割合のラットフィッシュ肝油とモノオレイン(脂質ビヒクル)及び超臨界ローズマリー抽出物(生理活性化合物)とから構成される配合物を得る
1:1のモル比でのラットフィッシュ肝油(RLO)(Phosphotech、フランス)と食品グレードのモノオレイン(MO)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH、シュタインハイム、ドイツ)との混合物を、市販の超臨界ローズマリー抽出物(SRE)(ESTABILOTON OS)と4%、9%及び16%(w/w)を含む種々の濃度で混合し、以下でRLO+MO+4%SRE、RLO+MO+9%SRE及びRLO+MO+16%SREと称される配合物を得た。次いで、これらの混合物を500バールの高圧ホモジナイザー(Emulsiflex C5、Avestin Europe)に3回通した。
胃内消化については、3gの配合物(RLO+MO+4%SRE、RLO+MO+9%SRE及びRLO+MO+16%SRE)を、食事性PLを模擬するために600MAGのリン脂質(PL)(Phospholipon 90H)、及び16.4mLの胃模擬溶液(pH2.5の0.15M NaCl、SGF)と混合した。1M HClを用いてpHを2.5に調整した。調製した媒体を3500rpmで2分間の均質化により予備乳化し、37℃に温度制御し、オービタル撹拌機(IKAのKS 4000 ic Control、シュタウフェン、ドイツ)内、200rpmで連続撹拌した。次いで、SGF(pH2.5)中のブタ起源のペプシン(EC 3.4.23.1、Sigma-Aldrich Chemie GmbH、シュタインハイム、ドイツ)(活性 3300U/MAGタンパク質)を含有する16%(w/v)溶液を1:12(w:w)の酵素:基質の割合で添加し、37℃で1時間インキュベートした。
消化中に採取された種々のアリコートから全脂質を抽出するために、サンプル:溶媒比=1:3(v/v)で種々の溶媒混合物を用い、毎回14500rpmで10分間遠心分離することで3回の連続抽出を行った。混合物は、極性の低いものから高いものへ、i)n−ヘキサン:メチル−tert−ブチル−エーテル(MTBE)(50:50、v:v);ii)MTBE:石油エーテル(PE)(50:50、v:v);iii)PE:エタノール(1:0.6、v:v)であった。
3.1 相分離
in vitro腸内消化プロセス中にミセル構造に組み込まれた脂質生成物から未消化脂質画分を分離するために、消化最終生成物をSoler-Rivas et al. (2010)によって行われたプロトコルに従って4000rpm、37℃で40分間遠心分離した。遠心分離後に、消化媒体は以下の3つの明らかに区別される相へと分離した:消化されなかった脂質サンプルの画分及びローズマリー抽出物の一部から構成される、油相(OP)と称される上相(in vivo条件では、この相は糞便と共に分泌されるか又は結腸微生物叢によって変換される);消化脂質画分が、ローズマリー抽出物が組み込まれたミセル構造及びベシクルを形成して存在し得る、ミセル相(MP)と称される中間水相(これは生体可給性画分、すなわち腸内上皮細胞による吸収が可能な画分である);並びに膵液消化中に放出される脂肪酸石鹸及び塩の残渣からなる、析出相(PP)と称される極めて僅かな不溶性下相(5)。
RLO+MO系内で送達されるSREの生体可給性画分の全ポリフェノール含量を、フォリン−チオカルト法を用いて決定した(6)。簡潔に述べると、10μlのサンプルを150μlのフォリン−チオカルト溶液と混合し、室温で3分間放置した。次いで、50μLの重炭酸ナトリウム溶液(3%)を添加した。最後に、暗所、37℃で2時間インキュベートした後、分光光度計(Genesis 10 UV Scanning、Thermo Scientific)を用いて735nmでの吸光度を測定した。ローズマリー抽出物自体及び種々の濃度(0.2MAG/mL〜2MAG/mL)のロスマリン酸を標準として使用した。
配合物RLO+MO+4%SRE、RLO+MO+9%SRE及びRLO+MO+16%SREの消化後に得られる(生体可給性)ミセル相のin vitro抗増殖活性を、ヒト結腸癌細胞モデルにおいて評価した。
ヒト結腸癌細胞株SW620を10%FBS、2mM グルタミン、並びに10000単位/mLのベースとなる(base)ペニシリン、10000μg/mLのベースとなるストレプトマイシン及び25000ng/mLのアムホテリシンBを含有する1%抗生物質−抗真菌剤溶液を添加したDMEM培地中で培養した。細胞培養物を標準温度(37℃)、湿度(95%)及び二酸化炭素(5%)条件下に維持した。
MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)法を用いて、消化生成物の抗増殖活性を測定した。その目的で、指数増殖期の細胞を24ウェルプレートに移したが、1ウェル当たり平均25000個の細胞を200μLの最終容量で組み入れた。37℃で2時間インキュベートした後、培養培地を、種々の濃度(0μL/mL〜11.5μL/mLのMP)でDMEM培養培地に希釈した、アッセイされる生成物(RLO+MO+4%SRE、RLO+MO+9%SRE及びRLO+MO+16%SRE)の各々の生体可給性画分(MP)を含有する培地で置き換えた。細胞生存能力を、出発細胞集団を制御するために処理時、及び細胞成長に対する生成物の影響を決定するためにプレートを37℃で48時間インキュベートした後の両方で決定した。生存細胞数を決定するために、20μLのMTT溶液(FBS中、5MAG/mL)を各ウェルに添加した。次いで、プレートを放置し、ホルマザン(MTTの青色の代謝生成物)を生存細胞に付着させるため3時間インキュベートした。インキュベーション後に、培地を取り出し、200μLのDMSO(ジメチルスルホキシド)を添加して細胞を解離させ、ホルマザンを再懸濁させたが、その濃度(分光光度プレートリーダー(UVM 340、Biochrom、ケンブリッジ)を用いて560nmで測定される)は、生存細胞の数に直接関連する。医薬品による治療に対する応答と該医薬品の用量又は濃度との間の関係として説明される概念であるIC50(50%の細胞生存能力の阻害)に対応する各生成物の濃度値を、NIH規定に従い、ロジスティック回帰を用いて算出した。
1 − 種々の割合のパイロットプラントに拡張可能な酵素的グリセロール分解プロセスを用いてRLOから得られる生成物(脂質ビヒクル)と超臨界ローズマリー抽出物(生理活性化合物)とから構成される配合物を得る
材料及び方法(最適化酵素的解糖法を参照されたい)に説明される、撹拌、温度及び時間条件下(200rpm及び40℃で48時間の連続撹拌)のラットフィッシュ肝油(RLO)(Phosphotech、フランス)から得られるグリセロール分解生成物(GP)混合物を、市販の超臨界ローズマリー抽出物(SRE)(ESTABILOTON OS)と4%、9%及び16%(w/w)を含む種々の濃度で混合し、以下でGP+4%SRE、GP+9%SRE及びGP+16%SREと称される配合物を得た。次いで、これらの混合物を500バールの高圧ホモジナイザー(Emulsiflex C5、Avestin Europe)に3回通した。
胃内消化については、3gの配合物(GP+4%SRE、GP+9%SRE及びGP+16%SRE)を、食事性PLを模擬するために600MAGのリン脂質(PL)(Phospholipon 90H)、及び16.4mLの胃模擬溶液(pH2.5の0.15M NaCl、SGF)と混合した。1M HClを用いてpHを2.5に調整した。調製した媒体を3500rpmで2分間の均質化により予備乳化し、37℃に温度制御し、オービタル撹拌機(IKAのKS 4000 ic Control、シュタウフェン、ドイツ)内、200rpmで連続撹拌した。次いで、SGF中のブタ起源のペプシン(EC 3.4.23.1、Sigma-Aldrich Chemie GmbH、シュタインハイム、ドイツ)(活性 3300U/MAGタンパク質)を含有する16%(w/v)溶液を1:12(w:w)の酵素:基質の割合で添加し、37℃で1時間インキュベートした。
消化中に採取された種々のアリコートから全脂質を抽出するために、サンプル:溶媒比=1:3(v/v)で種々の溶媒混合物を用い、毎回14500rpmで10分間遠心分離することで3回の連続抽出を行った。混合物は、極性の低いものから高いものへ、i)n−ヘキサン:メチル−tert−ブチル−エーテル(MTBE)(50:50、v:v);ii)MTBE:石油エーテル(PE)(50:50、v:v);iii)PE:エタノール(1:0.6、v:v)であった。
3.1 相分離
in vitro腸内消化プロセス中にミセル構造に組み込まれた脂質生成物から未消化脂質画分を分離するために、消化最終生成物をSoler-Rivas et al. (2010)によって行われたプロトコルに従って4000rpm、37℃で40分間遠心分離した。遠心分離後に、消化媒体は以下の3つの明らかに区別される相へと分離した:消化されなかった脂質サンプルの画分及びローズマリー抽出物の一部から構成される、油相(OP)と称される上相(in vivo条件では、この相は糞便と共に分泌されるか又は結腸微生物叢によって変換される);消化脂質画分が、ローズマリー抽出物が組み込まれたミセル構造及びベシクルを形成して存在し得る、ミセル相(MP)と称される中間水相(これは生体可給性画分、すなわち腸内上皮細胞による吸収が可能な画分である);並びに膵液消化中に放出される脂肪酸石鹸及び塩の残渣からなる、析出相(PP)と称される極めて僅かな不溶性下相(5)。
GP系内で送達されるSREの生体可給性画分の全ポリフェノール含量を、フォリン−チオカルト法を用いて決定した(6)。簡潔に述べると、10μlのサンプルを150μlのフォリン−チオカルト溶液と混合し、室温で3分間放置した。次いで、50μLの重炭酸ナトリウム溶液(3%)を添加した。最後に、暗所、37℃で2時間インキュベートした後、分光光度計(Genesis 10 UV Scanning、Thermo Scientific)を用いて735nmでの吸光度を測定した。ローズマリー抽出物自体及び種々の濃度(0.2MAG/mL〜2MAG/mL)のロスマリン酸を標準として使用した。
配合物GP+4%SRE、GP+9%SRE及びGP+16%SREの消化後に得られる(生体可給性)ミセル相のin vitro抗増殖活性を、ヒト結腸癌細胞モデルにおいて評価した。
ヒト結腸癌細胞株SW620を10%FBS、2mM グルタミン、並びに10000単位/mLのベースとなるペニシリン、10000μg/mLのベースとなるストレプトマイシン及び25000ng/mLのアムホテリシンBを含有する1%抗生物質−抗真菌剤溶液を添加したDMEM培地中で培養した。細胞培養物を標準温度(37℃)、湿度(95%)及び二酸化炭素(5%)条件下に維持した。
MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)法を用いて、消化生成物の抗増殖活性を測定した。その目的で、指数増殖期の細胞を24ウェルプレートに移したが、1ウェル当たり平均25000個の細胞を200μLの最終容量で組み入れた。37℃で2時間インキュベートした後、培養培地を、種々の濃度(0μL/mL〜11.5μL/mLのMP)でDMEM培養培地に希釈した、アッセイされる生成物(GP+4%SRE、GP+9%SRE及びGP+16%SRE)の各々の生体可給性画分(MP)を含有する培地で置き換えた。細胞生存能力を、出発細胞集団を制御するために処理時、及び細胞成長に対する生成物の影響を決定するためにプレートを37℃で48時間インキュベートした後の両方で決定した。生存細胞数を決定するために、20μLのMTT溶液(FBS中、5MAG/mL)を各ウェルに添加した。次いで、プレートを放置し、ホルマザン(MTTの青色の代謝生成物)を生存細胞に付着させるため3時間インキュベートした。インキュベーション後に、培地を取り出し、200μLのDMSO(ジメチルスルホキシド)を添加して細胞を解離させ、ホルマザンを再懸濁させたが、その濃度(分光光度プレートリーダー(UVM 340、Biochrom、ケンブリッジ)を用いて560nmで測定される)は、生存細胞の数に直接関連する。医薬品による治療に対する応答と該医薬品の用量又は濃度との間の関係として説明される概念であるIC50(50%の細胞生存能力の阻害)に対応する各生成物の濃度値*/*/を、NIH規定に従い、ロジスティック回帰を用いて算出した。
1 − 種々の割合での非送達超臨界ローズマリー抽出物(生理活性化合物)のin vitro胃腸内消化
胃内消化については、120MAG、270MAG及び480MAGの市販のSRE(それぞれ4%、9%及び16%の送達SREを含む配合物中に存在する量に等しい量)を、食事性PLを模擬するために600MAGのリン脂質(PL)(Phospholipon 90H)と混合し、16.4mLの胃模擬溶液(pH2.5の0.15M NaCl、SGF)と混合した。1M HClを用いてpHを2.5に調整した。調製した媒体を3500rpmで2分間の均質化により予備乳化し、37℃に温度制御し、オービタル撹拌機(IKAのKS 4000 ic Control、シュタウフェン、ドイツ)内、200rpmで連続撹拌した。次いで、SGF(pH2.5)中のブタ起源のペプシン(EC 3.4.23.1、Sigma-Aldrich Chemie GmbH、シュタインハイム、ドイツ)(活性 3300U/MAGタンパク質)を含有する16%(w/v)溶液を1:12(w:w)の酵素:基質の割合で添加し、37℃で1時間インキュベートした。
2.1 相分離
SREの生体可給性画分を消化プロセス中の分解又は析出による非生体可給性画分から分離するために、消化最終生成物をSoler-Rivas et al. (2010)によって行われたプロトコルに従って4000rpm、37℃で40分間遠心分離した。
非送達SREの生体可給性画分の全ポリフェノール含量を、フォリン−チオカルト法を用いて決定した(6)。簡潔に述べると、10μlのサンプルを150μlのフォリン−チオカルト溶液と混合し、室温で3分間放置した。次いで、50μLの重炭酸ナトリウム溶液(3%)を添加した。最後に、暗所、37℃で2時間インキュベートした後、分光光度計(Genesis 10 UV Scanning、Thermo Scientific)を用いて735nmでの吸光度を測定した。ローズマリー抽出物自体及び種々の濃度(0.2MAG/mL〜2MAG/mL)のロスマリン酸を標準として使用した。
非送達SREの消化後に得られる(生体可給性)ミセル相のin vitro抗増殖活性を、ヒト結腸癌細胞モデルにおいて評価した。
ヒト結腸癌細胞株SW620を10%FBS、2mM グルタミン、並びに10000単位/mLのベースとなるペニシリン、10000μg/mLのベースとなるストレプトマイシン及び25000ng/mLのアムホテリシンBを含有する1%抗生物質−抗真菌剤溶液を添加したDMEM培地中で培養した。細胞培養物を標準温度(37℃)、湿度(95%)及び二酸化炭素(5%)条件下に維持した。
MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)法を用いて、消化生成物の抗増殖活性を測定した。その目的で、指数増殖期の細胞を24ウェルプレートに移したが、1ウェル当たり平均25000個の細胞を200μLの最終容量で組み入れた。37℃で2時間インキュベートした後、培養培地を、種々の濃度(0μL/mL〜11.5μL/mLのMP)でDMEM培養培地に希釈した、アッセイされる生成物(4%のSRE、9%のSRE及び16%非送達SRE)の各々の生体可給性画分(MP)を含有する培地で置き換えた。細胞生存能力を、出発細胞集団を制御するために処理時、及び細胞成長に対する生成物の影響を決定するためにプレートを37℃で48時間インキュベートした後の両方で決定した。生存細胞数を決定するために、20μLのMTT溶液(FBS中、5MAG/mL)を各ウェルに添加した。次いで、プレートを放置し、ホルマザン(MTTの青色の代謝生成物)を生存細胞に付着させるため3時間インキュベートした。インキュベーション後に、培地を取り出し、200μLのDMSO(ジメチルスルホキシド)を添加して細胞を解離させ、ホルマザンを再懸濁させたが、その濃度(分光光度プレートリーダー(UVM 340、Biochrom、ケンブリッジ)を用いて560nmで測定される)は、生存細胞の数に直接関連する。医薬品による治療に対する応答と該医薬品の用量又は濃度との間の関係として説明される概念であるIC50(50%の細胞生存能力の阻害)に対応する各生成物の濃度値を、NIH規定に従い、ロジスティック回帰を用いて算出した。
1 − 非消化非送達超臨界ローズマリー抽出物のin vitro抗増殖活性研究
非消化非送達SREのin vitro抗増殖活性を、ヒト結腸癌細胞モデルにおいて評価した。
ヒト結腸癌細胞株SW620を10%FBS、2mM グルタミン、並びに10000単位/mLのベースとなるペニシリン、10000μg/mLのベースとなるストレプトマイシン及び25000ng/mLのアムホテリシンBを含有する1%抗生物質−抗真菌剤溶液を添加したDMEM培地中で培養した。細胞培養物を標準温度(37℃)、湿度(95%)及び二酸化炭素(5%)条件下に維持した。
MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)法を用いて、消化生成物の抗増殖活性を測定した。その目的で、指数増殖期の細胞を24ウェルプレートに移したが、1ウェル当たり平均25000個の細胞を200μLの最終容量で組み入れた。37℃で2時間インキュベートした後、培養培地を、種々の濃度(0μg/mL〜100μg/mL)でSREを含有する培地で置き換えた。細胞生存能力を、出発細胞集団を制御するために処理時、及び細胞成長に対する生成物の影響を決定するためにプレートを37℃で48時間インキュベートした後の両方で決定した。生存細胞数を決定するために、20μLのMTT溶液(FBS中、5MAG/mL)を各ウェルに添加した。次いで、プレートを放置し、ホルマザン(MTTの青色の代謝生成物)を生存細胞に付着させるため3時間インキュベートした。インキュベーション後に、培地を取り出し、200μLのDMSO(ジメチルスルホキシド)を添加して細胞を解離させ、ホルマザンを再懸濁させたが、その濃度(分光光度プレートリーダー(UVM 340、Biochrom、ケンブリッジ)を用いて560nmで測定される)は、生存細胞の数に直接関連する。医薬品による治療に対する応答と該医薬品の用量又は濃度との間の関係として説明される概念であるIC50(50%の細胞生存能力の阻害)に対応する各生成物の濃度値を、NIH規定に従い、ロジスティック回帰を用いて算出した。
1. in vitroでの胃腸内消化(GTI)の評価
使用するin vitro消化GTIモデルは、2つの連続相である胃相(pH2.5、ペプシンの存在下で37℃、1時間)及び腸相(pH7.4、パンクレアチンの存在下で37℃、1時間)からなる。本発明では、胃相は、担体脂質の消化のためにはそれほど用いられず、送達される成分又は薬物の安定性に対する酸性pH及び胃内の水性媒体の影響の研究のために用いられる。腸相に関しては、加水分解の程度及び生成する脂質種のレベルの点で文献(Hofmann and Borgstrom, 1964)中に認められる生理学的結果を再現するために、この工程中に用いられる条件(酵素/基質比、レシチン/胆汁酸塩比、消化時間、消化液のpH及びミネラル組成)は、脂質の腸内消化中の生理的条件を模擬するものである。
生体可給性研究の前に、消化の最終生成物を4000rpm及び37℃で40分間遠心分離した。遠心分離後に、消化媒体は以下の3つの明らかに区別される相へと分離した:消化されなかった脂質サンプルの画分及びローズマリー抽出物の一部から構成される、油相(OP)と称される上相(in vivo条件では、この相は糞便と共に分泌されるか又は結腸微生物叢によって変換される);膵液消化中に放出される脂肪酸石鹸及び塩の残渣からなる、析出相(PP)と称される極めて僅かな不溶性下相;並びに膵リパーゼによって消化され、胆嚢により分泌された胆汁酸塩及びリン脂質により乳化された脂質画分が、(抽出物を含む配合物の場合に組み込まれたSREと共に)ミセル構造及びベシクルを形成して存在し得る、ミセル相(MP)と称される中間水相(これは生体可給性画分、すなわち腸内上皮細胞による吸収が可能な画分である)。
本発明の脂質系(RLO、RLO+MO及びGP)、SREが組み込まれた配合物(RLO+MO+SRE及びGP+SRE)及び(消化及び非消化)非送達SREの抗増殖活性を、ヒト結腸癌細胞培養物(SW620株)中でMTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)法を用いて評価した。その目的で、種々の濃度(0μL/mL〜11.5μL/mLのMP)でDMEM培養培地に希釈した、脂質系の生体可給性画分(MP)、SREを含む配合物及び非送達SREで細胞を処理した。非消化非送達SREの場合、細胞をDMSO(0μg/mL〜100μg/mL)中の種々の濃度の抽出物で処理した。細胞生存能力を、出発細胞集団を制御するために処理時、及び細胞成長に対する生成物の影響を決定するためにプレートを37℃で48時間インキュベートした後に決定した。生成物の抗増殖活性を推定するために用いたパラメーターは、医薬品による治療に対する応答と該医薬品の用量又は濃度との間の関係として説明されるIC50(50%の細胞生存能力の阻害)であった。結果の検証を可能にするために、3回の独立実験を少なくとも三連で行った(n=9)。
脂質系(RLO、RLO+MO及びGP)、SREが組み込まれた配合物(RLO+MO+9%SRE及びGP+9%SRE)及び(消化及び非消化)非送達SREの抗増殖活性をヒト膵癌細胞培養物(MiaPaca−2株)においてMTT法を用いて評価した。
7.1. 方法論
平均年齢27.9±10.1歳の57人の健常ボランティア(58.6%が女性)が参加し、そのうち30人が研究群に属し、27人が対照群に属する8週間の二重盲検並行ランダム化研究を行った。
RLO:20%アルキルグリセロールを含むサメ肝油(Gustav Heess):750mg(150mgのアルキルグリセロールをもたらす)
SRE:ローズマリー抗酸化抽出物、25%ジテルペンフェノール、型番号027.020(ロスマリヌス・オフィキナリスL.):45mg(11.25mgのジテルペンフェノールをもたらす)
MS:食品グレードのモノステアリン酸グリセロール
組成:91.2%RLO+5.2%SRE+3.6%MS
in vitroで刺激した単核細胞のサイトカインプロファイルを示す図5に示されるように、主成分分析ではIL4の減少、並びに方法論に詳細に記載される栄養補給剤と関連するIL10及びIFNgの適度な増加への傾向が示され、これは一方で先天性免疫応答活性化及び寛容の好適な応答を、M1/M2マクロファージの中期極性化及びエフェクター細胞(食作用活性を有する単球、細胞傷害活性を有するNK細胞)の成熟に有利なサイトカインプロファイルと共に示す。
先天性免疫応答の活性化及び寛容
食作用活性(単球)及び細胞傷害活性(NK細胞)を有するエフェクター細胞に対する免疫応答の中期極性化
抗炎症活性及び抗腫瘍活性を有するサイトカインプロファイルの生成
*限局性腫瘍を有する癌患者における転移の発生を予防する薬剤
*貪食能を有する成熟エフェクター細胞(単球、NK細胞)の産生、抗腫瘍活性を有するサイトカインの産生及び腫瘍抗原を標的とするTリンパ球の機能的成熟への先天性応答の活性化が必要とされる候補患者において免疫療法を増強する薬剤
*免疫障害を予防する薬剤
Claims (16)
- 超臨界ローズマリー抽出物(SRE)と、ラットフィッシュ肝油(RLO)、又はラットフィッシュ肝油(RLO)をベースとした酵素的若しくは化学的グリセロール分解プロセスの生成物を含む脂質系とを含む組成物。
- ラットフィッシュ肝油(RLO)とSREとを含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- モノグリセリド、好ましくは2%〜30%(w/w)のモノグリセリドを更に含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記モノグリセリドがモノオレイン(MO)及びモノステアリン(MS)からなるリストから選択される、請求項3に記載の組成物。
- 前記モノグリセリドがMSである、請求項4に記載の組成物。
- 以下のものを含む±30%の組成物からなる、請求項5に記載の組成物:
a. 91.2%(w/w)のRLO、
b. 5.2%(w/w)のSRE、及び、
c. 3.6%(w/w)のMS。 - 前記脂質系が、前記ラットフィッシュ肝油をベースとした酵素的又は化学的グリセロール分解プロセスの生成物であり、以下のものを含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物:
a. 25%〜35%(w/w)のモノグリセリド及び/又は遊離アルキルグリセロール、
b. 10%〜25%(w/w)のジアシルグリセロールエーテル(DAGE)、並びに、
c. 40%〜60%(w/w)のモノアシルグリセロールエーテル(MAGE)及び/又はジアシルグリセロール(DAG)(ここで、前記脂質系中に存在するMAGE及びDAGの総量に対するMAGEの割合は、少なくとも50%(w/w)である)。 - 前記脂質系が、前記ラットフィッシュ肝油をベースとした酵素的又は化学的グリセロール分解プロセスの生成物であり、以下のものを含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物:
a. 25%〜35%(w/w)のモノグリセリド及び/又は遊離アルキルグリセロール、
b. 10%〜25%(w/w)のジアシルグリセロールエーテル(DAGE)、
c. 0%〜5%(w/w)のトリグリセリド、
d. 0%〜3%のグリセリン、並びに、
e. 40%〜60%(w/w)のモノアシルグリセロールエーテル(MAGE)及び/又はジアシルグリセロール(DAG)(ここで、前記脂質系中に存在するMAGE及びDAGの総量に対するMAGEの割合は、少なくとも50%(w/w)である)。 - 前記脂質系が、前記ラットフィッシュ肝油をベースとした酵素的又は化学的グリセロール分解プロセスの生成物であり、以下のものを含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物:
a. 28%〜32%(w/w)のモノグリセリド及び/又は遊離アルキルグリセロール、
b. 18%〜22%(w/w)のジアシルグリセロールエーテル(DAGE)、
c. 0%〜2%(w/w)のトリグリセリド、
d. 1%〜3%のグリセリン、及び、
e. 40%〜50%(w/w)のモノアシルグリセロールエーテル(MAGE)及び/又はジアシルグリセロール(DAG)(ここで、前記脂質系中に存在するMAGE及びDAGの総量に対するMAGEの割合は、少なくとも50%(w/w)である)。 - 癌又は免疫障害を有する患者に対し、免疫療法増強剤又はアジュバントとして使用される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 関節リウマチ、I型糖尿病、乾癬、セリアック病及び多発性硬化症からなるリストから選択される自己免疫性免疫障害を有する患者の治療に使用される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 腫瘍成長、慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス感染、(B型及びC型)肝炎ウイルス感染又はヒト免疫不全ウイルス感染を有する患者の治療に使用される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 腎臓損傷の予防に使用される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 機能性食品、栄養補助食品、天然抽出物又は薬物、好ましくは抗癌剤の薬学的に許容可能な又は食品グレードのビヒクルの合成のための請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物を含む食品組成物。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物と、任意に薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
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