JP2012143231A - 非球体細胞の生死活性判定方法及び判定装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 底面と上面とが対向する透明電極で構成されたセル中の非球体細胞懸濁液に、初期周波数を印加する工程と、周波数を、判定周波数まで上昇させる工程と、前記判定周波数における非球体細胞の生死を判定する工程とを含む非球体細胞の生死活性判定方法、及びこれに用いる非球体細胞の生死活性判定装置1であって、セル2と、交流発振器3と、観察装置4と、画像表示装置5と、画像処理装置6とを備える装置を提供する。
【選択図】 図1
Description
ここで使用する細胞は分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)で、長軸が約10μm、短軸が約4μmの円柱状であった。この分裂酵母菌を天然YE培地(0.5% 酵母エキス,3% グルコース)でOD600=0.3まで30℃、80rpmで振盪培養(パーソナル11EX、タイテック社)した。培養後、4000rpm、4℃、5分間の条件で遠心分離器(KUBOTA1900、久保田製作所)を用いて非電解質で等張液の0.6Mソルビトールで洗浄し、再懸濁して細胞濃度を調整した。
25×75mmで、厚さ680μmのITO(インジウム−酸化スズ)透明電極2枚の間に絶縁スペーサを挟み込み、この隙間に調製した細胞懸濁液10μlを注入した。実験システムの構成は、概ね、図2に示すとおりである。
透明電極が底面と上面になるように、セルを倒立型顕微鏡(IX−71、オリンパス社)に設置し、3分間静置して、細胞を底面側の透明電極上に沈降させた。交流発振器(KSG4300、菊水電子工業)を自作のソフトウエアによって制御し、プログラムによって、初期周波数を400kHzとした。そこから40MHzまで一定間隔で周波数を上げていくことで細胞の配向変化をカメラ(CoolSNAP HQ2、Photometrics社)を通してパソコンで画像を記録した。発振器の電圧は、10Vp−pで出力したが、周波数によって変化した。
一定時間ごとに記録した画像は、市販の画像解析ソフトウエア(MetaMorph、Molecular Devices社製)を用いて二値化処理し、細胞の投影面積を合計して算出した。
(5−1)周波数帯域の検討
上記(1)にしたがって調製した生細胞サンプルと、死細胞サンプルのそれぞれを、電極間隔が100μmになるように絶縁スペーサを挟み込んだセルに注入し、細胞濃度が、3×105cells/cm2となるようにした。それぞれのサンプルは、外部電導率を1mS/mとした。まず、400kHzの初期周波数を与え、40MHzまで周波数を上昇させた。切替え時間は15秒間隔とし、切替え周波数は、400kHz〜3MHzの間は200kHz間隔、3〜20MHzの間は1MHz間隔、20〜40MHzの間は2MHz間隔とした。図3に、周波数(Hz)に対する、細胞投影面積(μm2)のグラフを示す。直立した細胞(正の配向)は投影面積が小さく、転倒した細胞(負の配向)は投影面積が大きくなるため、図3のように細胞の配向現象を定量的に測定することが出来た。
細胞の配向変化を観察する上で細胞濃度は非常に重要な因子である。極度に細胞濃度が高い場合は、細胞が重なり合うため正負の配向変化を観察することは困難であることが理論的にも予測される。上記と同様にして、外部電導率が1mS/mの生死細胞混合サンプルを調製した。上記同様、電極間隔を100μmとし、400kHzの初期周波数を与え、40MHzまで上昇させた。切替えの時間間隔は15秒、周波数間隔は、(1)と同様とした。図示はしないが、実際、生細胞では細胞濃度が1×106cells/cm2以上で10〜40MHzと広い範囲で正負の配向が混在して観察され、正確な配向現象を捉えることは出来なかった。
電界強度は細胞の誘電分極に大きく関わり配向力が変化する。そこで電界強度の影響を調べるため、30〜300μmのスペーサを用いて電極間隔を変えた。ただし本発明の生死判定装置では印加電圧の大きさは使用した周波数に依存して、5〜9Vp−pで変化したので電界強度もそれに対応して変化した。電極間が20μm以下では細胞の動きが制限されるため配向現象を観察することは出来なかったので30μm以上の電極間に調整した。さらに電極間が大きくなると沈殿する細胞数が増えるので、沈殿した細胞濃度を、3×105cells/cm2と、一定の濃度の生死細胞混合サンプルを調製し、実験を行った。外部電導率は、上記と同じく1mS/mとし、400kHzの初期周波数を与え、40MHzまで上昇させた。切替えの時間間隔は15秒、周波数間隔は、(5−1)と同様とした。
外部溶液の電導率もまた細胞の誘電分極に大きく作用し配向力に影響する。外部電導率はソルビトール溶液に添加するKClの量を変化させることにより、1〜56mS/mの間で調整した。細胞濃度が3×105cells/cm2の生死細胞混合サンプルとし、電極間距離は100μm、400kHzの初期周波数を与え、40MHzまで上昇させた。切替えの時間間隔は15秒、周波数間隔は、(5−1)と同様とした。
交流電界中の配向現象を用いて顕微鏡下で個々の細胞の生死判定をするためには、生細胞のみを直立(正の配向)させ、死細胞を転倒(負の配向)させることで見分けることが可能となる。そのための配向条件として上記の結果を考慮すると、対象が酵母細胞の場合には、細胞濃度3×105cells/cm2、電極間隔100μm、電圧5〜10Vp−p、外部電導率1mS/m以下で、判定周波数3〜20MHzの範囲にすると、生細胞のみ直立するため、個々の生死細胞を判定することが可能であった。ただし諸条件によって死細胞の転換周波数が変化し易いことを考慮すると、15MHz前後の周波数を印加することが好ましい。
一般に細胞の生死を判定する定義は難しいが、ここでは生死混合サンプルをSYTO9とPropidium iodide(PI)で蛍光染色することで生死判定する方法と比較した。生死の判定は、生死細胞混合サンプルについて行った。細胞濃度が3×105
cells/cm2、外部電導率1mS/mとなるよう、生死細胞混合サンプルを調製し、電極間隔100μmのセルに注入した。400kHzの初期周波数から判定周波数15MHzまで、周波数を上昇させた。切替えの時間間隔は15秒、周波数間隔は、(5−1)と同様とした。細胞の染色は、市販の生死測定キット(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits、invitrogen社)中の蛍光色素SYTO9とPIを用いて行った。蛍光観察は、倒立型蛍光顕微鏡(IX−71、オリンパス社)を用いて、青(480nm)の励起光を照射して緑(540nm)と赤色(570nm以上)の蛍光を観察した。
電極間隔と懸濁液容量を変化させ、電気的特性変化を測定した。電極間距離は、50μm、100μm、200μmの間で、細胞懸濁液の滴下量は、1μL、1.5μL、3μL、6μL、10μLの間で変化させた。発振器の出力を2Vにして電極間にかかる電圧をオシロスコープで測定した。なお、実施例2では、細胞懸濁液は、細胞培養までは実施例1と同様の条件で行い、ソルビトールでの洗浄を行う替わりに、超純水(電導率0.01mS/m)のみで細胞を洗浄し、再懸濁した。電極間距離、細胞懸濁液の滴下量以外は、実施例1の(2)、(3)と同様の実験システムで試験を行った。結果を図14に示す。図14のグラフで示されるように、キャパシタンスが小さくなる条件では高周波での電圧低下が少なくなった。ただし配向観察時における細胞の沈降時間、懸濁液の蒸発なども考慮すると電極間は100μm、滴下量は3μL、とするのがもっとも好ましいことが示された。
次に、印加周波数の検討を再度行った。細胞懸濁液は、上記実施例2の(1)と同様に調製し、電極間距離は100μm、細胞懸濁液の滴下量は、3μLとした。また、電圧の印加は、上記実施例2(1)の方法に従って2V一定の値となるようにした。細胞の直立割合は、下記(3)に示す方法で算出した。
上記判定周波数において生細胞のみが直立することを利用し、細胞の直立転倒状態の割合をカウントすることで検量線を作成することなく、生存率を算出した。細胞のカウントは画像解析ソフト(Molecular Devices社製 MetaMorph)の形態解析機能(IMA:Integrated Morphometry Analysis)を用い、二値化された画像データより個々の細胞の直立転倒状態の違いによる一細胞当たりの投影面積範囲及び直径範囲に基づいて区別し、それぞれの細胞数をカウントした。1画面中(1.5×10−3cm2)に記録する細胞は100個以下(7×104cells/cm2)にすることで良好な結果が得られた。これは、より正確にカウントするため細胞接触による投影面積増加による誤認を避けることができたためである。
実施例1では培養した培地のままでは懸濁液の電導率が高いため配向が起こらず、浸透圧調整を兼ねた非電解質のソルビトールで洗浄および再懸濁し導電率を低くすることによって直立する細胞を得ていた。実施例2では、ソルビトールを使用せず、超純水(電導率0.01mS/m)又はイオン交換水(0.1mS/m)のみで細胞を洗浄、再懸濁することでも配向が観察され転換周波数及び生死判定への影響もないことが確認できた。
分裂酵母菌は定常期になると長軸が短くなり長短の比が約1.9となることが知られている。このような長短軸の比が小さくなる条件下であっても、図19(直立、あるいは正の配向)、図20(転倒、あるいは負の配向)のように顕微鏡下でも直立転倒状態を区別することができた。そして、上記実施例2(3)の生存率算出方法を用いて、直立転倒細胞率を算出することができた。形状が変化しても転換周波数は大きく変わることはなく、判定周波数に影響しなかった。また判定周波数での直立転倒細胞は蛍光色素による判定とほぼ一致していることが確認できた。これにより培養中の増殖期の細胞状態を連続してモニタリング測定できることがわかった。
原核生物である大腸菌(JM109)でもITO電極間での配向により直立転倒状態の細胞を観察することができた。図21に、直立状態(正の配向)にある大腸菌の生死混合サンプルの顕微鏡写真(100倍)を、図22に、直立状態と転倒状態(負の配向)にある大腸菌の生死混合サンプルの顕微鏡写真(100倍)を示す。分裂酵母菌と比較すると、細胞サイズが小さく、顕微鏡の観察には100倍の対物レンズを使用する必要があった。また電極間に浮遊するためピントが合わせにくいため全体の定量化は難しいが、生死細胞により転換周波数が異なり5MHz付近の判定周波数を印加すると個々の細胞の配向方向によって判定することが可能であった。またLactobacillus caseiなどの乳酸桿菌でも同様にITO電極間での配向現象が観察できた。
透過率を測定するシステムは、図13に示す構成のものを用いた。光源部としてはタングステンハロゲンランプ(Ocean Optics LS−1)、検出部は分光器(Ocean Optics S1024DW)を用い、波長600nmでの透過率変化を測定した。光源部7に接続した光ファイバーケーブル7aを、透明電極の底面21bに、検出部8に接続した光ファイバーケーブル8aを、透明電極の上面21aに設置した。交流電圧を印加するシステムは実施例2(1)で用いたものと同じとした。ここでは、細胞懸濁液として、実施例2(1)の条件で調製したものを用いた。
2 セル
21a 上面を構成する透明電極
21b 底面を構成する透明電極
22 細胞懸濁液
23 死細胞
24 生細胞
3 交流発振器
4 観察装置
5 画像表示装置
6 画像処理装置
7 光源
7a 光源接続光ファイバーケーブル
7b コリメーティングレンズ
8 分光器
8a 分光器接続光ファイバーケーブル
8b コリメーティングレンズ
9 演算処理装置
Claims (16)
- 底面と上面とが対向する透明電極で構成されたセル中の非球体細胞懸濁液に、初期周波数を印加する工程と、
周波数を、判定周波数まで上昇させる工程と、
前記判定周波数における非球体細胞の生死を判定する工程と
を含む非球体細胞の生死活性判定方法。 - 前記生死を判定する工程が、
前記判定周波数における非球体細胞の投影画像を取得する工程と、
前記取得した前記投影画像を二値化し、投影面積を得る工程と、
前記投影面積に基づいて、負の配向を示す細胞と、正の配向を示す細胞とを定量化する工程と
を含む、請求項1に記載の非球体細胞の生死活性判定方法。 - 前記生死を判定する工程が、
前記判定周波数における非球体細胞の投影画像を取得する工程と、
前記取得した前記投影画像から、負の配向を示す細胞と、正の配向を示す細胞との細胞数を得る工程と、
前記細胞数から負の配向を示す細胞と、正の配向を示す細胞とを定量化する工程と
を含む、請求項1に記載の非球体細胞の生死活性判定方法。 - 前記生死を判定する工程が、
前記初期周波数から判定周波数まで周波数を上昇させながら、非球体細胞懸濁液の光透過率を測定する工程と、
負の配向を示す細胞と、正の配向を示す細胞との割合を算出する工程と
を含む、請求項1に記載の非球体細胞の生死活性判定方法。 - 前記初期周波数が100k〜1MHzであり、前記判定周波数が2〜20MHzである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記非球体細胞が、酵母菌であり、前記判定周波数が3〜9MHzである、請求項5に記載の方法。
- 前記非球体細胞懸濁液が、1x105〜5x105cells/cm2の細胞濃度を有する、請求項2または4に記載の方法。
- 前記非球体細胞懸濁液が、1x104〜1x105cells/cm2の細胞濃度を有する、請求項3に記載の方法。
- 前記非球体細胞懸濁液が、12mS/m以下の外部電導率を有する、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記非球体細胞懸濁液が、0.01〜3.5mS/mの外部電導率を有する、請求項9に記載の方法。
- 前記非球体細胞が、酵母菌または桿菌である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記非球体細胞が、乳酸桿菌、大腸菌である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記底面の透明電極と前記上面の透明電極との電極間距離が、50〜200μmであり、前記セル中の非球体細胞懸濁液が、1〜5μLである、請求項1〜12にのいずれかに記載の方法。
- 底面と上面とが対向する透明電極で構成されたセルと、
前記セルに所定範囲の周波数を印加する交流発振器と、
前記セル中の細胞の投影画像を取得する観察装置と、
前記観察装置が取得した前記投影画像を表示する画像表示装置と、
前記投影画像を二値化して、負の配向を示す細胞と、正の配向を示す細胞とを定量化する画像処理装置と
を備える非球体細胞の生死活性判定装置。 - 底面と上面とが対向する透明電極で構成されたセルと、
前記セルに所定範囲の周波数を印加する交流発振器と、
光源と、分光器とを含む光透過率測定装置であって、前記セル中の非球体細胞懸濁液の光透過率を測定するための光透過率測定装置と
を備える非球体細胞の生死活性判定装置。 - 前記底面の透明電極と前記上面の透明電極との電極間距離が、50〜200μmである、請求項14または15に記載の装置。
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