JP2012122987A - 結合反応測定装置および結合反応測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】第１物質および第２物質が互いに結合してなる複合体と第１物質と第２物質との間の反応を測定する場合に高精度な定量分析をすることができる結合反応測定装置を提供する。
【解決手段】結合反応測定装置１は、電気泳動槽１０、走査部２０、励起光源３０、対物レンズ４１、ダイクロイックミラー４２、ミラー４３、光フィルタ４４、結像レンズ４５、ピンホール板４６、光検出器５０および解析部６０を備える。解析部６０は、励起光源３０から出力された励起光が照射される電気泳動槽１０の微小空間の各位置について、光検出器５０から出力された蛍光検出信号を入力して、蛍光相関分光法により解析する。
【選択図】図１

Description

本発明は、結合反応測定装置および結合反応測定方法に関するものである。

２つの物質の間の相互作用（すなわち結合反応）を用いた測定は、物質の分離や定量を行う上で広く用いられている。例えば、抗原抗体反応は、抗原とその抗体との間の特異的な結合反応である。ある種の抗原に対して産生された抗体は、特別な場合を除きその抗原とのみ結合する。このような免疫反応を利用した免疫測定法は、複雑な組成の混合物の中から抗原である測定対象物質を特異的に選別することができるので、物質の分離や定量を行う際には非常に有用である。

抗体を用いた生体の微量成分（抗原）の検出や定量には、該微量成分と抗体とにより複合体を形成させ、これを電気泳動により分析する方法が用いられる。電気泳動法として等電点電気泳動法を用いた場合は、非常に高い分離能での分析が可能である。ここで、等電点電気泳動法とは、試料の実効電荷がゼロとなるｐＨ（等電点、ｐＩ）で試料が泳動しなくなる現象を利用した電気泳動法である。試料は、泳動用担体（両性担体）溶液に形成されたｐＨ勾配において、その等電点と等しい位置に濃縮される。

また、内径５０〜１００μｍで長さ３０〜１００ｃｍの溶融シリカからなる毛細管（キャピラリー）の中で一次元的な電気泳動を行うキャピラリー電気泳動法が考案されている。また、毛細管（キャピラリー）に替えて、石英，ガラスおよびプラスチック等樹脂からなる基板に設けられた微小流路で一次元的な電気泳動を行うマイクロチップ電気泳動法も研究されている。以降では、これらキャピラリー電気泳動法およびマイクロチップ電気泳動法を含め一次元的な電気泳動を行う方法を一次元電気泳動法と呼ぶ。一次元電気泳動法では、極微量の試料でも分離が可能である。

電気泳動により分離された試料を検出する方法としては、紫外可視検出法および蛍光検出法が挙げられる。紫外可視検出法では、電気泳動槽内の試料に紫外光または可視光を照射して、その光が試料に吸収されることによる光量の変化から試料を検出する。蛍光検出法では、予め試料を蛍光物質で標識しておき、分離されてきた試料成分に光を照射して発せられる蛍光を検出することにより、試料濃度を定量化する。蛍光検出法は、検出感度が高い点で優れている。

上記の等電点電気泳動法，一次元電気泳動法および蛍光検出法を組み合わせた結合反応測定技術により、微量の試料であっても高精度の定量的分析を行うことが可能となる。近年、この結合反応測定技術により、生体内の微量成分を定量分析する場合が増加している。このような分析を行う場合は、生体内の微量成分と、該微量成分を抗原として認識する抗体とを結合させ、この結合により免疫複合体を形成させて、該免疫複合体を検出する。高精度の検出のためには免疫複合体が蛍光標識されていることが好ましい。このとき、抗原または抗体のいずれかが蛍光標識されている必要があるが、抗体が蛍光標識されている方が好ましい。この理由は、複数の物質群からなる生体成分において、分析の目的とする微量成分（抗原）を蛍光標識する場合、予め該微量成分のみを単離する必要があり、操作が極めて煩雑となるからである。

また、等電点電気泳動を行った結果、複数の等電点位置で蛍光を発することが判明した場合、抗原および抗体の双方または何れか一方の等電点の不均一性に起因するものであるが、抗体の等電点が均一であれば、試料である複合体の等電点の不均一性は、抗原の等電点の不均一性を反映したものとなる。測定対象となる生体成分である抗原については、修飾や分解等により等電点の不均一性を有している場合が殆どである。このことから、等電点電気泳動法，一次元電気泳動法および蛍光検出法を組み合わせた結合反応測定技術においては、蛍光標識された抗体の等電点が均一であることが必要である。このような結合反応測定技術は特許文献１に開示されている。

特表平８−５０６１８２号公報

等電点電気泳動法，一次元電気泳動法および蛍光検出法を組み合わせた結合反応測定技術は、測定対象である抗原，蛍光標識された抗体および複合体それぞれの等電点が互いに異なることに基づくものであり、このことから以下のように原理上の限界を有している。複合体の等電点は、抗原の等電点と抗体の等電点との間に位置する。抗原および抗体それぞれの等電点が互いに近い場合、抗体および複合体それぞれの等電点も互いに近い。したがって、抗原，抗体および複合体それぞれの高精度な定量分析が困難である。

本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、第１物質および第２物質が互いに結合してなる複合体と第１物質と第２物質との間の反応を測定する場合に高精度な定量分析をすることができる結合反応測定装置および結合反応測定方法を提供することを目的とする。

本発明の結合反応測定装置は、第１物質および第２物質が互いに結合してなる複合体と第１物質と第２物質との間の結合反応を測定する装置であって、(1) 蛍光色素が結合された第１物質，第２物質および複合体を一次元的に等電点電気泳動させる微小空間を有する電気泳動槽と、(2) 蛍光色素を励起し得る波長の励起光を出力する励起光源と、(3) 励起光源から出力された励起光を電気泳動槽の微小空間の内部に集光照射する励起光学系と、(4) 励起光学系による励起光の集光照射の位置を電気泳動槽の微小空間に沿って走査する走査部と、(5) 励起光学系により励起光が照射される電気泳動槽の微小空間の各位置について、蛍光色素から発生する蛍光を検出し、その検出した蛍光の強度に応じた値の蛍光検出信号を出力する光検出器と、(6) 励起光学系により励起光が照射される電気泳動槽の微小空間の各位置で発生した蛍光を光検出器へ導く検出光学系と、(7) 励起光学系により励起光が照射される電気泳動槽の微小空間の各位置について、光検出器から出力された蛍光検出信号を入力して解析する解析部と、を備えことを特徴とする。

さらに、本発明の結合反応測定装置では、解析部は、(a) 第１物質および第２物質それぞれが既知量である場合に、電気泳動槽の微小空間に第１物質および第２物質を導入して等電点電気泳動させたときに、電気泳動槽の微小空間において等電点電気泳動により分画された第１物質および複合体それぞれの領域から発生する蛍光を光検出器により検出して得られた蛍光検出信号の自己相関関数を求め、この自己相関関数を解析することで得られる第１物質，第２物質および複合体それぞれの量に基づいて検量線を作成し、(b) 第１物質および第２物質の何れかが未知量である場合に、電気泳動槽の微小空間に第１物質および第２物質を導入して等電点電気泳動させたときに、電気泳動槽の微小空間において等電点電気泳動により分画された第１物質および複合体それぞれの領域から発生する蛍光を光検出器により検出して得られた蛍光検出信号の自己相関関数を求め、この自己相関関数および検量線に基づいて第１物質または第２物質を定量する、ことを特徴とする。

また、本発明の結合反応測定方法は、第１物質および第２物質が互いに結合してなる複合体と第１物質と第２物質との間の結合反応を測定する方法であって、(1) 蛍光色素が結合された第１物質，第２物質および複合体を一次元的に等電点電気泳動させる微小空間を有する電気泳動槽と、(2) 蛍光色素を励起し得る波長の励起光を出力する励起光源と、(3) 励起光源から出力された励起光を電気泳動槽の微小空間の内部に集光照射する励起光学系と、(4) 励起光学系による励起光の集光照射の位置を電気泳動槽の微小空間に沿って走査する走査部と、(5) 励起光学系により励起光が照射される電気泳動槽の微小空間の各位置について、蛍光色素から発生する蛍光を検出し、その検出した蛍光の強度に応じた値の蛍光検出信号を出力する光検出器と、(6) 励起光学系により励起光が照射される電気泳動槽の微小空間の各位置で発生した蛍光を光検出器へ導く検出光学系と、を用いることを特徴とする。

さらに、本発明の結合反応測定方法は、(a) 第１物質および第２物質それぞれが既知量である場合に、電気泳動槽の微小空間に第１物質および第２物質を導入して等電点電気泳動させたときに、電気泳動槽の微小空間において等電点電気泳動により分画された第１物質および複合体それぞれの領域から発生する蛍光を光検出器により検出して得られた蛍光検出信号の自己相関関数を求め、この自己相関関数を解析することで得られる第１物質，第２物質および複合体それぞれの量に基づいて検量線を作成し、(b) 第１物質および第２物質の何れかが未知量である場合に、電気泳動槽の微小空間に第１物質および第２物質を導入して等電点電気泳動させたときに、電気泳動槽の微小空間において等電点電気泳動により分画された第１物質および複合体それぞれの領域から発生する蛍光を光検出器により検出して得られた蛍光検出信号の自己相関関数を求め、この自己相関関数および検量線に基づいて第１物質または第２物質を定量する、ことを特徴とする。

本発明の結合反応測定装置または結合反応測定方法では、第１物質が抗体であって第２物質が抗原であるのが好適である。

本発明によれば、第１物質および第２物質が互いに結合してなる複合体と第１物質と第２物質との間の反応を測定する場合に高精度な定量分析をすることができる。

本実施形態の結合反応測定装置１の構成図である。 電気泳動槽１０の微小空間における抗原Ａ，抗体Ｂおよび複合体Ｃそれぞれの分布および蛍光発生分布を示す図である。 電気泳動槽１０の微小空間のうち抗原Ａ，複合体Ｃおよび抗体Ｂそれぞれが存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号の自己相関関数を示す図である。 電気泳動槽１０の微小空間における抗原Ａ，抗体Ｂおよび複合体Ｃそれぞれの分布および蛍光発生分布を示す図である。 電気泳動槽１０の微小空間のうち抗原Ａ，複合体Ｃおよび抗体Ｂそれぞれが主に存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号の自己相関関数を示す図である。 水浸の対物レンズ４１および電気泳動槽１０の配置関係を示す図である。 水浸の対物レンズ４１および電気泳動槽１０の配置関係を示す図である。 対物レンズ４１から出力された励起光８１の集光領域１２の形状を示す図である。 対物レンズ４１から出力された励起光８１の集光の様子を示す図である。 等電点電気泳動による各プローブの収束状態の計測例（エレクトロフェログラム）を示す図である。 収束前および収束後それぞれにおいてプローブＡで発生した蛍光を受光した光検出器から出力された蛍光検出信号Ｉ(ｔ)を示すグラフである。 収束前および収束後それぞれの蛍光検出信号Ｉ(ｔ)の自己相関関数Ｇ(τ)を示すグラフである。 収束前および収束後それぞれの各プローブの分子数を纏めた図表である。 等電点電気泳動により収束した後のプローブＡおよびプローブＢそれぞれの縦軸を１に規格化した自己相関関数Ｇ(τ)を示すグラフである。 プローブＢと抗原との混合物の等電点電気泳動による収束の前後の自己相関関数Ｇ(τ)を示すグラフである。 プローブＡ，プローブＢおよびプローブＣそれぞれの等電点電気泳動による収束後の縦軸を１に規格化した自己相関関数Ｇ(τ)を示すグラフである。 プローブＡ，プローブＢおよびプローブＣそれぞれの等電点電気泳動による収束後の並進拡散時間を纏めた図表である。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

図１は、本実施形態の結合反応測定装置１の構成図である。結合反応測定装置１は、第１物質，第２物質および複合体の間の結合反応を測定する装置である。結合反応測定装置１は、電気泳動槽１０、走査部２０、励起光源３０、対物レンズ４１、ダイクロイックミラー４２、ミラー４３、光フィルタ４４、結像レンズ４５、ピンホール板４６、光検出器５０および解析部６０を備える。

好適には、第１物質は抗体であり、第２物質は該抗体と特異的に結合する抗原である。複合体は、第１物質（抗体）と第２物質（抗原）とが互いに結合したものである。第１物質（抗体）は蛍光色素が結合される。また、第１物質（抗体）の等電点は均一である。

電気泳動槽１０は、蛍光色素が結合された第１物質，第２物質および複合体を一次元的に等電点電気泳動させる微小空間を有する。この電気泳動槽１０は、毛細管（キャピラリー）の内部の微小空間で一次元的な電気泳動を行わせるものであってもよいし、石英，ガラスおよびプラスチック等樹脂からなる基板に設けられた微小流路で一次元的な電気泳動を行わせるものであってもよい。何れの場合も、等電点電気泳動させる微小空間は、微小な断面を有し、所定方向に沿って延在している。後者のマイクロチップ電気泳動法は、基板に設けた微小流路では熱の放散が良好であるので、高電圧の印加が可能となり、結果として電気泳動の分離時間の短縮が可能であり、したがって、特に高電圧の印加が必要である等電点電気泳動において有効である。

励起光源３０は、抗体に結合された蛍光色素を励起し得る波長の励起光を出力する。励起光源３０は励起光を連続的に出力する。励起光源３０はレーザ光源であるのが好適である。励起光源３０から出力された励起光は、ダイクロイックミラー４２により反射された後、対物レンズ４１により電気泳動槽１０の微小空間の内部に集光照射される。すなわち、対物レンズ４１およびダイクロイックミラー４２は、励起光源３０から出力された励起光を電気泳動槽１０の微小空間の内部に集光照射する励起光学系を構成している。対物レンズ４１の光軸は、電気泳動槽１０の微小空間が延在する方向に直交している。

走査部２０は、励起光学系による励起光の集光照射の位置を電気泳動槽１０の微小空間に沿って走査する。走査部２０は、対物レンズ４１の光軸に垂直な方向であって電気泳動槽１０の微小空間が延在する方向に電気泳動槽１０を移動させることで、励起光集光照射位置を電気泳動槽１０の微小空間に沿って走査することができる。

電気泳動槽１０の微小空間のうち蛍光標識抗体または複合体が存在している位置に励起光が集光照射されると、その蛍光標識抗体または複合体から蛍光が発生する。その蛍光は、対物レンズ４１、ダイクロイックミラー４２、ミラー４３、光フィルタ４４、結像レンズ４５およびピンホール板４６を経て、光検出器５０により受光される。すなわち、対物レンズ４１、ダイクロイックミラー４２、ミラー４３、光フィルタ４４、結像レンズ４５およびピンホール板４６は、励起光学系により励起光が照射される電気泳動槽１０の微小空間の各位置で発生した蛍光を光検出器５０へ導く検出光学系を構成している。

対物レンズ４１は、励起光源３０から出力されダイクロイックミラー４２により反射された励起光を入力して電気泳動槽１０の微小空間の内部に集光照射するとともに、その集光照射位置で発生した蛍光を入力してダイクロイックミラー４２へ出力する。ダイクロイックミラー４２は、励起光を反射させる一方、蛍光を透過させる。光フィルタ４４は、対物レンズ４１からダイクロイックミラー４２およびミラー４３を経て到達した光のうち、蛍光を選択的に透過させる一方で、励起光の散乱成分を含む他の波長の光を遮断する。結像レンズ４５は、光フィルタ４４を透過して到達した蛍光をピンホール板４６の開口位置に集光する。ピンホール板４６は、開口位置に到達した蛍光を光検出器５０へ出力する。対物レンズ４１による励起光集光照射位置とピンホール板４６の開口位置との間の光学系は、共焦点光学系を構成している。

光検出器５０は、励起光学系により励起光が照射される電気泳動槽の微小空間の各位置について、蛍光色素から発生して検出光学系を経て到達した蛍光を検出し、その検出した蛍光の強度に応じた値の蛍光検出信号を出力する。この光検出器５０は、光子検出が可能な光電子増倍管であるのが好適である。このような光検出器５０は、蛍光を受光したときに該蛍光の光子を光電変換して光電子を発生し、その光電子を増倍して多数の二次光電子を発生して、光子検出事象に応じてパルス電流信号を蛍光検出信号として出力することができる。

解析部６０は、励起光学系により励起光が照射される電気泳動槽１０の微小空間の各位置について、光検出器５０から出力された蛍光検出信号を入力して解析する。解析部６０は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ: Fluorescence Correlation Spectroscopy）により、蛍光検出信号の自己相関関数を求めて、蛍光を発した分子の並進拡散時間や分子数を求めることができる。蛍光相関分光法は、極低濃度の蛍光分子が存在する溶液の被測定試料中の微小領域に励起光を照射するととともに、その微小な励起光照射領域で発生した蛍光の強度を検出して、その蛍光強度の経時変化の自己相関関数を求め、この自己相関関数を解析することで、被測定試料中の蛍光分子の並進拡散運動等を測定するものである。

蛍光検出信号をＩ(ｔ)と表すと、自己相関関数Ｇ(τ)は下記（１）式で表される。ｔは時間変数であり、τは相関時間を表す変数である。<>は時間平均を求める演算を表す。この自己相関関数Ｇ(τ)に基づいて、励起光照射領域における蛍光標識抗体および複合体それぞれの並進拡散時間や分子数が求められる。

自己相関関数Ｇ(τ)は、理想分子運動モデルを想定した場合、下記（２）式によりフィッティング処理される。この式中で、Ｆは三重項状態の比率である。τ_tripは三重項状態の並進拡散時間である。Ｎは励起光照射領域（蛍光観測領域）内の分子の平均個数である。Ｍは分子種の数（Ｍ＝１or２or３）である。ｙ_ｉはＭ種のうちの第ｉの分子種の寄与率である。τ_Ｄｉは第ｉの分子種の並進拡散時間である。また、Ｓは、励起光照射領域（蛍光観測領域）の半径と軸長の半分の長さとの比である。

上記フィッティング処理では、例えば最小二乗法が用いられ、実測による自己相関関数に基づいて、理想分子運動モデルを想定した場合の自己相関関数におけるパラメータが決定される。ここで決定されるべきパラメータは、抗体および複合体それぞれの並進拡散時間および分子数である。分子の並進拡散時間が求められれば、その分子の大きさも求められる。

解析部６０は、抗体および抗原それぞれが既知量である場合に、電気泳動槽１０の微小空間に抗体および抗原を導入して等電点電気泳動させたときに、電気泳動槽１０の微小空間において等電点電気泳動により分画された抗体および複合体それぞれの領域から発生する蛍光を光検出器５０により検出して得られた蛍光検出信号Ｉ(ｔ)の自己相関関数Ｇ(τ)を求め、この自己相関関数Ｇ(τ)を解析することで得られる抗体，抗原および複合体それぞれの量に基づいて検量線を作成する。

解析部６０は、抗体および抗原の何れかが未知量である場合に、電気泳動槽１０の微小空間に抗体および抗原を導入して等電点電気泳動させたときに、電気泳動槽１０の微小空間において等電点電気泳動により分画された抗体および複合体それぞれの領域から発生する蛍光を光検出器５０により検出して得られた蛍光検出信号Ｉ(ｔ)の自己相関関数Ｇ(τ)を求め、この自己相関関数Ｇ(τ)および上記検量線に基づいて抗体または抗原を定量する。

以下では、本実施形態の結合反応測定装置１の動作および本実施形態の結合反応測定方法について、電気泳動槽１０の微小空間において等電点電気泳動により分画された抗体および複合体それぞれの領域が充分に離間している場合と、充分には離間されていない場合（一部が重なっている場合を含む。）と、の２つに分けて、検量線作成方法および定量方法について説明する。

図２（ａ）は、等電点電気泳動により分画された抗体および複合体それぞれの領域が充分に離間している場合の電気泳動槽１０の微小空間における抗原Ａ，抗体Ｂおよび複合体Ｃそれぞれの分布の様子を模式的に示す図であり、同図（ｂ）は、この場合の蛍光発生分布を示す図である。同図では、電気泳動槽１０の微小空間の延在方向を横軸としている。図３（ａ）は、電気泳動槽１０の微小空間のうち抗原Ａが存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ａ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ａ(τ)を示す図である。図３（ｂ）は、電気泳動槽１０の微小空間のうち複合体Ｃが存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ｃ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ｃ(τ)を示す図である。また、図３（ｃ）は、電気泳動槽１０の微小空間のうち抗体Ｂが存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ｂ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ｂ(τ)を示す図である。

図２（ａ）に示されるように、等電点電気泳動により抗原Ａ，抗体Ｂおよび複合体Ｃそれぞれの領域は充分に離間している。このとき、同図（ｂ）に示されるように、電気泳動槽１０の微小空間の延在方向の蛍光発生分布において、抗体Ｂで発生する蛍光と、複合体Ｃで発生する蛍光とは、充分に区別可能である。

抗原Ａは蛍光標識されていないので、図３（ａ）に示されるように、抗原Ａが存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ａ(ｔ)は０であり、この蛍光検出信号Ｉ_Ａ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ａ(τ)は求められ得ない。

複合体Ｃが存在する領域で発生する蛍光には、複合体Ｃからの蛍光のみが含まれており、抗体Ａからの蛍光は含まれていない。したがって、複合体Ｃが存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ｃ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ｃ(τ)は、図３（ｂ）に示されるように、複合体Ｃのみの並進拡散時間および分子数が反映されたものである。この自己相関関数Ｇ_Ｃ(τ)から複合体Ｃの並進拡散時間および分子数が求められる。

抗体Ｂが存在する領域で発生する蛍光には、抗体Ｂからの蛍光のみが含まれており、複合体Ｃからの蛍光は含まれていない。したがって、抗体Ｂが存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ｂ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ｂ(τ)は、図３（ｃ）に示されるように、抗体Ｂのみの並進拡散時間および分子数が反映されたものである。この自己相関関数Ｇ_Ｂ(τ)から抗体Ｂの並進拡散時間および分子数が求められる。

そこで、電気泳動槽１０の微小空間の延在方向に励起光集光照射位置が走査され、その各位置で発生する蛍光の強度の分布が求められることで、電気泳動槽１０の微小空間において等電点電気泳動により分画された抗原Ａ，抗体Ｂおよび複合体Ｃそれぞれの領域が求められる。この各領域を求める工程は、抗原Ａおよび抗体Ｂの組に対して一度だけ行われればよい。

複合体Ｃが存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ｃ(ｔ)が測定され、この蛍光検出信号Ｉ_Ｃ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ｃ(τ)が求められ、この自己相関関数Ｇ_Ｃ(τ)から複合体Ｃの並進拡散時間および分子数が求められる。また、抗体Ｂが存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ｂ(ｔ)が測定され、この蛍光検出信号Ｉ_Ｂ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ｂ(τ)が求められ、この自己相関関数Ｇ_Ｂ(τ)から抗体Ｂの並進拡散時間および分子数が求められる。これを用いることで検量線の作成および定量が可能となる。

図４（ａ）は、等電点電気泳動により分画された抗体および複合体それぞれの領域が充分には離間していない場合（一部が重なっている場合を含む。）の電気泳動槽１０の微小空間における抗原Ａ，抗体Ｂおよび複合体Ｃそれぞれの分布の様子を模式的に示す図であり、同図（ｂ）は、この場合の蛍光発生分布を示す図である。同図では、電気泳動槽１０の微小空間の延在方向を横軸としている。図５（ａ）は、電気泳動槽１０の微小空間のうち抗原Ａが主に存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ａ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ａ(τ)を示す図である。図５（ｂ）は、電気泳動槽１０の微小空間のうち複合体Ｃが主に存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ｃ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ｃ(τ)を示す図である。また、図５（ｃ）は、電気泳動槽１０の微小空間のうち抗体Ｂが主に存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ｂ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ｂ(τ)を示す図である。

図４（ａ）に示されるように、等電点電気泳動により抗原Ａ，抗体Ｂおよび複合体Ｃそれぞれの領域は、充分には離間しておらず、一部領域が重なっている。このとき、同図（ｂ）に示されるように、電気泳動槽１０の微小空間の延在方向の蛍光発生分布において、抗体Ｂで発生する蛍光と、複合体Ｃで発生する蛍光とは、区別できない場合がある。

抗原Ａは蛍光標識されていないので、抗原Ａから蛍光が発生することはない。しかし、抗原Ａが主に存在する領域には複合体Ｃも幾らか存在するので、図５（ａ）に示されるように、この領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ａ(ｔ)は、複合体Ｃから発生する蛍光の弱い信号を含む。この蛍光検出信号Ｉ_Ａ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ａ(τ)は、解析不能なレベルである。

複合体Ｃが主に存在する領域には抗体Ｂも幾らか存在するので、この領域で発生する蛍光には、複合体Ｃからの蛍光が含まれている他、抗体Ａからの蛍光も僅かに含まれている。したがって、複合体Ｃが主に存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ｃ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ｃ(τ)は、図５（ｂ）に示されるように、複合体Ｃおよび抗体Ｂそれぞれの並進拡散時間および分子数が反映されたものである。この自己相関関数Ｇ_Ｃ(τ)から複合体Ｃおよび抗体Ｂそれぞれの並進拡散時間および分子数が求められる。

抗体Ｂが主に存在する領域には複合体Ｃも幾らか存在するので、この領域で発生する蛍光には、抗体Ｂからの蛍光が含まれている他、複合体Ｃからの蛍光も僅かに含まれている。したがって、抗体Ｂが主に存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ｂ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ｂ(τ)は、図５（ｃ）に示されるように、抗体Ｂおよび複合体Ｃそれぞれの並進拡散時間および分子数が反映されたものである。この自己相関関数Ｇ_Ｂ(τ)から抗体Ｂおよび複合体Ｃそれぞれの並進拡散時間および分子数が求められる。

そこで、電気泳動槽１０の微小空間の延在方向に励起光集光照射位置が走査され、その各位置で発生する蛍光の強度の分布が求められることで、電気泳動槽１０の微小空間において等電点電気泳動により分画された抗原Ａ，抗体Ｂおよび複合体Ｃそれぞれが主に存在する領域が求められる。この各領域を求める工程は、抗原Ａおよび抗体Ｂの組に対して一度だけ行われてもよいが、毎回行われるのが好ましい。

抗体Ｂが主に存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ｂ(ｔ)が測定され、蛍光検出信号Ｉ_Ｂ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ｂ(τ)が求められる。また、複合体Ｃが主に存在する領域で発生する蛍光についての蛍光検出信号Ｉ_Ｃ(ｔ)が測定され、蛍光検出信号Ｉ_Ｃ(ｔ)の自己相関関数Ｇ_Ｃ(τ)が求められる。なお、自己相関関数Ｇ_Ｂ(τ)，Ｇ_Ｃ(τ)それぞれを求めるに際しては、各領域において陰極側（抗体Ｂが存在する側）から数点それぞれにおいて求めるのが好適である。

先ず、自己相関関数Ｇ_Ｂ(τ)が抗体Ｂおよび複合体Ｃについて解析されて、抗体Ｂの並進拡散時間および分子数が求められる。次に、ここで求められた抗体Ｂの並進拡散時間および分子数が用いられ、自己相関関数Ｇ_Ｃ(τ)が複合体Ｃおよび抗体Ｂについて解析されて、複合体Ｃの並進拡散時間および分子数が求められる。これを用いることで検量線の作成および定量が可能となる。

ところで、抗原，抗体および複合体それぞれは、等電点電気泳動により、電気泳動槽１０の微小空間内において等電点の値に応じた位置に収束する。複合体の収束位置は、抗原の収束位置と抗体の収束位置との間となる。抗原および抗体それぞれの等電点は以下の（３）式から求めることができる。[Ｈ^＋]は水素イオン濃度である。Ｋ_ｉはプロトンを受け取って正電荷を持つ基（塩基）のｐＫａ値であり、ｎ_ｉは該塩基の個数である。Ｋ_ｊはプロトンを受け取って正電荷を持つ基（塩基）のｐＫａ値であり、ｎ_ｊは該塩基の個数である。

塩基およびｐＫａ値の例としては、α-ＣＯＯＨ（Ｃ末端アミノ酸）のｐＫａ値は３.６０であり、α-ＮＨ_２（Ｎ末端アミノ酸）のｐＫａ値は７.６０であり、Ａｓｐ側鎖ＣＯＯＨ基のｐＫａ値は３.９５であり、Ｇｌｕ側鎖ＣＯＯＨ基のｐＫａ値は４.４５であり、Ｔｙｒ側鎖ＯＨ基のｐＫａ値は９.８０であり、Ｈｉｓ側鎖イミダゾール基のｐＫａ値は６.４５であり、Ｌｙｓ側鎖ε-ＮＨ_２基のｐＫａ値は１０.２０であり、Ａｒｇ側鎖グアニジル基のｐＫａ値は１２.５０であり、Ｃｙｓ側鎖ＳＨ基のｐＫａ値は８.５０である。

すなわち、抗原，抗体および複合体それぞれを構成する塩基について、上記のｐＫａ値を用いて、ｘ＝０ となる水素イオン濃度[Ｈ^＋] を求め、この水素イオン濃度[Ｈ^＋] から等電点を計算することができる。これにより、電気泳動槽１０の微小空間内における抗原，抗体および複合体それぞれの収束位置の見当を付けることができるので、等電点電気泳動によって電気泳動槽１０の微小空間内に分画された蛍光標識抗体および複合体それぞれの領域から発せられた蛍光の強度の自己相関関数を取得することができる。

電気泳動槽１０の微小空間内に分画された各領域については、上記の式を用いて蛍光標識抗体および複合体それぞれの等電点の値から収束する場所を特定して、その場所を固定して検出することができる。しかし、電気泳動槽１０の微小空間全体に対して励起光照射を走査して蛍光を検出することで検出位置を特定することが好ましい。

また、電気泳動槽１０の微小空間において抗原，抗体および複合体それぞれを等電点電気泳動によって分離する際、これとは別に設けた微小空間に予め等電点が決まっている物質（等電点マーカ）を充填して同時に分離を行って、その等電点マーカの収束位置から抗体および複合体それぞれの領域を特定することで検出の精度が向上する。予め等電点が決まっている物質（等電点マーカ）としては、特許第２８２８４２６号公報，特許第３２４６８８８号公報，特許第３５２０２２２号公報および米国特許５８６６６８３号明細書等に開示されている物質が好適に使用可能である。

蛍光相関分光法における蛍光の自己相関測定においては、測定領域は１ｆＬ（フェムトリットル）程度の極微小領域とされ、フォトンカウンティング領域での測定であるので、蛍光標識抗体の濃度は１ｎＭ〜１０ｎＭ（１０^−９Ｍ〜１０^−８Ｍ）程度が最大濃度となる。この濃度において、測定領域内の平均分子数は０.６個（＝6×10²³×1×10^-9×1×10^-15）〜６個である。一方、標的分子である抗原の濃度は１ｐＭ程度である。したがって、抗原と抗体との結合による複合体の形成については、抗体全体の分子数の１／100〜１／1000程度しか関与していないことになる。それ故、形成された複合体を蛍光の蛍光相関分光法の測定領域で検出することは困難である。

一方、等電点電気泳動では等電点への分子の収束により100倍〜1,000倍程度に濃度が高められるので、形成された複合体について、その蛍光分子数としては０.６個〜６個程度となり、測定領域で検出することが可能となる。すなわち、蛍光相関分光法と等電点電気泳動法とを組み合わせることではじめて、抗原，蛍光標識抗体および複合体それぞれが精度良く検出・定量することが可能となる。

次に、電気泳動槽１０の微小空間（微小流路）の好適な断面サイズについて説明する。図６および図７それぞれは、水浸の対物レンズ４１および電気泳動槽１０の配置関係を示す図である。対物レンズ４１と電気泳動槽１０との間には水７０がある。図６は、対物レンズ４１から出力された励起光８１が電気泳動槽１０の微小流路１１の内壁下面に集光されている場合を示す。図７は、対物レンズ４１から出力された励起光８１が電気泳動槽１０の微小流路１１の内壁上面に集光されている場合を示す。微小流路１１内の蛍光色素が結合された物質に励起光８１が照射されると、その照射箇所から蛍光８２が発生し、その蛍光は対物レンズ４１に入射される。

図６および図７の何れの場合にも、電気泳動槽１０を構成する材料（例えばガラスやプラスティック）と微小流路１１内の試料溶液とは屈折率が互いに異なるので、励起光８１の反射が大きい。この反射励起光は、対物レンズ４１を経た後に光フィルタ４４により遮断されるが、強度が大きい場合には、光フィルタ４４により完全には遮断されず、光検出器５０により受光されて計測ノイズとなる。したがって、対物レンズ４１から出力された励起光８１の集光領域は、対物レンズ４１の光軸に沿った方向に関し微小流路１１の中央付近であるのが好ましい。

図８は、対物レンズ４１から出力された励起光８１の集光領域１２の形状を示す図である。蛍光相関分光法（ＦＣＳ）では、微小流路１１内の実効的な励起光集光領域（すなわち蛍光観測領域）１２の形状およびサイズを考慮することが重要である。その際の指標としてＳＰ（Structure Parameter）が定義される。励起光集光領域１２は楕円体であり、その楕円体の長軸半径をｚとし短軸半径をｗとしたとき、ＳＰはＳＰ＝ｚ／ｗ なる式で表される。

通常、このＳＰの計測値は５〜１０である。短軸半径ｗは励起光の波長により決まる。ＦＣＳで使用される励起光の波長は４００ｎｍ〜１０００ｎｍである。これらのことから、楕円体で表される励起光集光領域１２の長軸半径ｚは５μｍ程度である。したがって、微小流路１１の高さ（対物レンズ４１の光軸に沿った方向の高さ）は１０μｍ以上であることが必要である。

微小流路１１の幅（対物レンズ４１の光軸および微小流路１１の延在方向の双方に垂直な方向の幅）の下限値は、微小流路１１の高さの下限値および対物レンズ４１のＮＡに基づいて得られる。図９は、対物レンズ４１から出力された励起光８１の集光の様子を示す図である。媒質の屈折率をｎとし、集光位置Ｐから対物レンズ８１を見込む角度を２θとすると、ＮＡ＝ｎ・sinθ なる式が成り立つ。対物レンズ４１のＮＡを１.１５とした場合、微小流路１１の高さ１０μｍに対応する微小流路１１の幅は３４μｍとなる。また、対物レンズ４１のＮＡを１とした場合、微小流路１１の高さ１０μｍに対応する微小流路１１の幅は２２.８μｍとなる。したがって、微小流路１１の幅は２２.８μｍ以上であることが必要である。

以上を纏めると、微小流路１１の高さは１０μｍ以上であることが必要であり、微小流路１１の幅は２２.８μｍ以上であることが必要である。なお、電気泳動槽１０および対物レンズ４１の配置の際の誤差や微小流路１１の作製の際の誤差が最大で±１０μｍ程度あるので、これを考慮した場合には、微小流路１１の高さは３０μｍ以上であることが望ましく、微小流路１１の幅は４２.８μｍ以上であることが望ましい。一方、微小流路１１の高さ及び幅それぞれの上限値については、ＦＣＳの観点からは特に制限はないものの、等電点電気泳動の観点からは小さいことが望ましい。

次に実施例について説明する。本実施例では、蛍光標識ペプチド（プローブＡ）および蛍光標識タンパク質（プローブＢ）が測定用試料として用いられた。

プローブＡは、N末端α-アミノ基に5-carboxytetramethylrhodaminaのスクシンイミド体を結合させた合成ペプチド（配列：DDEHHHKR）である。プローブＡは、特許文献（特許２８２８４２６号公報）および非特許文献（Electrophoresis, 16, 1479 (1995)）に準拠して調製された。蛍光標識後のプローブＡの分子量は約１,５００であり、等電点(ｐI)は６.２３であった。プローブＡのpI値については、特許文献（特許３５２０２２２号公報）および非特許文献（Anal. Chem., 74, 1046 (2002)）に記載されている方法に従って測定した。

プローブＢは、ヒトα１−アンチトリプシンに対する抗体遺伝子をクローニング後に大腸菌でFab’体として発現した組換えタンパク質である。プローブＢのFd鎖C末端付近のCysがteteramethylrhodamine iodoacetoamideで標識された。プローブＢの分子量は約５０,０００であり、ｐI値は５.５９であった。なお、プローブＢの詳細については、特許文献（特許３４６１８０４号公報）および非特許文献（Electrophoresis, 23, 909 (2002)）に記載されている。

プローブＡおよびプローブＢそれぞれは、４０倍に希釈された両性担体溶液（Pharmalyte3-10）、0.1％ Tween20、0.3％ N,N,N',N',-tetramethylethylenediamine(TEMED)、0.1％ 酢酸、１ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液、0.1％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）を含む溶液に溶解されて、等電点電気泳動用の試料溶液とされた。等電点電気泳動の際の電極液（陰極液）として０.１％のHPMCを含む２０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液が用いられ、電極液（陽極液）として０.１％のHPMCを含む２０ｍＭりん酸溶液が用いられた。

図１０は、等電点電気泳動による各プローブの収束状態の計測例（エレクトロフェログラム）を示す図である。縦軸は蛍光強度を示す。横軸は、全長３０ｍｍのチャネルの中心を０としての距離を表し、左側が陽極側、右側が陰極側となっている。等電点電気泳動において、電圧の印加を開始して５分から１０分程度で、各プローブで発生した蛍光の強度が最大となり、各プローブの収束点が確認された。これにより、本装置を用いて等電点電気泳動による試料の収束が可能であることが確認された。

図１１は、収束前および収束後それぞれにおいてプローブＡで発生した蛍光を受光した光検出器から出力された蛍光検出信号Ｉ(ｔ)を示すグラフである。また、図１２は、収束前および収束後それぞれの蛍光検出信号Ｉ(ｔ)の自己相関関数Ｇ(τ)を示すグラフである。蛍光検出信号Ｉ(ｔ)から上記（１）式に基づいて自己相関関数Ｇ(τ)が計算された。図１２に示されるように、等電点電気泳動により蛍光観測領域の分子数増加を示すＧ(τ)の減少が確認された。また、自己相関関数Ｇ(τ)が上記（２）式によりフィッティング処理されて、各プローブの並進拡散時間および分子数が求められた。

図１３は、収束前および収束後それぞれの各プローブの分子数を纏めた図表である。この図から判るように、等電点電気泳動により収束前と比較して収束後においては、プローブＡでは３６倍の分子数の増加が確認され、また、プローブＢでは２３倍の分子数の増加が確認された。プローブＡの場合、蛍光観測領域における分子数は、収束前に１.０９個であったのに対して、等電点収束後には３９.７４であった。収束前のプローブＡの濃度が５.０×１０^−９Ｍであったので、収束後では１.８×１０^−７Ｍ相当の濃度を計測したものと同等になる。これらから、微小流路における等電点電気泳動中の自己相関計測による分子数変化の計測が可能であることが明らかになった。

図１４は、等電点電気泳動により収束した後のプローブＡおよびプローブＢそれぞれの自己相関関数Ｇ(τ)を示すグラフである。同図では、両者の対比を容易にするため、縦軸に関し各グラフが規格化されている。分子量約１,５００のプローブＡの自己相関曲線より分子量約５０,０００のプローブＢの自己相関曲線が遅い方へシフトしていることが確認された。

また、プローブＢとこれに特異的に結合する抗原（ヒトα１−アンチトリプシン）とをモル比１:２の割合で混合し、遮光下、室温にて約２０分間に亘って反応させた。この溶液について、等電点電気泳動による収束の前後で、蛍光検出信号Ｉ(ｔ)が測定され、自己相関関数Ｇ(τ)が計算された。図１５は、プローブＢと抗原との混合物の等電点電気泳動による収束の前後の自己相関関数Ｇ(τ)を示すグラフである。同図から、収束前と比較して収束後においては並進拡散時間の増加が確認された。これは抗原抗体反応によって形成された複合体が確認されたことになる。

ここで、プローブＢと抗原（ヒトα１−アンチトリプシン）との混合溶液をプローブＣと表す。図１６は、プローブＡ，プローブＢおよびプローブＣそれぞれの等電点電気泳動による収束後の自己相関関数Ｇ(τ)を示すグラフである。同図でも、三者の対比を容易にするため、縦軸に関し各グラフが規格化されている。図１７は、プローブＡ，プローブＢおよびプローブＣそれぞれの等電点電気泳動による収束後の並進拡散時間を纏めた図表である。

以上のとおり、本実施形態の測定装置および測定方法によって、第１物質および第２物質が互いに結合してなる複合体と第１物質と第２物質との間の反応を高精度に定量分析し得ることが可能となった。

１…結合反応測定装置、１０…電気泳動槽、１１…微小流路（微小空間）、１２…励起光集光領域（蛍光観測領域）、２０…走査部、３０…励起光源、４１…対物レンズ、４２…ダイクロイックミラー、４３…ミラー、４４…光フィルタ、４５…結像レンズ、４６…ピンホール板、５０…光検出器、６０…解析部、７０…水、８１…励起光、８２…蛍光。

Claims (4)

1. 第１物質および第２物質が互いに結合してなる複合体と前記第１物質と前記第２物質との間の結合反応を測定する装置であって、
   蛍光色素が結合された前記第１物質，前記第２物質および前記複合体を一次元的に等電点電気泳動させる微小空間を有する電気泳動槽と、
   前記蛍光色素を励起し得る波長の励起光を出力する励起光源と、
   前記励起光源から出力された励起光を前記電気泳動槽の微小空間の内部に集光照射する励起光学系と、
   前記励起光学系による励起光の集光照射の位置を前記電気泳動槽の微小空間に沿って走査する走査部と、
   前記励起光学系により励起光が照射される前記電気泳動槽の微小空間の各位置について、前記蛍光色素から発生する蛍光を検出し、その検出した蛍光の強度に応じた値の蛍光検出信号を出力する光検出器と、
   前記励起光学系により励起光が照射される前記電気泳動槽の微小空間の各位置で発生した蛍光を前記光検出器へ導く検出光学系と、
   前記励起光学系により励起光が照射される前記電気泳動槽の微小空間の各位置について、前記光検出器から出力された蛍光検出信号を入力して解析する解析部と、
   を備え、
   前記解析部が、
   前記第１物質および前記第２物質それぞれが既知量である場合に、前記電気泳動槽の微小空間に前記第１物質および前記第２物質を導入して等電点電気泳動させたときに、前記電気泳動槽の微小空間において等電点電気泳動により分画された前記第１物質および前記複合体それぞれの領域から発生する蛍光を前記光検出器により検出して得られた蛍光検出信号の自己相関関数を求め、この自己相関関数を解析することで得られる前記第１物質，前記第２物質および前記複合体それぞれの量に基づいて検量線を作成し、
   前記第１物質および前記第２物質の何れかが未知量である場合に、前記電気泳動槽の微小空間に前記第１物質および前記第２物質を導入して等電点電気泳動させたときに、前記電気泳動槽の微小空間において等電点電気泳動により分画された前記第１物質および前記複合体それぞれの領域から発生する蛍光を前記光検出器により検出して得られた蛍光検出信号の自己相関関数を求め、この自己相関関数および前記検量線に基づいて前記第１物質または前記第２物質を定量する、
   ことを特徴とする結合反応測定装置。
2. 前記第１物質が抗体であって前記第２物質が抗原であることを特徴とする請求項１に記載の結合反応測定装置。
3. 第１物質および第２物質が互いに結合してなる複合体と前記第１物質と前記第２物質との間の結合反応を測定する方法であって、
   蛍光色素が結合された前記第１物質，前記第２物質および前記複合体を一次元的に等電点電気泳動させる微小空間を有する電気泳動槽と、
   前記蛍光色素を励起し得る波長の励起光を出力する励起光源と、
   前記励起光源から出力された励起光を前記電気泳動槽の微小空間の内部に集光照射する励起光学系と、
   前記励起光学系による励起光の集光照射の位置を前記電気泳動槽の微小空間に沿って走査する走査部と、
   前記励起光学系により励起光が照射される前記電気泳動槽の微小空間の各位置について、前記蛍光色素から発生する蛍光を検出し、その検出した蛍光の強度に応じた値の蛍光検出信号を出力する光検出器と、
   前記励起光学系により励起光が照射される前記電気泳動槽の微小空間の各位置で発生した蛍光を前記光検出器へ導く検出光学系と、
   を用い、
   前記第１物質および前記第２物質それぞれが既知量である場合に、前記電気泳動槽の微小空間に前記第１物質および前記第２物質を導入して等電点電気泳動させたときに、前記電気泳動槽の微小空間において等電点電気泳動により分画された前記第１物質および前記複合体それぞれの領域から発生する蛍光を前記光検出器により検出して得られた蛍光検出信号の自己相関関数を求め、この自己相関関数を解析することで得られる前記第１物質，前記第２物質および前記複合体それぞれの量に基づいて検量線を作成し、
   前記第１物質および前記第２物質の何れかが未知量である場合に、前記電気泳動槽の微小空間に前記第１物質および前記第２物質を導入して等電点電気泳動させたときに、前記電気泳動槽の微小空間において等電点電気泳動により分画された前記第１物質および前記複合体それぞれの領域から発生する蛍光を前記光検出器により検出して得られた蛍光検出信号の自己相関関数を求め、この自己相関関数および前記検量線に基づいて前記第１物質または前記第２物質を定量する、
   ことを特徴とする結合反応測定方法。
4. 前記第１物質が抗体であって前記第２物質が抗原であることを特徴とする請求項３に記載の結合反応測定方法。

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