JP2012092032A - Ceramide production promoter - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、セラミド産生促進剤、ならびにそれを含有する飲食品、医薬品、ペットフードおよび化粧品に関するものである。 The present invention relates to a ceramide production promoter, and foods and drinks, pharmaceuticals, pet foods and cosmetics containing the same.
皮膚の老化、特に乾燥は中高年以降、加齢と共に進行し、従来から、美容における大きな悩みとなっている（例えば、非特許文献１）。皮膚の乾燥の原因は様々であるが、その一因として挙げられるのは、角質間細胞脂質の一つであるセラミドの減少である。セラミドは、水分を保持する働きを示す角質の細胞間に含まれているものであり、体内の水分の蒸発を抑えるという役割を担っている。しかしながら、加齢とともにセラミドの分泌量が減少することが知られている（例えば、非特許文献２）。このセラミドの減少が、皮膚の乾燥の一因となると考えられている。 Skin aging, especially drying, has progressed with aging since middle-aged and older, and has been a major concern in beauty in the past (for example, Non-Patent Document 1). There are various causes of skin dryness. One reason for this is a decrease in ceramide, one of the interstitial cell lipids. Ceramide is contained between keratinous cells that function to retain moisture, and plays a role in suppressing the evaporation of moisture in the body. However, it is known that the amount of ceramide secretion decreases with age (for example, Non-Patent Document 2). This decrease in ceramide is believed to contribute to skin dryness.
皮膚は表皮と、表皮の下部に存在する真皮より構成されており、真皮に含まれるコラーゲンやヒアルロン酸、エラスチンなどが体の形態の維持をつかさどっている。一方、表皮は、外界からの異物の侵入を阻止したり、体内に含まれる水分の外界への蒸散を抑制したりするなどの機能を有している。 The skin is composed of the epidermis and the dermis present in the lower part of the epidermis. Collagen, hyaluronic acid, elastin, etc. contained in the dermis are responsible for maintaining the body form. On the other hand, the epidermis has functions such as preventing the entry of foreign substances from the outside world and suppressing the evaporation of moisture contained in the body to the outside world.
表皮の中でも、最も外側に位置する角質層は、水分の蒸散抑制に重要な働きを示している。角質層の間における脂質（つまり、角質間細胞脂質）の分泌が損なわれると水分を保てなくなり、アトピー性皮膚炎など、水分不足に起因して様々な皮膚疾患を発症する。 Among the epidermis, the outermost stratum corneum shows an important function for suppressing moisture transpiration. If the secretion of lipids (ie, interstitial cell lipids) between the stratum corneum is impaired, water cannot be maintained, and various skin diseases such as atopic dermatitis develop due to lack of water.
角質間細胞脂質の主要成分はセラミドであり、上述のように、皮膚の水分不足を抑制するという役割を担っている。セラミドは脂肪酸と長鎖塩基であるスフィンゴシンが酸アミド結合をしたものの総称である。セラミドの種類としては、スフィンゴシンや脂肪酸鎖の構造によって、いくつかの種類があることが確認されている（例えば、非特許文献３）。このセラミドが、角質層で脂溶性成分の層を作り出すことで、外部からの異物の侵入や、内部からの水分の蒸発を抑制している。しかしながら、前述の通り、セラミド量は加齢によって減少する傾向にある。 The main component of interstitial cell lipids is ceramide, and plays a role of suppressing water deficiency in the skin as described above. Ceramide is a general term for fatty acid and sphingosine, which is a long-chain base, formed by acid amide bond. It has been confirmed that there are several types of ceramides depending on the structure of sphingosine or fatty acid chain (for example, Non-Patent Document 3). This ceramide creates a fat-soluble component layer in the stratum corneum, thereby suppressing the entry of foreign substances from the outside and the evaporation of moisture from the inside. However, as described above, the amount of ceramide tends to decrease with aging.
このような状況に鑑み、従来から、表皮中に存在するセラミドを補ったり、セラミドの産生を促進したりすることが検討されてきた。具体的には、皮膚にセラミド又はセラミド類似体を塗布することで、経皮吸収によってセラミドを補う方法（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３）や、皮膚にセラミドの産生を促進する物質を塗布する方法（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６）などが挙げられる。 In view of such circumstances, conventionally, it has been studied to supplement ceramide present in the epidermis or promote production of ceramide. Specifically, ceramide or a ceramide analog is applied to the skin to supplement ceramide by percutaneous absorption (for example, Patent Document 1, Patent Document 2, Patent Document 3), or promote the production of ceramide on the skin. And a method of applying a substance to be applied (for example, Patent Document 4, Patent Document 5, and Patent Document 6).
しかしながら、上述したセラミド、その類似体等を有効成分とするセラミド産生促進用経皮吸収剤は、植物由来であり、一般的に高価であるという問題があった。これに加え、経皮吸収を促進するために乳化剤を使用するため、保湿性に問題を引き起こす場合があった。また、植物由来のセラミドではなく合成品のセラミドを用いた場合は、反応中間体の除去や合成に使用した溶媒の残存の問題などから、長期間塗布することは好ましくない場合があった。これらの現状を踏まえて、安全で、長期間使用しても問題なく表皮のセラミド量を増やすことの出来る材料が求められていた。 However, the ceramide production promoting transdermal absorbent containing the above-described ceramide, analogs thereof and the like as an active ingredient has a problem that it is derived from plants and is generally expensive. In addition, since an emulsifier is used to promote percutaneous absorption, there may be a problem in moisture retention. In addition, when synthetic ceramide is used instead of plant-derived ceramide, it may not be preferable to apply for a long period of time due to the removal of reaction intermediates and the remaining solvent used for synthesis. In light of these current conditions, there has been a demand for a material that is safe and can increase the amount of ceramide in the epidermis without problems even after long-term use.
一方、スフィンゴ脂質は、皮膚組織や神経系の組織に多く存在し、細胞のシグナル伝達やアポトーシス等の生理現象に対して重要な役割を果たしていることが明らかとなってきつつあり、近年、注目されている。 On the other hand, sphingolipids are abundant in skin tissues and nervous system tissues, and it is becoming clear that they play an important role in physiological phenomena such as cell signal transduction and apoptosis. ing.
例えば、代表的なスフィンゴ脂質であるグルコシルセラミドは、そのままの形態で吸収されることにより皮膚における保湿性向上や美肌効果を有することが知られている（例えば、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。また、グルコシルセラミドは、アトピー性皮膚炎改善作用（例えば、非特許文献７、８）を有することが知られている。さらにまた、セラミドは脳機能改善作用（例えば、特許文献７）や筋肉損傷抑制作用（例えば、特許文献８）を有することが知られている。しかしながら、スフィンゴ脂質にセラミド産生促進作用があることは、これまで報告されていなかった。 For example, glucosylceramide, which is a typical sphingolipid, is known to have improved moisture retention and skin beautifying effects by being absorbed as it is (for example, Non-Patent Document 4 and Non-Patent Document 5). Non-patent document 6). In addition, glucosylceramide is known to have an atopic dermatitis improving action (for example, Non-Patent Documents 7 and 8). Furthermore, ceramide is known to have a brain function improving action (for example, Patent Document 7) and a muscle damage suppressing action (for example, Patent Document 8). However, it has not been reported so far that sphingolipid has a ceramide production promoting action.
また、スフィンゴ脂質の構成成分であるスフィンゴイド類（スフィンゴイド塩基）については、ヒト結腸ガン細胞でのアポトーシス誘導作用（例えば、非特許文献９）や、マウスにおける大腸線腫抑制作用（例えば、非特許文献１０）を有することが知られている。 In addition, with regard to sphingoids (sphingoid bases), which are constituents of sphingolipids, apoptosis-inducing action in human colon cancer cells (for example, Non-Patent Document 9) and colonic nematoma-inhibiting action in mice (for example, non-patents) It is known to have patent document 10).
このようなスフィンゴイド類には、表皮の下部に存在する真皮にてコラーゲン産生促進作用があることが報告されている（例えば、特許文献９）。しかしながら、スフィンゴイド類や、その他のコラーゲン産生促進作用を有する物質（例えばクロセチン、パッションフルーツの種子抽出物、マメ科シカクマメ属に属する植物の抽出物など）に、表皮にてセラミド産生促進作用があることは、これまで報告されていなかった（例えば、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２）。 It has been reported that such sphingoids have an action of promoting collagen production in the dermis present in the lower part of the epidermis (for example, Patent Document 9). However, sphingoids and other substances that promote collagen production (such as crocetin, passion fruit seed extract, plant leguminous plant extract, etc.) have ceramide production promoting activity in the epidermis. This has not been reported so far (for example, Patent Document 10, Patent Document 11, and Patent Document 12).
上記の問題を解決するために、本発明は、安価かつ安全であり、効果的に表皮中のセラミドを増加させることが可能なセラミド産生促進剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、該セラミド産生促進剤を含有する飲食品、化粧品、医薬品、ペットフード等を提供することを目的とするものである。 In order to solve the above problems, an object of the present invention is to provide a ceramide production promoter that is inexpensive and safe and can effectively increase ceramide in the epidermis. Furthermore, this invention aims at providing the food-drinks, cosmetics, a pharmaceutical, pet food, etc. containing this ceramide production promoter.
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意検討した結果、意外にもスフィンゴイド類に高いセラミド産生促進効果があることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明の趣旨は下記の通りである。
（１）スフィンゴイド類を含有することを特徴とするセラミド産生促進剤。
（２）スフィンゴイド類が植物素材由来であることを特徴とする（１）のセラミド産生促進剤。
（３）スフィンゴイド類が、４−ヒドロキシスフィンガニン、４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン、スフィンガニン、８−スフィンゲニン、４−スフィンゲニンおよび４、８−スフィンガジエニンから選ばれる１種以上であることを特徴とする（１）または（２）のセラミド産生促進剤。
（４）スフィンゴ脂質を含有することを特徴とするセラミド産生促進剤。
（５）経口摂取後、生体内でスフィンゴイド類に分解されるスフィンゴ脂質を含有することを特徴とする（４）のセラミド産生促進剤。
（６）スフィンゴ脂質が植物素材由来のものである（４）または（５）のセラミド産生促進剤。
（７）（１）〜（６）いずれかのセラミド産生促進剤を含有することを特徴とする飲食品。
（８）（１）〜（６）のいずれかのセラミド産生促進剤を含有することを特徴とする医薬品。
（９）（１）〜（６）のいずれかのセラミド産生促進剤を含有することを特徴とするペットフード。
（１０）（１）〜（３）のいずれかのセラミド産生促進剤を含有することを特徴とする化粧品。
As a result of intensive studies to solve such problems, the present inventors have unexpectedly found that sphingoids have a high ceramide production promoting effect and have reached the present invention.
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) A ceramide production promoter characterized by containing sphingoids.
(2) The ceramide production promoter according to (1), wherein the sphingoids are derived from a plant material.
(3) The sphingoids are at least one selected from 4-hydroxysphinganin, 4-hydroxy-8-sphingenin, sphinganine, 8-sphingenin, 4-sphingenin and 4,8-sphingadienin. (1) or (2) ceramide production promoter characterized by these.
(4) A ceramide production promoter characterized by containing a sphingolipid.
(5) The ceramide production promoter according to (4), comprising a sphingolipid that is decomposed into sphingoids in vivo after ingestion.
(6) The ceramide production promoter according to (4) or (5), wherein the sphingolipid is derived from a plant material.
(7) A food or drink comprising the ceramide production promoter according to any one of (1) to (6).
(8) A pharmaceutical comprising the ceramide production promoter according to any one of (1) to (6).
(9) A pet food comprising the ceramide production promoter according to any one of (1) to (6).
(10) A cosmetic comprising the ceramide production promoter according to any one of (1) to (3).
本発明によれば、安価かつ安全であり、効果的に表皮中のセラミドを増加させることが可能なセラミド産生促進剤を提供することができる。さらに、本発明によれば、該セラミド産生促進剤を含有する飲食品、化粧品、医薬品、ペットフード等を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a ceramide production promoter that is inexpensive and safe and can effectively increase ceramide in the epidermis. Furthermore, according to this invention, the food / beverage products, cosmetics, a pharmaceutical, pet food, etc. containing this ceramide production promoter can be provided.
以下、本発明について説明する。
本発明のセラミド産生促進剤は、有効成分として、スフィンゴイド類、またはスフィンゴ脂質を含有する。スフィンゴイド類、またはスフィンゴ脂質を有効成分とする本発明のセラミド産生促進剤を経口摂取したり、皮膚に塗布したりすることにより、表皮中のセラミドの産生を効果的に促進することが可能となる。
The present invention will be described below.
The ceramide production promoter of the present invention contains sphingoids or sphingolipids as active ingredients. It is possible to effectively promote the production of ceramide in the epidermis by orally ingesting or applying it to the skin of the ceramide production promoter of the present invention containing sphingoids or sphingolipids as an active ingredient Become.
なお、スフィンゴイド類は、スフィンゴ脂質構造中に存在するものであり、スフィンゴ脂質を構成成分に分解することにより調製できる。つまり、スフィンゴ脂質を含有させたセラミド産生促進剤を経口投与する場合には、生体内中でスフィンゴ脂質を分解させることにより、有効成分として機能するスフィンゴイド類が生成される。 The sphingoids are present in the sphingolipid structure and can be prepared by decomposing the sphingolipid into constituent components. That is, when a ceramide production promoter containing sphingolipid is orally administered, sphingoids that function as active ingredients are generated by degrading the sphingolipid in vivo.
スフィンゴ脂質について、以下に述べる。
本発明に用いられるスフィンゴ脂質は、本発明の効果を損なうものでない限り、特に制限されない。例えば、天然素材由来（植物素材由来や動物素材由来）のセラミドやグルコシルセラミドなどのスフィンゴ脂質が含有される素材から抽出されたスフィンゴ脂質；化学合成されたスフィンゴ脂質；あるいは酵素合成されたスフィンゴ脂質等を用いることができる。
The sphingolipid is described below.
The sphingolipid used in the present invention is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention. For example, sphingolipids extracted from materials containing sphingolipids such as ceramides derived from natural materials (derived from plant materials and animal materials) and glucosylceramides; chemically synthesized sphingolipids; or enzymatically synthesized sphingolipids, etc. Can be used.
植物素材由来のスフィンゴ脂質は、植物素材を水や有機溶媒で抽出する方法により得ることができる。そして、植物素材由来のスフィンゴイド類は、植物素材由来のスフィンゴ脂質を分解することにより得られる。 A sphingolipid derived from a plant material can be obtained by a method of extracting the plant material with water or an organic solvent. And sphingoids derived from plant materials are obtained by decomposing sphingolipids derived from plant materials.
植物素材由来のスフィンゴ脂質を得る場合に、使用される植物素材は特に限定されない。例えばアーモンド、アオサ、アオノリ、アカザ、アカシア、アカネ、アカブドウ、アカマツ（松ヤニ、琥珀、コーパルを含む。以下マツ類については同じ）、アガリクス、アキノノゲシ、アケビ、アサガオ、アザレア、アジサイ、アシタバ、アズキ、アスパラガス、アセロラ、アセンヤク、アニス、アボガド、アマチャ、アマチャヅル、アマリリス、アルテア、アルニカ、アロエ、アンジェリカ、アンズ、アンソッコウ、イグサ、イザヨイバラ、イチイ、イチジク、イチョウ、イランイラン、ウイキョウ、ウーロン茶、ウコン、ウスベニアオイ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、温州ミカン、エイジツ、エシャロット、エゾウコギ、エニシダ、エノキタケ、エルダーフラワー、エンドウ、オーキッド、オオバコ、オオヒレアザミ、オオムギ、オケラ、オスマンサス、オトギリソウ、オドリコソウ、オニドコロ、オリーブ、オレガノ、オレンジ（オレンジピールを含む）、カーネーション、カカオ、カキ、カキドオシ、カッコン、カシワ、カタクリ、カボチャ、カミツレ、カムカム、カモミール、カラスウリ、カラマツ、カリン、ガルシニア、カルダモン、キイチゴ、キウイ、キキョウ、キャベツ（ケールを含む）、キャラウェイ、キュウリ、キンカン、ギンナン、グァバ、クコ、クズ、クチナシ、クミン、クランベリー、クルミ、グレープフルーツ、クローブ、クロマツ、クロマメ、クロレラ、ケツメイシ、ゲンノショウコ、コケモモ、コショウ、コスモス、ゴボウ、コムギ（小麦胚芽を含む）、ゴマ、コマツナ、コメ（米糠を含む）、コリアンダー、コンニャク芋（コンニャクトビ粉を含む）、コンブ、サーモンベリー、サイプレス、ザクロ、サツマ芋、サト芋、サトウキビ、サトウダイコン、サフラン、ザボン、サンザシ、サンショウ、シイタケ、シクラメン、シソ、シメジ、ジャガ芋、シャクヤク、ジャスミン、ジュズダマ、シュンギク、ショウガ、ショウブ、シラカシ、ジンチョウゲ、シンナモン、スイカ、スイトピー、スギナ、スターアニス、スターアップル、スダチ、ステビア、スモモ、セージ（サルビア）、ゼニアオイ、セロリ、センキュウ、センブリ、ソバ、ソラマメ、ダイコン、ダイズ（おからを含む）、ダイダイ、タイム、タケノコ、タマネギ、タラゴン、タロイモ、タンジン、タンポポ、チコリ、ツキミソウ、ツクシ、ツバキ、ツボクサ、ツメクサ、ツルクサ、ツルナ、ツワブキ、ディル、テンジクアオイ（ゼラニウム）、トウガ、トウガラシ、トウキ、トウチュウカソウ、トウモロコシ、ドクダミ、トコン、トチュウ、トネリコ、ナガイモ、ナズナ、ナツメグ、ナンテン、ニガウリ、ニガヨモギ、ニラ、ニンジン、ニンニク、ネギ、ノコギリソウ、ノコギリヤシ、ノビル、バーベナ、パーム、パイナップル、ハイビスカス、ハコベ、バジル、パセリ、ハダカムギ、ハッカ、ハトムギ、バナナ、バナバ、バニラ、パプリカ、ハマメリス、ビート、ピーマン、ヒガンバナ、ヒシ、ヒジキ、ピスタチオ、ヒソップ（ヤナギハッカ）、ヒナギク、ヒナゲシ、ヒノキ、ヒバ、ヒマシ、ヒマワリ、ビワ、ファレノプシス、フェネグリーク、フキノトウ、ブラックベリー、プラム、ブルーベリー（ビルベリーを含む）、プルーン、ヘチマ、ベニバナ、ベラドンナ、ベルガモット、ホウセンカ、ホウレンソウ、ホオズキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マイタケ、マオウ、マカ、マカデミアンナッツ、マタタビ、マリーゴールド、マンゴー、ミツバ、ミモザ、ミョウガ、ミルラ、ムラサキ、メース、メリッサ、メリロート、メロン、メン（綿実油粕を含む）、モヤシ、ヤグルマソウ、ヤマ芋、ヤマユリ、ヤマヨモギ、ユーカリ、ユキノシタ、ユズ、ユリ、ヨクイニン、ヨメナ（アスター）、ヨモギ、ライム、ライムギ、ライラック、ラズベリー、ラッカセイ、ラッキョウ、リンゴ（アップルファイバーを含む）、リンドウ、レイシ、レタス、レモン、レンゲソウ、レンコン、ローズヒップ、ローズマリー、ローリエ、ワケギ、ワサビ（セイヨウワサビを含む）などが挙げられる。 When obtaining a sphingolipid derived from a plant material, the plant material used is not particularly limited. For example, Almond, Aosa, Aonori, Akaza, Acacia, Akane, Aka grape, Red pine (Including pine ani, persimmon, copal, the same applies to pines), Agaricus, Akinonogeshi, Akebi, Asagao, Azalea, Hydrangea, Ashitaba, Azuki, Asparagus, acerola, asenyaku, anise, avocado, achacha, achachaul, amaryllis, altea, arnica, aloe, angelica, apricot, anthony, rush, isayoi rose, yew, fig, ginkgo, ylang ylang, ivy, woo Nepenthes, Udo, Ume, Vulture, Satsuma mandarin, Ages, Shallot, Ezokogi, Enishida, Enokitake, Elderflower, Pea, Orchid, Psyllium, Great White Thistle Wheat, Ochera, Osmanthus, Hypericum, Odrianthus, Onidokoroko, Olive, Oregano, Orange (including orange peel), Carnation, Cacao, Oyster, Oyster, Cuckoo, Kashiwa, Katakuri, Pumpkin, Chamomile, Camcam, Chamomile, Oxalis, Larch, Karin, Garcinia, Cardamom, Raspberry, Kiwi, Koki, Cabbage (including Kale), Caraway, Cucumber, Kumquat, Ginnan, Guava, Cuco, Kudzu, Gardenia, Cumin, Cranberry, Walnut, Grapefruit, Clove, Black Pine, Black Bean, Chlorella, Ketsumeishi, Gennoshoko, Cowberry, Pepper, Cosmos, Burdock, Wheat (including wheat germ), Sesame, Komatsuna, Rice (including rice bran), Coriander, Konjac rice (kon) Corn, salmon berry, cypress, pomegranate, sweet potato, sugar cane, sugar cane, sugar beet, saffron, pomelo, hawthorn, salamander, shiitake mushroom, cyclamen, perilla, shimeji, potato, peonies, jasmine, Juzudama, garlic, ginger, ginger, sardine, ginkgo biloba, cinnamon, watermelon, sweet pea, horsetail, star anise, star apple, sudachi, stevia, plum, sage (salvia), mallow, celery, cucumber, assembly, buckwheat, broad bean, radish , Soybean (including okara), daidai, thyme, bamboo shoot, onion, tarragon, taro, tanjin, dandelion, chicory, camellia, tsukushi, camellia, camellia, clover, tsurusa, tsuruna, camellia, dill, Ginkgo biloba (Geranium), Toga, Capsicum, Toki, Red pepper, Corn, Dokudami, Tokon, Tochu, Ash, Chinese yam, Natsuna, Nutmeg, Nanten, Nigari, Nagimugi, Nira, Carrot, Saccharum, Sorghum Verbena, Palm, Pineapple, Hibiscus, Octopus, Basil, Parsley, Hadakamugi, Hakka, Barley, Banana, Banaba, Vanilla, Paprika, Hamamelis, Beet, Bell Pepper, Hymopana, Hishi, Hijiki, Pistachio, Hysop , Cypress, hiba, castor, sunflower, loquat, phalaenopsis, phenegrek, cypress, blackberry, plum, blueberry (including bilberry), prunes, loofah, beni Na, belladonna, bergamot, spinach, spinach, physalis, bodyfish, buttons, hops, jojoba, maitake, mao, maca, macadamia nuts, matababi, marigold, mango, honey bees, mimosa, mioga, myrrh, myrrh, murasaki, mace, melissa , Merirot, melon, men (including cottonseed oil lees), bean sprouts, cornflower, dormouse pods, pine lilies, porcupines, eucalyptus, yukinoshita, yuzu, lily, yokuinin, yomena (aster), mugwort, lime, rye, lilac, raspberry, peanut , Sea bream, apple (including apple fiber), gentian, litchi, lettuce, lemon, lotus root, lotus root, rosehip, rosemary, bay leaf, wasabi, wasabi (including horseradish), etc.
なお、植物素材由来のスフィンゴ脂質のなかでも、セラミド産生促進効果の観点から、コンニャク芋（コンニャクトビ粉を含む）、温州ミカン由来のものが特に好ましい。 Of the sphingolipids derived from plant materials, those derived from konjac koji (including konjac powder) and Satsuma mandarin are particularly preferred from the viewpoint of the effect of promoting ceramide production.
上述の植物素材を抽出することにより、スフィンゴ脂質を得ることができる。抽出の際には、水や有機溶媒を用いることができる。使用する有機溶媒としては、本発明の効果を損なうものでなければ、いかなるものを用いても良く、特に制限されない。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類、ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ピリジン類等が挙げられる。これらは単独で、もしくは２種以上を組み合わせて用いることができる。 A sphingolipid can be obtained by extracting the plant material described above. In the extraction, water or an organic solvent can be used. Any organic solvent may be used as long as it does not impair the effects of the present invention, and is not particularly limited. Examples of the organic solvent include alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol; polyhydric alcohols such as ethylene glycol, propylene glycol and glycerol; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; esters such as methyl acetate and ethyl acetate. Ethers such as tetrahydrofuran and diethyl ether; halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, dichloroethane and chloroform; aliphatic hydrocarbons such as hexane and pentane; aromatic hydrocarbons such as toluene; and polyethers such as polyethylene glycol; Pyridines and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
上記の有機溶媒の中でも、食品に対して使用する場合には、エタノール、ヘキサンが望ましい。また、抽出効率を上げるために、水、酵素、各種界面活性剤等を、本発明の効果を損なわない範囲で使用することも可能である。 Among the above organic solvents, ethanol and hexane are desirable when used for food. In order to increase the extraction efficiency, water, enzymes, various surfactants, and the like can be used as long as the effects of the present invention are not impaired.
植物素材からスフィンゴ脂質を抽出するには、公知の方法を用いればよく、抽出を複数回行うこともできる。また、近年注目を浴びている超臨界抽出法を使用することも可能である。 In order to extract the sphingolipid from the plant material, a known method may be used, and the extraction may be performed a plurality of times. It is also possible to use a supercritical extraction method that has been attracting attention in recent years.
このようにして得られた抽出液は、濃縮操作により濃縮物とすることができる。濃縮操作としては、例えば、エバポレーターのような減圧濃縮装置を用いたり、加熱したりして、溶媒を除去することが挙げられる。次いで、濃縮物を公知慣用の精製手段により精製することで、スフィンゴ脂質を得ることができる。例えば、該抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで数回精製したり、アルカリ処理や溶媒分画等により不純物を除去した後に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製したりすることにより、スフィンゴ脂質を得ることができる。 The extract thus obtained can be made into a concentrate by a concentration operation. Examples of the concentration operation include removal of the solvent by using a vacuum concentration device such as an evaporator or heating. Subsequently, a sphingolipid can be obtained by refine | purifying a concentrate by a well-known and usual refinement | purification means. For example, the sphingolipid can be obtained by purifying the extract several times by silica gel column chromatography, or by purifying the silica gel column chromatography after removing impurities by alkali treatment or solvent fractionation. it can.
スフィンゴイド類について、以下に述べる。
本発明におけるスフィンゴイド類は、炭化水素化合物にアミノ基、水酸基が結合した長鎖アミノアルコール構造を持つ化合物の総称である。スフィンゴイド類は、主に、セラミドやグルコシルセラミド等のスフィンゴ脂質の構成成分として、動物、植物、真菌に広く分布している。スフィンゴイド類は、水酸基の数、二重結合の数や位置により多数の分子種が存在し、由来によって含まれる分子種や、その含有割合は異なる。例えば、４‐スフィンゲニン（スフィンゴシン）、スフィンガニン、４‐ヒドロキシ‐スフィンガニン（フィトスフィンゴシン）、８‐スフィンゲニン、４，８‐スフィンガジエニン、４‐ヒドロキシ‐８‐スフィンゲニンなどが挙げられる。
The sphingoids are described below.
The sphingoids in the present invention are a general term for compounds having a long-chain amino alcohol structure in which an amino group and a hydroxyl group are bonded to a hydrocarbon compound. Sphingoids are widely distributed in animals, plants, and fungi mainly as constituents of sphingolipids such as ceramide and glucosylceramide. Sphingoids have a large number of molecular species depending on the number of hydroxyl groups and the number and position of double bonds, and the molecular species included in the origin and the content ratio thereof are different. For example, 4-sphingenin (sphingosine), sphinganine, 4-hydroxy-sphinganin (phytosphingosine), 8-sphingenin, 4,8-sphingadienine, 4-hydroxy-8-sphingenin and the like can be mentioned.
本発明に用いられるスフィンゴイド類としては、天然素材由来であるものの他、化学合成品や酵素合成品を用いることも可能である。スフィンゴイド類としては、スフィンゴシン（スフィンゲニン）、ジヒドロスフィンゴシン（スフィンガニン）、フィトスフィンゴシン、デヒドロスフィンゴシン、デヒドロフィトスフィンゴシン、スフィンガジエニン及びこれらのＮ−メチル体又はＮ，Ｎ−ジメチル体等が挙げられる。 As the sphingoids used in the present invention, in addition to those derived from natural materials, chemically synthesized products and enzyme synthesized products can also be used. Examples of sphingoids include sphingosine (sphingenin), dihydrosphingosine (sphinganine), phytosphingosine, dehydrosphingosine, dehydrophytosphingosine, sphingadienin and their N-methyl or N, N-dimethyl isomers.
スフィンゴイド類の炭素数は、１６〜２２が好ましい。また、スフィンゴイド類としては、直鎖又は分岐鎖の飽和又は不飽和のいずれでもよい。具体的には、８−スフィンゲニン、４，８−スフィンガジエニン、４−ヒドロキシ−スフィンゲニンなどや、４−スフィンゲニン（スフィンゴシン）、スフィンガニン、４−ヒドロキシ−スフィンガニン（フィトスフィンゴシン）などが挙げられる。 As for carbon number of sphingoids, 16-22 are preferable. The sphingoids may be either linear or branched saturated or unsaturated. Specific examples include 8-sphingenin, 4,8-sphingadienin, 4-hydroxy-sphingenin, 4-sphingenin (sphingosine), sphinganine, 4-hydroxy-sphinganin (phytosphingosine), and the like.
なかでも、植物素材由来のスフィンゴイド類は、セラミド産生促進効果に優れているため好ましい。セラミド産生促進効果の観点からは、４，８−スフィンガジエニン、４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン、８−スフィンゲニンが特に好ましく、４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニンが最も好ましい。 Of these, sphingoids derived from plant materials are preferable because of their excellent ceramide production promoting effect. From the viewpoint of the effect of promoting ceramide production, 4,8-sphingadienin, 4-hydroxy-8-sphingenin and 8-sphingenin are particularly preferable, and 4-hydroxy-8-sphingenin is most preferable.
本発明のセラミド産生促進剤において、セラミド産生促進効果の観点から、上記スフィンゴイド類に対する４，８−スフィンガジエニン、４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン及び８−スフィンゲニンの割合が５０質量％以上であることが好ましく、７０質量％以上がより好ましく、９０質量％以上がいっそう好ましく、９３質量％以上がよりいっそう好ましい。 In the ceramide production promoter of the present invention, from the viewpoint of the effect of promoting ceramide production, the ratio of 4,8-sphingadienin, 4-hydroxy-8-sphingenin and 8-sphingenin to the sphingoids is 50% by mass or more. It is preferably 70% by mass or more, more preferably 90% by mass or more, and still more preferably 93% by mass or more.
スフィンゴイド類を得る方法について、以下に述べる。
まず、上述のようにして得られたスフィンゴ脂質を、含水メタノール性塩酸などとともに加熱して構成成分に分解する。次いで溶媒抽出することにより、スフィンゴイド類を得ることができる。
A method for obtaining sphingoids will be described below.
First, the sphingolipid obtained as described above is heated together with hydrous methanolic hydrochloric acid and decomposed into constituent components. Subsequently, sphingoids can be obtained by solvent extraction.
スフィンゴイド類は、そのまま多種類の分子種の混合物として、コラーゲン産生促進剤として使用してもよいし、クロマトグラフィー等で、さらに分画・精製して用いてもよい。 The sphingoids may be used as a mixture of various molecular species as they are as a collagen production promoter, or may be further fractionated and purified by chromatography or the like.
スフィンゴ脂質を分解することにより得られたスフィンゴイド類は、スフィンゴ脂質よりも、セラミド産生促進効果により優れている。その理由はさだかではないが、スフィンゴ脂質を摂取した場合に比べ、スフィンゴイド類を摂取した方が、体内のセラミドを合成する酵素がより増加するためであると推測される。 Sphingoids obtained by decomposing sphingolipids are superior to sphingolipids in promoting ceramide production. The reason for this is not clear, but it is presumed that the amount of the enzyme that synthesizes ceramide in the body increases more when the sphingoids are consumed than when the sphingolipids are consumed.
特に、本発明においては、スフィンゴイド類を含有させたセラミド産生促進剤であるか、あるいは、経口投与により摂取されるスフィンゴ脂質を含有させたセラミド産生促進剤であって、生体内中でスフィンゴ脂質を分解させることによりスフィンゴイド類を生成させうるセラミド産生促進剤であることが好ましい。生体内中で、スフィンゴ脂質を分解させることで、体内への吸収性などが向上したスフィンゴイド類が得られるため、より優れたセラミド産生促進効果を発現させることができる。 In particular, in the present invention, it is a ceramide production promoter containing sphingoids, or a ceramide production promoter containing sphingolipids taken by oral administration, which is a sphingolipid in vivo. It is preferable that it is a ceramide production promoter which can produce sphingoids by decomposing | disassembling. By decomposing sphingolipids in the living body, sphingoids having improved absorption in the body and the like can be obtained, so that a better ceramide production promoting effect can be expressed.
セラミド産生促進剤の形態としては、特に限定されず、水又は油脂に分散させた液剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。 The form of the ceramide production promoter is not particularly limited, and examples thereof include a liquid agent, a tablet, a granule, a powder, and a capsule dispersed in water or oil.
本発明におけるセラミド産生促進剤は、スフィンゴイド類又はスフィンゴ脂質として成人１日あたりの摂取量が０．０１〜１０００ｍｇとなるように摂取することが好ましく、さらに０．１〜１００ｍｇが好ましく、０．１〜３０ｍｇが一層好ましい。なお、成人１日あたりの摂取量が０．０１ｍｇ未満であると、前記のセラミド産生促進効果が低くなる場合がある。一方、成人１日あたりの摂取量が１０００ｍｇを超えると、セラミド産生促進効果に対して原料コストが高くなる場合がある。 The ceramide production promoter in the present invention is preferably ingested as sphingoids or sphingolipids so that the daily intake per adult is 0.01 to 1000 mg, more preferably 0.1 to 100 mg, and 1-30 mg is more preferable. In addition, when the intake amount per day for an adult is less than 0.01 mg, the ceramide production promoting effect may be lowered. On the other hand, if the intake amount per day for an adult exceeds 1000 mg, the raw material cost may increase for the ceramide production promoting effect.
本発明のセラミド産生促進剤は、スフィンゴイド類又はスフィンゴ脂質以外に、本発明の効果を損なわない範囲内で、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤等の成分を、必要に応じて含有していてもよい。 The ceramide production promoter of the present invention is water, fats and oils, waxes, hydrocarbons, fatty acids, higher alcohols, esters other than sphingoids or sphingolipids as long as the effects of the present invention are not impaired. , Plant extracts, water-soluble polymers, surfactants, metal soaps, alcohol, polyhydric alcohols, pH adjusters, antioxidants, UV absorbers, preservatives, fragrances, powders, thickeners, pigments, Components such as chelating agents may be contained as necessary.
本発明の飲食品は、上記セラミド産生促進剤を配合したものであり、食品、飲料、嗜好品、サプリメントなど、経口で摂取しうるものである。その形態は特に限定されず、パン類、麺類等の主菜となりうるもの；チーズ、ハム、ウィンナー、魚介加工品等の副菜となりうるもの；果汁飲料、炭酸飲料、乳飲料等の飲料；クッキー、ケーキ、ゼリー、プリン、キャンディー、ヨーグルト等の嗜好品とすることが出来る。また、サプリメントとしての形態も特に限定されるものではなく、錠剤、カプセル、ソフトカプセル、栄養ドリンク状の形態が挙げられる。 The food / beverage products of this invention mix | blend the said ceramide production promoter, and can be ingested orally, such as a foodstuff, a drink, a luxury product, and a supplement. The form is not particularly limited, and can be a main dish such as breads and noodles; can be a side dish such as cheese, ham, winner, processed seafood; beverages such as fruit juice drinks, carbonated drinks, milk drinks; cookies , Cakes, jellies, puddings, candy, yogurt, etc. Moreover, the form as a supplement is not specifically limited, either, The form of a tablet, a capsule, a soft capsule, and an energy drink form is mentioned.
本発明の医薬品は、上記セラミド産生促進剤を配合したものである。その形態は特に限定されず、例えば、水又は油脂に分散させた液剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。 The pharmaceutical of the present invention is a combination of the ceramide production promoter. The form is not particularly limited, and examples thereof include liquids, tablets, granules, powders, and capsules dispersed in water or fats and oils.
本発明のペットフードは、上記セラミド産生促進剤を配合したものである。その形態は特に限定されず、本発明のセラミド産生促進剤に、例えばトウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦などの穀類、ふすま、米ぬかなどのぬか類、コーングルテンミール、コーンジャムミールなどの粕類、脱脂粉乳、ホエー、魚粉、骨粉などの動物性飼料類、ビール酵母などの酵母類、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなどのカルシウム類、ビタミン類、油脂類、アミノ酸類、糖類などを配合したものが挙げられる。 The pet food of the present invention contains the ceramide production promoter. The form is not particularly limited. Examples of the ceramide production promoter of the present invention include grains such as corn, wheat, barley and rye, bran such as bran and rice bran, potatoes such as corn gluten meal and corn jam meal, and defatted. Examples include animal feeds such as milk powder, whey, fish meal, and bone meal, yeasts such as brewer's yeast, calciums such as calcium phosphate and calcium carbonate, vitamins, fats and oils, amino acids, saccharides, and the like.
本発明の化粧品は、上記セラミド産生促進剤を配合したものである。その形態は特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、化粧水（ローション）、パック、美容液、洗浄剤、メーキャップ化粧料などが挙げられる。 The cosmetic of the present invention contains the above ceramide production promoter. The form is not particularly limited, and examples thereof include emulsions, creams, lotions, packs, cosmetics, cleaning agents, makeup cosmetics, and the like.
本発明のセラミド産生促進剤、それを配合した飲食物、医薬品、ペットフードおよび化粧品には、本発明の効果を損なわない範囲で、必要に応じて、種々の機能性成分を配合することが出来る。機能性成分としては、例えば、ビタミンＣ、コラーゲン、スクワラン、ナイアシン、ナイアシンアミド、ヒアルロン酸、プラセンタエキス、ソルビトール、キチン、キトサンや、その他にも種々の植物抽出物等が挙げられる。これらの配合量については、本発明の効果を損なわない限り限定されない。 In the ceramide production promoter of the present invention, foods and drinks, pharmaceuticals, pet foods and cosmetics containing the same, various functional components can be blended as necessary within the range not impairing the effects of the present invention. . Examples of the functional component include vitamin C, collagen, squalane, niacin, niacinamide, hyaluronic acid, placenta extract, sorbitol, chitin, chitosan, and various other plant extracts. About these compounding quantities, unless the effect of this invention is impaired, it is not limited.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
調製例１（スフィンゴイド類の調製）
コンニャクとび粉１Ｋｇを撹拌糟に仕込み、そこにエタノール２Ｌを加え、常温で２時間撹拌して混合物を得た。得られた混合物をろ過し、抽出物（抽出溶液）と残渣とに分離した。抽出溶液をエバポレーターにより濃縮し、茶褐色の蝋状濃縮物を約１０ｇ得た。
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Preparation Example 1 (Preparation of sphingoids)
1 kg of konjac fly flour was charged into a stirring bowl, 2 L of ethanol was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours to obtain a mixture. The obtained mixture was filtered and separated into an extract (extraction solution) and a residue. The extracted solution was concentrated by an evaporator to obtain about 10 g of a brownish waxy concentrate.
得られた濃縮物を、０．４ＮのＫＯＨにより弱アルカリ分解した後、混合溶媒（クロロホルム／メタノール／水＝８／４／３、体積比）で再抽出を行った。クロロホルム相を減圧下濃縮乾固して、脂質８．６ｇを得た。 The resulting concentrate was subjected to weak alkali decomposition with 0.4 N KOH, and then re-extracted with a mixed solvent (chloroform / methanol / water = 8/4/3, volume ratio). The chloroform phase was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 8.6 g of lipid.
続いて、この脂質を４倍量のアセトンで２回洗浄した後、２０倍量のエタノール、０．２倍量の活性炭を加え脱色処理し、黄白色固体１．４ｇを得た。この黄白色固体うち、１ｇをシリカゲルカラムに供給し、混合溶媒（酢酸エチル／エタノール＝９５／５、体積比）で共雑物を除き、混合溶媒（酢酸エチル／エタノール＝９０／１０、体積比）で溶出してグルコシルセラミドを精製し、白色のグルコシルセラミド粉末０．６ｇを得た。得られたグルコシルセラミド粉末を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（島津製作所製、「ＣＬＡＳＳ−ＶＰ／ＬＣ−１０」）を用い、また、ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社製 「Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０」）を用いて検出を行った結果、他のピークやスポットなどがほとんど見られないことから、共離ピークで純度を求めた結果、９８％以上であった。 Subsequently, the lipid was washed twice with 4 times the amount of acetone and then decolorized by adding 20 times the amount of ethanol and 0.2 times the amount of activated carbon to obtain 1.4 g of a yellowish white solid. Of this yellowish white solid, 1 g was supplied to a silica gel column, mixed impurities were removed with a mixed solvent (ethyl acetate / ethanol = 95/5, volume ratio), and a mixed solvent (ethyl acetate / ethanol = 90/10, volume ratio). ) To purify glucosylceramide to obtain 0.6 g of white glucosylceramide powder. Detection of the obtained glucosylceramide powder using high performance liquid chromatography (HPLC) (manufactured by Shimadzu Corporation, “CLASS-VP / LC-10”) and TLC (“Silica gel 60” manufactured by Merck) As a result, almost no other peaks or spots were observed, and as a result, the purity was determined as a segregation peak and found to be 98% or more.
続いて、このグルコシルセラミド粉末を、１Ｎ含水メタノール性塩酸中で、７０℃で１８時間加熱した。次いで、ヘキサンで脂肪酸メチルエステルを抽出除去後、４ＮのＮａＯＨで中和し、さらにクロロホルム、メタノールを添加して、混合溶媒（クロロホルム／メタノール／水＝１／１／１、体積比）として抽出することによってセラミド産生促進剤であるスフィンゴイド類を調製した。得られたスフィンゴイド類を、トリメチルシリル化剤（東京化成工業社製、「Ｃ０３０６」）、トリメチルシリル化した。次いで、分析装置（Ａｇｉｌｅｎｔ社製、「６８９０Ｎ、５９７５Ｃ」）を用いてＧＣ−ＭＳ分析を行ったところ、得られたスフィンゴイド類は、４，８‐スフィンガジエニン（６６質量％）、４−ヒドロキシ‐８‐スフィンゲニン（２２質量％）、８−スフィンゲニン（４質量％）及びその他の微量スフィンゴイド（８質量％）の混合物であることが確認された。 Subsequently, the glucosylceramide powder was heated at 70 ° C. for 18 hours in 1N aqueous methanolic hydrochloric acid. Next, the fatty acid methyl ester is extracted and removed with hexane, neutralized with 4N NaOH, further added with chloroform and methanol, and extracted as a mixed solvent (chloroform / methanol / water = 1/1/1, volume ratio). Thus, sphingoids which are ceramide production promoters were prepared. The obtained sphingoids were trimethylsilylated with a trimethylsilylating agent (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., “C0306”). Subsequently, GC-MS analysis was performed using an analyzer (manufactured by Agilent, “6890N, 5975C”). As a result, the obtained sphingoids were 4,8-sphingadienine (66% by mass), 4 It was confirmed to be a mixture of -hydroxy-8-sphingenin (22% by mass), 8-sphingenin (4% by mass) and other trace sphingoids (8% by mass).
実施例１（セラミド産生促進剤の調製）
調製例１で得られたコンニャクとび粉由来スフィンゴイド類５ｍｇに、エタノール１ｍＬを加え、撹拌・溶解して、液剤であるセラミド産生促進剤を調製した。
Example 1 (Preparation of ceramide production promoter)
1 mL of ethanol was added to 5 mg of the konjac fly powder-derived sphingoids obtained in Preparation Example 1, and the mixture was stirred and dissolved to prepare a ceramide production promoter as a liquid.
実施例２［セラミド合成酵素セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）を用いた産生促進効果の評価］
正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ社製、「ＮＨＥＫ」）を、２．５×１０３細胞／ウェルとなるように、２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に播種した。その後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、インキュベーター（ＥＳＰＥＣ社製）を用いて培養を行った。３日に一度培地（クラボウ社製）交換を行いながら、８０％コンフレントな状態になるまで培養を継続した。
Example 2 [Evaluation of production promotion effect using ceramide synthase serine palmitoyltransferase (SPT)]
Normal human epidermal keratinocytes (Kurabo, “NHEK”) were seeded in a 24-well plate (IWAKI) at 2.5 × 10 3 cells / well. Thereafter, the cells were cultured using an incubator (manufactured by ESPEC) in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 . While changing the medium (made by Kurabo Industries) once every 3 days, the culture was continued until it became 80% confluent.
調製例１で得たスフィンゴイド類を、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度となるようにエタノール（ナカライテスク社製）に溶解して得られた溶液を、上述の培地から血清を除いたものに添加し、細胞に培地を交換することで作用させた。 A solution obtained by dissolving the sphingoids obtained in Preparation Example 1 in ethanol (manufactured by Nacalai Tesque) to a concentration of 1 μg / ml, 5 μg / ml, and 10 μg / ml The cells were allowed to act by exchanging the medium.
対照群として、４種類を用いた。すなわち、溶媒であるエタノール、およびセラミド産生促進効果を有する材料として既に報告されているナイアシンアミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度でエタノールに溶解させて得られた溶液を用いた。 Four types were used as control groups. That is, it is obtained by dissolving ethanol as a solvent and niacinamide (manufactured by Sigma Aldrich) already reported as a material having a ceramide production promoting effect in ethanol at concentrations of 1 μg / ml, 5 μg / ml, and 10 μg / ml. The resulting solution was used.
培地を交換した直後から、７２時間培養を行なった。７２時間経過後、該培地をプレートから除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、核酸抽出試薬であるＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を各ウェル５００μｌずつ添加し懸濁することで細胞中のＲＮＡを溶解させ、ＲＮＡを抽出した。次いで、逆転写酵素（タカラバイオ社製、ＲＲ０３７Ａ）をＲＮＡ１０００μｇあたり１μｌ添加し、ｃＤＮＡを得た。 The culture was performed for 72 hours immediately after the medium was changed. After 72 hours, the medium was removed from the plate, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then the nucleic acid extraction reagent ISOGEN (manufactured by Nippon Gene) was added and suspended in 500 μl per well. The RNA contained therein was dissolved, and RNA was extracted. Next, reverse transcriptase (Takara Bio, RR037A) was added at 1 μl per 1000 μg of RNA to obtain cDNA.
得られたｃＤＮＡを用い、リアルタイムＰＣＲ（アプライドシステムズジャパン社製）を使用して、ＳＰＴの遺伝子量の定量を行った。その定量結果を表１に示す。なお、表１においては、薬剤を添加せず、エタノール単独で定量を行ったものを基準値（１００）として評価を行った。 Using the obtained cDNA, the amount of SPT gene was quantified using real-time PCR (Applied Systems Japan). The quantitative results are shown in Table 1. In Table 1, the evaluation was carried out using a standard value (100) obtained by quantitative determination with ethanol alone without adding a drug.
表１から明らかなように、こんにゃくとび粉由来スフィンゴイド類を含有した本発明のセラミド産生促進剤は、従来のセラミド産生促進成分であるナイアシンアミドと比較して、強いＳＰＴ産生促進活性があること（つまり、セラミド産生促進効果に優れること）が示された。 As is clear from Table 1, the ceramide production promoter of the present invention containing konjac flying potato-derived sphingoids has a stronger SPT production promoting activity than niacinamide, which is a conventional ceramide production promoting component. (That is, it is excellent in the ceramide production promoting effect).
実施例３（スフィンゴイドの分子種別のＳＰＴ産生促進効果）
調製例１で得られたスフィンゴイド類を、カラムを用いて分画し精製を行った。精製は、球状シリカゲル（富士シリシア化学社製、「ＭＢ−４Ｂ」）（１００〜２００ｍｅｓｈ）を用いて、混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝５０／５０、６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、１００／０、体積比）のステップワイズ溶出により行った。精製したスフィンゴイド類を、試験管にフラクション別に分種した。
Example 3 (Sphingoid promoting effect of sphingoid molecular type)
The sphingoids obtained in Preparation Example 1 were fractionated using a column and purified. For purification, spherical silica gel (manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd., “MB-4B”) (100 to 200 mesh) is used, and a mixed solvent (chloroform / methanol = 50/50, 60/40, 70/30, 80/20, 90/10, 100/0, volume ratio). Purified sphingoids were classified into fractions in test tubes.
得られたそれぞれの試験管を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（島津製作所製、「ＣＬＡＳＳ−ＶＰ／ＬＣ−１０」）を用いて確認し、高純度であると思われるフラクションを回収した。その後、フラクションをエバポレーター（東京理化器械社製）を用いて乾固させることにより、スフィンゴイド類の各成分を得た。 Each of the obtained test tubes was confirmed using high performance liquid chromatography (HPLC) (manufactured by Shimadzu Corporation, “CLASS-VP / LC-10”), and a fraction considered to be high purity was collected. Then, each component of sphingoids was obtained by drying the fraction using an evaporator (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.).
次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ社製、「６８９０Ｎ、５９７５Ｃ」を用いてＧＣ−ＭＳ分析を行ったところ、得られたスフィンゴイド類の単離物は、４、８−スフィンガジエニン、４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニンであることが確認された。これに調製例１にて得られた精製前のスフィンゴイド類の混合物を加えた３種のスフィンゴイド類を、５μｇ／ｍｌの濃度となるようにエタノールに添加し、実施例２と同様の定量を行った。その定量結果を表２に示す。なお、表２においては、薬剤を添加せず、エタノール単独で定量を行ったものを基準値（１００）として評価を行った。 Subsequently, when GC-MS analysis was performed using “6890N, 5975C” manufactured by Agilent, the resulting sphingoid isolates were 4,8-sphingadienine, 4-hydroxy-8- It was confirmed to be sphingenin. Three kinds of sphingoids obtained by adding the mixture of sphingoids before purification obtained in Preparation Example 1 to this were added to ethanol so as to have a concentration of 5 μg / ml, and the same quantification as in Example 2 was performed. Went. The quantitative results are shown in Table 2. In Table 2, the evaluation was carried out using a standard value (100) obtained by quantitative determination with ethanol alone without adding a drug.
表２から明らかなように、スフィンゴイド類の混合物であるスフィンゴイド類を用いた場合より、４、８−スフィンガジエニン単独、もしくは４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン単独であるスフィンゴイド類を用いた場合は、より優れたセラミド産生促進効果を示すことがわかった。なかでも、４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニンは、特に優れたセラミド産生促進効果を示すことがわかった。 As is apparent from Table 2, when using sphingoids, which is a mixture of sphingoids, 4,8-sphingadienin alone or 4-syl-8-sphingenin alone is used. It was found that the ceramide production promoting effect was more excellent. Among these, 4-hydroxy-8-sphingenin was found to exhibit a particularly excellent ceramide production promoting effect.
実施例４（３次元皮膚モデルを使用したセラミド産生促進試験）
３次元皮膚モデルの角質バリア機能を向上させたモデルであるＬＳＥ−ｈｉｇｈ（東洋紡社）を使用し、調製例１で得られたスフィンゴイド類のセラミド産生促進効果を確認した。
Example 4 (Ceramide production promotion test using a three-dimensional skin model)
Using LSE-high (Toyobo Co., Ltd.), which is a model in which the keratin barrier function of the three-dimensional skin model is improved, the effect of promoting the ceramide production of the sphingoids obtained in Preparation Example 1 was confirmed.
ＬＳＥ−ｈｉｇｈを、到着後、付属の培地にて培養した。ここで、調製例１で得られたスフィンゴイド類を、５μｇ／ｍｌの濃度でエタノールに溶解させた溶液を培地に添加して、３日間培養を行った。なお、対照群としては、溶媒であるエタノール、およびナイアシンアミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を、５μｇ／ｍｌの濃度でエタノールに溶解させた溶液を用いた。 Upon arrival, LSE-high was cultured in the attached medium. Here, a solution in which the sphingoids obtained in Preparation Example 1 were dissolved in ethanol at a concentration of 5 μg / ml was added to the medium and cultured for 3 days. As a control group, a solution in which ethanol as a solvent and niacinamide (manufactured by Sigma Aldrich) were dissolved in ethanol at a concentration of 5 μg / ml was used.
３日間経過後、ＬＳＥ−ｈｉｇｈより表皮をはがし、混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝１／２、体積比）にてセラミドの抽出を行った。その後溶媒を回収し、この溶媒よりセラミドの抽出を行った。抽出後の溶媒を、さらに混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝１／１、体積比）にて溶解し、以下に示すような条件で薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を実施することで、セラミドの量を定量した。 After 3 days, the epidermis was peeled off from LSE-high, and ceramide was extracted with a mixed solvent (chloroform / methanol = 1/2, volume ratio). Thereafter, the solvent was recovered, and ceramide was extracted from the solvent. The solvent after extraction is further dissolved in a mixed solvent (chloroform / methanol = 1/1, volume ratio), and thin layer chromatography (TLC) is performed under the conditions shown below, whereby the amount of ceramide is reduced. Quantified.
（薄層クロマトグラフィー）
ＴＬＣ板（Ｍｅｒｃｋ社製、「ＨＰＴＬＣ Ｐｌａｔｅｓ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ６０」）を使用し、抽出液とセラミドの標準品（Ａｖａｎｔｉ社製）を使用して、ＴＬＣを実施した。
(Thin layer chromatography)
TLC was performed using a TLC plate (manufactured by Merck, “HPTLC Plates Silica gel 60”), and using an extract and a standard product of ceramide (manufactured by Avanti).
展開溶媒としては、以下の６種の溶媒を使用した。なお、以下の溶媒１〜６における、各々の溶媒の混合割合は体積比である。
溶媒１．クロロホルム
溶媒２．クロロホルム／アセトン／メタノール＝７６／８／１６
溶媒３．クロロホルム／酢酸ヘキシル／アセトン／メタノール＝８６／１／１０／４
溶媒４．クロロホルム／アセトン／メタノール＝７６／４／２０
溶媒５．クロロホルム／ジエチルエーテル／酢酸ヘキシル／酢酸エチル／アセトン／メタノール＝７２／４／１／４／１６／４
溶媒６．へキサン／ジエチルエーテル／酢酸エチル＝８０／１６／４
The following six solvents were used as developing solvents. In addition, the mixing ratio of each solvent in the following solvents 1 to 6 is a volume ratio.
Solvent 1. 1. chloroform solvent Chloroform / acetone / methanol = 76/8/16
Solvent 3. Chloroform / hexyl acetate / acetone / methanol = 86/1/10/4
Solvent 4. Chloroform / acetone / methanol = 76/4/20
Solvent 5. Chloroform / diethyl ether / hexyl acetate / ethyl acetate / acetone / methanol = 72/4/1/4/16/4
Solvent 6. Hexane / diethyl ether / ethyl acetate = 80/16/4
上記の溶媒を用いて展開を行い、その後、発色試薬混合溶媒に（酢酸／リン酸／水＝５／２／９５）に０．５質量％の濃度となるように硫酸銅を溶解させた水溶液を、ＴＬＣ板に塗布し、ヒートブロックを使用して加熱することで発色させた。発色させたＴＬＣ板をスキャナーで取り込んだ後、ＴＬＣ専用画像解析ソフトウェア（リポニクス社製、「Ｊｕｓｔ ＴＬＣ」）を使用して、セラミドのスポットを選択し、その濃さと大きさからセラミドの量を定量した。その定量結果を表３に示す。なお、表３においては、薬剤を添加せず、エタノール単独で定量を行ったものを基準値（１００）として評価を行った。 Development using the above solvent, and then an aqueous solution in which copper sulfate is dissolved in a coloring reagent mixed solvent (acetic acid / phosphoric acid / water = 5/2/95) to a concentration of 0.5 mass% Was applied to a TLC plate and colored by heating using a heat block. After loading the developed TLC plate with a scanner, select the ceramide spot using TLC dedicated image analysis software (Liponics, “Just TLC”) and quantify the amount of ceramide from its density and size. did. The quantitative results are shown in Table 3. In Table 3, the evaluation was carried out with the reference value (100) determined by quantification with ethanol alone without adding a drug.
表３から明らかなように、５μｇ／ｍｌの濃度でスフィンゴイド類を培地に添加することで、３次元皮膚モデルセラミドの産生を顕著に促進することが出来た。 As apparent from Table 3, the production of the three-dimensional skin model ceramide could be remarkably promoted by adding sphingoids to the medium at a concentration of 5 μg / ml.
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