JP2012146566A - タンパク質光電変換素子、光電変換システム、タンパク質光電変換素子の製造方法、光電変換システムの製造方法およびタンパク質固定化電極 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】金電極11上に金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体からなるタンパク質12を固定化してタンパク質固定化電極を形成する。このタンパク質固定化電極を用いてタンパク質光電変換素子を製造する。このタンパク質光電変換素子をカラー撮像素子などの光電変換システムに用いる。
【選択図】図1
Description
上記課題および他の課題は、添付図面を参照した本明細書の記述から明らかとなるであろう。
金電極と、
上記金電極に固定化された金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子である。
金電極と、
上記金電極に固定化された金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子を有する光電変換システムである。
金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化する工程を有するタンパク質光電変換素子の製造方法である。
金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化する工程を有する光電変換システムの製造方法である。
金電極と、
上記金電極に固定化されたシトクロムb562 または金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質固定化電極である。
1.第1の実施の形態(タンパク質固定化電極およびその製造方法)
2.第2の実施の形態(タンパク質光電変換素子)
3.第3の実施の形態(非接液全固体型タンパク質光電変換素子)
4.第4の実施の形態(カラー撮像素子)
[タンパク質固定化電極]
図1は第1の実施の形態によるタンパク質固定化電極を示す。
このタンパク質固定化電極は、例えば、金電極11の表面に正電荷を持たせた後、タンパク質12を溶解した緩衝液に金電極11を浸漬して金電極11の表面にタンパク質12を吸着させることにより製造することができる。
a.大腸菌由来シトクロムb562 の発現・精製方法
大腸菌由来シトクロムb562 の構造遺伝子を組み込んだプラスミド(Cyt−b562/pKK223−3)を作製し、大腸菌JM109株に形質転換した。発現・精製方法は非特許文献1に準じた。
1979年にX線結晶構造解析により決定されたシトクロムb562 の結晶構造(非特許文献2参照)を図3A、BおよびCに示す。ここで、図3Aはリボンモデルを示し、ヘムとその配位子アミノ酸を棒モデルで示す。図3Bはシトクロムb562 が図3Aと同じ向きの時の電荷分布を示し、楕円状の破線で囲まれた部分が一番強く負に帯電しているヘム−プロピオン酸露出面である(図3Cでも同様)。図3Cはシトクロムb562 を図3Bの状態から縦軸の周りに180度回転させた状態(図3Bに示す状態のシトクロムb562 の裏側)の電荷分布を示す。図3A、BおよびCに示すように、シトクロムb562 は4ヘリックスバンドル構造を有し、補欠分子族ヘムを1分子有する。そのヘムのプロピオン酸は分子から足を出すように露出している。図3Bに示す電荷分布を見ると、ちょうどそのヘムのプロピオン酸サイトに強い負電荷を持つことが分かる。したがって、金電極11の表面に正電荷を持たせると、シトクロムb562 をヘムのプロピオン酸サイトで金電極11に吸着させることができる。その模式図を図4に示す(ヘムのみ棒モデルで示す)。この例では、金電極11上に、最表面に正電荷を有する自己組織化単分子膜13を形成し、この自己組織化単分子膜13の最表面の正電荷とシトクロムb562 のヘムのプロピオン酸サイトの負電荷との間に働く静電引力によりシトクロムb562 が自己組織化単分子膜13に吸着している。
この金ドロップ電極を熱濃硫酸(120℃)で洗浄し、硫酸中の酸化還元サイクル処理で金ドロップ電極の表面のラフネス(粗さ)を増した。この金ドロップ電極を0.1mM 11−アミノウンデカンチオール(H2 N−C11−SH)/エタノール溶液に室温で16時間以上浸し、金ドロップ電極の表面に自己組織化単分子膜13としてH2 N−C11−SH膜を形成した。こうしてH2 N−C11−SH膜を形成した金ドロップ電極に圧縮エアを当てて乾燥後、50μMシトクロムb562 /4.4mMリン酸カリウム(pH7.2)溶液60μLにソーキングし、4℃で一昼夜インキュベートした。
a.亜鉛置換シトクロムb562 の調製
亜鉛置換シトクロムb562 の調製法はすでにHamachiらによる報告(非特許文献4)があるため、それに準じて亜鉛置換シトクロムb562 の調製を行った。
金電極11として直径2mmの金ドロップ電極を形成した。
a.亜鉛クロリンシトクロムb562 の調製
実施例2と同様にしてアポシトクロムb562 を得た。
金電極11として直径2mmの金ドロップ電極を形成した。
a.シトクロムb562 のトリプトファンおよびシステイン変異体の調製
実施例1の発現プラスミドと下記のプライマー(下線は変異箇所)を用いて、I17W/H63N(イソロイシン17をトリプトファンに、ヒスチジン63をアスパラギンに変更)変異体、および、I17C/H63N(イソロイシン17をシステインに、ヒスチジン63をアスパラギンに変更)変異体プラスミドをStratagene社製、QuickChange Lightning Site directed mutagenesis kit を用いて調製した。なお、H63Nの変異は、亜鉛ポルフィリンの再構成時に、このヒスチジンに亜鉛ポルフィリンが配位結合するのを避けるためである(非特許文献7参照)。また、イソロイシン17と異なるアミノ酸残基をトリプトファンに変更してもよい。
I17W ans:5’−CCGCTTTTTCCCACACTTTTAAATTGTCGTTGAGG−3’
I17C sen:5’−CAATTTAAAAGTGTGCGAAAAAGCGGATAAC−3’
I17C ans:5’−CCGCTTTTTCGCACACTTTTAAATTGTCGTTGAGG−3’
H63N sen:5’−GATTTCCGCAACGGTTTCGACATTCTG−3’
H63N ans:5’−GTCGAAACCGTTGCGGAAATCTTTC−3’
上記の精製シトクロムb562 _I17C/H63Nから実施例2と同様にして酸−ブタノン法により脱ヘムし、超純水(2L×3回)、1mM DTT(2L×1回)、1mM Acetate−Na pH5.0、100mM KCl(2L×1回)に対して透析し、アポタンパク質を調製した。
上記のキノン導入アポタンパク質に対し、2.2〜2.5倍量の亜鉛プロトポルフィリン(ZnPP)を加え、Bio−rad EconoPac10 DG脱塩カラム(緩衝液は50mM Tris−HCl(pH8.0)、0.1mM EDTA)でタンパク質画分を回収した。こうして得られた亜鉛置換シトクロムb562 _I17C/H63Nの吸収スペクトルを図16に示す。図16の右上の挿入図は野生型(WT)の吸収スペクトルを示す。
上記のようにして得られた亜鉛置換シトクロムb562 _I17C/H63Nを実施例1と同様に、11−アミノウンデカンチオールを用いて金ドロップ電極に固定化した。亜鉛置換シトクロムb562 _I17C/H63Nを金ドロップ電極からなる金電極11上の自己組織化単分子膜13に吸着させた時の模式図を図17に示す。図17において、17番目のアミノ酸(W、BQ、CoQ)と63番目のアスパラギン(H63N)を棒モデルで示す。この亜鉛置換シトクロムb562 _I17C/H63N固定化金ドロップ電極に光を照射すると、電子(e- )が破線で示すように電極から分子表面方向へと抜け出す。図17には、トリプトファン(Trp)、システイン(Cys)に結合したパラベンゾキノン(BQ)およびシステインに結合した2,3−ジメトキシ−5−メチルパラベンゾキノン(CoQ)の構造を示した。
特許文献1によると、亜鉛置換シトクロムc固定化電極にメディエーターとしてフェロ/フェリシアナイド(E0 =360mV vs NHE)を入れると、光電流がエンハンスされる。光照射によりポルフィリンの電子が励起され、光励起に関わる分子軌道(Goutermanの4軌道)のうち、被占軌道の二つ(ポルフィリンπ軌道に亜鉛−硫黄のπ結合性軌道が混成したもの)に正孔(ホール)が発生する。その正孔がタンパク質の外殻アミノ酸に局在化した分子軌道と強くカップルし、色素上で発生した正孔はタンパク質の外殻(溶液側)に移動する。フェロ/フェリシアナイドはその正孔を埋めるというモデルが提唱されている。
30mg/mLのシトクロムb562 _I17W/H63N溶液(10mM Acetate−Na pH5.0)を等量の0.1M Bis−Tris pH6.5、45%Poly(propylene glycol)P400(Index−58)と混ぜ、シッティングドロップ蒸気拡散法、ハンギングドロップ蒸気拡散法で20℃、2日間インキュベートすることで、図24に示すようなシトクロムb562 _I17W/H63Nの結晶が得られた。図24中の両矢印は0.1mmを示す。得られた結晶は空間群P1のツイン結晶で、2.53Å分解能の回折データを得ることができた。その統計値を表1に示す。
[タンパク質光電変換素子]
図31に第2の実施の形態によるタンパク質光電変換素子を示し、特にタンパク質固定化電極を示す。
図32はこのタンパク質光電変換素子の使用形態の第1の例を示す。
図32に示すように、この第1の例では、金電極21上にタンパク質22が固定化されたタンパク質固定化電極と対極23とが互いに対向して設けられる。これらのタンパク質固定化電極および対極23は、容器24中に入れられた電解質溶液25中に浸漬される。電解質溶液25は、タンパク質22の機能を損なわないものが用いられる。また、この電解質溶液25の電解質(あるいはレドックス種)は、タンパク質固定化電極で酸化反応が起こり、対極23で還元反応が起こるもの、または、タンパク質固定化電極で還元反応が起こり、対極23で酸化反応が起こるものが用いられる。
図33に示すように、この第2の例では、第1の例のようにバイアス電源26を用いてバイアス電圧を発生させるのではなく、タンパク質固定化電極および対極23が持つ自然電極電位の差をバイアス電圧として用いる。この場合、参照電極27は用いる必要がない。したがって、このタンパク質光電変換素子は、タンパク質固定化電極および対極23を用いる二電極系である。第2の例の上記以外のことは第1の例と同様である。
このタンパク質光電変換素子の製造方法の一例について説明する。
まず、電極21をタンパク質22と緩衝液とを含む溶液に浸漬し、タンパク質22を電極21上に固定化する。こうしてタンパク質固定化電極が形成される。
次に、このタンパク質固定化電極と対極23とを用いて例えば図32、図33または図34に示すタンパク質光電変換素子を製造する。
このタンパク質光電変換素子のタンパク質22が亜鉛置換シトクロムb562 である場合は、波長418〜420nmの青色の単色光またはこの波長成分を含む光が入射すると、タンパク質22から光励起により電子が発生し、電子伝達により金電極21に電子が移動する。また、このタンパク質光電変換素子のタンパク質22が亜鉛クロリンシトクロムb562 である場合は、波長418〜420nmの青色の単色光あるいは波長636nm付近の赤色の単色光またはこの波長成分を含む光が入射すると、タンパク質22から光励起により電子が発生し、電子伝達により金電極21に電子が移動する。そして、金電極21と対極23とから外部に光電流が取り出される。
[非接液全固体型タンパク質光電変換素子]
図35は第3の実施の形態による非接液全固体型タンパク質光電変換素子を示す。この非接液全固体型タンパク質光電変換素子においては固体タンパク質層を用いる。ここで、固体タンパク質層とは、水などの液体を含まずにタンパク質が集合して層状の固体をなすものを意味する。また、非接液全固体型タンパク質光電変換素子の「非接液」とは、タンパク質光電変換素子の内外が水などの液体と接触しない状態で使用されることを意味する。また、非接液全固体型タンパク質光電変換素子の「全固体型」とは、素子の全ての部位が水などの液体を含まないものであることを意味する。
この非接液全固体型タンパク質光電変換素子の製造方法について説明する。
まず、電極41、42の一方、例えば電極41上に、タンパク質43aを含む溶液、典型的にはタンパク質43aを水を含む緩衝液に溶解したタンパク質溶液を液滴下法、スピンコート法、ディップ法、スプレー法、インクジェット法などにより付着させる。
以上のようにして目的とする非接液全固体型タンパク質光電変換素子が製造される。
この非接液全固体型タンパク質光電変換素子の動作について説明する。
非接液全固体型タンパク質光電変換素子の電極41と電極42との間に電極42側が低電位となるように電圧(バイアス電圧)を印加しておく。ここでは、電極41が透明電極であるとする。この非接液全固体型タンパク質光電変換素子の固体タンパク質層43に光が入射しないときには、この固体タンパク質層43は絶縁性であり、電極41と電極42との間に電流は流れない。この状態が非接液全固体型タンパク質光電変換素子のオフ状態である。これに対して、図37に示すように、電極41を透過して固体タンパク質層43に光(hν)が入射すると、この固体タンパク質層43を構成するタンパク質43aが光励起され、その結果、この固体タンパク質層43が導電性となる。そして、電極42から電子(e)が固体タンパク質層43を通って電極41に流れ、電極41と電極42との間に光電流が流れる。この状態が非接液全固体型タンパク質光電変換素子のオン状態である。このように固体タンパク質層43は光導電体として振る舞い、この非接液全固体型タンパク質光電変換素子への光の入射の有無によりオン/オフ動作が可能である。
[カラー撮像素子]
第4の実施の形態によるカラー撮像素子においては、赤色光のタンパク質光電変換素子、緑色光のタンパク質光電変換素子および青色光のタンパク質光電変換素子を用いる。これらのタンパク質光電変換素子は同一基板上に形成してもよいし、赤色光のタンパク質光電変換素子、緑色光のタンパク質光電変換素子および青色光のタンパク質光電変換素子をそれぞれ別の基板上に形成し、これらの基板を配列することでカラー撮像素子を構成してもよい。
図38に示すように、このカラー撮像素子においては、基板61上の一画素の領域における赤色光、緑色光および青色光のタンパク質光電変換素子形成領域に、それぞれ金電極62a、62b、62cが設けられている。これらの金電極62a、62b、62cは互いに電気的に絶縁されている。基板61としては各種のものを用いることができ、必要に応じて選ばれるが、例えば、シリコン基板などの半導体基板、ガラス基板などの透明基板などを用いることができる。特に、基板61としてシリコン基板などの半導体基板を用いることにより、従来公知の半導体テクノロジーを用いてカラー撮像素子の信号処理回路や駆動回路などをこの半導体基板に容易に形成することができる。基板61として導電性基板を用いる場合には、例えば、この基板61の表面にSiO2 膜などの絶縁膜を形成し、その上に金電極62a、62b、62cを形成してもよい。
上記以外のことは第1の実施の形態と同様である。
この第4の実施の形態によれば、タンパク質を用いた新規なカラー撮像素子を実現することができる。
例えば、上述の実施の形態および実施例において挙げた数値、構造、構成、形状、材料などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、構造、構成、形状、材料などを用いてもよい。
Claims (17)
- 金電極と、
上記金電極に固定化された金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子。 - 上記金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体は、そのポルフィリンのプロピオン酸を上記金電極側に向けて固定化されている請求項1記載のタンパク質光電変換素子。
- 上記金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体に、π電子を有するレドックスアクティブな基が導入されている請求項2記載のタンパク質光電変換素子。
- 上記レドックスアクティブな基はトリプトファンまたはキノンである請求項3記載のタンパク質光電変換素子。
- 上記金属置換シトクロムb562 は亜鉛置換シトクロムb562 である請求項4記載のタンパク質光電変換素子。
- 金電極と、
上記金電極に固定化された金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質光電変換素子を有する光電変換システム。 - 上記金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体は、そのポルフィリンのプロピオン酸を上記金電極側に向けて固定化されている請求項6記載の光電変換システム。
- 上記金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体に、π電子を有するレドックスアクティブな基が導入されている請求項7記載の光電変換システム。
- 上記レドックスアクティブな基はトリプトファンまたはキノンである請求項8記載の光電変換システム。
- 上記金属置換シトクロムb562 は亜鉛置換シトクロムb562 である請求項9記載の光電変換システム。
- 金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化する工程を有するタンパク質光電変換素子の製造方法。
- 上記金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体は、そのポルフィリンのプロピオン酸を上記金電極側に向けて固定化されている請求項11記載のタンパク質光電変換素子の製造方法。
- 上記金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体に、π電子を有するレドックスアクティブな基が導入されている請求項12記載のタンパク質光電変換素子の製造方法。
- 上記レドックスアクティブな基はトリプトファンまたはキノンである請求項13記載のタンパク質光電変換素子の製造方法。
- 上記金属置換シトクロムb562 は亜鉛置換シトクロムb562 である請求項14記載のタンパク質光電変換素子の製造方法。
- 金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体を金電極上に固定化する工程を有する光電変換システムの製造方法。
- 金電極と、
上記金電極に固定化されたシトクロムb562 または金属置換シトクロムb562 または亜鉛クロリンシトクロムb562 またはそれらの誘導体もしくは変異体とを有するタンパク質固定化電極。
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