CN107075437A - 细胞测量机构和具有该细胞测量机构的细胞培养装置以及细胞测量方法 - Google Patents
细胞测量机构和具有该细胞测量机构的细胞培养装置以及细胞测量方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107075437A CN107075437A CN201480082245.1A CN201480082245A CN107075437A CN 107075437 A CN107075437 A CN 107075437A CN 201480082245 A CN201480082245 A CN 201480082245A CN 107075437 A CN107075437 A CN 107075437A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- suspending liquid
- calibration curve
- transmitance
- luminous intensity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 238000005259 measurement Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 151
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims abstract description 101
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims abstract description 97
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 43
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 29
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 29
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 14
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 8
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 claims description 4
- 230000004899 motility Effects 0.000 claims description 3
- 238000009738 saturating Methods 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 581
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 49
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 32
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 7
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 239000001055 blue pigment Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 201000011061 large intestine cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/0006—Controlling or regulating processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/48—Automatic or computerized control
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/04—Cell isolation or sorting
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
- G01N21/53—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid within a flowing fluid, e.g. smoke
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
- G01N15/075—Investigating concentration of particle suspensions by optical means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
- G01N2201/12—Circuits of general importance; Signal processing
- G01N2201/127—Calibration; base line adjustment; drift compensation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Computer Hardware Design (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种不依赖于操作者的熟练度、并且不对培养细胞进行染色、能够高精度且迅速地实行细胞存活率等的测量的细胞测量机构和细胞培养装置，以及细胞测量方法。细胞测量机构16具备：使细胞悬浮液流通的流路；将流路内的细胞悬浮液进行输送的液体驱动部7；基于从光源向在流体单元23内流动中的细胞悬浮液22进行照射光的照射所得到的前向散射光强度以及透过率和/或侧向散射光强度，求出细胞悬浮液中的细胞存活率的运算部18。本申请涉及校正曲线DB 18d，所述校正曲线DB 18d预先存储：表示活细胞浓度与前向散射光强度的关系、死细胞浓度与上述透过率的关系、以及细胞存活率与上述侧向散射光强度的关系的各校正曲线。
Description
技术领域
本发明本发明涉及细胞测量机构和具有该细胞测量机构的自动细胞培养装置、以及细胞测量方法。
背景技术
以往，细胞培养中大部分的操作都是通过手工操作来进行，细胞培养操作繁杂且花费时间，因此需要大量的人力成本。特别是，细胞计数和细胞存活率测定为繁杂且困难的操作，必须要求操作者的熟练度。
对此，提出了如专利文献1所示的细胞计数器那样，基于进行了台盼蓝色素染色的培养细胞的图像数据，自动计算细胞数的计数和细胞存活率等的方法。
此外，专利文献2中，示出了通过使用多波长的激光光源和多次流入光学测定(流式细胞仪)对全血中的红血球、白血球、血小板进行鉴定和定量的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2013-517460号公报
专利文献2：日本特表2012-525589号公报
发明内容
发明所要解决的课题
如果使用专利文献1所记载的细胞计数器来尝试细胞数的计数，则与利用以往的血球计数板的计数相比精度提高。但是，根据我们的实验结果，在细胞悬浮液的细胞浓度为1×105细胞/mL以下和5×106细胞/mL以上的浓度区域内，计数结果的可靠性极端降低了。在将细胞培养装置应用于再生医疗、细胞治疗时，需要测量细胞浓度为1×105细胞/mL以下的样本。然而，专利文献1的细胞计数器在该浓度区域内的测量精度低，无法适用。此外，细胞存活率是通过细胞轮廓的对比度来判断细胞的生死，但是活性降低了的细胞(以下，低活性的活细胞)的细胞轮廓的对比度低，难以判断生死。也就是说，无法测量继代培养中细胞悬浮液中的细胞存活率。
此外，就使用了专利文献2所示的流式细胞仪的细胞测量方法而言，需要对每一个细胞进行测定，因此需要大量的时间。
另一方面，以再生医疗或细胞治疗为目的进行细胞培养时，由于不能确认安全性，因此无法对供于治疗的细胞进行染色。因此，就必须用色素对细胞进行染色的专利文献1的细胞测量方法而言，难以适用于这样的细胞培养。此外，在如上所述的专利文献2的细胞测量方法中，测量需要大量的时间，因此变得难以适用于细胞培养装置。
对此，本发明提供一种不依赖于操作者的熟练度、并且不对培养细胞进行染色、能够高精度且迅速地实行至少细胞存活率的测量的细胞测量机构和具有该细胞测量机构的细胞培养装置、以及细胞测量方法。
用于解决问题的方法
为了解决上述课题，本发明的细胞测量机构的特征在于，具有：使细胞悬浮液流通的流路；将上述流路内的细胞悬浮液进行输送的液体驱动部；基于从光源向在上述流路内流动中的细胞悬浮液进行照射光的照射所得到的前向散射光强度以及透过率和/或侧向散射光强度，求出至少上述细胞悬浮液中的细胞存活率的运算部。
此外，本发明的细胞培养装置的特征在于，具有：培养细胞并使细胞增殖，并将增殖的细胞剥离的扩增培养机构；以及细胞测量机构，所述细胞测量机构具有：使含有由上述扩增培养机构剥离的细胞的细胞悬浮液流通的流路；将上述流路内的细胞悬浮液进行输送的液体驱动部；运算部，该运算部基于从光源向在上述流路内流动中的细胞悬浮液进行照射光的照射所得到的前向散射光强度以及透过率和/或侧向散射光强度，计算至少上述细胞悬浮液中的细胞存活率。
此外，本发明的细胞测量方法的特征在于，是求出细胞悬浮液中的至少细胞存活率的细胞测量方法，具有：
对于在流体单元内流通的细胞悬浮液，由光源从与上述细胞悬浮液的流动正交的方向进行照射光的照射的工序；对从上述细胞悬浮液散射的前向散射光强度进行测定的工序；对透过上述细胞悬浮液的上述照射光的透过率进行测定的工序；基于上述测定的前向散射光强度和预先储存的表示活细胞浓度与上述前向散射光强度的关系的第一校正曲线，求出上述细胞悬浮液中的活细胞浓度的工序；基于上述测定的上述透过率和预先储存的表示死细胞浓度与上述透过率的关系的第二校正曲线，求出上述细胞悬浮液中的死细胞浓度的工序；侧向基于上述求出的活细胞浓度和死细胞浓度，求出上述细胞悬浮液中的细胞存活率的工序。
发明的效果
根据本发明，能够提供一种不依赖于操作者的熟练度、并且不对培养细胞进行染色、能够高精度且迅速地实行至少细胞存活率的测量的细胞测量机构和具有该细胞测量机构的细胞培养装置、以及细胞测量方法。
例如，能够在配设于细胞培养装置内的流体单元内，通过非染色来迅速地测量含有继代培养细胞的细胞悬浮液中的细胞存活率。
上述之外的课题、构成和效果，通过以下的实施方式的说明而变得明确。
附图说明
图1为本发明的一个实施方式涉及的细胞培养装置的整体构成图。
图2为表示Caco-2细胞的显微镜图像，即包含活细胞、死细胞和低活性的活细胞的图像的图。
图3为图1所示的测定部的光学系统的概略构成图。
图4为图1所示的控制部的概略构成图。
图5为表示Caco-2细胞悬浮液中的活细胞浓度与前向散射光强度的关系的图，为校正曲线(1)的说明图。
图6为表示Caco-2细胞悬浮液中的各死细胞浓度中，来自光源的照射光的波长与透过率T的关系的光谱图。
图7为表示Caco-2培养基中的死细胞浓度与透过率T的关系的图，为校正曲线的说明图。
图8为表示Caco-2活细胞悬浮液中的死细胞浓度与透过率T的关系的图，为校正曲线(2)的说明图。
图9为表示Caco-2细胞悬浮液中的培养液和各细胞存活率中，来自光源的照射光的波长与侧向散射光强度的关系的光谱图。
图10为表示Caco-2活细胞悬浮液中的细胞存活率与侧向散射光强度的关系的图，为校正曲线(3)的说明图。
图11为根据本发明的一实施例涉及的实施例1的细胞测量机构的细胞存活率计算处理的流程图。
图12为根据本发明的另一实施例涉及的实施例2的细胞测量机构的细胞存活率计算处理的流程图。
图13为根据本发明的另一实施例涉及的实施例3的细胞测量机构的细胞存活率计算处理的流程图。
具体实施方式
本发明人等潜心研究的结果是：在再生医疗或细胞治疗中使用的培养细胞(继代培养细胞等)的情况下，根据每个患者或被检者的细胞活性的不同或培养状态(继代培养环境等)，混入粒径小的死细胞、垂死的细胞或低活性的活细胞。得到了以下见解：这些细胞与具有活性的活细胞大小不同，因此仅通过例如对于流通通过流体单元中的活细胞悬浮液利用光源进行照射光的照射而得到的散射光，难以求出正确的细胞数或细胞存活率。这里，本发明人等得到了以下见解：通过使用前向散射光强度和透过率、或者前向散射光强度和透过率以及侧向散射光强度，从而识别大小不同的上述各种细胞、即具有活性的活细胞、低活性的活细胞和死细胞，能够高精度且迅速地得到细胞数或细胞存活率。
本说明书中，分别合并或单独地将细胞悬浮液中的活细胞(viable cell)记为Vc、将活细胞的浓度记为CVc、将细胞悬浮液中的死细胞(dead cell)记为Dc、将死细胞的浓度记为CDc、将细胞悬浮液中的低活性的活细胞(subvital cell)记为Sc、将低活性的活细胞的浓度记为CSc。
图1为表示本发明的一个实施方式涉及的细胞培养装置的整体构成图。图1中，用实线表示使细胞悬浮液流通的流路，用虚线表示发送或接收控制信号或测量信号的信号线。细胞培养装置1由如下机构构成：培养并使细胞增殖、并将增殖的细胞剥离的扩增培养机构15；使由扩增培养机构15剥离的细胞分散并进行测定的细胞测量机构16；将由细胞测量机构16分散的细胞悬浮液向扩增培养机构15进行输送的细胞接种机构17；以及控制部18。予以说明的是，如后所述，控制部18与细胞测量机构16协同工作，具有基于所测量的前向散射光强度、透过率和侧向散射光强度，通过运算求出细胞悬浮液中的细胞存活率等的功能。该点中，控制部18构成细胞测量机构16的一部分。此外，控制部18还具有控制扩增培养机构15、细胞测量机构16和细胞接种机构17的功能。以下，将控制部18具有求出细胞悬浮液中的细胞存活率、活细胞浓度(CVc)、和死细胞浓度(CDc)的功能的构成作为一个例子进行说明，但不限于此。例如，可以在细胞测量机构16内设置具有上述功能的控制运算部，此外，也可以设为在后述的测定部6配设控制运算部的构成。
扩增培养机构15放置于未图示的CO2培养箱内。同样地，也可以设为细胞测量机构16和细胞接种机构17也放置于CO2培养箱内的构成。细胞培养装置1内的流路内设为封闭体系的无菌状态，在细胞培养装置1的运行中，导入流路内的空气例如通过HEPA过滤器(未图示)，在维持了无菌状态的环境下实施包含细胞的继代操作等在内的细胞培养。
关于在构成扩增培养机构15的扩增培养容器2中培养的细胞，从细胞供给部10，使用液体驱动部例如注射泵等而被导入。适量的细胞培养液从培养液供给部3通过液体驱动部例如挤压泵7而被导入，流通通过三通阀8和流路内，供给至扩增培养容器2。然后，对于在扩增培养容器2中培养的细胞，按照在导入的细胞培养液中成为均一浓度的方式，摇动容器，然后静置数日。对于所培养的细胞，于CO2培养箱内在适当的条件下，在扩增培养容器2内培养数日。扩增培养容器2中，为了能够观察培养细胞的增殖状态而设置有显微镜。这是因为，如果培养细胞在100％融合的状态、即在扩增培养容器2的整个底面区域增殖，则不进行在此之上的增殖，存在培养细胞的活性降低或死亡的担忧。一般而言，希望在达到70％～80％的融合的时刻将培养细胞剥离。细胞洗涤溶液供给部11在内部容纳有PBS(磷酸盐缓冲液)或HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)缓冲液等适合于细胞的洗涤液。例如，通过注射泵，从细胞洗涤液供给部11向扩增培养容器2内导入洗涤液，从而将滞留时间长的细胞培养液、死细胞或废物等挤出。被挤出的含有死细胞的细胞培养液通过挤压泵7而作为废液14向细胞培养装置1的封闭体系外排出。细胞剥离溶液供给部12容纳胰蛋白酶、胶原酶、分散酶等蛋白质水解酶。将这些蛋白质水解酶向扩增培养容器2导入并放置一定时间。利用这些蛋白酶，增殖了的培养细胞和与扩增培养容器2的底面粘接的整合蛋白等蛋白质分解，培养细胞从扩增培养容器2剥离。细胞剥离溶液抑制剂供给部13容纳胰蛋白酶抑制剂或细胞培养液等酶活性抑制剂。通过将这些细胞剥离溶液抑制剂向扩增培养容器2导入，从而使培养细胞剥离后的蛋白质分解酶的活性停止，实现酶活性对培养细胞的损伤的降低。
试样导入部4通过挤压泵7、三通阀8而回收从扩增培养容器2的底面剥离的培养细胞。此时，在扩增培养容器2底面的培养细胞的残渣多时，利用从培养液供给部3导入的细胞培养液进行预洗，然后回收到试样导入部4，从而能够提高培养细胞的回收率。
回收至试样供给部4的培养细胞通过注射泵(未图示)等液体驱动部和三通阀8而作为细胞悬浮液被导入细胞测量机构16的循环流路内。细胞测量机构16由分散部5、作为液体驱动部的挤压泵7以及测定部6构成。这些分散部5、挤压泵7和测定部6通过循环流路而被连接。根据培养的细胞种类不同，其凝集性不同，假设在培养凝集性高的细胞种类时，导入到细胞测量机构16的循环流路内的细胞悬浮液所含的培养细胞(以下简称为细胞)成为块状而流通通过循环流路。对此，利用作为液体驱动部的挤压泵7、通过三通阀8而向分散部5导入，从块状分散后，细胞悬浮液向测定部6导入。这里，分散部5是通过例如在流路内设置流路直径急剧缩小的狭窄部、或孔板等隔板而形成。细胞悬浮液流通通过这些狭窄部或孔板时，块状的细胞通过剪切力(Sheer Stress)而被分散。予以说明的是，培养低凝集性的细胞种类时，不是必须在细胞测量机构16内配设分散部5，只要通过以循环流路连接测定部6、挤压泵7和三通阀8，来构成细胞测量机构16即可。
关于细胞接种机构17，在一端为扩增培养容器2、另一端为通过三通阀8与细胞测量机构16内的循环流路连接的流路中，具备通过三通阀8而连接的细胞接种试样调整部9。细胞接种试样调整部9是为了对流通通过细胞测量机构16内的循环流路内的细胞悬浮液中的细胞浓度而配设的。也就是说，按照细胞悬浮液中的细胞浓度成为所期望的细胞浓度的方式，驱动作为液体驱动部的挤压泵7，通过一端连接至扩增培养容器2的流路，将含有从扩增培养容器2的底面剥离的细胞的细胞悬浮液通过三通阀8而加入到细胞接种试样调整部9内。然后，利用挤压泵7的驱动，从培养液供给部3通过三通阀8将期望量的细胞培养液导入至细胞接种试样调整部9，与已经加入的细胞悬浮液混合并稀释。然后，将稀释后的细胞悬浮液向细胞测量机构16的循环流路进行输送，利用后文详述的测定部6，测量前向散射光强度、透过率和侧向散射光强度。
这里，针对细胞悬浮液所含的活细胞(Vc)、低活性的活细胞(Sc)和死细胞(Dc)进行说明。图2中示出作为人大肠癌细胞株的Caco-2细胞的显微镜图像。图2所示的显微镜图像是在以下的条件下所得到的Caco-2细胞的图像。将Caco-2细胞培养为100％融合以上，不将粘接的细胞剥离而回收漂浮于培养液中的细胞。该状态的培养细胞大部分活性降低，剥离细胞的一部分，细胞培养液中漂浮着大量死细胞。获取细胞培养液的一部分，使用细胞计数器测定细胞浓度和存活率，则细胞浓度为5×105细胞/mL，存活率为20％。将该试样滴加于载玻片，用盖玻片固定后，使用倒置显微镜以物镜20倍进行拍摄的图像，就是图2所示的显微镜图像。如图2所示，观察尚具有活性的活细胞(Vc)19、低活性的活细胞(Sc)20、不具有活性的死亡了的死细胞(Dc)21。活细胞(Vc)19为发白色光，粒径大，与此相比，死细胞(Dc)21整体上着色为黑色，大多成为非粒子状。此外，不明确细胞膜，对细胞内部的结构变化的情况进行观察。虽然看起来大，但是不为粒子状，因此难以散射光。可知，低活性的活细胞(Sc)20为活细胞(Vc)19与死细胞(Dc)21的中间的状态，虽然发白色光，但其粒径比活细胞(Vc)19小。
图2所示的活细胞(Vc)、低活性的活细胞(Sc)和死细胞(Dc)为Caco-2细胞时，在此先对依赖于细胞种类的粒径的不同进行说明。关于活细胞(Vc)的粒径，就NIH/3T3细胞而言为约10μm，上述人大肠癌细胞株(Caco-2细胞)或人口腔粘膜上皮细胞为约14μm，人骨骼肌成肌细胞为约20μm。此外，人骨髓间充质干细胞为约10～50μm，人软骨细胞为约10μm。
接下来，针对图1所示的构成细胞测量机构16的测定部6进行说明。图3中示出测定部6的光学系统的概略构成图。本实施方式中的测定部6具备：在内部流通细胞悬浮液的流体单元23、按照相对于流通通过流体单元23的细胞悬浮液的流动方向正交的方式配设的光源22，隔着流体单元23而与光源22相对置，即按照检测器的受光面与从光源照射的照射光的光轴相对的方式配设的透过率检测器25。此外，测定部6具有：在透过率检测器25侧、相对于照射光的光轴具有规定的角度θ(前向散射检测角度)而配设的前向散射光检测器24，以及配设于与照射光的光轴垂直的轴上、该轴穿过流体单元23的大致中心、配设于与流体单元23离开规定的距离的位置的侧向散射光检测器26。这里，作为光源22，例如可以使用分光光度计、散射光度计、荧光光度计、流式细胞仪或粒度分布测定装置等所使用的激光光源、LED光源、钨灯或氙灯等。
这里，前向散射光是相对于光源22的光轴向前方方向散射的光，测量的前向散射光强度反映粒子的大小。此外，与光轴所成的角，即前向散射检测角度θ依赖于粒径。因此，例如按照最适合于上述每个细胞种类的活细胞(Vc)的粒径的方式，预先调整前向散射检测角度θ，配设前向散射光检测器24。这样一来，若按照与细胞种类的活细胞(Vc)的粒径相适应的角度测定散射的前向散射光强度，则只要是相同大小的粒径的活细胞(Vc)，散射光强度与活细胞(Vc)的浓度(CVc)就成比例。此外，在前向散射光的测定中，需要根据细胞(活细胞(Vc))的大小来选择光源波长。在符合细胞粒径的波长时，前向散射光强度容易依赖于细胞浓度变化，越是粒径大的细胞，越希望照射长波长的光。来自光源22的照射光优选像激光那样的平行光。
此外，在细胞从活性高的状态向活性低的状态、即从活细胞(Vc)向死细胞(Dc)变化的过程中，细胞内部的颜色变得发黑。因此，随着细胞悬浮液中的死细胞(Dc)的含有率增加，透过细胞悬浮液的光量衰减。由此，通过利用透过率检测器25测定透过率，能够获得死细胞(Dc)的浓度(CDc)。透过率测定中，在紫外光附近，细胞悬浮液中的所有有机成分的吸收重叠，因此变得难以正确地仅评价死细胞(Dc)。此外，在通过图1所示的培养液供给部3向扩增培养容器2导入的细胞培养液中，为了pH判定而添加酚红等pH指示剂。因此，细胞培养液被着色为黄色～红色，在可见光区域的波长时，受到细胞培养液的颜色的影响，透过率大幅降低。考虑到这些，如果在长波长区域利用透过率检测器25检测透过率，则能够不受到阻碍成分的影响而稳定地测量活细胞悬浮液中的死细胞(Dc)的浓度(CDc)。
另外，就活细胞(Vc)和死细胞(Dc)而言，细胞内的颗粒密度、内部结构不同。侧向散射光是以相对于如上所述的光源22的光轴呈90°的角度检测的光，反映粒子的密度、形态。因此，通过对细胞内的物质进行照射光的照射，则散射的侧向散射光强度的不同会反映细胞存活率。若测定细胞悬浮液中的侧向散射光光谱，则在紫外区域(230nm～310nm附近)检测到来自细胞质的有机成分的平缓的峰，如接近可见光区域的波长，则如上所述，受到细胞培养液的颜色的影响。因此，依赖于细胞内粒子的侧向散射光优选在紫外区域的短波长侧进行测量。
图4中示出图1所示的控制部18的概略构成图。如上所述，本实施方式中，作为一个例子，示出控制部18与细胞测量机构16协同工作，具有基于所测量的前向散射光强度、透过率和侧向散射光强度，通过运算求出细胞悬浮液中的细胞存活率等的功能的情况。
控制部18具备运算处理部18a、运算程序存储部18b、I/O界面18c和校正曲线数据库(DB)，具有将它们通过内部总线18e相互连接的构成。I/O界面18c设为能够获取由构成上述测定部6的前向散射光检测器24测量的前向散射光强度、由构成上述测定部6的透过率检测器25测量的透过率、以及由构成上述测定部6的侧向散射光检测器26测量的侧向散射光强度，并且能够向构成测定部6的光源22发送照射光的发射指令(照射时机等)。运算程序存储部18b存储有活细胞浓度运算程序、死细胞浓度运算程序和细胞存活率运算程序。此外，校正曲线数据库18d中，预先存储有表示活细胞浓度(CVc)与前向散射光强度的关系的、活细胞浓度(CVc)的运算中所使用的校正曲线(1)。表示死细胞浓度(CDc)与透过率T的关系的、死细胞浓度(CDc)的运算中所使用的校正曲线(2)也同样地被预先存储。此外，表示细胞存活率与侧向散射光强度的关系的、细胞存活率的运算中所使用的校正曲线(3)也被预先存储。予以说明的是，作为存储于运算程序存储部18b的程序，可以将活细胞浓度运算程序、死细胞浓度运算程序和细胞存活率运算程序组装为一个程序而存储。
运算处理部18a通过例如一个CPU或多个并列连接的CPU等处理器来实现。关于利用运算处理部18a的具体处理，后面在实施例中描述。运算处理部18a从运算程序存储部18b读取活细胞浓度运算程序，通过内部总线18e获取从I/O界面18c取得的前向散射光强度，并执行活细胞浓度运算程序。并且，参照校正曲线数据库18d，使用校正曲线(1)求出活细胞悬浮液中的活细胞浓度(CVc)。此外，运算处理部18a从运算程序存储部18b读取死细胞浓度运算程序，通过内部总线18e获取从I/O界面18c取得的透过率T，并执行死细胞浓度运算程序。并且，参照校正曲线数据库18d，使用校正曲线(2)求出活细胞悬浮液中的死细胞浓度(CDc)。进一步，当细胞悬浮液中所含的低活性的活细胞(Sc)的数量无限小、可以无视时，使用上述活细胞浓度(CVc)和死细胞浓度(CDc)求出细胞存活率。
此外，与上述不同的活细胞悬浮液中所含的低活性的活细胞(Sc)包含不能无视的程度的数量时，运算处理部18a在与上述同样地求出活细胞浓度(CVcc)和死细胞浓度(CDc)后，执行以下的处理。运算处理部18a从运算程序存储部18b读取细胞存活率运算程序，通过内部总线18e获取从I/O界面18c取得的侧向散射光强度，并执行细胞存活率运算程序。并且，参照校正曲线数据库18d，使用校正曲线(3)，进一步基于活细胞浓度(CVc)和死细胞浓度(CDc)求出细胞存活率。
如此，控制部18使用由测定部6测量的前向散射光强度、透过率T和/或侧向散射光强度，并且使用预先存储于校正曲线数据库18d中的校正曲线(1)～(3)，求出活细胞悬浮液中的细胞存活率，从而能够不依赖于操作者的熟练度、并且不对培养细胞进行染色、高精度且迅速地执行至少细胞存活率的测量。
予以说明的是，如上所述的本实施方式的细胞培装置1求出活细胞浓度(CVc)和死细胞浓度(CDc)，因此也能够求出活细胞(Vc)数和死细胞(Dc)数。此外，关于低活性的活细胞(Sc)，通过对由前向散射光检测器24所得到的前向散射光强度和由透过率检测器25所得到的透过率T预先设定规定的阈值，从而能够求出低活性的活细胞浓度(CSc)、进一步还有低活性的活细胞(Sc)数。关于阈值的设定，准备预先已知浓度的标准样品，测定前向散射光强度和透过率T，从而得到最适当的阈值。
以下，关于预先存储于校正曲线数据库18d中的校正曲线(1)～(3)，以人大肠癌细胞株(Caco-2细胞)的情况为例进行说明。
<表示活细胞浓度(CVc)与前向散射光强度的关系的校正曲线(1)>
图5为表示Caco-2细胞悬浮液中的活细胞浓度与前向散射光强度的关系的图，为校正曲线(1)的说明图。图5所示的校正曲线(1)是将图3所示的前向散射角度θ设为20°时的校正曲线。
首先，准备Caco-2细胞悬浮液中活细胞(Vc)成为活细胞浓度(CVc)100％的标准试样，进一步准备活细胞浓度(CVc)不同的多个标准试样。并且，将前向散射检测角度θ调整为20°，分别使活细胞浓度(CVc)不同的标准试样流通通过流体单元23内，利用前向散射检测器24测量前向散射光强度。并且，横轴取活细胞浓度(CVc)、纵轴取所测量的前向散射光强度，进行绘制。将绘制得到的各活细胞浓度(CVc)时前向散射光强度的测定值近似为直线，制成图5所示的校正曲线，作为校正曲线(1)存储于图4所示的校正曲线数据库18d中。予以说明的是，这里，将Caco-2细胞的活细胞(Vc)作为标准试样而准备了多个活细胞浓度(CVc)的试样，但不限于此。例如，也可以准备与Caco-2细胞的活细胞(Vc)相同粒径的胶乳粒子，将该胶乳粒子作为标准试样分别以不同浓度混合于细胞培养液，与上述同样地测定前向散射光强度，从而制成校正曲线(1)。
<表示死细胞胞浓度(CDc)与透过率T的关系的校正曲线(2)>
图6为表示Caco-2细胞悬浮液中的各死细胞浓度时来自光源的照射光的波长与透过率T的关系的光谱图。
首先，将Caco-2细胞导入培养容器，收集不粘接于培养容器的底面而漂浮于细胞培养液中的细胞，搅拌后静置10分钟。然后，在液面附近进行分取，利用细胞计数器测定分取的细胞，得到83％为粒径约5μm的死细胞(Dc)。使用该死细胞(Dc)，按照死细胞浓度(CDc)为1.5～6.0×105细胞/mL、活细胞浓度(CVc)为1.8×106细胞/mL的方式调制细胞悬浮液标准试样，测定各死细胞浓度(CDc)时的透过率T光谱。其结果是如图6所示，横轴取来自光源的照射光的波长、纵轴取透过率T，得到死细胞浓度(CDc)为0细胞/mL、1.5×105细胞/mL、3.0×105细胞/mL、和6.0×105细胞/mL时的光谱。
如图6的光谱图所示，在波长400nm以下的波长区域和450～600nm的波长区域中，在任一死细胞浓度(CDc)试样中，透过率T均大幅减少。这是因为，波长400nm以下时，发生由细胞质带来的吸收，此外在450～600nm的波长区域，发生由上述那样的pH指示剂的添加导致细胞培养液的着色而带来的吸收。在该波长区域以外，作为能够测定变黑的细胞、即死细胞(Dc)带来的照射光的吸收的波长区域，优选为650～750nm的最适波长区域Δλ。将求出该最适波长区域Δλ内的波长700nm时的透过率T的结果示于以下的表1。
[表1]
如表1所示，活细胞悬浮液中的死细胞浓度(CDc)为0细胞/mL时，得到透过率T为100.6％，死细胞浓度(CDc)为1.5×105细胞/mL时，得到透过率T为96.5％，死细胞浓度(CDc)为3.0×105细胞/mL时，得到透过率T为93.8％，死细胞浓度(CDc)为6.0×105细胞/mL时，得到透过率T为89.3％。由此，将死细胞浓度(CDc)为0细胞/mL的试样(细胞培养液等)流通通过流体单元23，利用透过率检测器25预先测定透过率T，将该测定值作为基线存储于存储部(未图示)，从而得到照射光波长700nm时的各活细胞悬浮液中的死细胞浓度(CDc)时透过率T的测量值与基线的差分，能够将由活细胞悬浮液中的死细胞(Dc)带来的透过率T的减少进行输出。
图7表示Caco-2培养基中的死细胞浓度(CDc)与透过率T的关系。此外，图8表示Caco-2活细胞悬浮液中的死细胞浓度(CDc)与透过率T的关系。在图7和图8的任一者中，如上所述，将照射光的波长设为700nm，将死细胞浓度(CDc)为0细胞/mL的标准试样的透过率T作为基线，求出与各死细胞浓度(CDc)的标准试样的透过率T的差分，制成校正曲线。确认到，培养基中的校正曲线和活细胞悬浮液中的校正曲线的斜率相同，不受到活细胞悬浮液的影响，随着黑色的死细胞(Dc)的个数增加，透过率T衰减。由此，将图8所示的表示死细胞浓度(CDc)与透过率T的关系的校正曲线作为校正曲线(2)存储于图4所示的校正曲线数据库18d中。予以说明的是，这里，将Caco-2细胞的死细胞(Dc)作为标准试样而准备了多个死细胞浓度(CDc)的试样，但不限于此。例如，也可以准备与Caco-2细胞的死细胞(Dc)相同粒径的黑色粒子，将该黑色粒子作为标准试样分别以不同的浓度混合于细胞培养液，与上述同样地测定透过率T，从而制成校正曲线(2)。这里，作为黑色粒子，可使用例如磁性粒子、碳黑等。
<表示细胞存活率与侧向散射光强度的关系的校正曲线(3)>
图9为表示Caco-2细胞悬浮液中的细胞培养液和各细胞存活率时来自光源的照射光的波长与侧向散射光强度的关系的光谱图。
首先，作为活细胞悬浮液标准试样，调制细胞存活率0％、即仅细胞培养液的(空白：blank)的标准试样、细胞存活率25％、细胞存活率40％、细胞存活率70％的细胞悬浮液标准试样。并且，使该各细胞存活率的细胞悬浮液标准试样流通通过流体单元23内，利用侧向散射光检测器26测定侧向散射光检测强度。其结果是如图9所示，横轴取来自光源的照射光的波长、纵轴取侧向散射光强度，得到细胞存活率为0％(仅细胞培养液)、25％、40％、70％时的光谱。
如图9的侧向散射光光谱图所示，在紫外区域(230nm～310nm附近)，针对每种细胞存活率，相对于照射光的波长的侧向散射光强度发生不同。但是，在紫外区域外，针对每种细胞存活率的侧向散射光强度没有不同，在此无法识别各细胞存活率。这是因为，如果接近如上所述的可见光区域的波长，则受到细胞培养液的颜色的影响。因此，依赖于细胞内粒子的侧向散射光优选在紫外区域的短波长侧进行测量。将波长280nm时侧向散射光强度的测定结果示于以下的表2。
[表2]
如表2所示，活细胞悬浮液中的细胞存活率为0％时，得到侧向散射光强度为17.48，细胞存活率为25％时，得到侧向散射光强度为19.76，细胞存活率为40％时，得到侧向散射光强度为24.31，细胞存活率为70％时，得到侧向散射光强度为32.85％。由此，仅使细胞培养液流通通过(细胞存活率：0％)流体单元23，利用侧向散射光检测器26预先测定侧向散射光强度，将该测定值作为基线存储于存储部(未图示)。并且，通过得到照射光波长280nm时的各活细胞悬浮液中的细胞存活率时侧向散射光强度与基线的差分，从而能够将活细胞悬浮液中的细胞存活率的增加部分进行输出。予以说明的是，不必须限于输出相对于基线的差分(增加部分)的构成，也可以是输出由侧向散射光检测器26测定的侧向散射光强度本身的构成。
图10表示Caco-2活细胞悬浮液中的细胞存活率与侧向散射光强度的关系。如上所述，将照射光的波长设为280nm，将细胞存活率为0％(仅细胞培养液)的标准试样的侧向散射光强度作为基线，求出与各细胞存活率的标准试样的侧向散射光强度的差分，制成校正曲线，作为校正曲线(3)存储于图4所示的校正曲线数据库18d中。予以说明的是，如图10所示，可确认侧向散射光强度与细胞存活率成比例。
如上所述，根据本实施方式的细胞测量机构16和细胞培养装置1，能够不依赖于操作者的熟练度、并且不对培养细胞进行染色、高精度且迅速地执行至少细胞存活率的测量。
此外，除了细胞存活率之外，还能够求出活细胞浓度(CVc)、死细胞浓度(CDc)、活细胞(Vc)数和死细胞(Dc)数。此外进一步，对于低活性的活细胞(Sc)也同样地能够求出低活性的活细胞浓度(CSc)和低活性的活细胞(Sc)数。
以下，使用附图对本发明的实施例进行说明。
实施例1
本实施例的细胞培养装置1与上述图1所示的构成同样，构成细胞测量机构16的测定部6与上述图3所示的构成同样，此外，控制部18的构成与上述图4所示的构成同样，省略重复的说明。予以说明的是，以下，将控制部18与细胞测量机构16协同工作，具有基于所测量的前向散射光强度、透过率和侧向散射光强度、通过运算求出细胞悬浮液中的细胞存活率等的功能的情况作为一个例子进行说明，但不限于此，例如可以在细胞测量机构16内设置具有上述功能的控制运算部，此外，还可以设为在后述的测定部6中配设控制运算部的构成。
此外，以下，作为培养细胞，以人大肠癌细胞株(Caco-2细胞)为例，以预先将与图3所示的光源22的光轴所成的角、即前向散射检测角度θ调整为20°并测定的情况为例进行说明。予以说明的是，如上所述，前向散射检测角度θ依赖于细胞种类的活细胞(Vc)的粒径。Caco-2细胞以外的其他细胞种类的测定中最适当的前向散射检测角度θ可调整至约5°～45°的范围内。
图11中表示利用本实施例的细胞测量机构16的细胞存活率计算处理的流程图。首先，图4所示的运算处理部18a从运算程序存储部18b通过内部总线18e读取活细胞浓度运算程序和死细胞浓度运算程序(步骤S101)。
步骤S102中，运算处理部18a通过I/O界面18c和内部总线18e获取由构成测定部6的前向散射光检测器24测定的前向散射光检测强度。这里，获取的前向散射光检测强度为利用扩增培养机构15进行培养和增殖，使含有剥离后的Caco-2细胞的活细胞悬浮液流通通过流体单元23内，利用来自光源22的照射光而向前向散射的前向散射光的强度。
步骤S103中，运算处理部18a接入校正曲线数据库18d，参照图5所示的表示Caco-2细胞悬浮液中的活细胞浓度(CVc)与前向散射光强度的关系的校正曲线(1)。运算处理部18a利用该校正曲线(1)提取出与测定的前向散射光强度相对应的活细胞浓度(CVc)，从而进行活细胞浓度(CVc)的计算(步骤S104)。
接下来，在步骤S105中，运算处理部18a通过I/O界面18c和内部总线18e获取由构成测定部6的透过率检测器25测定的透过率T。并且，运算处理部18a再次接入校正曲线数据库18d，参照图8所示的表示Caco-2细胞悬浮液中的死细胞浓度(CDc)与透过率T的关系的校正曲线(2)(步骤S106)。运算处理部18a利用该校正曲线(2)提取与测定的透过率T相对应的死细胞浓度(CDc)，进行该死细胞浓度(CDc)的计算(步骤S107)。予以说明的是，前向散射光强度是相对的信号，与此相对，透过率T是可以作为绝对值处理的信号。对此，与上述校正曲线(2)的制成时同样地，在测定时也预先仅使细胞培养液(与细胞存活率0％等同)流通通过流体单元23，将此时测定的透过率T作为基线而存储。并且，设定为将活细胞悬浮液向流体单元23流通时所得到的透过率T与基线的差分、即透过率T的减少进行输出的构成。换言之，这是因为，由透过率检测器24得到的透过率T是根据参考光进行背景修正(背景的噪声去除)后的信号。
步骤S108中，运算处理部18a使用由步骤S104得到的活细胞浓度(CVc)和由步骤S107得到的死细胞浓度(CDc)，计算(CVc/(CVc+CDc))，求出Caco-2细胞悬浮液中的细胞存活率。
予以说明的是，本实施例中，作为培养细胞的Caco-2细胞的剪切力(SheerStress)强，容易维持高细胞存活率，并且，是由剪切力带来的活性降低的影响小的细胞，因此，Caco-2细胞悬浮液中的活细胞浓度(CVc)、死细胞浓度(CDc)和低活性的活细胞浓度(CSc)可以推定为以下的关系。
低活性的活细胞浓度(CSc)<<(CVc+CSc+CDc)
CDc≈(CSc+CDc)
如上所述，本实施例中，基于通过用光源对活细胞悬浮液进行照射光的照射而得得到的前向散射光检测强度和透过率，可以获得活细胞悬浮液中以未知的浓度而含有的活细胞、即细胞存活率。予以说明的是，除了细胞存活率以外，还能够得到活细胞浓度(CVc)、死细胞浓度(CDc)、活细胞(Vc)数和死细胞(Dc)数。
根据本实施例，能够不依赖于操作者的熟练度、并且不对培养细胞进行染色、高精度且迅速地执行至少细胞存活率的测量。
此外，根据本实施例，为取得基线修正后的透过光的构成，利用简易的测定部的构成，能够得到与双光束分光光度计同样的测量精度。
实施例2
图12为表示作为本发明的另一实施例的实施例2的细胞存活率计算流程图。本实施例中，在细胞存活率的计算中，使用由构成测定部6的侧向散射光检测器26测定的侧向散射光强度，在这一点上与实施例1不同。以下，对于与实施例1同样的构成，省略其说明。
如图12所示，步骤S101中，运算处理部18a通过内部总线18e从运算程序存储部18b读取活细胞浓度运算程序和死细胞浓度运算程序，此外进一步还读取细胞存活率运算程序。此后的步骤S102直至步骤S107为止，与实施例1同样地执行。
通过步骤S107进行死细胞浓度(CDc)计算后，运算处理部18a通过I/O界面18c和内部总线18e读取由构成测定部6的侧向散射光检测器26测定的侧向散射光强度(步骤S109)。
步骤S110中，运算处理部18a接入校正曲线数据库18d，参照图10所示的表示Caco-2细胞悬浮液中的细胞存活率与侧向散射光强度的关系的校正曲线(3)。
步骤S111中，运算处理部18a使用由步骤S104得到的活细胞浓度(CVc)和由步骤S107得到的死细胞浓度(CDc)，对参照的校正曲线(3)的y截距进行修正。具体而言，预先使用实际试样的细胞种类(这里为Caco-2细胞)，准备细胞存活率约100％的细胞悬浮液。并且，利用前向散射光检测器24和侧向散射光检测器26测定并求出该细胞悬浮液中的活细胞浓度(CVc)与侧向散射光强度的关系。予以说明的是，细胞存活率约100％的细胞悬浮液可以通过离心分离操作而将悬浮液中的废物、小的死细胞除去而得到。但是，关于再生医疗、细胞治疗所使用的样本、株化了的初代培养细胞等，根据细胞种类，在细胞剥离操作、离心分离操作的过程中容易受到损伤、细胞活性降低，无法维持细胞存活率约100％。这种情况下，求出细胞剥离、离心分离操作中所得到的细胞悬浮液的平均最大细胞存活率。例如，就人口腔粘膜上皮细胞而言，最大细胞存活率为85～90％左右。求出最大细胞存活率时活细胞浓度(CVc)与侧向散射光强度的关系，存储于存储部。使用该最大细胞存活率时活细胞浓度(CVc)与侧向散射光强度的关系，由步骤S104和步骤S107得到的活细胞浓度(CVc)和死细胞浓度(CDc)来求出最大细胞存活率时的侧向散射光强度。使用该求出的侧向散射光强度的值，对校正曲线(3)的y截距进行修正。
接下来，步骤S112中，运算处理部18a使用修正后的校正曲线(3)来提取与测定的侧向散射光强度相对应的细胞存活率，从而进行细胞存活率的计算(步骤S112)。予以说明的是，将由步骤S111修正了y截距的校正曲线(3)代替校正曲线数据库18d中已经存储的校正曲线(3)而进行存储。也就是说，更新为修正后的校正曲线(3)并存储。
本实施例中也与实施例1同样地，作为培养细胞的Caco-2细胞的剪切力(SheerStress)强，容易维持高细胞存活率，并且，是由剪切力带来的活性降低的影响小的细胞，因此，Caco-2细胞悬浮液中的活细胞浓度(CVc)、死细胞浓度(CDc)和低活性的活细胞浓度(CSc)推定为以下的关系。
低活性的活细胞浓度(CSc)<<(CVc+CSc+CDc)
CDc≈(CSc+CDc)
根据本实施例，除了实施例1的效果之外，通过修正校正曲线(3)并计算细胞存活率，能够进一步高精度地测量细胞存活率。
实施例3
图13表示作为本发明的另一实施例的实施例3的细胞存活率计算流程图。实施例1和实施例2中，对于活细胞悬浮液中的低活性的活细胞浓度(CSc)为低到可以无视的情况、即可以为设想CDc≈(CSc+CDc)的情况进行了说明。本实施例中，对不设想为CDc≈(CSc+CDc)时活细胞悬浮液中的细胞存活率进行计算，在这一点上与实施例1和实施例2不同。以下，对于实施例1和实施例2同样的构成，省略其说明。
一般而言，活细胞悬浮液试样中的低活性的活细胞(Sc)的粒径比活细胞(Vc)的粒径小，比死细胞(Dc)的粒径大。因此，即使假设低活性的活细胞(Sc)的粒径与死细胞(Dc)的粒径基本相同，对于为了计算活细胞浓度(CVc)而使用的校正曲线(1)也没有影响。但是，假设与活细胞(Vc)的粒径接近的大小的低活性的活细胞(Sc)大量存在于活细胞悬浮液中时，对校正曲线(1)的斜率产生影响。
如图13所示，运算处理部18a与上述的实施例1同样地执行步骤S101直至步骤S107为止。然后，运算处理部18a利用由步骤S104得到的活细胞浓度(CVc)和由步骤S107得到的死细胞浓度(CDc)，计算低活性的活细胞浓度(CSc)和总细胞数，即活细胞(Vc)数+死细胞(Dc)数+低活性的活细胞(Sc)数(步骤S201)。
步骤S202中，运算处理部18a计算以下内容(步骤S202)。
((CVc+CSc+CDc)-CDc)/(CVc+CSc+CDc)
并且，比较上述计算结果与CVc/(CVc+CDc)(与图11所示的步骤S108同样)。比较结果大幅不同，从而判明与活细胞(Vc)的粒径接近的大小的低活性的活细胞(Sc)大量存在于活细胞悬浮液中。此外，由步骤S104可知，使用校正曲线(1)计算的活细胞浓度(CVc)不是正常值。在此，进入用于修正校正曲线(1)的处理。
首先，步骤S203中，将活细胞悬浮液放置一定时间(Δt)。在该Δt的期间，低活性的活细胞(Sc)的一部分成为死细胞(Dc)，低活性的活细胞(Sc)数从Δt放置前的时刻tA时的个数减少到Δt经过后的时刻tB时的个数。此外，死细胞(Dc)数从Δt放置前的时刻tA时的个数增加到Δt经过后的时刻tB时的个数。
步骤S204中，运算处理部18a将从侧向散射光强度得到的细胞存活率作为x轴，将由透过率T得到的细胞存活率作为y轴，对时刻tA和时刻tB的各细胞存活率进行绘制。关于将这些被绘制的两点间连接的直线的斜率，假设当低活性的活细胞浓度(CSc)为“0”时，直线的斜率成为“1”。但是，实际的直线的斜率从“1”背离。因此，计算由低活性的活细胞(Sc)产生的这种背离、即直线的斜率的差分，作为偏差。
步骤S205中，运算处理部18a使用步骤S204中求出的偏差，对存储于校正曲线数据库18d的校正曲线(1)进行修正，使用修正后的校正曲线(1)，再次提取出与测定的前向散射光强度相对应的活细胞浓度(CVc)，从而计算活细胞浓度(CVc)。予以说明的是，将由步骤S205修正的校正曲线(1)代替校正曲线数据库18d中已经存储的校正曲线(1)而进行存储。也就是说，更新为修正后的校正曲线(1)并存储。
步骤S206中，基于由步骤S205计算的活细胞浓度(CVc)和由步骤S107得到的死细胞浓度(CDc)，通过以下来计算细胞存活率。
(CVc+CSc)/(CVc+CSc+CDc)
根据本实施例，除了实施例1的效果之外，即使在活细胞悬浮液中大量存在低活性的活细胞(Sc)时，也能高精度地求出细胞存活率。
予以说明的是，可设为如下的构成：代替本实施例的步骤S205，基于由步骤S204得到的偏差，改变前向散射检测角度θ，按照与存储于校正曲线数据库18d的校正曲线(1)的斜率一致的方式，调整前向散射光检测器24的配置位置。
此外，预先准备与活细胞(Vc)的粒径小的胶乳粒子，将该胶乳粒子作为近似的低活性的活细胞(Sc)，添加至校正曲线(1)的制成时所使用的标准试样。并且，求出对于作为存储于校正曲线数据库18d的校正曲线(1)的、活细胞浓度(CVc)与前向散射光强度的关系所带来的影响。并且，制成向标准试样添加了浓度不同的胶乳粒子时的校正曲线，重新存储至校正曲线数据库18d，从而在活细胞悬浮液中大量存在低活性的活细胞(Sc)时，可以作为活细胞浓度(CVc)的计算所使用的校正曲线。在该情况下，所使用的胶乳粒子的粒径优选设为活细胞(Vc)的粒径±数μm，即使最低也优选使用一种以上粒径的胶乳粒子。
实施例1至实施例3中，作为培养细胞的一个例子，示出了Caco-2细胞，但在培养其他细胞种类、例如NIH/3T3细胞、人口腔粘膜上皮细胞、人骨骼肌成肌细胞、人骨髓间充质干细胞或人软骨细胞等各种细胞时也同样可以适用。
予以说明的是，本发明不限定于上述实施例，还包含各种变形例。例如，上述实施例是为了易懂地说明本发明而详细说明的实施例，并不必限定为具备所说明的全部构成。此外，某一实施例的构成的一部分可以被替换成另一实施例的构成，此外，可以在某一实施例的构成中加入另一实施例的构成。此外，对于各实施例的构成的一部分，可以进行另一实施例的构成的追加、删除、替换。
符号说明
1：细胞培养装置；2：扩增培养容器；3：培养液供给部；4：试样导入部；5：分散部；6：测定部；7：挤压泵；8：三通阀；9：细胞接种试样调制部；10：细胞供给部；11：细胞洗涤溶液供给部；12：细胞剥离溶液供给部；13：细胞剥离溶液抑制剂供给部；14：废液；15：扩增培养机构；16：细胞测量机构；17：细胞接种机构；18：控制部；18a：运算处理部；18b：运算程序存储部；18c：I/O界面；18d：校正曲线数据库(DB)；18e：内部总线；19：活细胞；20：低活性活细胞；21：死细胞；22：光源；23：流体单元；24：前向散射光检测器；25：透过率检测器；26：侧向散射光检测器。
Claims (15)
1.一种细胞测量机构，其特征在于，具有：
使细胞悬浮液流通的流路，
将所述流路内的细胞悬浮液进行输送的液体驱动部，以及
运算部，基于从光源向在所述流路内流动中的细胞悬浮液进行照射光的照射所得到的前向散射光强度以及透过率和/或侧向散射光强度，求出至少所述细胞悬浮液中的细胞存活率。
2.根据权利要求1所述的细胞测量机构，其特征在于，所述运算部具有校正曲线数据库，所述校正曲线数据库预先存储：表示活细胞浓度与所述前向散射光强度的关系的第一校正曲线，表示死细胞浓度与所述透过率的关系的第二校正曲线，以及表示细胞存活率与所述侧向散射光强度的关系的第三校正曲线。
3.根据权利要求2所述的细胞测量机构，其特征在于，具备测定部，所述测定部具有：
流通所述细胞悬浮液的流体单元，
按照与在所述流体单元中流通的细胞悬浮液的流动方向正交的方式配设的光源，
隔着所述流体单元而与所述光源相对置、配设在来自所述光源的照射光的光轴上的透过率检测器，
在所述透过率检测器侧、根据所述活细胞的粒径相对于所述照射光的光轴具有所规定的角度而配设的前向散射光检测器，以及
按照与所述细胞悬浮液的流动方向和所述照射光的光轴这二者正交的方式配设的侧向散射光检测器。
4.根据权利要求3所述的细胞测量机构，其特征在于，
所述运算部基于由所述前向散射光检测器测定的前向散射光强度和所述第一校正曲线，求出所述细胞悬浮液中的活细胞浓度，
基于由所述透过率检测器测定的透过率和所述第二校正曲线，求出所述细胞悬浮液中的死细胞浓度，
基于所述求出的活细胞浓度和死细胞浓度，求出所述细胞悬浮液中的细胞存活率。
5.根据权利要求3所述的细胞测量机构，其特征在于，
所述前向散射光检测器配设于相对于所述照射光的光轴为约5°～45°的角度范围内，
所述运算部基于由所述前向散射光检测器测定的前向散射光强度和所述第一校正曲线，求出所述细胞悬浮液中的活细胞浓度或活细胞数。
6.根据权利要求3所述的细胞测量机构，其特征在于，
将仅细胞培养液在所述流体单元流通时测定的透过率作为基线预先存储，将在所述细胞培养液中包含培养细胞的所述细胞悬浮液在所述流体单元流通时测定的透过率作为与所述基线的差分而输出。
7.根据权利要求3所述的细胞测量机构，其特征在于，
所述运算部基于由所述前向散射光检测器测定的前向散射光强度和所述第一校正曲线，求出所述细胞悬浮液中的活细胞浓度，
基于由所述透过率检测器测定的透过率和所述第二校正曲线，求出所述死细胞浓度，
基于所述求出的活细胞浓度和死细胞浓度，修正所述第三校正曲线，并且
基于修正后的第三校正曲线和由所述侧向散射光检测器测定的侧向散射光强度，求出所述细胞悬浮液中的细胞存活率。
8.一种细胞培养装置，其特征在于，具备：
培养细胞并使细胞增殖、并将增殖的细胞剥离的扩增培养机构；以及
细胞测量机构，该细胞测量机构具有：
使含有由所述扩增培养机构剥离的细胞的细胞悬浮液流通的流路；
将所述流路内的细胞悬浮液进行输送的液体驱动部；以及
运算部，该运算部基于从光源向在所述流路内流动中的细胞悬浮液进行照射光的照射所得到的前向散射光强度以及透过率和/或侧向散射光强度，计算至少所述细胞悬浮液中的细胞存活率。
9.根据权利要求8所述的细胞培养装置，其特征在于，
所述运算部具有校正曲线数据库，所述校正曲线数据库预先存储：表示活细胞浓度与所述前向散射光强度的关系的第一校正曲线，表示死细胞浓度与所述透过率的关系的第二校正曲线，以及表示细胞存活率与所述侧向散射光强度的关系的第三校正曲线。
10.根据权利要求9所述的细胞培养装置，其特征在于，
所述细胞测量机构具备测定部，所述测定部具有：
流通所述细胞悬浮液的流体单元，
按照与在所述流体单元中流通的细胞悬浮液的流动方向正交的方式配设的光源，
隔着所述流体单元而与所述光源相对置、配设在来自所述光源的照射光的光轴上的透过率检测器，
在所述透过率检测器侧、根据所述活细胞的粒径相对于所述照射光的光轴具有所规定的角度而配设的前向散射光检测器，以及
按照与所述细胞悬浮液的流动方向和所述照射光的光轴这两者正交的方式配设的侧向散射光检测器。
11.根据权利要求10所述的细胞培养装置，其特征在于，
所述前向散射光检测器配设于相对于所述照射光的光轴为约5°～45°的角度范围内，
所述运算部基于由所述前向散射光检测器测定的前向散射光强度和所述第一校正曲线，求出所述细胞悬浮液中的活细胞浓度或活细胞数。
12.根据权利要求10所述的细胞培养装置，其特征在于，
将仅细胞培养液在所述流体单元流通时测定的透过率作为基线预先存储，将在所述细胞培养液中包含培养细胞的所述细胞悬浮液在所述流体单元流通时测定的透过率作为与所述基线的差分而输出。
13.根据权利要求10所述的细胞培养装置，其特征在于，
所述运算部基于由所述前向散射光检测器测定的前向散射光强度和所述第一校正曲线，求出所述细胞悬浮液中的活细胞浓度，
基于由所述透过率检测器测定的透过率和所述第二校正曲线，求出所述死细胞浓度，
基于所述求出的活细胞浓度和死细胞浓度，修正所述第三校正曲线，并且
基于修正后的第三校正曲线和由所述侧向散射光检测器测定的侧向散射光强度，求出所述细胞悬浮液中的细胞存活率。
14.一种细胞测量方法，其特征在于，是求出细胞悬浮液中的至少细胞存活率的细胞测量方法，具有下述工序：
对于在流体单元内流通的细胞悬浮液，由光源从与所述细胞悬浮液的流动正交的方向进行照射光的照射的工序，
对从所述细胞悬浮液散射的前向散射光强度进行测定的工序，
对透过所述细胞悬浮液的所述照射光的透过率进行测定的工序，
基于所述测定的前向散射光强度和预先储存的表示活细胞浓度与所述前向散射光强度的关系的第一校正曲线，求出所述细胞悬浮液中的活细胞浓度的工序，
基于所述测定的所述透过率和预先储存的表示死细胞浓度与所述透过率的关系的第二校正曲线，求出所述细胞悬浮液中的死细胞浓度的工序，以及
基于所述求出的活细胞浓度和死细胞浓度，求出所述细胞悬浮液中的细胞存活率的工序。
15.根据权利要求14所述的细胞测量方法，其特征在于，进一步具备下述工序：
对从所述细胞悬浮液向与所述照射光的光轴和所述细胞悬浮液的流动方向正交的方向散射的侧向散射光强度进行测定的工序，
基于所述求出的活细胞浓度和死细胞浓度，对预先储存的表示细胞存活率与所述侧向散射光强度的关系的第三校正曲线进行修正的工序，以及
基于所述修正的第三校正曲线和所述侧向散射光强度，求出所述细胞悬浮液中的细胞存活率的工序。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2014/078033 WO2016063364A1 (ja) | 2014-10-22 | 2014-10-22 | 細胞計測機構及びそれを有する細胞培養装置並びに細胞計測方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107075437A true CN107075437A (zh) | 2017-08-18 |
| CN107075437B CN107075437B (zh) | 2019-12-03 |
Family
ID=55760437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201480082245.1A Active CN107075437B (zh) | 2014-10-22 | 2014-10-22 | 细胞测量机构和具有该细胞测量机构的细胞培养装置以及细胞测量方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10456767B2 (zh) |
| JP (1) | JP6367351B2 (zh) |
| CN (1) | CN107075437B (zh) |
| WO (1) | WO2016063364A1 (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108318436A (zh) * | 2018-02-06 | 2018-07-24 | 迈克医疗电子有限公司 | 反应曲线生成方法、装置及光学检测系统 |
| CN108728344A (zh) * | 2017-04-19 | 2018-11-02 | 阿自倍尔株式会社 | 细胞生存率判定装置以及细胞生存率判定方法 |
| CN107075437B (zh) * | 2014-10-22 | 2019-12-03 | 株式会社日立高新技术 | 细胞测量机构和具有该细胞测量机构的细胞培养装置以及细胞测量方法 |
| CN114514309A (zh) * | 2019-09-26 | 2022-05-17 | 京瓷株式会社 | 细胞检测装置和细胞检测方法 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018183088A (ja) * | 2017-04-26 | 2018-11-22 | アズビル株式会社 | 細胞生存率判定装置 |
| US11187661B2 (en) * | 2017-07-05 | 2021-11-30 | Saudi Arabian Oil Company | Detecting black powder levels in flow-lines |
| EP3505613B1 (en) * | 2017-12-27 | 2024-07-03 | Industrial Technology Research Institute | Cell culture module, cell culture system and cell culture method |
| JP2021040575A (ja) * | 2019-09-12 | 2021-03-18 | シンフォニアテクノロジー株式会社 | 細胞培養装置 |
| US11268891B2 (en) * | 2020-06-17 | 2022-03-08 | Kidde Technologies, Inc. | Fire extinguishing agent concentration measuring system and method |
| US20220347352A1 (en) * | 2021-04-30 | 2022-11-03 | Avita Medical, Inc. | Cell suspension composition with therapeutic potential and related methods and systems for identifying same |
| WO2023022091A1 (ja) * | 2021-08-16 | 2023-02-23 | 株式会社ニコン | 解析システム、観察容器、解析方法およびプログラム |
| US20240085306A1 (en) * | 2021-09-29 | 2024-03-14 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method for enriching cells or cell nuclei |
| JP2023130916A (ja) * | 2022-03-08 | 2023-09-21 | キヤノン株式会社 | 培養装置、細胞密度測定装置、および細胞密度測定方法 |
| WO2023189395A1 (ja) * | 2022-03-28 | 2023-10-05 | テルモ株式会社 | 細胞培養装置及び校正方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5445939A (en) * | 1986-08-12 | 1995-08-29 | Anderson; Jeffrey E. | Method for assessment of the mononuclear leukocyte immune system |
| US5812419A (en) * | 1994-08-01 | 1998-09-22 | Abbott Laboratories | Fully automated analysis method with optical system for blood cell analyzer |
| JP2012143231A (ja) * | 2010-12-22 | 2012-08-02 | Toyama Univ | 非球体細胞の生死活性判定方法及び判定装置 |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH549796A (de) * | 1971-03-29 | 1974-05-31 | Sigrist Willy | Verfahren zur messung von in einer fluessigkeit suspendierten stoffen und einrichtung zur ausfuehrung des verfahrens. |
| US4286876A (en) * | 1979-01-02 | 1981-09-01 | Coulter Electronics, Inc. | Apparatus and method for measuring scattering of light in particle detection systems |
| US4595291A (en) * | 1982-10-15 | 1986-06-17 | Tokyo Shibaura Denki Kabushiki Kaisha | Particle diameter measuring device |
| US4676641A (en) * | 1986-01-08 | 1987-06-30 | Coulter Electronics Of New England, Inc. | System for measuring the size distribution of particles dispersed in a fluid |
| JP2635126B2 (ja) * | 1988-09-30 | 1997-07-30 | 東亜医用電子株式会社 | 核の分葉指数を求めるための粒子分析装置及び方法 |
| US4953978A (en) * | 1989-03-03 | 1990-09-04 | Coulter Electronics Of New England, Inc. | Particle size analysis utilizing polarization intensity differential scattering |
| US4981580A (en) * | 1989-05-01 | 1991-01-01 | Coulter Corporation | Coincidence arbitration in a flow cytomery sorting system |
| GB9818348D0 (en) * | 1998-08-22 | 1998-10-14 | Malvern Instr Ltd | Improvements relating to the measurement of particle size distribution |
| JP3393817B2 (ja) * | 1998-10-16 | 2003-04-07 | 株式会社堀場製作所 | 粒径分布測定装置 |
| US6507400B1 (en) * | 1999-02-27 | 2003-01-14 | Mwi, Inc. | Optical system for multi-part differential particle discrimination and an apparatus using the same |
| US6646742B1 (en) * | 2000-02-19 | 2003-11-11 | Mwi, Inc. | Optical device and method for multi-angle laser light scatter |
| US6859276B2 (en) * | 2003-01-24 | 2005-02-22 | Coulter International Corp. | Extracted polarization intensity differential scattering for particle characterization |
| EP2306174B1 (en) * | 2003-03-28 | 2016-05-11 | Inguran, LLC | Flow cytometry nozzle for orienting particles and corresponding method |
| WO2005022147A1 (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-10 | Celula, Inc. | Methods and apparatus for sorting cells using an optical switch in a microfluidic channel network |
| US8634072B2 (en) * | 2004-03-06 | 2014-01-21 | Michael Trainer | Methods and apparatus for determining characteristics of particles |
| JP4047336B2 (ja) * | 2005-02-08 | 2008-02-13 | 独立行政法人科学技術振興機構 | ゲル電極付セルソーターチップ |
| EP2181317B1 (en) * | 2007-08-15 | 2012-12-05 | Malvern Instruments Ltd | Broad-range spectrometer |
| US8942458B2 (en) | 2008-06-27 | 2015-01-27 | Furukawa Electric Co., Ltd. | Method for distinguishing and sorting of cells and device therefor |
| US8603773B2 (en) * | 2008-09-19 | 2013-12-10 | Beckman Coulter | Method and system for analyzing a blood sample |
| CN102323191B (zh) * | 2008-09-26 | 2013-11-06 | 株式会社堀场制作所 | 颗粒物性测量装置 |
| US8456635B2 (en) * | 2008-10-24 | 2013-06-04 | University Of Notre Dame Du Lac | Methods and apparatus to obtain suspended particle information |
| JP5871792B2 (ja) | 2009-04-27 | 2016-03-01 | アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ | 自動血液分析器において、レーザーからの前方散乱を用いることによる、赤血球細胞を白血球細胞から判別する方法 |
| US9001200B2 (en) | 2010-01-12 | 2015-04-07 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Cell characterization using multiple focus planes |
| GB2494733A (en) * | 2011-09-14 | 2013-03-20 | Malvern Instr Ltd | Measuring particle size distribution by light scattering |
| WO2014034275A1 (ja) * | 2012-08-30 | 2014-03-06 | 株式会社 日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析装置 |
| JP2014148636A (ja) * | 2013-02-04 | 2014-08-21 | Polyplastics Co | 樹脂組成物及びインサート成形品 |
| WO2016013394A1 (ja) * | 2014-07-22 | 2016-01-28 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 細胞数濃度調整装置およびそれを用いた自動継代培養システム |
| JP6367351B2 (ja) * | 2014-10-22 | 2018-08-08 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 細胞計測機構及びそれを有する細胞培養装置並びに細胞計測方法 |
-
2014
- 2014-10-22 JP JP2016554992A patent/JP6367351B2/ja active Active
- 2014-10-22 CN CN201480082245.1A patent/CN107075437B/zh active Active
- 2014-10-22 US US15/518,041 patent/US10456767B2/en active Active
- 2014-10-22 WO PCT/JP2014/078033 patent/WO2016063364A1/ja active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5445939A (en) * | 1986-08-12 | 1995-08-29 | Anderson; Jeffrey E. | Method for assessment of the mononuclear leukocyte immune system |
| US5812419A (en) * | 1994-08-01 | 1998-09-22 | Abbott Laboratories | Fully automated analysis method with optical system for blood cell analyzer |
| JP2012143231A (ja) * | 2010-12-22 | 2012-08-02 | Toyama Univ | 非球体細胞の生死活性判定方法及び判定装置 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107075437B (zh) * | 2014-10-22 | 2019-12-03 | 株式会社日立高新技术 | 细胞测量机构和具有该细胞测量机构的细胞培养装置以及细胞测量方法 |
| CN108728344A (zh) * | 2017-04-19 | 2018-11-02 | 阿自倍尔株式会社 | 细胞生存率判定装置以及细胞生存率判定方法 |
| CN108318436A (zh) * | 2018-02-06 | 2018-07-24 | 迈克医疗电子有限公司 | 反应曲线生成方法、装置及光学检测系统 |
| CN114514309A (zh) * | 2019-09-26 | 2022-05-17 | 京瓷株式会社 | 细胞检测装置和细胞检测方法 |
| CN114514309B (zh) * | 2019-09-26 | 2024-05-24 | 京瓷株式会社 | 细胞检测装置和细胞检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20170306287A1 (en) | 2017-10-26 |
| JP6367351B2 (ja) | 2018-08-08 |
| US10456767B2 (en) | 2019-10-29 |
| CN107075437B (zh) | 2019-12-03 |
| WO2016063364A1 (ja) | 2016-04-28 |
| JPWO2016063364A1 (ja) | 2017-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107075437B (zh) | 细胞测量机构和具有该细胞测量机构的细胞培养装置以及细胞测量方法 | |
| AU2017263807B2 (en) | Performing optical measurements on a sample | |
| US10677727B2 (en) | Scattered light integrating collector | |
| AU2007275926B2 (en) | Enumeration of thrombocytes | |
| CN108693100B (zh) | 流式细胞仪及粒子的检出方法 | |
| Boffi et al. | KCC2-dependent steady-state intracellular chloride concentration and pH in cortical layer 2/3 neurons of anesthetized and awake mice | |
| US9206462B2 (en) | Device for bacteria classification and pretreatment device for bacteria test | |
| CN104020282B (zh) | 尿分析装置、样本分析方法及尿分析装置用控制系统 | |
| EP2401355A1 (en) | Method for the bacteriological investigation of a biological sample and relative device | |
| JP7128748B2 (ja) | 生体物質の培養のための装置 | |
| CN107179300A (zh) | 刺参体腔细胞内钙离子浓度的检测方法 | |
| Okkelman et al. | Visualization of stem cell niche by fluorescence lifetime imaging microscopy | |
| US20080182290A1 (en) | Apparatus and methods for determining viability of cell-based products | |
| O’Hagan et al. | Kymographic analysis of transport in an individual neuronal sensory cilium in Caenorhabditis elegans | |
| ES2857686T3 (es) | Dispositivo para monitorizar la dinámica espacial y temporal de trombina | |
| US10514334B2 (en) | Cell measurement method | |
| CN108491688A (zh) | 一种基于供体-受体浓度比预处理fret双杂交检测数据的方法 | |
| Saborio et al. | A protocol to use Drosophila melanogaster larvae to model human glioblastoma | |
| CN210736776U (zh) | 一种培养检测仪 | |
| KR102110288B1 (ko) | 세포 생존율 판정 장치 및 세포 생존율 판정 방법 | |
| CN108495928A (zh) | 用于从细胞获得指示剂信号的方法 | |
| Jia | Multivariable and sensor feedback based real-time monitoring and control of microalgae production system | |
| JP2021092470A (ja) | スペクトル測定装置およびスペクトル測定方法 | |
| O’Toole et al. | Sample collection protocol for single-cell RNA sequencing of functionally identified neuronal populations in vivo | |
| Deshpande et al. | Classical outlooks into the gray areas of oncology research using preclinical models |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |