PT104158B - Aplicação da monooleína como novo lípido adjuvante em lipofecção - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO DIZ RESPEITO À APLICAÇÃO DE SISTEMAS LÍPIDICOS CATIÔNICOS À BASE DE MONOOLEINA, NA COMPLEXAÇÃO, TRANSPORTE E TRANSFECÇÃO DE MATERIAL GENÉTICO EM CÉLULAS ALVO. OS SISTEMAS LIPÍDÍCOS SÃO PREPARADOS ATRAVÉS DA CONJUGAÇÃO DO LÍPIDO NEUTRAL MONOOLEOÍL-RAC-GLÍCEROL (MONOOLEINA) COM OS TENSIOACTIVOS CATIÁNÍCOS DA FAMÍLIA DE DIOCTADECILDÍMETÍLAMÓNIO (DODAX) (BROMETO DE DIOCTADECILDIMETILAMÓNIO (DODAB), CLORETO DE DIOCTADECILDÍMETILAMÓNIO (DODAC) E FOSFATO DE DIOCTADECILDÍMETILAMÓNIO (DODAP)) . ESTE MÉTODO DE LÍPOFECÇÃO É APLICÁVEL TANTO NO DOMÍNIO DA INVESTIGAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR (APLICAÇÃO IN VITRO), COMO NA ÁREA DASAÚDE EM TERAPIA GÉNICA (APLICAÇÃO IN VIVO), APRESENTANDO ELEVADOS NÍVEIS DE BIOCOMPATIBÍLÍDADE E REDUZIDOS CUSTOS DE AQUISIÇÃO.

Description

RHmmmnmRi mlicaçío da ccm WN® lífxdo m&wmm m mmmcçm !! x transformação genotip.rea de uma célula .implica. uca codificação renoarpica iodurindo oma alteração heredidária eormaxiecte do Doa e do seu perfil, de empressaim date feo.6meno pode oer obtido artirloiairminte atravée da inserção de material gédico exógeno na eelala i, i ma a a a eoçe o;, à preaecte i i cnxooao dia respeito a uma cora roroolaçâo com reoemco a lipídea cariónicos (lipofecção) , através da cortj ug a ç a a o. a I X- O w d .·' neo t r a .1 mo no o 1 o o 11 - r a c - ulacerol ( monooieina} ct :m os i ens ioaet i vos cai ión 1 coe derivados de Bioctadeciidimetliamórbai ·ΊΧ>0Μ(} .,· como por execplo, Brometo de UioctadeciMimebiiamónio (DODÃB) ? Cloreto de Dioctacleciidlasetrieoórdo (BODMb e Fosfato de B.ioctadesrildlcotiieodnio (DODB.P), com aplicação no domínio da ievest tqaoao em Biologia, boiecoiar (aplicação In 'titrop, aesim como na área da eauae em Terapia Genica (aplicação iei da Invasão A ameul rcaçao feootiprca de uma célula, indasida por una alteracuo neresiearaa ρβηοοηοηίην oo DOA a oo asa poro ri. a Este .ienòmero da issergdo de ’.çao).. e revelada investigação como na a r e a da. dá eap.reasáof dá--ae o nome de trarmfonauupk pode ser obtido a.rtif icislmente através fatorial génico exógeno na célula (transias se de estrema importância tanto no; domínio eu Biologia Hoiecular -aplicação ia vi Oro) * ssnue seu lereprs eeou.ca papricsçao an νχνο>

Os vários métodos de transíecçâo actualmente conhecidos tom sido ímequentemonte agrupados eo dois

0 W p'OS λ mdtOOOS ί 'XO. 1' S Χ'Ο COiSOS W:U X t S V } S:mOtC-OOS nao---vbrais (complexaçao de DNA P o l: ne roa, c o - ρ r o c 1 pi u a ç d o d o eiect reporação, bouba rde-users:o oí oren jeoçdo de bHd) dfesiov e d Tábeia_____I apresenta principais vantagens e descanta por intermédio de ii.pio.oe ou DNA coe fosfato da cálcio, cie partículas carregarias, ου

t ai2002; ' rt resumo comparativo das Οίθΐΐΐΐ 3 SídOC.:. ò iOolB ui b:' S ub;: £i doi.S tipos de sis tersas de rena reage-n, .................................................................................

Tabela_____I - Compara pilo entre a >3 propriedades de sistemas de franstecçao virais a stéo-v traia ÍGregorisdie,-5:007)

Siateeras virais Zi&tmm a aio "Vàrs.i s

banidas & a dOPldi.Gdde XXT ν\Λ ne tra ' ''' a s .'0·. m . : ” fp< e<... lípides) , p-p beUsp dd relae ·. e.;..v4íp . „: cp . g p- 'G' ·. 5 e ¥··:'-.' *... :." '' .. ' ..Pé .;p.f* ..: pt ¥$$ . - ' . d > d UsO comolesaciso ' 0 " P 7 · ap ,::d p v l.b#ptppi-g· •dlrp^ipBPdP. p,\\d PP Papaoidaoe ae transporte de DMA cos: dl fero rd eo tamanhos e diferentes formas í-CCCí 00, linear)

de manufactura prooesao p--g Processo ce manutac· re 1 a i i vame s?: t e « i.mp 1 e s e barato rei em 1087 eae relgaer e seus

Dentro do grande gro.po doe métodos nao-virais, una especial reievaruala t.e.m .sido dada nas últimas' décadas ao método de iipclecçáa.. que envolve o uso de isposgomas cadi.onioos paaa a complereçao. e iiosrtaçao de DGã exógeno no anterior dm? células. OOrS.DOradO.reS OOSΟ.Γ.β VΟΠΟΙ POrU ptimorra VSS O USO 00 moleeoias lipidicas com grupos químicos positivos para eransfecçao cénica em culturas do cálidas (Felqner st 01.,1987), do contrário da· outras drogas rmensportadas em sistemas rípidicos, o· OPA plasmloico na o era encapsulado no interior do irgoosoma, r a t antes dosara fortemente con.densado pela aeção de pequenos vesicnlos; catiénicos que cobriam total ou paroialoente o plasmídeo, dando origem a d et ruturas reais tarde designadas o a iipopleaos, cuja í:orm,aç:âo era forteamnie dependente da atracçao eleeírostátrca entre o esqueleto de fosfates negativos do DK.A e as cabeças positivas, dos surlactantes oafcioni.cos ÍLabamblolear et ai, , 1996; fdeager, 1999), D desenmdv.imenf o do novos lipidos para aplicação oro Terapia Gémea, ds-se essenc.ni imante através do teste emprrrco de composios nunca antes utilirados para esse fio, cada um doa quais sendo analisado para uma aplicação particular, Depors da descoberta inicial de Felgner e seus colaboradores, ues primeira vaga da investigação resultou na descoberta de numerosas moléculas, contorne referido em emersos documentos publicados: US5279933 (Rose, 1994), usn9solos p:r, oeuonq, rb.e. Vsn.derOvif .1999? < novos desenvolvimentos, com..muen a ser' propostos na síntese de novos lipidos catidnroos para trausíeeção, como referido noa ·.;·· comentos 335651981 -Asley et al, 1997), WQ200S-023289 do MacDonuid, L, beco, 1095), onde a descrita a aplicação da misturas de lipidos catidnroos sintéticos i,1-dlo.mor; -sn-gli.eero™3"-®i:.il.£osíoesolin.a (EiDQPC) f 1,2~ãxXaaroiX~sn- giicerom-Mnifosiocolina iBBbSRb , o )., 2 •dimrrrsto.r i · sc η 1.1 coro - 3 ~et 1.1 toa foeoli na (mmc) em sistemas de transfdiicçao sem indicaçán da lipidcs odjuvantao, dum outro documenta US7067697, blraag Gao, 2006} ,· «ao apresentados variou lipidos cutidnicos combinado,a coo agentes bíocotiaoa funcionais para aplicações farmacêuticas e onde SORE {du. o 1 e o i X ™ fu o f a t .1 d a 1 - et o - a ο 1 a;:; i r; a} s c o 1 e s t e ro 1 s ao .identificados como ui aidos adjuvantes.

Tem aiao demoreorado que a, adição de Lípides neutras adjuvantes .1 formulação doa lipoplcxoa aromevem um aumento na taxa da I ibsrtaçâo da Dtbi a na eficrescia da transiecçao, quer ceia promoção ao processo ae tussa doa lipoplenos do motores dimensões com a membrana celular, quer pela i.ntenai. f .1 caça o do processo de endocftose acra Irpoplexos de dimensões redeeicas (M,R, Almofli. et t.1, , fOOsd ,

Ho entanto, dependendo da tipo e prapnieo.ad.es dia linho cefuiar utilicoda, o ruo ara sistema de 11 ao tenção pode apresentar eficiências de trsnotecçãa muito diferentes, o que tem justificado a constante necessidade da procura de nevou: formulações adaptados a cada tipo de célula.

De várias documentas prcni.lcs.das até ò data, os lipidos adjuvantes mais frequenteoeare citados sâe o DOeE, o colesterol e scun derivados fõSâ883S2X ~ R, Resaka, 1999? a dSivOi.tli - d, ES:yttefte.mpieton e Cfh., ksviakis, 2006; >

Estes adjuvasses, apesar de, num modo geral promoverem o p.roce^so de tran ,s f eoçao, mostraram set apenas um dos vá rios faoteres que condi cfoaa.m a et rc.,. encia de transfecçãa, uma v cr que o próprio tipo de célula o transfcotar o ode ser def erminante no eficiência do procedo. Além disso, parâmetros cone o tamanho e o Pipo de estrutura doe complexos parecem ser igrssimente importantes no desenvolvimento de um sistema de tratsleooáo, uma vea que o ca toa por condicionar o grau de biofuncionalidade., bio-compotibilidade e toxicaáato doo sistemas. Todos estes fautores ajudam a explicar & rara o- pela qual soa eficiência o; levada do compiexacáo de DBA. nac está necessariamente associada a ore::, alta taxa do transfeoção.

Kecentementef o tensieaotivo sintético Brometo de Dioetadociidisditila-aónio {BOB&B; ·:Pig . 1; foi utllisado pelos próprios autores da presente invenção em conjugação com om lipidc natural de baixo valor comercial çbsnooleins)paro desenvolver: sistemas veelcaiar.es que demonstraram, ser capares de complexat oficientemente D.NA comerciai -Silva et ai,, 2006} , No entanto., à semelhança do que já foi ver i ideado em muitos ostros sí s t emas ve s roo rares (Cd. deposito et al,,· 2006;} e do já referia- a anter ionven te. altas eilc. Lênoias de eompie mação de DNã não cu tão necessariamente associadas a taxas elevadas de transfecção, n boncoieina, i -mo o colo cu 1 - ::ao-ct. i ceroi (MO) -- |jb|^2, õ um lípide neutral and; isi.ii.de de origem, natural que apresenta a particularidade de possuir duas fases cábloas bioontinuas inverticas, mesmo em. excesso de H20 (t 90% e/si , como se pode verificar ao seu diagrama do fase, representado aa Figo 3 |Lipousxy et aif. 1995;, A existência de diversas fases naO"iamolares., acrescida do seu baixo valor comercial, indicam que o composto Itsnocd.eina se apresente corso em. potencial candidato a iioido adjuvante. A estrutura doa complexos iipidos/DdA ciepende fortemente da proporção 1.1 pi do ca! iòpicoí DHlp assam como da proporção 1 r o i d o o a 11 d o r c o; 11 p 1 d o no ut rui (May et a 1 > , £004;, Além disso,· a própria fortiaçao doa lipoplexos é dependente do método do preparação doa iipossomas, assim coroo do p·: ocedimeflo ut 11 irado para completar o DMA com oa eesicnl.es catió ricos (Simões et a2d06} É também reconhecido que a ordem do adi ,çao Coe lipides e DM tem um. efeito critico nas propriedC' .;es físicas e na te ti vidade biológica Cora lipoplexos resultantes (itcanchant ei. al.f 2004} . boato forma, do conheod.mento da eficiência da menooieióa na coo pior a o oco do odA ; Silva c tal,, 2008; na o rosnrta oPcxc c oca aorrcsçao em. transtecçao.

Acè ao momento, nao foi descrita a ntiiisacao de seroe ia loa copo lipido adiu cante em sistemas de lipoiecção,· loto apesar do aen racarai.do valor comercial e da oca baixa citotoxicidade, como é proposto açora nesta nova i.nvençao, A mooítoleina apenas perore referida como fasendo parte do formulações que utiiisam o encapsulamento do DMA em irposscmas,, e não por lipofecçào eia compiexaçao (dOiíPAi/Ot? IdO ( 2002;], A ap(i.ica.çâc da mote ptlaina como adjuvante trar ainda a vantagem adicionai de poder oer aplicada em diferentes tipee de células. O documento 0360?4267 (Oaavo Fotos unem et ai; 1098; menciona métodos de transfecçao utili.rendo come sectores não~virsis lipi.dos oatidrd.oos derivados de esf ingosinae, otilimando cm primeiro I.ipido adjuvante D02E e como segundo i i.pi.Ct; adjuvante selecionado doo Ciacyi glycerois em células ΕΚ-;...

Centrarlamente a mancoreina que pertence à classe dos mononc.riçliceroiim o ,d.> Oot õ·:· C; beer6.es: têm sues caudas is 1 d r o f ób 1 eoc.. s o cri o 0 1 u. dl Sté semelhantes aoe 11 oi cios; adjuvantes habitua is ÍDOPE),

Bruue das figuras

Figbl - bepresecsc apeio química cia mclécnlm Brometo cia Dáoctadecxidimotilscson 1 o (DODL.B} .

Fig,.2 - Representação química da molécula 1- moaooleoil -rac-qli.cerol (tdsnooleina) ,

Fif .3 - Diagrama de tace da molécula .i -cccrscclcoi i ·· rnc~ giioerol {Monoolerna), contendo di.ferent.es estruturas do organ .tração; estrutura .Lamelar {Lm LOestruture Bão-Lamelar Heuagonal Invertida ()½) c estrutura Bae-Lameiar Cubica Incortica iQ-B „ fig,4 - Comparaçáo da c.itotoxi cidade H8h) cie diferentes lipoplerca caf .tónicos em células embrionários da r m. nuxíieae masu csroarnoa como rançao oa v x ato. r reta ae celular determinada cor oco cl cu da. .actividade cia encima lactato deaidroganase {abaorvãacia a rsQ rmb ,

Fig,S - Cccrpaoceçao da eticiéncia de transreceae {48 horas) de diferentes lipeplexos oationioos em células: em.br i.onar ias d··; rim is ama rc 29BT, cxelcaiada com::.· função da dam.0 repórter â-Qg iectcoxda.se absorvância a icOcm) >

Scral da. luwncéo

: í. pS CSC.U vO :C CvOClO-CO ·:.Χ:’ :..’.VC O :.: 0 .·' :O a X L CCaS lipidxcos oatiónicos compostos por aurfaotantes catidnxeos derivados de dioctadecildievetila:n6n.io {W&M,} e pelo teo.s i oact.i vo neutra 1. Ixmonool.sci m-occcgl ieeroi. (MG;:xm>leio.a, MO ... na compisxação e transporte do DNã, e como veiculo de transiormaçéo genética em céloias, A .Monooleina, 1~ •neoeoieoxi-cmos^gxiseroi (MO} f è um. iiprdo neutral anfxf i.ii.co de origem nato ral que apresenta partioularidade da possuir duma fases· cúbicas bicontin invertidas, mesmo STS :::.0 :.00:.: O 0 000 H20 {o 90% o/w)v como pode verificar so seu diag rama de tace, representado Fíq.. 3 (Liponskv et ai,, lis95} , A. existência da diversas ia ses nao·' iameiares, acrescida do SCO baixo valor comerciai, indicam que o composto · d. COO iOXO a sc apresenta como um potencial candidato a. iipido adjuvante om sistemas de iipofeccao, Λ complexagao do DH.A, determinada pela atuvaeçao eleetrestatioa entro os grupos amónia carregados pesitimamente do surlactarrse sintético DODM. e o esqueleto do fosfates nega ticoe do Dbe piasmidico, provoca a o que coonxe escoes da estrutura, dando origem a complexos QPs/L.ip.ido voigarmoste conhecidos por iipoplexos, *o*··*:o-.t.c caso contêm também o linxdo neutro Monooleina> A inclusão de bonooreina na constituição d;;; Iipopleso confere a. esiss propriedades eompie mamente distintas, devido ao facto dos mvvnoac:U.q.liceróis; apresentarem um padrão de curvatura distinto do surra.ciante cattónico utilirado. P diminuição da r. igi.de r estruturai dos vesicnios de DO.DPX provocada para adreao ce donooreraa; aumenta :P ϊ·ΐΟ.\.·\ϊ. 1 .'idade lateral da cadete iipidica, o que acaba por promover a Pnteracçao meobrana--d.ipopi.eso, favorecendo as;sim o processo de tramafecçlbm descrição Jjetalbada da. Invenção bondo aplicáreis ratões molares monooleina;iipido cstiónico entre 0>1 e 0-3, um medeio de realiração da invenção consiste na aplicação da formulação com. ratão molar iipido cat. tónico íDODAB);iipido adjuvante {tíonoolei ns} 2 : 1.em razoes de oarga distintas (2;r e 4 ; i im de entre as possíveis { Oo 1; l a 4; 1. )correspondendo a diferentes concentrações de grupos amónio positivos {DO.OAB; para a mesma concentração de grupos fosfato negativos {.Dbág , A eiicieneia relativa dos sistemas (quer ao nivel da sua taxa de fransfecçáo e do seu grau de oitotoricidade; foi aferida por comparaçao áirecua coai. um sistema comerciai de iipofecçào {Lipof eetamina®;, nas condições indicadas pelo fabricante pínvitrogen). A eficiência de transiecçao roi determinada através da meorçto da actividade da enrama repórter !3-galacfoaidase 0 nitel αν citei :nsicidaáe (Absorvârcia a 420nm} sFig, 4: , foi determinado .através da cediça.o da actividade da ensina Lactato Daaidrogenasa (Absorvânoia a 34 0.oau (fig. S) ,

do. exemplo apoeeentado, a aciiiração . de diferentes rardes de casca (e/··) (2:1 e 4:1} para o cisterna DODABobD (IcoU; preadee-ae coo a nacossadodo de determinar a concentração má n.ima de iiplcio que permitisse obtes orna taxa máxima de trsn.sieoção, sem gao isso representasse um acréscimo de toxicidade para as próprias células.

Pa tlarmulação iíp.íd i ca. t estada, m.a.ito emnors sosee esperado quo a r :5j gdg.0 caras {t/-d 4:1. apresentasse ama Λ.Ο Λ.;;οΐ,ίν 1.:;; p ç.i-.0. i-À í. trilyplv OÚC.I Λ eletada guo a ratão de. cerca í s / -} s.:5 ciev1. do a m. aior concentracao p Πί^ϊ::' :d 1 roo secção)0 ΓΐϊΟ^’νΙΟ aao V'"ÍO a terrficar 0 x ρ e rmo n t a ma as ai- (5: dq * 4: , bevldo ao acréscimo oe 0;. 10101. d a 0 e te r i ficado à s 42 r :orae (52 para 72 nas r&tdoa de oarga (a-/~> 2; Ί e 4:1, .nmn:>oct ornamentei (Fico t; , De referir que o sistema comerciai (Licoreotamins> apresenta um e i te3 do citotoxicibabe 272} , saperior ao do :tieterna DODAfuHO (2:1),. para a rssao de oarga (0/-0 2:1. em todo o osso. a demonstração do gue a rosou 100a0 DODAB:Honooieina (2:1} em raacea de oarga (x/-) dlat.lut.aSj apresentam eficiências de tteru>fccçao comparáveis (r>c.. (s/-) 2:1; e mesmo eu per.rores (ror, (:-/-} 4:1} ao .sistema comercial, mostrara que o modelo da intenção e efactivo em 0ntraçdos cari á 101s c is ii.pi.do e DMA, n at. s. ve r sa t s. 1 sda de pode vir a rocelar-se ir til na cação do aiotema de 1ipofeoçâo .noutro tipo de 1inhas oe lai ases em quo a sacão de oarga 50./-} 2:1 seja menos eficiente que as restantes, rransfecção sejam. rxngserl.de 1.) n ty C ''ΐ·' C· li í .· era qae entrar; cone x.çoes ae para aumentar a eficiência do doa liposeossae catídoioos mistos rara a pxepa.raçao oas so.i.uçoes xrpossomx;.xs ο,χx:.....rss.. colamos definidos da a soluçdee stock de OODAB o Honcoleina em exanoi í£0 mM3 iorcc injectadas aoa forre agifação a roei so.fuçao--2smpao aquosa a 70 mg (30 mk: Irixo-Hpl; . uma concentração final de lipido mlOIuiB a Monoo.le.lnx3} do 1 mH foi obtida para a raráo mclau: lipido catidaico (.DODAB) ;lipido adjacente (.Monooleina) 2x3... tospsx&ç&o dos lipopls^os catiénioo»

Os lipoplesos ca ti cai coe fora o preparados através da adxçao de colonos definidos de ecxcçces .:. ipessomai s mistas (concniXtraçdee car i aveia de grupos ardo .1 a positivos·) a um colune constante de solução de DBA (concentração fira de grupos. fosfato negativos nxbsero de poços r Ipg .DMA/poço) .. Di.feran.tes vo.la.osc; de Bei o Opti-onem. l foram otilieados parti pariater ias volume total constante de solução nas varias formulações e ratões da carda (e/"p testadas {iOQaldpoço). Os 1 i coo xo scn raauitxpjes foram incubados à temperatura ambiente durante 30 m.ln ser: agitação, isolemento 0 material genético- tctrodunido na célula foi o pLrsmidso pft-p-gal binvitrcgen) , que foi amplificado pela estirpe competente nsojmricP.ia ao.l.i DHBi .

purificaçâo do Dbé foi í:eoco neblinando o Kit de ertracçáo " Ors rri;V O;MidiprepS DPn r-.:r'ifl.cãt ion ovale:??* comercial!rado peia empresa Promeqa, d concentração final d.O dKé i λ v 05UQV Uní IO.S ÍSOSttOa pO.iO 00000 VSncra 0 SvU O.m dusO ao pect.ro f of óme t r o d d imadau Uv - 31G1 ·· to,

Ctslfcura da célalas

Paro ensaios de transíscça.o o de análise de ctlf otoxicidade* células da linha celular 293! foram oultiaadae e:r frascos !75cer com meio DPEb supieoenI:udo com L-gltruamina ·1 mM) , bicarbonato do sódio (1,5 g./ip . glucose (1,5 g/Xbf noto fetal do bovino (10% v/y} e antibiótico (1 tctr/ml? , As células rorao regoiarmente subcditivadas entre ao par ragora: 1B o 24, sondo sempre mantidas a conf luências inferiores a 00%: (3?hr e 5%; b()2; , hipofmcçâo

Ocre horas antoe da. t ra; ,s.f ecc ao, cada frasco T71 cm3 foi .1 arado ano ver; coo soluça o PBS uX; e aa céinlao f orara déaaderídas através da adiçso ·οo solução de tripsina 0.05%: (3 md.n incubação a 17 bf e 5% 032;. 0 a oco a: o de células ciáveis foi quantificado num. henocitòmevro peio método dd exordsáo do atui de tripano, áo células foram

resta: acendidas em vol ate apropriado do meio DMEM suplementado pera oOter a densidade de rbUO células/poço, transferidas para pisoas de 2 4 ~Ο ηΙ t i poços num voluma final 4 / '/ Ο r;; V Li..:, / POÇO ; νΟχ". Ci; CLL D v‘" v ;i i? COTLt L, U trílCX·;; Πθ vLLci dói traotsfecçao; ,

No dia da transi ecçâo, o maio do cultora ioi substituído por seio DMEM fresco,· e os iipopl.exos recém-preparados (ver secção 'diroparaçac· cos i ipcpi exos (1¾ si cri ccs") foram adicionados homogeneamente a cada poço. num volume que nao excedeu 20¾ do volume final (1 og Ddi/poço) . As células forem erre o novamente incubadas a 37*C e 5% COsí duraste 2ih"'48h, A eficiência de tuansfecçao foi determinada através do uivei de esprsssao do gane reportar (f-galactomidasa} A citotoxicidade foi cedida através da quantificação intra e setracelular da encima Lactato Desidroqenase íLDH; nas amestras analisadas.

Análise da eficiência de izansfcoçno Çensnio da actiridada da encima ^''gal.actcáidaae! vara determinar a eficiência de transfecçãn, aa células xeoésem acabadas (24h~i8h} foram lavadas duas roses com PBS (IX) e risadas durante· 1.6 min com aolnçacvtampâo de lise {RI,B IX) .· A a células foram aniso recolhidas a centraíugados durante 2 min a IsOOÍhtpm pare remover os restos celulares, A. actividadc da ourima (P-galactoeraase nas diversas smostras ;am. unidades arbitrárias da t i.uorosoénora,· aro. ; fof determinada a :om e k r t do expreaslo n ~ g a 1 a o t o s i d a s o Eu xyme ássay oostem ei. th Espertem Lysi s Bafxer" da- acordo com instruções do fabem tanta α μΐ do extracto celular a r a ai de colação : ALE IX o 50 ui da ..·· ; ! solução Asoay 2X ··:· 150 ul de solução de carbonato de sódio para parar a reacçao color imétrica: .· com leitura a absorvãncxa 400 no em placa 05--bnlal.poços num leitor de mioxopiacas speotrabaa IsOPC, toális® do aiv«l de oitoto^ioidedo (usemo de actividade da. «aa-ima Lactato Leaidrogaoaaa)

Oara dotexmiaur c nivel de çitotoxicidade nos sistemas analisados, ror ao aoanrif içados os nivele letra- e exaraceiaiares da encima ror. ta to uesidrogenase, A recolha rk> meio ;ie cal boxe em cada poço permitiu a posterior quantificaçao da LDH extracelniar, Para obter o valor da LDP intracelular,, proceden-ce t lavagem dos poços coo SCO μΐ de soluçao-tampao Tris--010:1 [Í5mM}.· seguida de xaspaaem mecânica e li.ee da amostra celular por 3 períodos de son Dragão de 30seu, Ambas as amostras obtidas (iat.r«™ e extraceluiar) foram centrifugadas durante imin a i3000rpm. para remover os restos celulares. .A actividade intracelular eia eaoima LDH foi determinada [10 ul de amostra intracelular f zrO ui. de solução ΗΑΌΡ (0,31 mM; e 10 p.i de solução de piruvato (5.00 mM) para parar a receção color imetr roa) em placa st-dultipoçoa num leitor de mioropl.acas Spect razias 34 0PC (absorvão.oia a 34 0 nm) . A actividade ertraceiolax da ensina LDH foi também medida [40 ul de amostra intraeelalar --:- 200 μ.:, de solução NADH :0,31 mH; 3 10 ui de solução de piruvato ;8,vtmM} para parar a reacçao colorimétrica] om placa 06---Puitioocos raio ;aPooredncla a 34 0 .leitor de nd.croplacaa SpactraMax 340RC nro , D balanço entre a actitidsde intra- e aetracalalar da encima LDH, perrdte a deterabacapao da taxa de aobrevivencia célular, ERA, Naslov,· λ'λ > . Py ícheca , R.G, Eoroaova., í.· 3*'. * Serebrersti.kovta, í 2 0 0 2 5 , ^Catiorci.· o Atgdiíphi.leo nf Both Fipid and Pen-'lipid Uri;: iberapu'-',· (2000) , Ru snian

Chemical Balletirp v. 4 9f n, 3, pp., 385-401 l . Pregoa tacisícOO-Pí 'd,apoeone Ibonnoioçy - li Entrapeent o.i Draga aed ôtner Materials lato Liposomes",· 3;',; Báitiont Editions I. Hea1thcare, Eew York (U3A)pp, t' '/ d" P,L, Felgnerç T,R. Gadek, M. Holsrp Fu Roauup FLW, Chanf KL de'i, dtr, Horthrop, R,K, Ringoid,. ML Daniel sor; f ÍI987), ^Liporeotionu a h.ighXy e.i;f.lcientf lipid-mediated DK.R"- transfect.ion procedera, Frocs.edin.gs of ths National ecaOany oh Sciences USA, n. 84., ρρ, 7413-7417 F, Faixa t-Moiner, R. K. Rtaífao, C, B.-L.scoe, H, Feuron, O. Feageas, 8. Eursesítreiger,· p, OPerling, E, Riar.bii ia, 33 3, Sare:, (1396) , ':.An electron asieroaeopy study into the trechanrers of gene transfer tdtn iipopoiyaKP.n.es05 Gene Tnerapy, n, II, pp, 1010-1017 IP Meager, (1900),. "Pene Tnerapy Techno.logiee, applicationa and Regniations'5 5" Edilion, Obíitions .,. P. S, Li.mltecí, Nea York {USA)·, pn.. 0 39 2 J. Hui, et e 1. , {1999}, ''The Bole Of fielper .Lípide In

Cationro LipoeoKie-Mepiated Gene Transfer'·, Blophysioal Journal, n, 71, pp, 590-599 BJ,. Feiqner, Y, 1 , Toai, L, Sekhn, C,01 Hheeier, 5-Mantlrorpe, 01 Marshall, S.B, Cheng, (1993), ''Ls-proved catlonio iipih fortiulatione for lo vivo gene Pherapy'"·, hrn,N, Y. hcad. Sei>, n, 7 72, pp, 12 6-159 15 Farhood, R, Bottega, B..M. Epand, L, Haang, (1992), "Bffect of catior.dc olhedesreroi derivativas on gene transfer and protelo .tinase C socar;55 Biochire Siophys, nota, n. r, ρρ„ rej-iat (50, Babel, D, Gordon, P. ·'<. Bishop, B,0, Nickoioif, G,Y, Yar;g, a, Aroga, 3),0, Caneron, E55 Nabal, Λ5: . Chang, (1 990), ^larrnne responsos in human iseianosví. altar transfer of an allogeneic c.lass 1 major hhstooompatihility coesplea gane aitb DMLddposome sosmpiexesrh Proa. Natl. hcad, Bei. 051., n, 10, pp, 19309-19393 iLia, D, Liggitt, d. Bhong, C. Tif K, Gaenalerg R, Debag 0.995). ''Cationi.c l.ipoeo.ae K“-ui.1.&regi.nt.ra^ano.i:!.s gene dáiiveryO J. BioI< Chetg n. 92,- pa, £4864-24870

Rvl, Gehato, K. Eenabata, X. Takakura, M, Bastida, {199 grnvivo diapaeition ahgggcieristiae oi pianm.id complexed aitt caai.onic ).iposoreae''p J. Druq largetiaq, £, pp, 149"-19 7 f

MA Γ; , R. Oudrhirií 06 P. vlgnaron, E6 Peucharnltr, T. Leclerca J,G, Beto, P. Beh.0., {).997), -'Gona transfcr:' by qn-adainiao··· sbcCesteroi catroaic ixpide xnto aXrvay epXtbrrliai cells in vibre and ia.....aapn".. Eroc, Ratl. Acad, Bei. USA, r;., (g pp, ).661 -1.65 6 P.C.a. BarreXsXro, (21)01v'£qaXXibaiuni and dinetic Bfcadiaa ca the Biraiing at DBA to Cationio l.lposarr.es^, Ph.B, tb.es.is,-Physãcal Chsodatry DepartjnerrL, Ca a ter for Chemistry and Cr. arai cai Pag ir cor 1 ncc Lun.d Urd.varsity,. Bnodon

J,E, deves Silva, Γ:).G. Catrixnnrg M6E.C.D. Rsai Oliveira, (2008),' AXharacderxsaeion of Roaocd.eirg-Based llipoplesas a a.mg ax uoxrj.saenca epecaraoscopy , -.njoxnai οχ ε iUorsscsÃice, .PP' 1-B B, Liaonsky, B, Smmmaíg- ().996), dlttactnre -ma dy a araras ai 6berbrarand:, 2aa Sd.it.iarg Elseviar Edxtiona, Pev York, S, May, A. Bon-3hauI, (200-1},.· ''bodeiing oe oationic Ilpid-;3E'A coiopleaen^, Core. F;ed< Ene o, , n, 11, ρρ. 101--107 5, SirAvea, A, FvLlfpo, 6. Fanaca, IA Mano, FC Penacho, 5. Ddayunes, M.2, Lima, (2005;, ,v'Ca:tic>r;lc llpasomas for gene de 1 teary", Hl:na-rt Cpi.n, brun D:;: 1le, n , 2, pp, 1-19 I > Eranohant, et 31«. of Fi.aeaa.o Da 7.(.verv Pene Medicine, a.. 6, 2b F. Aincit( et Pene Pelivery: Internai;; latien", n> 410, pp, 246-2 (2001; , ^Pnyaicocbemical CpH 1 cn i :;:e :..;. o o by Catlonic Lápide", 1 na Jouraai of no. 524-225 al,.. 2.1 op .arch (2003;, ''Citioníc PHnoaona Fediated hvateai atndy and Machiai em of. ires oi Bloohe.:riatay ind Biophysica, C. E a po i i. t o e t a 1,, (2 0 0 6} ntructare, eira and tóFioity Lipoplaaea Cone ribatas to 1 r a n a f a c t i on E f i: i c i e n e y ", Blointerfaces, n> 53, pp. 127 :'Tha Analvaia oi; aerura on o.t DPAS-002E and DC-2201-470PE Baplain Ir.oi.r Dlivfnfabt Cola ai ea ta d Sarfacea B: [A] J.K. Roso, (1394;, "Lipononai Idansfaotian of baoleio Aca.da .(..ato Ananal CifflCL 5(25270533, p«a-a3 V'a.nderby.1, (2005), 'Methoas ler Moléculas lato Celis and Assassment ;B( G, a a A..:np AL,

Bei rtau; mg Puo i. e i o no a;; (C) R, Ma o Do ta?. Id, L, Waag, (2009;,. 'dDranefaati.on Reagent;P2 GO2005033289,. 59 1.9. Organi.eation, p , 1-42, (Dj Xiaay Ga o, (2006) "Caríouíc ldposo.mes for Gane Iraaoter" 09706769 2 ρ.Ι~29> (Ej Raley et al 21397; 'Glationic Fhosphol ipids for traaaféctiorr'' U55651981, p< 1.-13.

[E] Η,. Sríivth-Ieaplatan,· 222, Paviakió, (2006), "Lipoao;ae

Cevolavae for lecreased dystesaic Delivery'2 U27001614. p, 1-2 3.. .Cor ÍE) R, Rasada, (1393} f ''Choleatarol Derivativa .:.2. pOeO.UÍO.:. '0': : Ο .2;. A.0.2 .'. 2 .C , 2.2 V C' '> CÍ 0 /. .:. , O· , .:. 4 , ΓHi Klananari at al (1338), 'aáposoaal Transfectron, EethocEf 036079 667,. ρ, 1 -10 , 8 di® F®v®r«iF® da 2011

Claims (2)

1. , Om método para o transporte e X.ibe reação de ácidos ao cie icos rd oéi odes ex vbvcu para iaduçâo oo o.iiera:d.amento de o o· nos, caraocerirado por: a. ôbteaçáo de uma mistura contendo roo.eocd.ei.aa r o.aa fracçao molar coroproeralida entre 0,1 s i; , N0 'p? 'di? mâtPlòlO conjuga da com um ou ma i s moléculas do grupo· de ripiuos; brometo de cLloot adeci idime t i i embaio (DODAB), cloreto de diocttdooi idime t i lambnio í DO D AC}, fos f i na • X ,-c· \A s, dioct a deci idime 0.1 iamòrdc· (DO DAI; coles te m ai : Descoresterei; Compisxaca o do acido nucléico através oa adução da mista ora anu erior à temperarara ambiente, por um . oeri.odí o de incabacao de 30 minutos, em meio de cultura preferenciaimente coo baixo teor de eo.ro, o pK 7,1 e forte og.ítaçáo meoân i.ca; c, Adição da miatura la celulae-alvo, numa proporção 1/3 · e/td , com um por iodo de .r.tiOuCaçao error e ca a -suo., a o ;... e rt :·,,·,.η·, IPdétodOí ao acordo com a 'reivindicação 1 , caraccor 1 todo por a condeneaçao do ácido nucléico ser efectuada pela nuiçáo do agente de iipoteoçâo a razoes de carpa lipidc oationioo/fosfato entre 1,0 e 4,0,
2. 3-Método, de acordo com as reivindicações 1 a .2, caracterizado por os ácidos nuoiOieos serem DOA ou ROA, 4 , iétodo, de a cerdo coe a a r-oLvindioeçôea loiraeteriaade cor os; células·"solao se.teta de 1 n a.t ur.es a eocaríòt loa, tais; co;no células vegetais e cé.laias anisoais,. incluindo cdlolae de cultoras pricériae e li.aha.Si celulares coat.1;aues 5. dpi 1 cação de cétcdo, ccnfoinae descrito nas reivindicações 1 a 4, caract.er.1 nado por ee destinar a aplicações; :os; áreas da genética a da biotecnologia saolecnisr, Braga., 0 da Fasnsraiao da 2011