JP2012126758A - バイオフィルム除去剤 - Google Patents
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【解決手段】下記式(1)で表される化合物を1種以上含有し、固体表面に形成したタンパク質構成比率がBSA(ウシ血清アルブミン)換算で30質量%以上のバイオフィルムを除去するバイオフィルム除去剤。
R−CONH−(CH2)n−COOM (1)
〔式中、Rはヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数10〜22の炭化水素基を示し、nは1〜6の整数を示し、Mは水素原子又は塩形成性陽イオンを示す。〕
【選択図】なし
Description
〔式中、Rはヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数10〜22の炭化水素基を示し、nは1〜6の整数を示し、Mは水素原子又は塩形成性陽イオンを示す。〕
本発明のバイオフィルム除去剤は、有効成分として式(1)で表される化合物〔以下、化合物(1)という〕を1種以上含有する。
〔式中、Rはヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数10〜22の炭化水素基を示し、nは1〜6の整数を示し、Mは水素原子又は塩形成性陽イオンを示す。〕
また、バイオフィルム除去剤を接触させておく温度は、厳密に制御する必要はないが、0〜100℃の範囲にあることが好ましく、10〜80℃の範囲にあることがより好ましく、20〜50℃が更に好ましい。
人体に有害、ないしは美観の面から不良である原因菌として知られている黄色ブドウ球菌(NBRC13276)、アシネトバクター(環境単離菌)、及び緑膿菌(NBRC13275)を選択し、各々に由来するバイオフィルムについて、そのタンパク質、多糖、核酸の比率を以下の方法で測定した。
黄色ブドウ球菌はTSB No.2液体培地(シグマ社製)で、アシネトバクターはMHB液体培地(和光純薬社製)で、緑膿菌はLB培地(和光純薬社製)で、それぞれ、37℃、20時間培養した。各種菌の培養液を滅菌生理食塩水で100倍に希釈後、黄色ブドウ球菌はTSB No.2寒天培地に、アシネトバクターはMHB寒天培地に、緑膿菌はNAC寒天培地(栄研化学社製)に各10枚塗抹し、それぞれ、37℃で48時間培養した。140 mM NaCl、10 mM EDTAを含むpH 7.5の水溶液(A液と略す)を各寒天培地上に5 ml添加し、菌層部をコンラージ棒で掻きとる操作を各プレートに対し2回実施し、菌液を回収した。回収した菌液を30分間攪拌し、8000 rpm、20 min 15℃で遠心分離した。上澄みを回収し、0.2 μmのメンブレンフィルター(Nalgene filtration product社)でろ過した。一方、菌層にA液100 mlを加え、同様に攪拌し、液を遠沈管に集め、1分間ボルテックス(Scientific Industry社、G-560)にて攪拌を行い、遠心分離、ろ過する操作を3回行った。ろ液を集め、透析セルロースチューブに封入し、5Lのイオン交換水下で48時間(2回イオン交換水を交換)透析し、低分子化合物を除いた。
回収した液体をLowry法(測定キットはナカライテスク社製)で測定し、測定キットの指示に従い、ウシ血清アルブミンによる検量線からタンパク質濃度を定量し、タンパク質由来のバイオフィルム量とした。また回収した液体をフェノール硫酸法によって、黄色ブドウ球菌及びアシネトバクターはマンノースによる検量線から、緑膿菌はアルギン酸による検量線から多糖類濃度を定量し、多糖類由来のバイオフィルム量とした(非特許文献3)。さらに、回収した液体について260nmの吸収極大を測定して核酸の存在を確認後、透析分の固形分からタンパク質量と多糖類量を引いて核酸量とし、核酸由来のバイオフィルム量とした。
<化合物(1)>
・化合物1−1:N−ヤシ油脂肪酸アシルグリシンカリウム塩(味の素社製 アミライトGCK−12K、30%水溶液)
・化合物1−2:N−ヤシ油脂肪酸アシルグリシン(100mM HCl(和光純薬社製)でアミライトGCK−12Kを中和して調製)
・化合物1−3:N−ヤシ油脂肪酸アシルグリシンナトリウム塩(味の素社製 アミライトGCS)
・化合物1−4:N−ラウロイル−β−アラニンカリウム塩(N−ラウロイル−β−アラニン(三井化学社製 LBA)をKOH(和光純薬社製)で等モル中和して調製)
<化合物(1’):化合物(1)の比較成分>
・化合物1’−1:ポリオキシエチレン(4)ラウリルエーテル硫酸カリウム塩(花王社製 エマール4.0K)
・化合物1’−2:オクタン酸ナトリウム(関東化学社製)
・化合物1’−3:オクチル硫酸ナトリウム(和光純薬社製)
・化合物1’−4:アルキルアミドプロピルベタイン(花王社製 アンヒトール20AB、30%水溶液)
・化合物1’−5:アルキルスルホヒドロキシベタイン(花王社製 アンヒトール20HD、30%水溶液)
・化合物1’−6:ヤシ油脂肪酸ソルビタン(花王社製 レオドールスーパーSP−L10)
・化合物1’−7:ポリオキシエチレン(5)ラウリルエーテル(花王社製 エマルゲン106)
・化合物1’−8:セチルトリメチルアンモニウムクロライド(花王社製 コータミン60W、30%水溶液)
・化合物1’−9:アルキルグルコシド(花王社製 マイドール12)
・化合物1’−10:ラウロイルメチルタウリンナトリウム塩(日光ケミカル社製 ニッコールLMT)
・化合物1’−11:N−アシルアスパラギン酸ナトリウム塩(旭化成ケミカルズ社製 アミノフォーマFLMS−P1)
・化合物1’−12:N−アシルグルタミン酸カリウム塩(味の素社製 アミソフトCK−11F)
・化合物1’−13:塩化カルシウム(和光純薬)
・化合物1’−14:αアミラーゼ(ノボザイムズ社製 ターマミル120L)
<金属イオン捕捉剤(キレート剤)>
・キレート剤1:エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩(和光純薬社製)
・キレート剤2:ニトリロ三酢酸三ナトリウム塩(アクゾ ノーベル社製 ディゾルビンA−92)
表2に示す成分を用い、以下に示す方法で表2に示す組成のバイオフィルム除去剤を調製した(ここで、実施例1−22及び比較例1−14は下記<バイオフィルム除去剤の調製1>に従って、また比較例15は下記<バイオフィルム除去剤の調製2>に従ってそれぞれ調製した)。得られたバイオフィルム除去剤のバイオフィルム除去性能を下記要領で評価した。結果を表2に示す。
なお、表2中の濃度はバイオフィルム除去剤全量に対する有効分濃度(質量%)で示す。また、以下の記載においては、特に断りのない限り、「%」は「質量%」の意を示す。
100 mlのガラスビーカーに、スターラーピース(直径8mm x 30 mm、増田理化工業製)を挿入し、さらにバイオフィルム除去剤の出来上がり質量が100gとなるように、表2に示す質量比率にて、全ての成分を投入した。ウォーターバスにて80℃まで昇温し、100 rpmで30分間撹拌した。水溶液の外観が均一になったことを確認し、室温(25℃)まで冷却した。
100 mlのガラスビーカーに、スターラーピース(直径8mm x 30 mm、増田理化工業製)を挿入し、さらにバイオフィルム除去剤の出来上がり質量が100gとなるように、表2に示す質量比率にて、全ての成分を投入した。室温(25℃)下、100 rpmで5分間撹拌し、水溶液の外観が均一になったことを確認した。
黄色ブドウ球菌(NBRC13276)1株を、25 mlのTBS No.2培地(シグマ社製)で37℃、22時間振盪培養した。波長600 nmの濁度を測定し(濁度計 HITACHI社製 U-2800)、濁度が0.1となるようにTBS No.2培地で希釈した後、底面が平面である滅菌96ウェルプレート(ファルコン社製)の各ウェルに0.15 ml添加して、37℃、24時間あるいは48時間静置培養した。また、ポジティブコントロールとして、同じプレートの異なるウェルに菌を含まないTSB No.2培地を0.15 ml加えたサンプルも調製した。なお、アシネトバクター(環境単離菌)はMHB液体培地(和光純薬社製)を用いて、緑膿菌(NBRC13275)はLB培地(和光純薬社製)を用いて、同様に試験サンプルとポジティブコントロールをそれぞれ調製した。上澄みを廃棄後、各ウェルに0.2 mlの滅菌イオン交換水(以下、滅菌水という)を添加し、上澄みを廃棄する操作(以下、washという)を2回行った。次いで、各ウェルに0.2 mlの滅菌水を添加し、表2に示す各バイオフィルム除去剤を添加する直前まで保持した。
上澄みの廃棄直後、特に記載がない限り、室温(25℃)で保存した表2に示す各バイオフィルム除去剤を各ウェルに添加し、室温(25℃)で1分放置した。なお室温以外のサンプルに関しては、サンプルを各温度のインキュベーターにあらかじめ1晩保存し、上澄みの廃棄直後、サンプルの温度が変化しないようすばやく各ウェルに添加した。
その後上澄みを廃棄し、2回washした。また、バイオフィルム除去剤の代わりに滅菌水を用いて同様の操作を行ったものをネガティブコントロールとし、ポジティブコントロールは滅菌水で同様の操作を実施した。
その後、各ウェルに、クリスタルバイオレット(和光純薬社製)の0.1%水溶液0.2 mlを添加し、室温で10分放置した。滅菌水で2回washした後、95%エタノール溶液(シグマ社製)0.2 mlを各ウェルに添加し、4℃で一晩放置した。次いで、各ウェルに関し、570 nmの吸光度を測定した。得られた吸光度値を下記の式に代入し、バイオフィルム除去率を算出した。
なお、上記全ての工程は無菌状態にて実施した。
As:サンプル吸光度
An:ネガティブコントロール吸光度
Ap:ポジティブコントロール吸光度
Claims (5)
- 式(1)で表される化合物を1種以上含有し、固体表面に形成したタンパク質構成比率がBSA(ウシ血清アルブミン)換算で30質量%以上のバイオフィルムを除去するバイオフィルム除去剤。
R−CONH−(CH2)n−COOM (1)
〔式中、Rはヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数10〜22の炭化水素基を示し、nは1〜6の整数を示し、Mは水素原子又は塩形成性陽イオンを示す。〕 - 更に金属イオン捕捉剤(キレート剤)を含有する、請求項1記載のバイオフィルム除去剤。
- 前記式(1)のRが炭素数12〜14の飽和アルキル基である請求項1又は2記載のバイオフィルム除去剤。
- 前記式(1)のnが1又は2である請求項1〜3の何れか1項記載のバイオフィルム除去剤。
- 請求項1〜4の何れか1項記載のバイオフィルム除去剤を用いて、固体表面に形成したタンパク質構成比率がBSA(ウシ血清アルブミン)換算で30質量%以上のバイオフィルムを除去する方法。
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