JP2012153699A - マクロライドおよびその製造方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】神経保護および神経再生組成物ならびに類似体を含有する医薬組成物の提供。
【解決手段】放線菌株ＬＬ−Ｃ３１０３７およびＢＤ２４０の発酵を使用した、式（Ｉ）の新規化合物およびそれを含有する医薬組成物。

【選択図】なし

Description

１つの態様において、本発明は、神経保護および神経再生組成物、ならびにその誘導体および類似体に関する。本発明は、特に、神経保護および神経再生組成物の製造用の放線菌株、神経保護および神経再生組成物ならびに類似体を含有する医薬組成物、神経保護および神経再生組成物の製造法ならびにその使用法に関する。
イムノフィリンは、種々の細胞型、例えば、細菌、酵母および種々の型の哺乳動物細胞の、免疫系および神経系に見出される。イムノフィリンの種類は、シクロフィリンおよびＦＫ５０６−結合タンパク質（例えばＦＫＢＰ）を包含する。シクロスポリンＡは、シクロフィリンに結合するマクロライドイムノフィリンリガンドである。他のマクロライドイムノフィリンリガンド、例えば、メリダマイシン、ＦＫ５０６およびラパマイシンは、ＦＫＢＰに結合することが分かっている。
イムノフィリンの細胞内機能を説明する１つの方法は、それらの酵素活性の同定による。例えばＦＫＢＰの機能は、それらのロタマーゼ（即ち、ペチジ−プロリル
シス−トランスイソメラーゼ）（petidy-prolyl cis-trans isomerase）活性によって説明できる。
ＦＫ５０６およびラパマイシンは、免疫抑制性イムノフィリンリガンドである。一方、メリダマイシンは、非免疫抑制性である。Salituro, et al., Tetrahedron Letters, Vol. 36, No. 7,
997-1000(1995)．実際に、メリダマイシンは、ＦＫ５０６およびラパマイシンの両方のアンタゴニストである（ＷＯ
９４／１８２０７）。
他の非免疫抑制性イムノフィリンは、スタイナーら（米国特許第６，５００，８４３号）によって開示され、彼らは、ＦＫＢＰ型イムノフィリンに親和性を有する神経栄養性ピペコリン酸誘導化合物を、イムノフィリンタンパク質に関連した酵素活性の阻害物質、特に神経成長または再生を刺激または促進するペプチジル−プロリルイソメラーゼまたはロタマーゼ酵素活性の阻害物質として使用することを記載している。
メリダマイシンは、以下のような使用について同定されている：マクロフィリン結合免疫抑制剤、例えばＦＫ５０６またはラパマイシン、の過剰服用の解毒剤；ステロイド増強剤；および／または生体産生ＭＩＰ（マクロファージ感染性増強剤）またはＭｉｐ様因子によって生じる感染または感染症用の抗感染剤（ＷＯ
９４／１８２０７）。さらに、メリダマイシンは、炎症性／過剰増殖性皮膚疾患の治療にも有用であると考えられる（ＷＯ
９４／１８２０７）。
神経栄養性、例えば、神経保護性および／または神経再生性の化合物を見出すことが望ましい。当分野において、化合物、およびそのような化合物を含む治療薬を提供することが必要とされている。
米国特許第６，５００，８４３号 ＷＯ ９４／１８２０７
１つの態様において、本発明は式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容可能な塩に関する：


本発明は、さらに１またはそれ以上の製薬上許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含む、薬剤を包含する、組成物の製造に有用である。
他の態様において、本発明は、マクロライドおよび産生される他の化学物質を産生することが可能な条件下で培養することができる、新規放線菌株ＬＬ−Ｃ３１０３７およびＢＤ２４０を提供する。例えば、放線菌株ＬＬ−Ｃ３１０３７およびＢＤ２４０の発酵を使用して、式（Ｉ）の新規化合物、ならびにメリダマイシン（式（II））を生成することができる：

さらに他の態様において、本発明は、本発明の新規放線菌株ＬＬ−Ｃ３１０３７およびＢＤ２４０の培養物から、式（Ｉ）および式（II）の精製化合物を分離する方法を提供する。本発明は、さらに、本発明の新規菌株によって産生された化合物を含有する医薬組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、特に神経系疾患の治療のために、本発明の化合物または組成物を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の治療方法を提供する。
本発明のさらに他の態様および利点は、以下の本発明の詳細な説明から容易に明らかである。
４００ｍＨｚにおけるＣＤ3ＯＤ中の式（Ｉ）の化合物の陽子核磁気共鳴（NMR）スペクトルである。
本発明は、一部において、マクロライド化合物、それを含有する神経保護および神経再生組成物、および該化合物の生成用の放線菌株に関する。本発明は、さらに、放線菌株において該化合物を生成する方法にも関する。
特に、本発明は、式（Ｉ）の化合物、またはその製薬上許容可能な塩を提供する。
「製薬上許容可能な塩」という用語は、有機および無機酸、例えば、酢酸、乳酸、クエン酸、桂皮酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、蓚酸、プロピオン酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、グリコール酸、ピルビン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、サリチル酸、安息香酸、および同様に公知の許容される酸から誘導される塩を意味する。
式（Ｉ）および（II）では立体化学に関係なく示されているが、式（Ｉ）または（II）の化合物は１またはそれ以上のキラル中心を含有しうる。「式（Ｉ）の化合物」または「式（II）の化合物」という場合、それらの全ての立体異性体を含む該構造式のあらゆる化合物を包含するものと理解される。
式（Ｉ）の化合物の物理化学的特徴は以下の通りである：
見掛け(apparent)分子式：Ｃ44Ｈ73ＮＯ12
分子量：陽イオンエレクトロスプレー
ｍ／ｚ＝８３０．９(Ｍ+Ｎａ)+；
陰イオンエレクトロスプレー
ＭＳ ｍ／ｚ＝８０７．４(Ｍ-Ｈ)-；
高解像フーリエ変換 ＭＳ ｍ／ｚ＝８３０．５００２１(Ｍ+Ｎａ)+
紫外吸収スペクトル：λmax ｎｍ(アセトニトリル／水)＝２１０ｎｍ，端吸収
旋光[α]25 D−１．１(ｃ １．０、ＭｅＯＨ)
陽子磁気共鳴スペクトル：(４００ＭＨｚ ＣＤ3ＯＤ)：例えば図１参照。
神経保護化合物（Ｉ）の製造について、本発明は、特定の生物、例えば、ＬＬ−Ｃ３１０３７およびＢＤ２４０として指定されるストレプトマイセス種に限定されない。実際に、この生物の天然変異体の使用、ならびに、当業者に公知の種々の変異誘発手段、例えば、ナイトロジェンマスタード（nitrogen mustard）、Ｘ線、紫外線、Ｎ'-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジンまたはアクチノファージへの暴露によって、この生物から作製される誘発変異体の使用を包含することが望ましく、かつそれを意図している。さらに、当業者に公知の遺伝子技術、例えば、接合、導入および遺伝子工学技術によって作製される種間および種内遺伝子組換え体を包含することも望ましく、かつそれを意図している。
１つの実施形態において、化合物および該化合物を製造する方法は、１６Ｓ
ｒＤＮＡ配列の比較によってストレプトマイセス属に分類される放線菌株の分離株（細胞）に関する。放線菌株の分離株は、寒天培地、例えば、本明細書に記載されるＡＴＣＣ寒天培地Ｎｏ．１７２または１７４（ATCC Media Handbook, 1st edition, 1984）で増殖させた場合に、気中菌糸体を産生せず、黄褐色（tan）菌糸体を産生し、可溶性色素を産生しない。または、他の好適な培地を、例えばＳｉｇｍａ（St.Louis,MO）から商業的に購入してもよい。さらなる実施形態において、放線菌の分離株が、式Ｉの化合物または式IIの化合物である少なくとも１つの化合物を産生する。さらなる実施形態において、放線菌の分離株が、式Ｉの化合物および式IIの化合物の両方を産生する。
式（II）の化合物およびその使用に関する付加的開示が、同一出願人による米国仮出願（発明の名称「Non-Immunosuppressive Immunophilin Ligands As Neuroprotective And/Or
Neuroregenerative Agents」、代理人件名AM101605/WYNC-0803、米国特許出願第６０／５６９，４３０号、出願日２００４年３月２日）に示されている。
前記方法は、好ましくは、放線菌株ＬＬ−Ｃ３１０３７およびＢＤ２４０の発酵における増殖を含む。別の実施形態において、好適な条件下で放線菌株を培養して、式（Ｉ）および／または（II）の化合物を生成することを含む方法を提供する。
１つの実施形態において、本発明は、放線菌株ＬＬ−Ｃ３１０３７を提供し、該菌株は、ブダペスト条約の規定により、Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL), 1815 North
University Avenue, Peoria, Illinois 61604に、２００４年３月１日に寄託され、ＮＲＲＬ表示番号３０７２１が付与された。別の実施形態において、本発明は、放線菌株ＢＤ２４０を提供し、該菌株は、ブダペスト条約の規定により、Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL), 1815 North
University Avenue, Peoria, Illinois 61604に、２００５年１月１９日に寄託され、ＮＲＲＬ表示番号３０８１０が付与された。本発明は、さらに、式（Ｉ）および／または式（II）の化合物を産生する能力を特徴とする、本発明の新規菌株の分離株、ならびにそれらの誘導体、変異体、組換え体および変形形態（modified forms）も提供する。１つの態様において、それらの誘導体、変異体、組換え体および変形形態は、１またはそれ以上の下記特徴をさらに有する：気中菌糸体を産生しない；黄褐色の基底菌糸体を産生する；および可溶性色素を産生しない。
新規化合物（Ｉ）および／または化合物（II）を包含するマクロライド化合物を生成するために、ストレプトマイセス種ＬＬ−Ｃ３１０３７およびＢＤ２４０を培養するための発酵条件を、フラスコ内で行うことができる。またはより多くの量の生成を、同様の条件下で発酵槽にて行うこともできる。
ストレプトマイセス種ＬＬ−Ｃ３１０３７およびＢＤ２４０の培養、およびマクロライド化合物の生成に有効な培地は、非同化性炭素源、例えば、デキストロース、スクロース、グリセロール、糖蜜、デンプンガラクトース、フルクトース、コーンスターチ、麦芽エキスおよびそれらの組合せ；非同化性窒素源、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、アミノ酸、タンパク質加水分解物、コーンスティープリカー（corn steep liquor）、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトン、トリプトンおよびそれらの組合せ；ならびに、無機陰イオンおよび陽イオン、例えば、カリウム、ナトリウム、硫酸、カルシウム、マグネシウム、塩化物。微量元素、例えば、亜鉛、コバルト、鉄、硼素、モリブデンおよび銅が、培地の他の成分の不純物として供給される。タンクおよびボトルにおける通気は、発酵培地の中または表面に滅菌空気を通すことによって供給される。機械インペラーが、タンクにおけるさらなる撹拌を与える。消泡剤、例えば、ポリプロピレングリコールを、必要であれば添加することができる。
増殖培地において式（Ｉ）の神経保護および神経再生化合物を生成するための、本明細書に記載の放線菌株の管理条件下での培養の発酵条件。
１つの実施形態において、発酵生成培地は、好ましくは、下記物質を組み合わすことによって作製される：約１〜約２ｗｔ％のデキストロース、約１〜約３ｗｔ％のダイズ源、酵母
約０．２５〜約１ｗｔ％の、約０．１ｗｔ％のカルシウム源、約５〜約１０ｗｔ％、好ましくは６〜８ｗｔ％のマルトデキストリン、および必要に応じて０〜０．５ｗｔ％のプロリン。必要に応じて、他の成分も含有してよい。好適には、培地を、ｐＨ
約６．５〜７．５、好ましくは約６．８〜７に調整する。一般に、好適な撹拌および通気を行いながら培養物を発酵させる。または、他の好適な発酵培地を、当業者によって、他の適切な炭素源または他の成分で置き換えて作製してもよく、および／または商業的に購入してもよい。一般に、例えば、Sigma Aldrich（St. Louis, MO）；G. J. Tortora et al, Microbiology：An Introduction Media Update(Benjamin
Cummings Publishing Co.；Oct.1, 2001)；Maintaining Cultures for Biotechnology and Industry, eds. J. C.
Hunter-Cevera and A. Bet(Academic Press, Jan 25, 1996)が参照される。
発酵から、約５〜１０日後、好ましくは約７日後に、培養物からの細胞を、遠心分離によってペレット化する。１つの態様において、細胞を好適な溶媒、例えば、エチルアセテートで抽出する。抽出物を真空濃縮し、最少量の好適な溶媒、例えばメタノールに再懸濁させる。溶液を、逆相シリカカラムに装填し、水中２０％〜１００％のメタノールで溶離する。６０％メタノール〜１００％メタノールから溶離する画分を、真空濃縮する。プロリルメリダマイシンを含有する画分を、好適な方法、例えば、クロマトグラフィー法によって分離する。
別の実施形態において、上澄みを好適な樹脂と混合し、約８〜１６時間静止させる。次に、樹脂を、好適な溶媒、例えば、メタノールで洗浄し、濾液を収集する。細胞ペレットに、エチルアセテート−メタノール混合物を添加する。これを何度も振り、遠心分離し、上澄みを収集する。細胞上澄み、およびブロス(broth)メタノール濾液を合わし、真空濃縮する。粗抽出物をシリカに吸収し、真空液体クロマトグラフィー（VLC）によって分画する。化合物を、好適な溶媒、例えば、ジクロロメタン中のメタノールで溶離する。この抽出物を濃縮し、シリカに吸収し、フラッシュシリカカラムに装填する。化合物を好適な溶媒で溶離し、濃縮し、カラムクロマトグラフィーによってさらに精製する。
粗または半精製物質中の式Ｉの化合物の存在は、従来法、例えば、画分の液体クロマトグラフィー質量分析によって確認できる。これらの画分を溜め、クロマトグラフィー法、および任意に、例えば真空での、濃縮によって、さらに精製してよい。
実験室および／または臨床目的の化合物の取扱いおよび配合に必要とされるように、得られた精製化合物は、細胞および細胞物質、副生成物、試薬および他の異物を含有しない。本発明に使用される化合物の純度は、８０ｗｔ％より大きく、より好ましくは少なくとも９０ｗｔ％、さらに好ましくは９５ｗｔ％より大きく、さらに好ましくは少なくとも９９ｗｔ％であることが好ましい。１つの態様において、本発明は、そのような化合物がどのように生成されたかに関係なく、本発明の化合物を含有する組成物を提供する。
治療的適用において限定するものではないが、式（Ｉ）の化合物を、中枢神経系の疾患、神経系疾患および末梢神経系の疾患の治療に使用することが望ましい。中枢神経系の疾患は、下記の疾患を包含するがそれらに限定されない：てんかん、脳卒中、脳虚血、脳性麻痺、多発性硬化症、アルパー病（Alper's disease）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、レヴィー小体認知症、レット症候群（Rhett syndrome）、神経因性疼痛、脊髄外傷および外傷性脳損傷。
本発明における神経系疾患は、限定はされず、神経変性に関連した種々の末梢神経障害性および神経系の疾患を包含する。当該疾患は、例えば、鉛、アクリルアミド、γ−ジケトン（グルー−スニッファー神経障害）、カーボンジスルフィド、ダプソン、マダニ、ポルフィリン症、ギラン−バレー症候群、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病によって生じる、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィ、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、進行性延髄遺伝性筋萎縮症、ヘルニア様、破裂性または脱出性脊椎骨円板症候群、頸部脊椎症、神経叢障害、胸郭出口破壊症候群、末梢神経障害を包含するが、限定はされない。
神経栄養療法が適切であることが示されている特定の疾患は、下記疾患を包含するがそれらに限定されない：中枢神経系疾患、アルツハイマー病、老化、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、脊髄損傷、てんかん、炎症性疾患、関節リウマチ、自己免疫疾患、呼吸窮迫、気腫、中枢神経系外傷および脳卒中。
本明細書において使用される「被験者」または「患者」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物であってよい哺乳動物を意味する。
本明細書において使用される「投与する」、「投与すること」または「投与」という用語は、化合物または組成物を患者に直接的に投与するか、または、化合物のプロドラッグ誘導体または類似体（これは、患者の体内で、対応量の活性化合物または物質を形成する）を患者に投与することを意味する。
本発明の化合物は、老人性認知症、レヴィー小体認知症、軽度認知障害、アルツハイマー病、認知低下、関連(associated)神経変性疾患の予防、治療または抑制、ならびに神経保護または認知強化を付与するのにも有効である。
本明細書において使用される「有効量」および「治療有効量」という用語は、患者に投与した場合に、患者が罹患していると考えられる症状を少なくとも部分的に改善するのに有効な、式（Ｉ）の化合物の量を意味する。
特定の疾患状態または障害の治療または抑制のために投与する場合、有効投与量は、使用される特定の化合物、投与法、治療を受けている症状、その重症度、ならびに、治療を受けている個々の患者に関する種々の身体的要因に依存して変化しうるものと理解される。そのような投与量は、活性化合物を被投与者の血流に向けるのに有効な任意の方法で投与され、そのような投与法は、経口、インプラント、非経口（静脈内、腹腔内および皮下注射を含む）、直腸、鼻腔内、膣および経皮投与を包含する。
本発明の化合物の有効投与は、月１回、週１回または毎日、または他の好適な間隔で行いうる。例えば、非経口投与は、週１回ベースにおいて、１週につき約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、または約１００ｍｇ〜約２５０ｍｇの投与量で行いうる。好適な経口投与量は、約０．１ｍｇ／日より多くてよい。好ましくは、投与は、単回投与または２回もしくはそれ以上の分割投与において、約１０ｍｇ／日より多く、特に約５０ｍｇ／日より多い。経口投与は、一般に、約１，０００ｍｇ／日を超えず、特に約６００ｍｇ／日を超えない。計画日用量は、投与経路によって変化すると考えられる。
本発明の活性化合物を含有する経口配合物は、錠剤、カプセル剤、口腔内形態（buccal forms）、トローチ剤、ロゼンジ剤および経口液、懸濁剤または液剤を包含する一般に使用される任意の経口形態を含む。カプセル剤は、活性化合物と、不活性充填剤および／または希釈剤、例えば、製薬上許容可能なデンプン（例えば、トウモロコシ、バレイショまたはタピオカデンプン）、砂糖、人工甘味料、粉末セルロース、例えば、結晶性または微結晶性セルロース、小麦粉、ゼラチン、ゴム等との混合物を含有しうる。有効な錠剤配合物は、従来の圧縮法、湿式造粒法または乾式造粒法によって製造でき、製薬上許容可能な希釈剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、表面改質剤（界面活性剤を含む）、懸濁化または安定化剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アルギニン酸、アラビアゴム、キサンタンゴム、クエン酸ナトリウム、複合シリケート、炭酸カルシウム、グリシン、デキストリン、スクロース、ソルビトール、リン酸ジカルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、タルク、ドライスターチおよび粉末砂糖を含む）を使用しうる。好ましい表面改質剤は、ノニオンおよびアニオン表面改質剤を包含する。表面改質剤の代表例は、ポロキサマー１８８、ベンザルコニウムクロライド、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ロウ、ソルビタンエステル、コロイドルシリコンジオキシド、リン酸、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸マグネシウムアルミニウムおよびトリエタノールアミンを包含するがそれらに限定されない。本発明における経口配合物は、活性化合物の吸収を変化させるために、一般的な遅延または持続放出配合物を使用しうる。経口用配合は、適切な可溶化剤または乳化剤を必要であれば含有する水またはフルーツジュースに、活性成分を添加することによって行ってもよい。
ある場合には、化合物を、エアロゾルの形態で、気道に直接的に投与することが望ましいこともある。
本発明の化合物は、非経口または腹腔内投与してもよい。遊離塩基または薬理的に許容される塩としてのこれらの活性化合物の溶液または懸濁液は、界面活性剤、例えばヒドロキシ−プロピルセルロースと適切に混合した水において調製することができる。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの油中混合物において、調製することができる。保存および使用の通常条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する防腐剤を含有する。
注射使用に好適な医薬形態は、滅菌水性溶液または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調合用の滅菌粉末を包含する。全ての場合に、該形態は、滅菌性にすべきであり、かつ容易注射可能性が存在する程度に流動性にすべきである。該形態は、製造および保存条件下において安定であるべきであり、かつ、微生物、例えば、細菌および真菌の汚染作用に対して保護すべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレグリコール）、適切なそれらの混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。
本発明の開示目的のために、経皮投与は、体の表面、および上皮および粘膜組織を含む体の通路の内層への全ての投与を包含するものと理解される。そのような投与は、ローション剤、クリーム剤、フォーム剤（foams）、貼付剤、懸濁剤、液剤および坐剤（直腸および膣）における本発明の化合物またはその製薬上許容可能な塩を使用して行いうる。
経皮投与は、活性成分、および、活性成分に不活性であり、皮膚に非毒性であり、かつ皮膚から血流への全身的吸収用の物質の送達が可能な担体を含有する経皮パッチの使用によって行いうる。担体は、クリームおよび軟膏、ペースト、ゲルおよび密封手段（occlusive devices）のなどの形態であってもよい。クリームおよび軟膏は、水中油または油中水型の粘稠液体または半固体エマルジョンであってよい。活性成分を含有する石油または親水性石油に分散した吸収性粉末から成るペーストも好適である。種々の密封手段、例えば、担体と共にまたは担体無しで活性成分を含有するレザバー（reservoir）を覆う半透膜、または活性成分を含有するマトリックスは、活性成分を血流に放出するために使用しうる。他の密封手段は、文献において公知である。
坐剤配合物は、カカオ脂（坐剤の融点を変化させるためにワックスを添加するかまたは添加しない）、およびグリセリンを包含する従来物質から形成しうる。水溶性坐剤基剤、例えば、種々の分子量を有するポリエチレングリコールも使用しうる。
本発明は、さらに、送達用に配合された化合物を含有する包装容器を備える製品を提供する。別の態様において、本発明は、例えば、本発明の化合物の送達用の、針、注射器および他の包装容器を備えるキットを提供する。必要に応じて、そのようなキットは、薬剤投与説明書、希釈剤、および/または本発明の化合物の固体形態の混合用の担体を備えていてもよい。
本発明の化合物の製造に使用される試薬は、商業的に入手できるか、または文献に記載の一般的手順によって調製できる。
本発明の代表的な製造例を、以下の実施例に記載する。
放線菌株ＬＬ−Ｃ３１０３７の発酵条件

放線菌株ＬＬ−Ｃ３１０３７を制御条件下で培養するための発酵条件により、増殖培地において、一般式（Ｉ）の神経保護および神経再生化合物を産生する。
放線菌株は、培養物保存機関Wyeth Research, Pearl River, New York 10965に培養物ＬＬ−Ｃ３１０３７として保存されている。この微生物の生存培養物は、ブダペスト条約により、Patent Culture Collection, Northern Regional Research
Laboratory(NRRL), U.S. Department of Agriculture, Peoria, IL 61604に寄託され、その永久収集に追加されている。培養物ＬＬ−Ｃ３１０３７は、ＮＲＲＬアクセッション番号３０７２１が付与され、２００４年３月１日に寄託されている。
寒天平板、例えば、ＡＴＣＣ寒天培地Ｎｏ．１７２における、放線菌株ＬＬ−Ｃ３１０３７の培養物は、気中菌糸体を産生しない。基底菌糸体は黄褐色であり、可溶性色素は産生されない。増幅遺伝子の分離および直接塩基配列決定後に、菌株ＬＬ−Ｃ３１０３７について１６Ｓ
ｒＤＮＡ配列を決定した。ヌクレオチド配列を、先に調査されたストレプトマイセス属菌株の配列を用いてアライメントし、２つのネイバー−ジョイニングツリーアルゴリズム（two neighbor-joining tree algorithms）を使用して系統樹を得た。１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は、ストレプトマイセス属の菌株の分類を裏付けた。
化合物（Ｉ）の生成のためにストレプトマイセス種ＬＬ−Ｃ３１０３７を培養するための発酵条件を、フラスコ内で行った。または、より多くの量の生成を、同様の条件下で発酵槽にて行った。
Ａ． フラスコ発酵
下記の配合のシード培地(seed medium)は、以下の物質を混合することによって作製した：デキストロース（オートクレーブ処理後に添加），１％；可溶性デンプン，２％；イースト抽出物，０．５％；Ｎ−Ｚアミン型Ａ（Sheffield），０．５％；炭酸カルシウム，０．１％；ｐＨ７．０。
２５×１５０ｍｍガラス管中のシード培地１０ｍＬに、ＡＴＣＣ寒天培地Ｎｏ．１７２で培養したループ２杯分のＬＬ−Ｃ３１０３７の細胞塊を接種した。寒天培養物からの充分な接種物を使用して、７２時間の増殖後に、混濁したシードを得た。一次シード管を、軌道２インチのジャイロ−ロータリーシェーカーを使用して２００ｒｐｍにおいて２８℃で７２時間インキュベートした。次に、一次シード（７ｍＬ）を使用して、シード培地３０ｍＬを含有する２５０ｍＬ三角フラスコに接種した。この二次シードフラスコを、ジャイロ−ロータリーシェーカー（軌道２インチ）を使用して２００ｒｐｍにおいて２８℃で２４時間インキュベートした。
下記配合の発酵生成培地は、以下の物質を混合することによって作製した：デキストロース（オートクレーブ処理後に添加），１％；マルトリン
Ｍ１８０，６％；大豆粉，１％；イースト抽出物，０．６％；Ｇａｍａｃｏ（ＣａＣＯ3），０．１％；ｐＨ７．０。
第二シード培養物１ｍＬを、２５０ｍＬ三角フラスコ内の発酵生成培地５０ｍＬに接種した。これらの生成フラスコを、ジャイロ−ロータリーシェーカー（軌道２インチ）を使用して２００ｒｐｍにおいて２６℃で７日間インキュベートした。
Ｂ． 発酵槽発酵
下記配合のシード培地を、以下の物質を合わすことによって作製した：デキストロース（オートクレーブ処理後に添加）、２％；可溶性デンプン、２％；イースト抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、０．３％；小麦加水分解物ＷＧＥ８０Ｍ（DMV International）、０．５％；大豆加水分解物ＳＥ５０ＭＡＦ（DMV International）、１．５％；ｐＨ６．８〜７．０。
凍結シード培養物１ｍＬを、４Ｌ三角フラスコ内のシード培地１Ｌに接種した。このシードフラスコを、ジャイロ−ロータリーシェーカー（軌道２インチ）を使用して２５０ｒｐｍにおいて３０℃で７２時間インキュベートした。
下記配合の発酵生成培地は、以下の物質を混合することによって作製した：デキストロース（オートクレーブ処理後に添加），２％；マルトリン
Ｍ５００，８％；栄養大豆(nutrisoy)（ＧＰＣ），１％；イースト抽出物（Ｄｉｆｃｏ），０．６％；Ｇａｍａｃｏ（ＣａＣＯ3），０．１％；Ｍａｃｏｌ
Ｐ２０００，０．２％；ｐＨ６．８〜７．０。
シード培養物１ｍＬを、７０Ｌ発酵槽中の発酵生成培地６０Ｌに接種した。発酵を、３５０〜５５０ｒｐｍで撹拌し、０．５〜０．７５ vol vol-1 min-1（VVM）で通気しながら２６℃で５日間インキュベートした。
ＬＬ−Ｃ３１０３７からの化合物（Ｉ）の精製

実施例１で作製した培養物ＬＬ−Ｃ３１０３７の発酵物８Ｌからの細胞を、遠心分離によってペレット化し、エチルアセテート３×３Ｌで抽出した。抽出物を真空濃縮し、最少量のメタノールに再懸濁させた。溶液をＣ１８逆相シリカ（Bondesil C18 ４０μ）に装填し、水中２０％〜１００％のメタノールで溶離した。６０％メタノール〜１００％メタノールから溶離した画分を真空濃縮した。次に、プロリルメリダマイシンを含有する画分を、分取ＨＰＬＣ（YMC ODS-A ５０×２５０ｍｍ １０μカラム、Ａ：水、Ｂ：メタノール、グラジエント：２０分間で５０％Ｂ→８０％Ｂ、次に、８０％メタノールで１０分間維持、２０ｍＬ／分）によってクロマトグラフィーに付した。式Ｉの化合物を、画分のＬＣＭＳ分析によって同定した（ｔR＝２２分）。これらの画分を溜めて、粗プロリルメリダマイシン３０ｍｇを得、分取ＨＰＬＣ（YMC ODS-A １０×２５０ｍｍ １０μ、Ａ：水、Ｂ：アセトニトリル、２ｍＬ／分、グラジエント：１０分間で４０％Ｂ→６０％Ｂ、１０分間維持、次に、１０分間で７０％Ｂ）によってさらに精製した。ＬＣＭＳ分析によって式Ｉの化合物を含有することが分かった画分（ｔR＝１８分）を溜め、真空濃縮して、精製プロリルメリダマイシン（１４．８ｍｇ，１．８５ｍｇ／Ｌ
回収）を得た。
放線菌株ＢＤ２４０の発酵条件

放線菌株ＢＤ２４０を制御条件下で培養するための発酵条件により、増殖培地において、一般式（Ｉ）の神経保護および神経再生化合物を産生する。
放線菌株は、培養物保存機関Wyeth Research, Pearl River, New York 10965に培養物ＢＤ２４０として保存されている。この微生物の生存培養物は、ブダペスト条約により、Patent Culture Collection, Northern Regional Research
Laboratory(NRRL), U.S. Department of Agriculture, Peoria, IL 61604に寄託され、その永久収集に追加されている。培養物ＢＤ２４０は、ＮＲＲＬアクセッション番号３０８１０が付与され、２００５年１月１９日に寄託されている。
寒天平板、例えば、ＡＴＣＣ寒天培地Ｎｏ．１７４における、放線菌株ＢＤ２４０の培養物は、気中菌糸体を産生しない。基底菌糸体は黄褐色であり、可溶性色素は産生されない。増幅遺伝子の分離および直接塩基配列決定後に、菌株ＢＤ２４０について１６Ｓ
ｒＤＮＡ配列を決定した。ヌクレオチド配列を、先に調査されたストレプトマイセス属菌株の配列を用いてアライメントし、２つのネイバー−ジョイニングツリーアルゴリズムを使用して系統樹を得た。１６Ｓ
ｒＤＮＡ配列は、ストレプトマイセス属の菌株の分類を裏付けた。
化合物（Ｉ）の生成のためにストレプトマイセス種ＢＤ２４０を培養するための発酵条件を、フラスコ内で行った。または、より多くの量の生成を、同様の条件下で発酵槽にて行った。
Ａ． フラスコ発酵
下記の配合のシード培地は、以下の物質を混合することによって作製した：デキストロース（オートクレーブ処理後に添加），１％；可溶性デンプン，２％；イースト抽出物（Ｄｉｆｃｏ），０．３％；小麦加水分解物ＷＧＥ８０Ｍ（DMV International），０．５％；大豆加水分解物ＳＥ５０ＭＡＦ（DMV International），１．５％；ｐＨ６．８〜７．０。
２５×１５０ｍｍガラス管中のシード培地１０ｍＬに、ＢＤ２４０の凍結シード培養物０．２ｍＬを接種した。シード管を、軌道２インチのジャイロ−ロータリーシェーカーを使用して２００ｒｐｍにおいて３０℃で４８時間インキュベートした。
下記配合の発酵生成培地は、以下の物質を混合することによって作製した：デキストロース（オートクレーブ処理後に添加），１％；マルトリン
Ｍ１８０，６％；大豆粉，１％；イースト抽出物，０．６％；Ｇａｍａｃｏ（ＣａＣＯ3），０．１％；Ｌ−プロリン，０．４％；３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸，２０．９ｇ／Ｌ；ｐＨ７．０。
シード培養物（０．５ｍＬ）を、２５０ｍＬ三角フラスコ内の発酵生成培地２５ｍＬに接種した。これらの生成フラスコを、ジャイロ−ロータリーシェーカー（軌道２インチ）を使用して２５０ｒｐｍにおいて２６℃で５日間インキュベートした。
Ｂ． 発酵槽発酵
下記配合のシード培地は、以下の物質を混合することによって作製した：デキストロース（オートクレーブ処理後に添加），１％；可溶性デンプン，２％；イースト抽出物（Ｄｉｆｃｏ），０．３％；小麦加水分解物（ＷＧＥ８０Ｍ、DMV International），０．５％；大豆加水分解物ＳＥ５０ＭＡＦ（DMV International），１．５％；ｐＨ６．８〜７．０。
凍結シード培養物（０．５ｍＬ）を、２Ｌ三角フラスコ内のシード培地２５０ｍＬに接種した。このシードフラスコを、ジャイロ−ロータリーシェーカー（軌道２インチ）を使用して２００ｒｐｍにおいて３０℃で４８時間インキュベートした。
下記配合の発酵生成培地は、以下の物質を混合することによって作製した：デキストロース（オートクレーブ処理後に添加），１％；マルトリン
Ｍ１８０，６％；大豆粉，１％；イースト抽出物（Ｄｉｆｃｏ），０．６％；Ｇａｍａｃｏ（ＣａＣＯ3），０．１％；Ｌ−プロリン，０．４％；Ｍａｃｏｌ
Ｐ２０００，０．１％；ｐＨ６．８〜７．０。
シード培養物２５０ｍＬを、１０Ｌ発酵槽中の発酵生成培地８Ｌに接種した。発酵を、４８０〜６５０ｒｐｍで撹拌し、１．０ vol vol-1 min-1（VVM）で通気しながら２６℃で７日間インキュベートした。
ＢＤ２４０からの化合物（Ｉ）の精製

実施例３で作製したＢＤ２４０の培養物１０Ｌからの細胞を、遠心分離によってペレット化した。水中の５％Ｄｉａｉｏｎ−ＨＰ２０樹脂を上澄みに添加し、これを室温で一晩撹拌した。樹脂をメタノールで洗浄し、濾液を収集した。細胞ペレットに、８０：２０エチルアセテートメタノールを添加した。これを何度も振り、遠心分離し、上澄みを収集した。細胞上澄みおよびブロス(broth)メタノール濾液を合わし、真空濃縮した。
粗抽出物をシリカ（３２〜６３μ、６０Å）に吸収し、真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ）によって分画した。化合物を、ジクロロメタン中の５％メタノールで溶離した。次に、この物質を、真空濃縮し、シリカ（３２〜６３μ、６０Å）に吸収し、フラッシュシリカカラム（６０ｍｍ×２５０ｍｍ）に装填した。化合物を、ジクロロメタン中の２％メタノールで溶離した。次に、この物質を、真空濃縮し、Sephadex LH-20（６０×４００ｍｍ、メタノール）に装填した。カラムを先ず３００ｍＬメタノールで洗浄し、３０ｍＬ画分を収集し、ＬＣＭＳでモニターした。目的とする化合物を含有する初期画分を、収集し、濃縮した。この半精製（semi-pure）物質を、分取ＨＰＬＣ（YMC ODS-A ５０×２５０ｍｍ １０μカラム、Ａ：水、Ｂ：メタノール、グラジエント：２００分間で５５％Ｂ→７０％Ｂ、３０ｍＬ／分）によってクロマトグラフィーに付した。式（Ｉ）の化合物を、画分のＬＣＭＳ分析によって同定した。関心のあるこれらの画分を溜め、真空濃縮して、式（Ｉ）の精製化合物（ｔR＝１３０分、１３８ｍｇ）を得た。
ＢＤ２４０からの化合物（II）の精製

ＢＤ２４０の培養物１０Ｌからの細胞を、遠心分離によってペレット化した。水中の５％Ｄｉａｉｏｎ−ＨＰ２０樹脂を上澄みに添加し、これを室温で一晩撹拌した。ＨＰ２０樹脂をメタノールで洗浄し、濾液を収集した。細胞ペレットに、８０：２０エチルアセテートメタノールを添加した。これを何度も振り、遠心分離し、上澄みを収集した。細胞上澄みおよびブロスメタノール濾液を合わし、真空濃縮した。
粗抽出物をシリカ（３２〜６３μ、６０Å）に吸収し、ＶＬＣによって分画した。化合物を、ジクロロメタン中の５％メタノールで溶離した。この物質を、真空濃縮し、シリカ（３２〜６３μ、６０Å）に吸収し、フラッシュシリカカラム（６０ｍｍ×２５０ｍｍ）に装填した。化合物を、ジクロロメタン中の２％メタノールで溶離した。この物質を、真空濃縮し、Sephadex LH-20（６０×４００ｍｍ、メタノール）に装填した。カラムを先ず３００ｍＬメタノールで洗浄し、３０ｍＬ画分を収集し、ＬＣＭＳでモニターした。目的とする化合物を含有する初期画分を、収集し、濃縮した。この半精製物質を、分取ＨＰＬＣ（YMC ODS-A ５０×２５０ｍｍ １０μカラム、Ａ：水、Ｂ：メタノール、グラジエント：２００分間で５５％Ｂ→７０％Ｂ、３０ｍＬ／分）によってクロマトグラフィーに付した。化合物IIを、画分のＬＣＭＳ分析によって同定した。関心のあるこれらの画分を溜め、真空濃縮して、精製化合物II（ｔR＝１５０分、２２０ｍｇ）を得た。
同様の方法を使用して、放線菌株ＬＬ−Ｃ３１０３７から化合物IIを精製することができる。
神経細胞培養物における化合物（Ｉ）の神経保護特性

ポングら、J Neurochem.69:986-994(1997)において先に記載されているように、中脳ドパミン作用性神経細胞培養物を作製した。胎齢１５日（E15）のラット胎児を集め、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で解剖した。中脳ドパミン作用領域を有する腹側組織片を切り離した。切り離した組織片を合わし、アール平衡塩類溶液（Worthington Biochemical, Freehold, NJ, U.S.A.）中２０ＩＵ／ｍＬパパインを含有する酵素的分離培地に移し、３７℃で６０分間インキュベートした。酵素的分離後に、パパイン溶液を吸引し、２，０００ＩＵ／ｍＬ
ＤＮアーゼおよび１０ｍｇ／ｍＬオボムコイドプロテアーゼ阻害剤を含有する完全培地［０．１ｍｇ／ｍＬアポトランスフェリンおよび２．５μｇ／ｍＬインスリンを補充した、等量の最小必須培地（MEM）およびＦ−１２栄養混合物（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）］中で、先端熱加工したガラスパスツールピペットを用いて、組織を機械的にすりつぶした。
Ａ． 高親和性ドパミン取り込みアッセイ
ドパミン取り込み実験のために、完全培地中の単細胞懸濁液を、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンで被覆した２４穴プレートに接種した。実験前に、培養物を７日間保持した。培養物を、種々の濃度の式（Ｉ）の化合物（ＰＢＳで洗浄し、培地で１ｎＭ〜１００ｎＭの濃度に希釈）で２４時間前処理し、次に、１０μＭ 神経毒１−メチル−４−フェニルピリジニウム（MPP+）に１時間暴露して、細胞培養物中の式（Ｉ）の化合物の神経保護作用を評価した。１時間のインキューベーション後、培地を３回交換し、新しい化合物をさらに４８時間添加した。
より詳しくは、ＭＰＰ+暴露後の中脳ドパミン作用性神経細胞培養物の４８時間増殖後、高親和性3Ｈ−ドパミン取り込みを、Prochiantz et al., Nature 293:570-572(1981)に記載の改変法によって行った。５．６ｍＭ グルコースおよび１ｍＭ アスコルビン酸を含有する予熱リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で、培養物を洗浄した。次に、培養物を、５０ｎＭ 3Ｈ−ドパミン（31 Ci/mmol、Du Pont-NEN, Wilmington, DE, U.S.A.）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。培養物を、緩衝液で２回洗浄し、０．５Ｎ ＮａＯＨで溶解させた。Ultima
Goldシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアルに溶解物を移し、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。または、培養物溶解物を緩衝液で２回洗浄し、Optiphase Supermixシンチレーションカクテル（Wallac Scintillation Products, Gaithersburg, MD, USA）と共に室温で２時間インキュベートし、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定することもできる。

表１に示すように、式（Ｉ）の化合物プロリルメリダマイシンは、培養ドパミン作用性神経細胞において、ＭＰＰ+誘発神経毒性に対して神経保護性であり、１０ｎｇ／ｍＬグリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）によって付与される最大保護（８４％取り込み）に対して、ＥＣ50 １１０ｎＭであった。メリダマイシンを使用した同様の調査は、プロリルメリダマイシンが、このアッセイにおいて、メリダマイシンより保護性であることを示した。
神経細胞培養物における化合物（Ｉ）の神経再生特性

分離した皮質神経細胞の培養物を、先に記載のように作製した［Pong et al., Exp Neurol. 2001 Sep;171(1):84-97(2001)］。すなわち、胎齢１５日のラット胎児を集め、氷冷ＰＢＳ中で解剖した。切り離した皮質を集め、パパインを含有する酵素的分離培地に移した。３０分後、先端熱加工したガラスパスツールピペットを用いて、組織を機械的にすりつぶした。完全培地中の単細胞懸濁液を、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンで被覆した９６穴プレートに接種した。２４時間後、培養物を、種々の濃度の式（Ｉ）の化合物で７２時間処理した。次に、培養物を固定し、神経フィラメント一次抗体およびペルオキシダーゼ標識二次抗体で染色した。ペルオキシダーゼ基質（K-Blue Max）を添加し、比色変化を比色プレートリーダーで測定した。

表２に示すように、神経細胞への化合物の添加は、培養した皮質神経細胞における神経細胞生存率を増加させ、ＥＣ50 ２１ｎＭであった。メリダマイシンを使用した同様の調査は、プロリルメリダマイシンが、このアッセイにおいて、メリダマイシンより有効であることを示した。
培養皮質神経細胞における化合物（Ｉ）の神経再生特性

分離した皮質神経細胞の培養物を、先に記載のように作製した（前記Pong et al., 2001）。すなわち、胎齢１５日のラット胎児を集め、氷冷ＰＢＳ中で解剖した。切り離した皮質を集め、パパインを含有する酵素的分離培地に移した。３０分後、先端熱加工したガラスパスツールピペットを用いて、組織を機械的にすりつぶした。完全培地中の単細胞懸濁液を、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンで被覆した９６穴プレートに接種した。２４時間後、培養物を、種々の濃度の式Ｉの化合物で７２時間処理した。次に、培養物を固定し、抗チューブリン一次抗体（ＴＵＪ−１）および蛍光標識二次抗体で染色した。Cellomics ArrayScanでEnhanced Neurite Outgrowth（ENO）アルゴリズムを使用して神経突起成長を測定し、細胞当たりの全神経突起長さとして示した。

培養背根神経節における化合物（Ｉ）の神経再生特性

分離した背根神経節の培養物を、先に記載のように作製した［A. Wood et al., "Stimulation of neurite outgrowth by
immunophilin ligands: quantitative analysis by Cellomics Array scan"
Society for Neuroscience (2004), abstract 104.3]。すなわち、生後３〜５日の子ラットを安楽死させた。脊柱を除去し、各背根神経節（DRG）を切り離した。切り離したＤＲＧを集め、パパインを含有する酵素的分離培地に移した。６０分後、先端熱加工したガラスパスツールピペットを用いて、組織を機械的にすりつぶした。完全培地中の単細胞懸濁液を、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンで被覆した９６穴プレートに接種した。２４時間後、培養物を、種々の濃度の式Ｉの化合物で７２時間処理した。次に、培養物を固定し、抗チューブリン一次抗体（ＴＵＪ−１）および蛍光標識二次抗体で染色した。Cellomics ArrayScanでEnhanced Neurite Outgrowth（ENO）アルゴリズムを使用して神経突起成長を測定し、細胞当たりの全神経突起長さとして示した。
本明細書において、物理的特性、例えば分子量、または化学的特性、例えば化学式に関して、範囲が使用されている場合、範囲の全組合せおよび半組合せおよびその中の特定の実施形態を包含するものとする。本明細書に引用されている全て実施形態文献、および寄託物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明を特定の態様に関して記載したが、本発明の真意を逸脱せずに変更を加えうるものと理解される。そのような変更は、添付の請求の範囲に含まれるものとする。

Claims (1)

  1. 式（Ｉ）の化合物、またはその製薬上許容可能な塩。


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