JP2012037477A - センサチップおよびそれを用いたアッセイ法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、高感度かつ高精度であり、イムノアッセイに必要不可欠である特異性に優れたプラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法、アッセイ用装置ならびにアッセイ用キットを提供することを目的とする。
【解決手段】本発明のセンサチップは、透明支持体と、該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に固定化されたリガンドとを含むプラズモン励起センサ、および該プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている面側に、リガンドに接することなく、該面と略平行に設けられた流路天板を有するセンサチップであって、該プラズモン励起センサと該流路天板との間（流路）に光学ノイズ吸収剤からなる層が含有されることを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、センサチップおよびそれを用いたアッセイ法、該アッセイ用装置ならびに該アッセイ用キットに関する。さらに詳しくは、本発明は、基板と金属薄膜とリガンドとを含むプラズモン励起センサおよび流路天板を有し、その間に光学ノイズ吸収剤からなる層を含有するセンサチップ、および表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ〕の原理に基づき該センサチップを用いたアッセイ法、該アッセイ用装置ならびに該アッセイ用キットに関する。

ＳＰＦＳ〔表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕において、全反射条件で増強されたプラズモン波のみが立ち、蛍光色素の励起光としてのみ働くのが好ましいが、現実的には、迷光、散乱光、プラズモン発生に伴うプラズモン散乱光などが混在する。これらはすべてプラズモン励起光と同一の波長なので、カットフィルタ等でカットしシグナルとしての蛍光と分離する。

例えば、特許文献１には、一般的なカットフィルタが配置されたＳＰＦＳ装置が開示されており、ノイズ源となる励起光や測定上不要な波長成分をカットする構造が開示されている。一方、特許文献２には、励起光と、発生する蛍光等との分離を完全に行うことを目的として、分子認識物質の作用によって発光強度が変化する発光物質を含有したＳＰＦＳセンサが開示されている。

しかしながら、ノイズの除去率を向上すれば蛍光シグナルもカットされるため自ずと限界がある。

特開２００９−２０４４８４号公報 特表２００１−５２３８１９号公報

本発明は、高感度かつ高精度であり、イムノアッセイに必要不可欠である特異性に優れたプラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法、アッセイ用装置ならびにアッセイ用キットを提供することを目的とする。

従来のＳＰＦＳ装置またはＳＰＦＳセンサで高感度化を追求すると、本来問題にならなかったレーザ光源の揺らぎから発生される励起光周辺の波長を有する光、あるいは一般的にはないと考えられているガラス材料、樹脂材料から発生する励起光周辺の波長を有する自家蛍光が問題であることが判明した。また、極微量の迷光、散乱光も微量シグナル検出の障害となるため、蛍光シグナル光以外の前記微量ノイズ光除去手段が望まれている。

本発明者らは、このような問題を解決すべく鋭意検討した結果、基板と金属薄膜とリガンドとを含むプラズモン励起センサと流路天板との間に光学ノイズ吸収剤からなる層を配置することによって、プラズモン発生直後に一定量の光学ノイズを吸収し、光学ノイズの絶対量を低減させることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明のセンサチップは、透明支持体と、該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に固定化されたリガンドとを含むプラズモン励起センサ、および該プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている面側に、リガンドに接することなく、該面と略平行に設けられた流路天板を有するセンサチップであって、該プラズモン励起センサと該流路天板との間（流路）に光学ノイズ吸収剤からなる層が含有されることを特徴とする。

上記光学ノイズ吸収剤からなる層は、上記金属薄膜の、上記透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成され、上記リガンドは、該光学ノイズ吸収剤からなる層の、該薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化されていること、上記流路天板の、上記プラズモン励起センサ側の一方の面に形成され、かつ該層は、リガンドに接することのないこと、または光学ノイズ吸収剤と、少なくとも該吸収剤を溶解する溶媒とを含み、上記プラズモン励起センサと上記流路天板との間（流路）を満たすことが好ましく、光学ノイズ吸収剤と高分子とを含むか、または誘電体と該誘電体の表面にシランカップリング剤を介して固定化されている光学ノイズ吸収剤とを含むことが好ましく、該光学ノイズ吸収剤は、顔料または染料であることが好ましい。

上記金属薄膜は、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されていることが好ましい。
また、本発明のアッセイ法（Ｉ）および（ＩＩ）は、それぞれ下記工程（ａ）〜（ｄ）および下記工程（ｅ）〜（ｈ）を含むことを特徴とする。

工程（ａ）：透明支持体と、該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に固定化された第１のリガンドとを含むプラズモン励起センサ、および該プラズモン励起センサの該リガンドが固定化されている面側に、該リガンドに接することなく、該面と略平行に設けられた流路天板を有するセンサチップであって、該プラズモン励起センサと該流路天板との間（流路）に光学ノイズ吸収剤からなる層が含有されるセンサチップに、検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたセンサチップに、さらに第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程；
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたセンサチップに、該透明支持体の、該金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程；および
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程；ならびに
工程（ｅ）：透明支持体と、該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に固定化された第１のリガンドとを含むプラズモン励起センサ、および該プラズモン励起センサの該リガンドが固定化されている面側に、該リガンドに接することなく、該面と略平行に設けられた流路天板を有するセンサチップに、検体を接触させる工程；
工程（ｆ）：該工程（ｅ）を経て得られたセンサチップに、さらに第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程；
工程（ｇ）：光学ノイズ吸収剤と、少なくとも該吸収剤を溶解する溶媒とを含み、上記プラズモン励起センサと上記流路天板との間（流路）を満たしながら、該工程（ｆ）を経て得られたセンサチップに、該透明支持体の、該金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程；および
工程（ｈ）：該工程（ｇ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。

上記アッセイ法（Ｉ）に記載の上記光学ノイズ吸収剤からなる層は、上記金属薄膜の、上記透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成され、上記リガンドは、該光学ノイズ吸収剤からなる層の、該薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化されていること、または上記流路天板の、上記プラズモン励起センサ側の一方の面に形成され、かつ該層は、リガンドに接することのないことが好ましく、光学ノイズ吸収剤と高分子とを含むか、または誘電体と該誘電体の表面にシランカップリング剤を介して固定化されている光学ノイズ吸収剤とを含むことが好ましい。

上記光学ノイズ吸収剤は、顔料または染料であることが好ましい。
上記金属薄膜は、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されていることが好ましい。

上記検体は、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液を含むことが好ましい。
本発明の装置は、少なくとも、上記工程（ｂ）または（ｆ）を経て得られたプラズモン励起センサ、レーザ光の光源、光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよび表面プラズモン励起増強蛍光検出部を含み、上記工程（ｃ）または（ｇ）に用いられることを特徴とする。

本発明のキットは、少なくとも、透明支持体と上記金属薄膜とを含むセンサおよび光学ノイズ吸収剤を含み、上記アッセイ法（Ｉ）または（ＩＩ）に用いられることを特徴とする。

本発明は、プラズモン発生直後に一定量の外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）およびプラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）を除去し、光学ノイズの絶対量を極限まで低減させ、高感度化に寄与できるセンサチップおよびそれを用いたアッセイ法、アッセイ用装置ならびにアッセイ用キットを提供することができる。

図１（１）〜（３）はそれぞれ、本発明に係るセンサチップ（１）〜（３）の一態様の断面概略図を示す。

次に、本発明のセンサチップ、アッセイ法、装置およびキットについて具体的に説明する。
まず、本発明のセンサチップについて、図１を用いて具体的に説明する。

＜センサチップ＞
本発明のセンサチップは、「透明支持体」１と、該支持体の一方の表面に形成された「金属薄膜」２と、該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に固定化された「リガンド」３とを含むプラズモン励起センサ、および該プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている面側に、リガンドに接することなく、該面と略平行に設けられた「流路天板」４を有するセンサチップであって、該プラズモン励起センサと該流路天板との間（流路）に「光学ノイズ吸収剤からなる層」５が含有されることを特徴とするものである。

該光学ノイズ吸収剤からなる層（以下「光学ノイズ吸収層」ともいう。）５は、符号１１のセンサチップ（１）、符号１２のセンサチップ（２）および符号１３のセンサチップ（３）の態様を含むことが好ましく、光学ノイズの絶対量を極限まで低減させるという効果がより顕著であり、実際の測定操作が容易なことから、センサチップ（３）が望ましく、センサチップ（２）がより望ましく、センサチップ（１）が特に望ましい。

（透明支持体）
本発明で用いられる透明支持体１としては、ガラス製であっても、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製であってもよく、屈折率〔ｎｄ〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。

なお、ガラス製の透明支持体は、市販品として、ＳＣＨＯＴＴ ＡＧ社製のＢＫ７（屈折率〔ｎｄ〕１.５２）およびＬａＳＦＮ９（屈折率〔ｎｄ〕1.８５）、（株）住田光学ガラス製のＫ−ＰＳＦｎ３（屈折率〔ｎｄ〕１．８４）、Ｋ−ＬａＳＦｎ１７（屈折率〔ｎｄ〕１．８８）およびＫ−ＬａＳＦｎ２２（屈折率〔ｎｄ〕１．９０）、（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎｄ〕１．７２）などが光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。

透明支持体は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製のＰＤＣ２００）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。

（金属薄膜）
上記透明支持体１の一方の表面に形成された金属薄膜２としては、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなることが望ましく、これら金属の合金であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。

なお、透明支持体１としてガラス製平面基板を用いる場合に限り、ガラスと金属薄膜２とをより強固に接着することができることから、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。

透明支持体１上に金属薄膜２を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜を形成することが好ましい。

金属薄膜２の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。

電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。

金属薄膜２の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜２であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。

（リガンド）
リガンド３とは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などであれば、特に限定されない。

「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。

なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
リガンド３の固定化方法については、センサチップ（１）の項目で説明する。

（流路天板）
本発明において、流路天板４とは、プラズモン励起センサとともに流路を形成するための一部であり、プラズモン励起センサと流路を挟んで対面している。その流路とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる角筒状または丸筒（管）状のものである。

流路天板４の材料としては、例えば、メチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
流路天板４の大きさは、プラズモン励起センサと同程度の大きさを有することが好ましいが、本発明は特に限定されない。

（光学ノイズ吸収剤）
本発明において、プラズモン発生直後に一定量の外光、励起光、迷光およびプラズモンの散乱光を含む光学ノイズを吸収するために用いられる光学ノイズ吸収剤は、顔料または染料であることが好ましい。なお、後述する検体と光学ノイズ吸収剤とを混合する場合（センサチップ（３）の態様）、光学ノイズ吸収剤は、水溶性基を有する水溶性の構造とする必要があるが、プラズモン励起センサまたは流路天板４に固定化する場合（センサチップ（１）または（２）の態様）は疎水性であってもよい。

このような顔料または染料は、金属薄膜２を形成する金属種およびプリズムを通して照射されるレーザ光の波長によって適宜選択され、それらの例示化合物を表１に示す。

以下、具体的な光学ノイズ吸収剤として有用な染料の例を挙げる。光学ノイズ吸収剤からなる層としてセンサチップに形成する場合は、油溶性染料、分散染料および顔料が好ましい。

油溶性染料としては、例えば、オリエント化学工業（株）製のＶａｌｉｆａｓｔ Ｙｅｌｌｏｗ ４１２０、Ｖａｌｉｆａｓｔ Ｙｅｌｌｏｗ ３１５０、Ｖａｌｉｆａｓｔ Ｙｅｌｌｏｗ ３１０８、Ｖａｌｉｆａｓｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２３１０Ｎ、Ｖａｌｉｆａｓｔ Ｙｅｌｌｏｗ １１０１、Ｖａｌｉｆａｓｔ Ｒｅｄ ３３２０、Ｖａｌｉｆａｓｔ Ｒｅｄ ３３０４、Ｖａｌｉｆａｓｔ Ｒｅｄ １３０６、Ｖａｌｉｆａｓｔ Ｂｌｕｅ ２６１０、Ｖａｌｉｆａｓｔ Ｂｌｕｅ ２６０６、Ｖａｌｉｆａｓｔ Ｂｌｕｅ １６０３、Ｏｉｌ Ｙｅｌｌｏｗ ＧＧ−Ｓ、Ｏｉｌ Ｙｅｌｌｏｗ ３Ｇ、Ｏｉｌ Ｙｅｌｌｏｗ １２９、Ｏｉｌ Ｙｅｌｌｏｗ １０７、Ｏｉｌ Ｙｅｌｌｏｗ １０５、Ｏｉｌ Ｓｃａｒｌｅｔ ３０８、Ｏｉｌ Ｒｅｄ ＲＲ、Ｏｉｌ Ｒｅｄ ＯＧ、Ｏｉｌ Ｒｅｄ ５、Ｏｉｌ Ｐｉｎｋ ３１２、Ｏｉｌ Ｂｌｕｅ ＢＯＳ、Ｏｉｌ Ｂｌｕｅ ６１３、Ｏｉｌ Ｂｌｕｅ ２Ｎ、Ｏｉｌ Ｂｌａｃｋ ＢＹ、Ｏｉｌ Ｂｌａｃｋ ＢＳ、Ｏｉｌ Ｂｌａｃｋ ８６０、Ｏｉｌ Ｂｌａｃｋ ５９７０、Ｏｉｌ Ｂｌａｃｋ ５９０６、Ｏｉｌ Ｂｌａｃｋ ５９０５；日本化薬（株）製のＫａｙａｓｅｔ Ｙｅｌｌｏｗ ＳＦ−Ｇ、Ｋａｙａｓｅｔ Ｙｅｌｌｏｗ Ｋ−ＣＬ、Ｋａｙａｓｅｔ Ｙｅｌｌｏｗ ＧＮ、Ｋａｙａｓｅｔ Ｙｅｌｌｏｗ Ａ−Ｇ、Ｋａｙａｓｅｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２Ｇ、Ｋａｙａｓｅｔ Ｒｅｄ ＳＦ−４Ｇ、Ｋａｙａｓｅｔ Ｒｅｄ Ｋ−ＢＬ、Ｋａｙａｓｅｔ Ｒｅｄ Ａ−ＢＲ、Ｋａｙａｓｅｔ Ｍａｇｅｎｔａ ３１２、Ｋａｙａｓｅｔ Ｂｌｕｅ Ｋ−ＦＬ；有本化学工業（株）製のＦＳ Ｙｅｌｌｏｗ １０１５、ＦＳ Ｍａｇｅｎｔａ １４０４、ＦＳ Ｃｙａｎ １５２２、ＦＳ Ｂｌｕｅ １５０４、Ｃ．Ｉ．Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ８８、８３、８２、７９、５６、２９、１９、１６、１４、０４、０３、０２、０１、Ｃ．Ｉ．Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｒｅｄ ８４：１、Ｃ．Ｉ．Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｒｅｄ ８４、２１８、１３２、７３、７２、５１、４３、２７、２４、１８、０１、Ｃ．Ｉ．Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂｌｕｅ ７０、６７、４４、４０、３５、１１、０２、０１、Ｃ．Ｉ．Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂｌａｃｋ ４３、７０、３４、２９、２７、２２、７、３、Ｃ．Ｉ．Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ３、Ｃ．Ｉ．Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｇｒｅｅｎ ３および７、Ｐｌａｓｔ Ｙｅｌｌｏｗ ＤＹ３５２、Ｐｌａｓｔ Ｒｅｄ ８３７５；三井化学（株）製のＭＳ Ｙｅｌｌｏｗ ＨＤ−１８０、ＭＳ Ｒｅｄ Ｇ、ＭＳ Ｍａｇｅｎｔａ ＨＭ−１４５０Ｈ、ＭＳ Ｂｌｕｅ ＨＭ−１３８４；住友化学（株）製のＥＳ Ｒｅｄ ３００１、ＥＳ Ｒｅｄ ３００２、ＥＳ Ｒｅｄ ３００３、ＴＳ Ｒｅｄ ３０５、ＥＳ Ｙｅｌｌｏｗ １００１、ＥＳ Ｙｅｌｌｏｗ １００２などが挙げられる。

また、分散染料としてしては、例えば、Ｃ．Ｉ．ディスパーズイエロー ５、４２、５４、６４、７９、８２、８３、９３、９９、１００、１１９、１２２、１２４、１２６、１６０、１８４：１、１８６、１９８、１９９、２０４、２２４および２３７；Ｃ．Ｉ．ディスパーズオレンジ １３、２９、３１：１、３３、４９、５４、５５、６６、７３、１１８、１１９および１６３；Ｃ．Ｉ．ディスパーズレッド ５４、６０、７２、７３、８６、８８、９１、９２、９３、１１１、１２６、１２７、１３４、１３５、１４３、１４５、１５２、１５３、１５４、１５９、１６４、１６７：１、１７７、１８１、２０４、２０６、２０７、２２１、２３９、２４０、２５８、２７７、２７８、２８３、３１１、３２３、３４３、３４８、３５６および３６２；Ｃ．Ｉ．ディスパーズバイオレット ３３；Ｃ．Ｉ．ディスパーズブルー ５６、６０、７３、８７、１１３、１２８、１４３、１４８、１５４、１５８、１６５、１６５：１、１６５：２、１７６、１８３、１８５、１９７、１９８、２０１、２１４、２２４、２２５、２５７、２６６、２６７、２８７、３５４、３５８、３６５および３６８ならびにＣ．Ｉ．ディスパーズグリーン ６：１および９等；ＴＳ Ｙｅｌｌｏｗ １１８、ＥＳ Ｏｒａｎｇｅ ２００１、ＥＳ Ｂｌｕｅ ６００１、ＴＳ Ｔｕｒｑ Ｂｌｕｅ ６１８；Ｂａｙｅｒ社製のＭＡＣＲＯＬＥＸ Ｙｅｌｌｏｗ ６Ｇ、Ｃｅｒｅｓ Ｂｌｕｅ ＧＮＮＥＯＰＡＮ Ｙｅｌｌｏｗ Ｏ７５、Ｃｅｒｅｓ Ｂｌｕｅ ＧＮ、ＭＡＣＲＯＬＥＸ Ｒｅｄ Ｖｉｏｌｅｔ Ｒ等が挙げられる。

本発明で用いることができる顔料は、特に限定されないが、散乱を発生させないために、その粒径としては、体積平均粒径で５０ｎｍ以下が好ましい。ブラック顔料であるカーボンブラックとしては、ファーネス法やチャネル法で製造されたカーボンブラックであってもよく、一次粒径が１５〜４０ｎｍ、ＢＥＴ法による比表面積が５０〜３００ｍ²／ｇ、ＤＢＰ吸油量が４０〜１５０ｍｌ／１００ｇ、揮発分が０．５〜１０質量％、ｐＨ値が２〜９を有するものが好ましい。このようなカーボンブラックとしては、例えば、Ｎｏ．２３００、Ｎｏ．９００、ＭＣＦ８８、Ｎｏ．４０、Ｎｏ．５２、ＭＡ７、ＭＡ８、Ｎｏ．２２００Ｂ（以上、三菱化成（株）製）；ＲＡＶＥＮ１２５５（コロンビア・インダストリアル社製）；ＲＥＧＡＬ４００Ｒ、ＲＥＧＡＬ６６０Ｒ、ＭＯＧＵＬ Ｌ（以上、キヤボット社製）；Ｃｏｌｏｒ Ｂｌａｃｋ ＦＷ１、Ｃｏｌｏｒ Ｂｌａｃｋ ＦＷ１８、Ｃｏｌｏｒ Ｂｌａｃｋ Ｓ１７０、Ｃｏｌｏｒ Ｂｌａｃｋ Ｓ１５０、Ｐｒｉｎｔｅｘ ３５、Ｐｒｉｎｔｅｘ Ｕ（以上、デグッサ社製）等が挙げられる。

イエロー顔料としては、例えば、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ３、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １３、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １６、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ７４、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ８３、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １２８、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １３８等が挙げられる。

マゼンタ顔料としては、例えば、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ ５、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ ７、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ １２、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ ４８（Ｃａ）、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ ４８（Ｍｎ）、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ ５７（Ｃａ）、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ １１２、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ １２２、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ １９等が挙げられる。

シアン顔料としては、例えば、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ １、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ ２、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ ３、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ １５：３、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ １５：４、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ １６、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ ２２、Ｃ．Ｉ．Ｖａｔ Ｂｌｕｅ ４、Ｃ．Ｉ．Ｖａｔ Ｂｌｕｅ ６等が挙げられる。

検出時に、光学ノイズ吸収剤を送液（反応溶液）に添加する場合は、水溶性染料が好ましい。水溶性染料の好ましい例としては、Ｃ．Ｉ．アシッドイエロー１７，２３，４２，４４，７９，１４２、Ｃ．Ｉ．アシッドレッド５２，８０，８２，２４９，２５４，２８９、Ｃ．Ｉ．アシッドブルー９，４５，２４９、Ｃ．Ｉ．アシッドブラック１，２，２４，９４、Ｃ．Ｉ．フードブラック１，２、Ｃ．Ｉ．ダイレクトイエロー１，１２，２４，３３，５０，５５，５８，８６，１３２，１４２，１４４，１７３、Ｃ．Ｉ．ダイレクトレッド１，４，９，８０，８１，２２５，２２７、Ｃ．Ｉ．ダイレクトブルー１，２，１５，７１，８６，８７，９８，１６５，１９９，２０２、Ｃ．Ｉ．ダイレクドブラック１９，３８，５１，７１，１５４，１６８，１７１，１９５、Ｃ．Ｉ．リアクティブレッド１４，３２，５５，７９，２４９、Ｃ．Ｉ．リアクティブブラック３，４，３５が挙げられる。

〔センサチップ（１）〕
センサチップ（１）は、図１（１）に示されるように、光学ノイズ吸収剤からなる層５が、金属薄膜２の、透明支持体１とは接していないもう一方の表面に形成され、リガンド３が、光学ノイズ吸収剤からなる層５の、金属薄膜２とは接していないもう一方の表面に固定化されていることが好ましい。

センサチップ（１）に含まれる光学ノイズ吸収剤からなる層５は、（ｉ）光学ノイズ吸収剤と高分子とを含むか、または（ｉｉ）誘電体と該誘電体の表面にシランカップリング剤を介して固定化されている光学ノイズ吸収剤とを含むことが好ましく、該（ｉ）はさらに下記（ｉ−１）および（ｉ−２）の態様を含むことが望ましい。

このような光学ノイズ吸収剤からなる層５は、作製の容易さおよびコスト削減の観点から、好ましくは（ｉｉ）、より好ましくは（ｉ−２）、特に好ましくは（ｉ−１）である。

（ｉ）光学ノイズ吸収剤と高分子とを含む態様：
（ｉ−１）このような高分子としては、リガンド３を金属薄膜２に固定化するために用いられ、例えば、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕のような厚みのある支持体、ＳＡＭまたは反応基を有するポリエチレングリコール、イミノジ酢酸誘導体（（Ｎ−５−ａｍｉｎｏ−１−ｃａｒｂｏｘｙｐｅｎｔｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ等）、結合様式としてのビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧなどが挙げられる。これらのうち、高感度化するためにリガンドを集積し易いの観点から、カルボキシメチルデキストランが好ましい。なお、これら高分子は１種単独でも２種以上併用してもよい。

光学ノイズ吸収剤は、固定化する場合、染料の官能基（例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基）に、該官能基と反応性のシランカップリング剤またはＳＡＭを結合させた後、金属基板または金属基板表面を被覆した誘電体層に固定するか、高分子材料に含浸して被膜を形成することにより形成される。高分子に疎水性染料を溶解または顔料を分散させてスピンコータで塗布することが、精度よく染料濃度を制御できることから、より好ましい。これらの方法により、厚さ０．０１〜１０μｍの光学ノイズ吸収剤からなる層５を形成する。

上述した、光学ノイズ吸収剤を固定化するために用いられるポリマーは、主な官能基としてアセタール基を含有するポリマー、炭酸エステル基を含有するポリマー、水酸基を含有するポリマー、およびエステル基を有するポリマーが好ましい。

アセタールを含有するポリマーとして好ましくは、ポリビニルブチラール樹脂であり、例えば、電気化学工業（株）製の＃２０００−Ｌ、＃３０００−１、＃３０００−２、＃３０００−４、＃３０００−Ｋ、＃４０００−１、＃４０００−２、＃５０００−Ａ、＃６０００−Ｃ、＃６０００−ＥＰ；または積水化学工業（株）製のＢＬ−１、ＢＬ−１Ｈ、ＢＬ−２、ＢＬ−２Ｈ、ＢＬ−５、ＢＬ−１０、ＢＬ−Ｓ、ＢＬ−ＳＨ、ＢＸ−１０、ＢＸ−Ｌ、ＢＭ−１、ＢＭ−２、ＢＭ−５、ＢＭ−Ｓ、ＢＭ−ＳＨ、ＢＨ−３、ＢＨ−６、ＢＨ−Ｓ、ＢＸ−１、ＢＸ−３、ＢＸ−５、ＫＳ−１０、ＫＳ−１、ＫＳ−３、ＫＳ−５などが挙げられる。

主な官能基として炭酸エステルを含有するポリマーとしては、ポリカーボネート樹脂であり、例えば、三菱エンジニアリングプラスチックス（株）製のユーピロンシリーズ、ノバレックスシリーズなどが挙げられる。

主な官能基として水酸基を含有するポリマーとしては、例えば、ＰＶＡがあり、例えば、（株）クラレ製のポバールＰＶＡ−１０２、ＰＶＡ−１１７、ＰＶＡ−ＣＳＡ、ＰＶＡ−６１７、ＰＶＡ−５０５などが挙げられる。

主な官能基としてエステル基を含有するポリマーとしては、ポリエステルであってもよく、例えば、日本ユピカ（株）製の４５１６、４７００、５８３４、６４００等が挙げられる。また、メタクリル系の樹脂であってもよく、例えば、旭化成（株）製のデルペットシリーズの５６０Ｆ、６０Ｎ、８０Ｎ、ＬＰ−１、ＳＲ８５００、ＳＲ６５００などを用いることができる。

また、本発明では、エチレン性不飽和結合を有するモノマーを重合して調製できるビニル系樹脂も好ましく用いることができ、スチレン樹脂、アクリル系樹脂も好ましく用いることができる。他に用いることのできる樹脂としては、例えば、スチレン、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル等の単量体を、ラジカル重合、カチオン重合、アニオン重合等の既存の方法で重合して用いることができる。

このように形成した光学ノイズ吸収剤からなる層５にリガンド３を固定化する方法としては、高分子が有する水酸基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネート基などの官能基（好ましくは、水酸基、およびカルボキシル基）とリガンド３が有する官能基（免疫反応促進能や非特異吸着反応抑制能を勘案し、高分子が有する官能基と適宜組み合わせることが好ましい。）とで反応させて化学結合を形成する方法などが挙げられる。

リガンド３の好ましい固定化量は、モル吸光係数によっても異なるが、上述の染料のモル吸光係数は概ね２万〜１０万であることから、固定化濃度としては、０．１Ｍ〜０．０００１Ｍである。

（ｉ−２）このような高分子としては、例えば、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリスチレン-アクリレート、ポリスチレン、ポリビニルブチラール、ポリエステルなどのポリマーが挙げられる。これらのうち、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリスチレンおよびポリビニルブチラールは、光学ノイズ吸収剤との相溶性に優れ、非特異的な吸着（例えば、蛋白質（アルブミン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン）、脂質、糖類（グルコース）などの吸着）を抑制することができるため好適である。なお、これらポリマーは１種単独でも２種以上併用してもよい。

光学ノイズ吸収剤は、ポリマーとともに溶剤に溶解し、得られた組成物を金属薄膜２の透明支持体１に接していない一方の表面に塗布し乾燥する（溶剤を揮発する）ことによって固定化することができ、厚さ０．０１〜１０μｍの光学ノイズ吸収剤からなる層５を形成する。

「溶剤」としては、揮発性が高ければ特に限定されず、例えば、メチルエチルケトン〔ＭＥＫ〕、アセトン等のケトン類；トルエン、キシレン等の芳香族類；酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類；ジクロロメタン、ジクロロエタン、テトラフルオロプロパン等の含ハロゲン系炭化水素類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ターシャリブタノール、テトラフルオロプロパノール等のアルコール類；ジエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル等のエーテル類；エチレングリコール等のグリコール類などが挙げられる。これらのうち、ポリマーの溶解安定性の観点から、ケトン類、芳香族類、エステル類、含ハロゲン系炭化水素類が好ましい。

「組成物」は、光学ノイズ吸収剤、ポリマーおよび溶剤以外に、必要に応じて酸化防止剤などの添加剤も含有することができる。
「酸化防止剤」としては、例えば、ペンタエリスリチルテトラキス［３−(３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)］プロピオネート、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，２’−ジオキシ−３，３’−ジ−ｔ−ブチル−５，５’−ジメチルジフェニルメタン、テトラキス［メチレン−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］メタンなどが挙げられる。

このように形成した光学ノイズ吸収剤からなる層５の総量（１００重量％）に対して、光学ノイズ吸収剤は１〜７５重量％が好ましく、３０〜７０重量％がより好ましく、ポリマーは２５〜９９重量％が好ましく、７０〜３０重量％がより好ましい。光学ノイズ吸収剤およびポリマーの含有量が上記範囲内であると、消光の効率が良好である。

また、溶剤は、組成物１００重量部に対して、１００〜１,０００重量部が好ましく、１００〜５００重量部がより好ましい。添加剤は、組成物１００重量部に対して、０．１〜１０重量部が好ましく、１〜５重量部がより好ましい。溶剤または添加剤の配合量が上記範囲内であると、塗布性が良く、蛍光量子収率の低下を起さないため好適である。

「塗布」する方法としては、特に限定されないが、例えば、スピンコート法、ワイヤーコート法、バーコート法、ロールコート法、ブレードコート法、カーテンコート法、スクリーン印刷法などが挙げられ、組成物を金属薄膜２の表面に塗布後、通常２０〜１００℃で、５〜３０分間乾燥させる。

リガンド３の固定化方法としては、ポリマーが有する水酸基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネート基などの官能基（好ましくは、水酸基およびカルボキシル基）とリガンド３が有する官能基（免疫反応促進能や非特異吸着反応抑制能を勘案し、ポリマーが有する官能基と適宜組み合わせることが好ましい。）とで反応させて化学結合を形成する方法、２感応性反応基を有する化合物（例えば、シランカップリング剤など）を介してリガンド３を固定化する方法などが挙げられる。

「シランカップリング剤」としては、加水分解でシラノール基（Ｓｉ-ＯＨ）を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、他端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されず、従来公知のシランカップリング剤を用いることができる。

シランカップリング剤以外には、リガンド３の固定化能に優れることから、例えば、カルボキシメチルデキストラン、ポリエチレングリコール、イミノジ酢酸誘導体（（Ｎ−５−ａｍｉｎｏ−１−ｃａｒｂｏｘｙｐｅｎｔｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ等）、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧなども好適である。

シランカップリング剤を用いる場合、リガンドの固定化方法の具体例として、まず金薄薄膜２が形成されている透明支持体１を、通常０．１〜１０％、好ましくは０．５％の濃度でシランカップリング剤を含む水溶液に３０分〜２時間浸漬後、室温の場合：通常１〜２４時間、好ましくは１０時間；１００℃の場合：通常１０分〜１時間、好ましくは３０分の乾燥を行い、この後、通常、上記基板を水で洗浄する。この時点で、シランカップリング剤の一方の末端が加水分解して得られたシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）を光学ノイズ吸収剤からなる層５側にして並べた単分子膜が形成されている。シランカップリング剤からなる単分子膜の外側には、シランカップリング剤が有するアミノ基やカルボキシル基が露出している状態となっている。

次に、リガンド３が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、シランカップリング剤が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる。

その他の好ましい方法の具体例としては、光学ノイズ吸収剤からなる層５内のポリマーのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、リガンド３が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる。

（ｉｉ）誘電体と該誘電体の表面にシランカップリング剤を介して固定化されている光学ノイズ吸収剤とを含む態様：
このような「誘電体」は、金属薄膜２による蛍光色素の金属消光を防止することを目的として、金属薄膜２の、透明支持体１と接していないもう一方の表面に形成したものであって、該誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもでき、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）または二酸化チタン（ＴｉＯ₂）を含むことが好ましい。

誘電体の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。

光学ノイズ吸収剤は、金属薄膜２の表面に形成された誘電体の表面にシランカップリング剤を介して固定化することができ、光学ノイズ吸収剤からなる層５を形成する。
「シランカップリング剤」としては、加水分解でシラノール基（Ｓｉ-ＯＨ）を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、他端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されず、従来公知のシランカップリング剤を用いることができる。

光学ノイズ吸収剤からなる層５の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、３０ｎｍ以下が好ましく、１０〜２０ｎｍがより好ましい。また、電場増強の観点からは、２００ｎｍ〜１ｍｍが好ましく、電場増強効果の安定性の観点からは、４００〜１,６００ｎｍが好ましい。プラズモン励起センサが、今後、大量生産される際、該センサが有するスペーサ層の厚さが変動することが想定され、特に４００ｎｍ以上の厚さを有すると共鳴角の変動が一層大きくなる可能性があるため、測定の安定性を確保する目的から、該スペーサ層の厚さとして、特に１０〜２０ｎｍが好ましい。

リガンド３の固定化方法としては、金属基板上に被覆したＳｉＯ₂上に３−アミノプロピルトリエトキシシランまたは２−カルボキシエチルトリエトキシシランを常法により固定化し、部分的にカルボキシル基またはアミノ基を官能基として有する染料をアミンカップリングにより固定化し、さらにリガンドを同様にアミンカップリングで形成する方法が好ましい。

〔センサチップ（２）〕
センサチップ（２）は、図１（２）に示されるように、光学ノイズ吸収剤からなる層５が、流路天板４の、上記プラズモン励起センサ側の一方の面に形成され、かつ光学ノイズ吸収剤からなる層５は、リガンド３に接することのないことが好ましい。
光学ノイズ吸収剤からなる層５は、リガンド３を固定化しないこと以外は、センサチップ（１）に含まれる光学ノイズ吸収剤からなる層５と同様に形成することができる。

〔センサチップ（３）〕
センサチップ（３）は、図１（３）に示されるように、光学ノイズ吸収剤からなる層５が、上記光学ノイズ吸収剤と、少なくとも該吸収剤を溶解する溶媒とを含み、上記プラズモン励起センサと流路天板４との間（流路）を満たすことが好ましい。

このような「溶媒」としては、後述する送液と同様のもの、すなわち、下記検体を希釈するための溶媒または緩衝液を用いることが好ましく、具体的には、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕、トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕などが挙げられるが、本発明においては特に限定されるものではない。

光学ノイズ吸収剤の濃度は、１〜１０００μモル/ｍｌが好ましく、１〜１００μモル/ｍｌがより好ましい。光学ノイズ吸収剤の濃度が上記範囲内であると、Ｓ／Ｎ比が向上するため好適である。

＜アッセイ法＞
本発明のアッセイ法は、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とするアッセイ法（Ｉ）または下記工程（ｅ）〜（ｈ）を含むことを特徴とするアッセイ法（ＩＩ）を含むものである。

〔アッセイ法（Ｉ）〕
アッセイ法（Ｉ）は、下記工程（ａ）〜（ｄ）、好ましくはさらに洗浄工程を含むことを特徴とするものである。

工程（ａ）：透明支持体と、該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に固定化された第１のリガンドとを含むプラズモン励起センサ、および該プラズモン励起センサの該リガンドが固定化されている面側に、該リガンドに接することなく、該面と略平行に設けられた流路天板を有するセンサチップであって、該プラズモン励起センサと該流路天板との間（流路）に光学ノイズ吸収剤からなる層が含有されるセンサチップに、検体を接触させる工程。

工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたセンサチップに、さらに第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程。
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたセンサチップに、該透明支持体の、該金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程。

工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
洗浄工程：上記工程（ａ）を経て得られたセンサチップの表面および／または上記工程（ｂ）を経て得られたセンサチップの表面を洗浄する工程。
以下、本発明のアッセイ法（Ｉ）について、図１を用いて具体的に説明する。

［工程（ａ）］
工程（ａ）とは、「透明支持体」１と、該支持体１の一方の表面に形成された「金属薄膜」２と、該薄膜２の、該支持体１とは接していないもう一方の表面に固定化された「第１のリガンド」とを含むプラズモン励起センサ、および該プラズモン励起センサの該リガンドが固定化されている面側に、該リガンドに接することなく、該面と略平行に設けられた「流路天板」４を有する「センサチップ」であって、該プラズモン励起センサと該流路天板４との間（流路）に「光学ノイズ吸収剤からなる層」５が含有されるセンサチップに、「検体」を「接触」させる工程である。

（センサチップ）
アッセイ法（Ｉ）で用いられる「センサチップ」は、上述したセンサチップ（１）または（２）が好適である。なお、透明支持体１、金属薄膜２、流路天板４および光学ノイズ吸収剤からなる層５は、上述したものと同様であり、第１のリガンドは、上記リガンド３と同様である。

（検体）
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。

（接触）
「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサの第１のリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。

「流路」とは、上述のとおり角筒状または丸筒（管）状のものであって、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は角筒状構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は丸筒（管）状を有することが好ましい。

その材料としては、プラズモン励起センサ部または流路天板４ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどからなり、薬液送達部ではシリコーンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。

プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。

流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、プラズモン励起センサの金属薄膜２が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜２が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートとプラズモン励起センサとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。

工業的に製造される大規模ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に銀基板を形成、または別途作製した銀基板を固定し、金表面に誘電体層、蛍光色素層およびリガンド固定化を行った後、流路天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。

「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕、トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。

送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。

送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．１〜１ｍＬである。
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎである。

（洗浄工程）
洗浄工程とは、上記工程（ａ）を経て得られたセンサチップの表面および／または下記工程（ｂ）を経て得られたセンサチップの表面を洗浄する工程である。

洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するもの、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を１５０〜５００ｍＭ含有するものが望ましい。あるいは、低ｐＨの緩衝液、例えば、１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ ＨＣｌでｐＨが１．５〜４．０のものであってもよい。

洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程（ａ）の送液を循環させる温度および流速と同じであることが好ましい。
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。

［工程（ｂ）］
工程（ｂ）とは、上記工程（ａ）、好ましくはさらに上記洗浄工程を経て得られたセンサチップに、さらに「第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」を反応させる工程である。

（蛍光色素）
「蛍光色素」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。

本発明で用いられる蛍光色素は、金属薄膜２による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。

このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。

これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表２に示す。

また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、例えばＥｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光色素となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ³⁺が挙げられる。

本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属薄膜２を形成する金属種による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜２として金を用いる場合には、金による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属薄膜２として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。

（第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート）
「第２のリガンドと蛍光色素からなるコンジュゲート」は、リガンドとして２次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。

本発明のアッセイ法（Ｉ）において、第２のリガンドは、アナライトに蛍光色素による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、上記第１のリガンドと同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第１のリガンドとして用いる１次抗体がポリクローナル抗体である場合、第２のリガンドとして用いる２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。

さらに、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）と競合する第２のアナライト（競合抗原；ただし、標的抗原とは異なるものである。）と２次抗体とがあらかじめ結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。

「第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」の作製方法としては、第２のリガンドとして２次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された２次抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。

このように作製された「第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」の送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００μｇ／ｍＬがより好ましい。
送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。

［工程（ｃ）］
工程（ｃ）とは、上記工程（ｂ）、好ましくはさらに上記洗浄工程を経て得られたセンサチップに、透明支持体１の、金属薄膜２を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。

（光学系）
本発明のアッセイ法（Ｉ）で用いる光源は、金属薄膜２にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。

レーザ光の照射により、全反射減衰条件（ＡＴＲ）において、金属薄膜２の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明支持体１の屈折率、金属薄膜２の金属種およびその膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。

蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。

「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜２に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。

「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明支持体１と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明支持体」の市販品と同様のものが挙げられる。

「光学フィルタ」としては、例えば、減光〔ＮＤ〕フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光〔ＮＤ〕フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。

「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）などの光学ノイズ、および蛍光色素の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。

「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。

「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。

〔工程（ｄ）〕
工程（ｄ）とは、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有される「アナライト」量を算出する工程である。

より具体的には、工程（ｄ）は、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のアナライト（標的抗原量もしくは標的抗体）量を測定シグナルから算出する工程である。

（アナライト）
「アナライト」としては、第１のリガンドに特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ〔ペプチド核酸〕等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ〔αフェトプロテイン〕等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。

（アッセイシグナル変化量）
さらに、工程（ｄ）は、上記工程（ｂ）の前に測定したシグナルを“ブランクシグナル”、としたとき、下記式で表されるアッセイのシグナル変化量を算出することができる。
シグナル変化量＝｜（アッセイ蛍光シグナル）−（ブランク蛍光シグナル）｜

〔アッセイ法（ＩＩ）〕
アッセイ法（ＩＩ）は、下記工程（ｅ）〜（ｈ）、好ましくはさらに洗浄工程を含むことを特徴とする。

工程（ｅ）：透明支持体と、該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に固定化された第１のリガンドとを含むプラズモン励起センサ、および該プラズモン励起センサの該リガンドが固定化されている面側に、該リガンドに接することなく、該面と略平行に設けられた流路天板を有するセンサチップに、検体を接触させる工程。

工程（ｆ）：該工程（ｅ）を経て得られたセンサチップに、さらに第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程。
工程（ｇ）：光学ノイズ吸収剤と、少なくとも該吸収剤を溶解する溶媒とを含み、上記プラズモン励起センサと上記流路天板との間（流路）を満たしながら、該工程（ｆ）を経て得られたセンサチップに、該透明支持体の、該金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程。

工程（ｈ）：該工程（ｇ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
洗浄工程：上記工程（ｅ）を経て得られたセンサチップの表面および／または上記工程（ｆ）を経て得られたセンサチップの表面を洗浄する工程。
以下、本発明のアッセイ法（ＩＩ）について、図１を用いて具体的に説明する。

［工程（ｅ）］
工程（ｅ）とは、透明支持体１と、該支持体１の一方の表面に形成された金属薄膜２と、該薄膜２の、該支持体１とは接していないもう一方の表面に固定化された第１のリガンドとを含むプラズモン励起センサ、および該プラズモン励起センサの該リガンドが固定化されている面側に、該リガンドに接することなく、該面と略平行に設けられた流路天板４を有するセンサチップに、「検体」を「接触」させる工程である。

（センサチップ）
アッセイ法（ＩＩ）で用いられる「センサチップ」は、上述したセンサチップ（３）が好適である。なお、透明支持体１、金属薄膜２、第１のリガンド、流路天板４、検体および接触は、上述したものと同様である。

（洗浄工程）
洗浄工程とは、上記工程（ｅ）を経て得られたセンサチップの表面および／または下記工程（ｆ）を経て得られたセンサチップの表面を洗浄する工程であり、洗浄する対象が異なる以外は上記アッセイ法（Ｉ）の洗浄工程と同様である。

［工程（ｆ）］
工程（ｆ）とは、上記工程（ｅ）、好ましくはさらに上記洗浄工程を経て得られたセンサチップに、さらに第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程である。
アッセイ法（ＩＩ）の工程（ｆ）は、対象とするセンサチップが異なる以外は、上記アッセイ法（Ｉ）の工程（ｂ）と同様である。

［工程（ｇ）］
工程（ｇ）とは、光学ノイズ吸収剤と、少なくとも該吸収剤を溶解する溶媒とを含み、上記プラズモン励起センサと上記流路天板との間（流路）を満たしながら、該工程（ｆ）、好ましくはさらに上記洗浄工程を経て得られたセンサチップに、透明支持体１の、金属薄膜２を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。

アッセイ法（ＩＩ）の工程（ｇ）は、上記工程（ｅ）および（ｆ）で用いたものと同様の送液に光学ノイズ吸収剤を添加し、対象とするセンサチップが異なる以外は、上記アッセイ法（Ｉ）の工程（ｃ）と同様である。

光学ノイズ吸収剤としては、Ａｕ基板ではインドール系、アゾ系、トリフェニルメタン系、銅フタロシアニン系、Ａｇ系ではアゾ系が好適である。
その濃度は上述したものと同様である。

［工程（ｈ）］
工程（ｈ）とは、上記工程（ｇ）で得られた測定結果から、検体中に含有される「アナライト」量を算出する工程である。
アッセイ法（ＩＩ）の工程（ｈ）は、測定結果が異なる工程から得られた以外は、上記アッセイ法（Ｉ）の工程（ｄ）と同様である。

＜装置＞
本発明の装置は、少なくとも、上記工程（ｂ）または（ｆ）を経て得られたプラズモン励起センサ、レーザ光の光源、光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよび表面プラズモン励起増強蛍光検出部を含み、上記工程（ｃ）または（ｇ）に用いられることを特徴とするものである。

すなわち、本発明の装置は、上記センサチップを用いて、本発明のアッセイ法を実施するためのものである。
「装置」としては、少なくともレーザ光の光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよび表面プラズモン励起増強蛍光〔ＳＰＦＳ〕検出部を含むものとし、検体液、洗浄液または標識抗体液などを取り扱う際に、センサチップと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、例えば、送液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。

また、表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰〔ＡＴＲ〕条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。

光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少ないが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。

＜キット＞
本発明のキットは、少なくとも、上記透明支持体と上記金属薄膜とを含むセンサおよび光学ノイズ吸収剤を含み、上記アッセイ法（Ｉ）に用いられることを特徴とするものであって、アッセイ法（Ｉ）を実施するにあたり、１次抗体、抗原などのリガンド、検体および２次抗体以外に必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。

少なくとも該支持体と該薄膜とを含むセンサと光学ノイズ吸収剤とを含むものは、センサチップ（１）または（２）の態様が好適である。
本発明のキットと、検体として、例えば、血液、血漿または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。

このようなキットとしては、具体的に、透明支持体の一方の表面に金属薄膜を形成したセンサ（センサチップ（２）の場合）、または該センサの金属薄膜の、透明支持体とは接していない一方の表面に、光学ノイズ吸収剤からなる層を形成したもの（センサチップ（１）の場合）；光学ノイズ吸収剤と、高分子、ポリマーまたは誘電体／シランカップリング剤（センサチップ（２）の場合）；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；センサと検体とを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬が挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「装置」を含めることもできる。

さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。

次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

［調製例１］光学ノイズ吸収剤として、Ｃ．Ｉ．ディスパーズブルー６０を含む塗布液の調製：
丸底フラスコに湯浴を付し、酢酸エチル１００ｇを加熱還流し、さらに、モノマーとして、ステアリルメタクリレート２０ｇ、メチルメタクリレート５０ｇおよび２−アセトアセトキシエチルメタクリレート３０ｇならびにＮ，Ｎ’−アゾビスイソバレロニトリル０．１ｇを各々溶解した混合液を２時間かけて滴下し、同温度にて１０時間反応させて樹脂（Ｒ−１）の酢酸エチル溶液を得た。
この樹脂溶液（Ｒ−１）を１ｍＬ計量し、さらにディスパーズブルー６０を１０ｍＭ含む酢酸エチル溶液を１ｍＬ加え撹拌して塗布液を調製した。

［調製例２］光学ノイズ吸収剤として銅フタロシアニンを含む塗布液の調製：
調製例１において、モノマーとして、メチルメタクリレート９０ｇおよびメチルメタクリレート１０ｇを用いた以外は調製例１と同様にして樹脂（Ｒ−２）の酢酸エチル溶液を得た。この樹脂溶液（Ｒ−２）を１ｍＬ計量し、さらに銅フタロシアニンを５ｍＭ含む酢酸エチル溶液を１ｍＬ加え撹拌して塗布液を調製した。

［実施例１］センサチップ（２）の製造およびそれを用いたアッセイ法の実施：
（ステップ１：金属薄膜の形成）
厚さ１ｍｍのガラス製の透明支持体「Ｓ−ＬＡＬ １０」（(株)オハラ製；屈折率〔ｎ_d〕＝１．７２）を、プラズマドライクリーナーでプラズマ洗浄した。プラズマ洗浄された該支持体の片面に、まずクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１ｎｍ、金薄膜の厚さは５０ｎｍであった。

（ステップ２：ＳＡＭの形成）
ステップ１により得られた金属基板を、１ｍＭの１１−Ａｍｉｎｏ−１−ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ（(株)同仁化学研究所製）エタノール溶液に室温で２４時間浸漬したことで、該基板の表面にアミノ基を有するＳＡＭをパターニングした。

（ステップ３：カルボキシメチルデキストランの結合）
ステップ２により得られたＳＡＭがパターニングされた金属基板を、カルボキシメチルデキストラン（名糖産業（株）製；分子量５０万、置換度１．０８）５０ｍｇ／ｍＬ水溶液に浸漬した。さらに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕（(株)同人化学研究所製）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をそれぞれ１００ｍＭになるように加えて、１時間室温で反応させたことで、アミノ基末端のＳＡＭとデキストランのカルボキシル基とのアミドカップリングによりデキストランが固定化された金属基板を得た。

（ステップ４：光学ノイズ吸収層の作製）
ポリメチルメタクリレート〔ＰＭＭＡ〕製基板の一方の面に、調製例１で得られた塗布液を乾燥膜厚が１０μｍになるようにスピンコータで塗布し、乾燥温度１００℃で５分間乾燥を行い、光学ノイズ吸収層を形成した。さらに送液導入用の穴（送液導入口）および送液排出用の穴（送液排出口）が上記測定領域内に位置するように形成した。

（ステップ５：センサチップの構築）
基板の金属薄膜およびＳＡＭが形成された側の面に、測定領域を形成するための、流路長１０ｍｍ、幅５ｍｍの穴の開いた厚さ０．５ｍｍのポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを乗せた。さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した（このシリコーンゴム製スペーサは送液に触れない状態にある）。このＰＤＭＳ製シートおよびシリコーンゴム製スペーサの上に、ステップ４で作製した光学ノイズ吸収層を形成したＰＭＭＡ製天板を乗せた。これらセンサ基板、ＰＤＭＳ製シート、およびＰＭＭＡ製天板の積層物を外周部で圧着してビスで固定し、チップとした。

（ステップ６：抗体の結合）
チップの送液導入口および送液排出口に、シリコーンゴム製のチューブおよびペリスタポンプを連結した（以下、特に記載しなくとも、各種流体の送液および循環はすべてこのようなチューブおよびペリスタポンプを用いて行った）。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕（(株)同人化学研究所製）４００ｍＭと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１００ｍＭとの混合液を、５００μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローして、カルボキシメチルデキストランを活性エステル化した。

続いて、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（１Ｄ５；２．５ｍｇ／ｍＬ、ミクリ免疫研究所（株）製）を、該抗体が２０μｇ／ｍＬとなるよう１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）にて希釈して得られた溶液を、５００μＬ／ｍｉｎにて３０分間フローして、該抗体をカルボキシメチルデキストランに連結した。

最後に、１Ｍエタノールアミン塩酸塩（ＳＩＧＭＡ社製；ｐＨ８．５）水溶液を５００μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローすることによってブロッキング処理をし、センサチップを完成させた。

（ステップ６：アッセイ法の実施）
上記ステップ１〜６に従い製造したセンサチップに、まず、ＡＦＰ（２．０ｍｇ／ｍＬ溶液、Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ社）が０．１ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５００μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。

続いて、上述のようにして調製した標識抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体が２．５μｇ／ｍＬとなるよう１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５００μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。洗浄工程として、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだＴＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５００μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローさせた。

その後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で流路を満たした状態にして、プラズモン励起センサの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサ表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。この測定値を「アッセイシグナル」とした。一方、上記ステップ１〜５に従い製造した別のプラズモン励起センサについて、最初にフローさせた送液にＡＦＰをまったく含まない（０ｎｇ／ｍＬ）ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を用いてフローさせた以外は上記と同じ手順で蛍光量を測定し、その測定値を「ブランクシグナル」とした。ブランクシグナルおよびアッセイシグナルから下記式によりＳ／Ｎ比を算出した。
Ｓ／Ｎ比＝｜（アッセイシグナル）｜／｜（ブランクシグナル）｜
得られた結果を表３に示す。

［実施例２］
実施例１において、調製例１で得られた塗布液の代わりに、調製例２で得られた塗布液を用いた以外は実施例１と同様にしてセンサチップを製造し、それを用いてアッセイ法を実施した。その結果を表３に示す。

［実施例３］
実施例１において、調製例１で得られた塗布液を用いずに、かつ送液中に１００μＭの濃度になるようにブリリアントグリーン（光学ノイズ吸収剤）を含有させた以外は実施例１と同様にしてセンサチップ（３）を製造し、それを用いてアッセイ法を実施した。その結果を表３に示す。

［比較例１］
実施例１において、調製例１で得られた塗布液を用いなかった以外は実施例１と同様にしてセンサチップを製造し、それを用いてアッセイ法を実施した。その結果を表３に示す。

本発明のセンサチップを用いたアッセイ法は、高感度かつ高精度に検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。

１・・・透明支持体
２・・・金属薄膜
３・・・リガンド
４・・・流路天板
５・・・光学ノイズ吸収剤からなる層
１１・・・センサチップ（１）
１２・・・センサチップ（２）
１３・・・センサチップ（３）

Claims (17)

1. 透明支持体と、
   該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、
   該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に固定化されたリガンドと
   を含むプラズモン励起センサ、および
   該プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている面側に、リガンドに接することなく、該面と略平行に設けられた流路天板
   を有するセンサチップであって、
   該プラズモン励起センサと該流路天板との間（流路）に光学ノイズ吸収剤からなる層が含有されることを特徴とするセンサチップ。
2. 上記光学ノイズ吸収剤からなる層が、上記金属薄膜の、上記透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成され、
   上記リガンドが、該光学ノイズ吸収剤からなる層の、該薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化されている請求項１に記載のセンサチップ。
3. 上記光学ノイズ吸収剤からなる層が、上記流路天板の、上記プラズモン励起センサ側の一方の面に形成され、かつ該層は、リガンドに接することのない請求項１に記載のセンサチップ。
4. 上記光学ノイズ吸収剤からなる層が、光学ノイズ吸収剤と、少なくとも該吸収剤を溶解する溶媒とを含み、上記プラズモン励起センサと上記流路天板との間（流路）を満たす請求項１に記載のセンサチップ。
5. 上記光学ノイズ吸収剤からなる層が、光学ノイズ吸収剤と高分子とを含むか、または誘電体と該誘電体の表面にシランカップリング剤を介して固定化されている光学ノイズ吸収剤とを含む請求項２または３に記載のセンサチップ。
6. 上記光学ノイズ吸収剤が、顔料または染料である請求項１〜５のいずれかに記載のセンサチップ。
7. 上記金属薄膜が、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されている請求項１〜６のいずれかに記載のセンサチップ。
8. 下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とするアッセイ法；
   工程（ａ）：透明支持体と、該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に固定化された第１のリガンドとを含むプラズモン励起センサ、および該プラズモン励起センサの該リガンドが固定化されている面側に、該リガンドに接することなく、該面と略平行に設けられた流路天板を有するセンサチップであって、該プラズモン励起センサと該流路天板との間（流路）に光学ノイズ吸収剤からなる層が含有されるセンサチップに、検体を接触させる工程；
   工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたセンサチップに、さらに第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程；
   工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたセンサチップに、該透明支持体の、該金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程；ならびに
   工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
9. 下記工程（ｅ）〜（ｈ）を含むことを特徴とするアッセイ法；
   工程（ｅ）：透明支持体と、該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に固定化された第１のリガンドとを含むプラズモン励起センサ、および該プラズモン励起センサの該リガンドが固定化されている面側に、該リガンドに接することなく、該面と略平行に設けられた流路天板を有するセンサチップに、検体を接触させる工程；
   工程（ｆ）：該工程（ｅ）を経て得られたセンサチップに、さらに第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程；
   工程（ｇ）：光学ノイズ吸収剤と、少なくとも該吸収剤を溶解する溶媒とを含み、上記プラズモン励起センサと上記流路天板との間（流路）を満たしながら、該工程（ｆ）を経て得られたセンサチップに、該透明支持体の、該金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程；ならびに
   工程（ｈ）：該工程（ｇ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
10. 上記光学ノイズ吸収剤からなる層が、上記金属薄膜の、上記透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成され、
    上記リガンドが、該光学ノイズ吸収剤からなる層の、該薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化されている請求項８に記載のアッセイ法。
11. 上記光学ノイズ吸収剤からなる層が、上記流路天板の、上記プラズモン励起センサ側の一方の面に形成され、かつ該層は、上記リガンドに接することのない請求項８に記載のアッセイ法。
12. 上記光学ノイズ吸収剤からなる層が、光学ノイズ吸収剤と高分子とを含むか、または誘電体と該誘電体の表面にシランカップリング剤を介して固定化されている光学ノイズ吸収剤とを含む請求項８，１０および１１のいずれかに記載のアッセイ法。
13. 上記光学ノイズ吸収剤が、顔料または染料である請求項８〜１２のいずれかに記載のアッセイ法。
14. 上記金属薄膜が、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されている請求項８〜１３のいずれかに記載のアッセイ法。
15. 上記検体が、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液を含む請求項８〜１４のいずれかに記載のアッセイ法。
16. 少なくとも、上記工程（ｂ）または（ｆ）を経て得られたプラズモン励起センサ、レーザ光の光源、光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよび表面プラズモン励起増強蛍光検出部を含み、請求項８，１０，１１，１２〜１５のいずれかに記載の工程（ｃ）または請求項９，１２〜１５のいずれかに記載の工程（ｇ）に用いられることを特徴とする装置。
17. 少なくとも、透明支持体と上記金属薄膜とを含むセンサおよび光学ノイズ吸収剤を含み、請求項８〜１５のいずれかに記載のアッセイ法に用いられることを特徴とするキット。