JP2011529337A - ジアゾメチル官能基を持つピリジン核を有する標識化試薬、該試薬の合成方法および生体分子の検出方法 - Google Patents

Abstract

式（Ｃ）または（Ｄ）

［式中、
・Ｒ_１は、特に検出可能な標識を表し、
・Ｒ_２およびＲ_３は、互いに独立であり、Ｈ、ＮＯ_２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ^２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲまたはＣＯＯＲを表し、ここで、Ｒはアルキルまたはアリールであり、
・Ｒ_４は、Ｈ、アルキル基またはアリール基を表し、
・Ｌは、リンカーアームである］
により表される標識化試薬。
本発明はまた、標識化試薬の合成、生体分子の標識化方法、前記方法により得られた標識された生体分子、一本鎖または二本鎖核酸の標識化および断片化の方法、前記方法により得ることが可能な標識された核酸、標識された核酸を含有する標的核酸を検出するためのキット、試薬が結合された固体支持体および核酸を捕捉するための方法に関する。
本発明は、診断分野に好ましく適用される。
【選択図】なし

Description

本発明は、生体分子を標識するための新規試薬、前記試薬を合成する方法、また、特に核酸の検出および分析を使用する分子診断の分野において生体分子を標識するための適用に関する。

従来技術は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは天然もしくは増幅核酸を標識するための数多くの方法が存在することを示す。

第１の方法は、標識を塩基に結合させることからなり、塩基は天然であるか修飾されている。第２の方法は、標識を糖に結合させることを提案しており、この場合にも、それは天然であるか修飾されている。第３の方法の主題は、標識をリン酸塩に結合させることである。

塩基における標識は、直接的に標識されたヌクレオチドを取り込ませて核酸を標識する手法で特に使用されてきた。

糖における標識は、化学合成により調製された核酸プローブの場合に使用されることが多い。

リン酸塩における標識もまた、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、官能基化されたアームおよび標識を導入するために使用されてきた。

実際には、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体または核酸の標識を行わなければならない当業者は、この結合を非常に簡単で、多数の選択肢がある塩基または糖に対して行う傾向がある。このことは、塩基に関しては、欧州特許出願０３２９１９８号、欧州特許出願第０３０２１７５号、欧州特許出願第００９７３７３号、欧州特許出願第００６３８７９号、米国特許出願第５４４９７６７号、米国特許出願第第５３２８８２４号、国際特許出願第ＷＯ９３／１６０９４号、ドイツ特許出願第３９１０１５１号、欧州特許出願第０５６７８４１号、または糖に関しては、欧州特許出願第０２８６８９８号などの数多くの文献の研究からも明らかである。

リン酸塩への標識の結合は、塩基または糖を官能基化させることからなる技術よりも複雑な技術であり、特に、リン酸塩は反応性が低いことから、使われることは少なかった（例えば、Ｊｅｎｃｋｓ Ｗ．Ｐ．ら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８２，１７７８−１７８５，１９６０参照)。同様に、オリゴヌクレオチド断片にプローブを導入するための方法に関連する、Ｏ‘ＤｏｎｎｅｌおよびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎによる総説（「Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」、Ｈｅｃｈｔ Ｓ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９６の２１６−２４３頁、「Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｒｏｕｐｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」）では、ヌクレオチド間のリン酸ジエステルの効率的なアルキル化は、不可能であると考えられている。

国際特許出願第ＷＯ９９／６５９２６号には、ＲＮＡを断片化し、末端のリン酸で標識することからなる、合成または天然リボ核酸（ＲＮＡ）を標識する方法が記載されている。この文献は、官能基であるヒドロキシル、アミン、ヒドラジン、アルコキシアミン、ハロゲン化アルキルおよびベンジル型ハロゲン化アルキルおよび、特に５−（ブロモメチル）フルオレセイン誘導体のような、断片化に組み合わせて標識に使用することができるいくつかの官能基について記載している。これらの官能基により、核酸を標識することができるが、この標識は、断片化の間に解放されたリン酸塩で生じるので、効率的な標識のためには、断片化の工程を有する必要がある。さらに、効率的な標識を得るためには、ＲＮＡに対して非常に過剰な標識化試薬を加える必要があり、過剰な標識により生じる、検出中のバックグラウンドノイズの問題が生じる。最後に、この方法は、二本鎖ＤＮＡでは効率的に作用しない。

従って、標識率については効率的で、標識位置に関しては特異的であり、特に、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方に使用することができる、水素結合を介する二重らせんの形成に関与する塩基のハイブリダイゼーション特性に影響を及ぼさず、最後に、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、天然の核酸または転写、逆転写または酵素増幅により調製されたものでも等しく標識することができる、新規の試薬が必要とされている。

本出願人は、上述の条件を満たし、標識のための反応性官能基としてジアゾメチル官能基を使用するこの種の新規標識を既に提案している。これは、例えば、国際特許出願第ＷＯ０２／０９０３１９、ＷＯ０２／０９０５８４およびＷＯ２００５／０９２９１０のケースである。

従って、ジアゾメチル官能基（式：−Ｃ（Ｎ_２）−）はリン酸塩基のアルキル化に既に使用されているが、いくらかの問題が生じる。一つには、少なくとも１つのジアゾ官能基を包含する試薬は、一般的にそれ自身不安定であり、標識化キットにこれらの試薬を使用すると問題を引き起こし、標識生成物の官能基が任意のサンプル中の標的生体分子の存在を証明するためのものである場合には、不利である。

最後に、ジアゾメチル官能基を持つ試薬は、その安定性を確保するためにフェニル型の芳香族核により、ビオチンなどの特定の標識に連結される。芳香族核の存在および標識の性質によりこれらの試薬は水に難溶性となり、水または水性緩衝液にのみ溶解する生体分子に結合するために、水と混和性の有機溶媒を使用することになる。しかし、これらの溶媒は、標識化反応にあまりに高い濃度で使用されると、生体分子の沈殿を引き起こすことがある。さらに、一体型装置による標識プロトコルの自動化のためには、有機溶媒を含有しない緩衝液中で標識化試薬を凍結乾燥することが不可欠である。有機溶媒は凍結乾燥に適合しない。従って、水性溶媒に十分可溶で、安定である標識化試薬を入手できる必要がある。

上記の文献、国際特許出願第ＷＯ０２／０９０３１９およびＷＯ０２／０９０５８４（第一世代分子）およびＷＯ２００５／０９２９１０（第二世代分子）に提唱されている標識化試薬は、これらの技術上の問題を解決するものでもある。

これらの分子は、結果として次のような欠点を有する。
‐化学的に不安定であり、４℃で溶液又は乾燥としておく必要があり、
‐合成が比較的複雑であり、
‐水性溶液に難溶性である。

これらの欠点にもかかわらず、これらの分子は、特に当業者にとって興味深く魅力的である。それらの物理的または化学的特徴を改良することがいかなる場合でも可能であり、これは、国際特許出願第ＷＯ２００９／００１０１７に開示されているような、より安定で、かつ合成がより簡単な分子である第三世代の分子の開発において最重要点であった。

この解決策の開始により、第一および第二世代分子の安定性の問題に立ち向かうことが可能になったが、その溶解度は、第二世代分子のそれ（１００％の水に０．３ｍＭ）よりわずかに良くなったに過ぎない。しかし、それはともかくとして、本出願人は、この方向に沿って、第三世代分子（溶解度は１００％の水に対して２〜２８ｍＭである）よりさらに溶解性が高く、我々の以前の発明中で既に説明した分子と同等またはそれ以上の安定性を有する新しい型の分子の説明を続ける。

上に開示されたこれら４つの文献は、先の三世代の分子について述べており、これらはいずれも環の近くのジアゾメチル官能基の存在に基づいている。不注意な省略により、本発明を開示している本文中で見落としているかもしれない説明を補充するために、これら４つの文献を参照することを読者に要請する。

そこで、新規発明は、ジアゾメチル官能基アルファへのピリジン核の導入を提案し、認識基は、アルファ’位またはピリジン環上である（図２参照、分子１０または分子１９）。第四世代分子は、安定性と溶解性の組み合わせの最良のプロファイルを提案する。

これにより、以下が分子に付与される。
１）４℃で乾燥状態または室温で溶液状態において、ニトロＤＫＳ以上またはこれと同等の化学的安定性。この特性は、第三世代分子のニトロアリール基と同様に、注目すべき方法によりジアゾ官能基を安定化するピリジン核の電子求引性によるものである。
２）ピリジン核上の窒素原子の存在によるはるかに大きい溶解性。
３）核酸を標識する市販の方法よりも高い核酸との反応性。

本発明は、既存の分子を著しく改善する。実際、第一および第二世代分子は、それ以前に存在したものに比較して、この点について既に改良がなされているとはいえ、化学的に不安定であるという欠点を有している。得られた結果は４℃で１年間保存した後であっても非常に良好であるので、従って、標識化は非常に効果的に存続する。さらに、これらの合成は比較的複雑さを残している。第三世代分子は、いっそう安定性が高く、その合成もより簡単であり、これらの分子を含有するキットの有効期限や合成の工業化において、非常に有利である。

第一および第二世代分子は、無水有機溶媒中で低温保存された場合、１年間は機能的に安定である。第三世代分子は、液体溶媒中または乾燥状態のいずれにおいても機能的および化学的にいっそう安定である。従ってこれを、例えば乾燥または凍結乾燥により、非常に長期間（１０〜１００倍長く）乾燥状態で保存した後に、水性溶媒中で取り扱うことができるが、凍結乾燥に対して不安定である第一および第二世代分子ではそうではない。

第三世代分子の工業的改善は、特に、問題が生じた場合に、所定の試薬の安定性に悪影響を与えることなく、配備された化学的性質が非常に効果的で強固でなければならない一体型装置またはマイクロシステムにおいて重要である。

最後に、上記第一および第二世代分子は、水性溶液への溶解性が乏しいので、反応を開始する前にこれら分子を適切に溶解しなければならない使用者にとって、非常に厄介である。

しかし、これらの分子および標識化方法が効果的であるとしても、標識化の有効性をさらに改善する第三世代の新しい分子およびそれら分子の新しい標識化方法により、出願人は、第一および第二世代分子の安定性の問題の解決法を見出すことに成功した。

しかし、これら分子の世代が第一から第三のいずれであっても、その溶解性に乏しいという点にもう一つの問題がある。従って、２つの新規な分子官能性を結合し、これら新規な試薬を作成した。それらは以下のように定義される。すなわち、
・ジアゾメチル官能基は、そのアルファ位に、それ自体はメタ、パラまたはオルト位において単一または複数の一種以上の基で置換可能なピリジン環を有し、
・ジアゾ官能基は、
‐第三世代の分子として、ビオチンまたは他の検出可能な基である、検出を可能にする基をアルファ’位に有し、
‐第一および第二世代分子では環、すなわち、本件ではピリジン環、に担持されている検出可能な基を担持していない。
第四世代の分子は、第三世代の分子と同程度の安定性と反応性を有するが、その溶解度は、その電子求引機能によりジアゾメチル官能基を同様に安定化するピリジン核の存在により改良されることに留意すべきである。

「多量体構造」、「検出可能な標識」、「間接システム」、「蛍光色素分子」、および他の関心の対象である標識剤、「共役」、「生体分子」、「核酸」、「酵素増幅法」、「実質的に水性溶液」、「均一溶液」、「固体支持体」および「精製工程」の定義は、特許出願ＷＯ２００５／０９２９１０に記載されており、読者は必要に応じてこれを参照することが求められる。

同様に、次の技術、
・グラフト化化学、および
・核酸の３’または５’末端へのリン酸塩の導入
も、上記特許出願に記載されており、読者は本発明を完全に理解するために必要な情報の全てをその文書中に見出すことができる。

さらに、これら第三世代の分子に担持されるジアゾメチル官能基は、第一および第二世代の分子と同様、核酸を支持体上に共有結合的に接合することを可能にする。特に吸着に比較して、接合は簡単で、連結は安定であり、核酸の固体支持体上への結合を可能にし、立体障害を減じてその後のハイブリダイゼーション工程をさらに促進する。

第四世代として説明されるこの新しい分子族は、ピリジンジアゾケトンビオチン（ＰｙＤＫＢ）またはピリジンジアゾビオチン（ＰｙＤＢ）と称され、それぞれ式（Ｃ）のＰｙＤＫＢおよび式（Ｄ）のＰｙＤＢ（下記参照）である比較的熱的に安定な標識化試薬により表される。

第１の実施態様によれば、本発明は式（Ｃ）：

[式中、
・Ｒ_１は、検出可能な標識または少なくも１つの多量体構造によって連結された少なくとも２つの検出可能な標識を表し、
・Ｒ_２およびＲ_３は、互いに独立であり、Ｈ、ＮＯ_２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ^２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲまたはＣＯＯＲを表し、ここで、Ｒはアルキルまたはアリールであり、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合を有する直鎖を含むリンカーアームである]
により表される標識化試薬を提供する。

第２の実施態様によれば、本発明は式（Ｄ）：

［式中、
・Ｒ_１は、検出可能な標識または少なくも１つの多量体構造によって連結された少なくとも２つの検出可能な標識を表し、
・Ｒ_２は、Ｈ、ＮＯ_２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ^２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲまたはＣＯＯＲを表し、ここで、Ｒはアルキルまたはアリールであり、
・Ｒ_４は、Ｈ、アルキル基またはアリール基を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合を有する直鎖を有するリンカーアームである］
により表される標識化試薬を提供する。

標識Ｒ_１とジアゾメチル官能基を同時に持つアームの位置（式Ｃ）は、ピリジン核の窒素原子の位置に関してパラ、メタまたはオルト位である。好ましくは、このアームは、ピリジン核の窒素原子の位置に関してパラ位である。

標識Ｒ_１を担持するアームの位置またはジアゾメチル官能基を担持するアームの位置（式Ｄ）は、互いに独立であり、ピリジン核の窒素原子の位置に関してパラ、メタまたはオルト位である。好ましくは、ジアゾメチル官能基を担持するアームは、ピリジン核の窒素原子の位置に関してパラ位であり、その際、標識Ｒ_１を担持する上記アームはピリジン核の上記窒素原子の位置に関してオルト位である。

好ましくは、Ｒ_２および／またはＲ_３はジアゾ官能基に関してメタ位である。この位置で、ジアゾメチル官能基が置換基Ｒ_２および／またはＲ_３と共役することができる。

本発明での意味として、アルキル基は次のように理解される。すなわち、鎖状または、アルキル鎖が少なくとも３個の炭素原子を有する場合には、分岐状または環状の、１〜６個の炭素原子（望ましくは、１〜２、１〜３または１〜４個の炭素原子）を有する飽和脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ‐ブチル、メチルシクロプロピル、ペンチル、２,２‐ジメチルプロピル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシル基が挙げられる。

本発明での意味として、アリール基は単環芳香族基を意味すると理解され、例えば、フェニル基である。

第１の実施態様の第１の変形例によれば、本発明は式（Ｅ）：

［式中、
・Ｒ_２およびＲ_３は、互いに独立であり、Ｈ、ＮＯ_２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ^２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲを表し、ここで、Ｒはアルキルまたはアリールであり、
・ｎは、１〜１２、好ましくは１〜６の整数である］
により表される標識化試薬を提供する。

第２の実施態様の第１の変形例によれば、本発明は式（Ｆ）：

［式中、
・Ｒ_２は、Ｈ、ＮＯ_２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ^２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲまたはＣＯＯＲを表し、ここで、Ｒはアルキルまたはアリールであり、
・Ｒ_４は、Ｈ、アルキル基またはアリール基を表し、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＨ_２ＮＨ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ_２Ｏ−または−ＣＨ_２Ｓ−を表し、
・ｍ、ｎおよびｐは、互いに独立であり、１〜１２、好ましくは１〜６の整数である］の標識化試薬を提供する。

第１の実施態様の第２の変形例によれば、本発明は式（Ｇ）：

により表される標識化試薬を提供する。

第２の実施態様の第２の変形例によれば、本発明は式（Ｈ）：

により表される標識化試薬を提供する。

いずれの実施態様またはそれらの変形例であっても、上に開示された本発明による試薬は、好ましくは式（Ｉ）：

により表されるＤ−ビオチン残基で構成されている基Ｒ_１を含有する。

本発明はまた、標識化試薬の合成方法に関し、上に開示されたように、以下の工程を有する（ＰｙＤＫＢ型分子）：
ａ）芳香族カルボン酸誘導体をラクトンのエノラートに反応させて（クライゼン型反応）環状前駆体を形成し、
ｂ）次いで、環状前駆体をハロゲン酸で開環しハロゲン化芳香族ケトンを形成し、
ｃ）ハロゲン化芳香族ケトンのカルボニル官能基を保護基によって保護し、被保護前駆体を形成し、
ｄ）被保護前駆体を（ガブリエル型の）アミノ化反応に供し、アミノ化前駆体を形成し、
ｅ）アミノ化前駆体を脱保護してアミン官能基を解放させ、前記アミン官能基を検出可能な標識と反応させて、そのカルボキシル官能基を活性化し、検出可能な標識を含有する前駆体を形成し、
ｆ）標識された前駆体にカルボニル官能基の脱保護の反応をさせて、標識されたカルボニル含有前駆体を形成し、最後に
ｇ）カルボニル官能基をジアゾ官能基に変換して、上述のように、標識されたカルボニル含有前駆体を標識化試薬に変換する。

ＰｙＤＢ型分子の合成に関しては、その工程は以下のようである：
ａ）芳香族ジカルボン酸をエステル化してジエステルを形成し、
ｂ）このジエステルを単一保護されたアミノ化エチレングリコール由来の化合物で位置選択的に置換し、カルボキシル官能基とアミン官能基が保護された前駆体を形成し、
ｃ）次いで、前駆体を還元してアルコールとし、かつ酸化してアルデヒドとし、
ｄ）工程ｃ）で合成されたアルデヒドを、アミン官能基を脱保護しながら同時にこの官能基を保護するために酸処理に供してアミノ化アセタールとし、
ｅ）アミノ化アセタールを活性化された検出可能な標識のカルボキシル官能基と反応させて、検出可能な標識を含有する前駆体を形成し、
ｆ）標識された前駆体をカルボニル官能基の脱保護の反応に供し、標識されたカルボニル含有前駆体を形成し、最後に
ｇ）バンフォード・スティーブンス反応によりカルボニル官能基をジアゾ官能基に変換して、上述のように、標識されたカルボニル含有前駆体を標識化試薬に変換する。

本発明はさらに、生体分子、特に核酸、を標識する方法に関し、該方法は、生体分子と試薬を均一な溶液中、実質的に水性の緩衝液中で接触させることを含む。

本発明はまた、生体分子を標識する上記方法により得られる、標識された分子を提案する。

本発明はまた、一本鎖または二本鎖核酸を標識化し、断片化する、以下の工程を有する方法に関する。すなわち、
・核酸を断片化し、
・上記試薬から選択された標識化試薬を用いて少なくとも１つの断片上に標識を結合させる。
この試薬は、共有結合的に主として上記断片の少なくとも１つのリン酸塩上に連結する。リン酸塩に結合させるこのような技術は、例えば、図１に示される。

第１の実施変形例においては、上記方法は、断片化および標識化が２工程で行われることを特徴とする。

第２の実施変形例においては、上記方法は、断片化および標識化が１工程で行われることを特徴とする。

いずれの実施変形例においても、上記方法は、標識化が実質的に水性の均一な溶液中で行われることを特徴とする。

いずれの実施変形例においても、上記方法は、断片化が酵素的、物理的または化学的手段により行われることを特徴とする。

上述の方法は、出願人がこれらの方法により取得することが可能な標識された核酸を特許請求する権利も与える。

本発明はさらに、上述のように、標識された核酸を含有する標的核酸を検出するためのキットに関する。

本発明はまた、上述のように、試薬が結合している固体支持体に関する。

最後に、本発明は、核酸を捕獲するための、以下の工程を有する方法に関する。すなわち、
・直接的または間接的に、少なくとも一つの上述の生体分子または上述の核酸であって、ジアゾメチル官能基を有する生体分子または核酸を結合させた固体支持体を使用し、
・これを、遊離核酸を含有し得る生体サンプルと接触させ、そして
・少なくとも１つの核酸に分子が共有結合する前記固体支持体を洗浄する。

これらの第四世代のＤＫＢ分子は、リンカーと称されるスペーサアームＬと、ビオチン、ハプテン、蛍光色素分子、蛍光基、発光基などの検出可能な基から構成されうる標識Ｒ_１とを担持する。

Ｌは少なくとも２つの共有結合からなる直鎖を有するリンカーアームであり、ｎは１に等しい整数である。有利には、前述の実施態様または変形例のいずれの試薬においても、Ｌは、１〜２０回、好ましくは１〜１２回、さらに好ましくは２〜６回繰り返される、−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）−部分を含んでいる。

添付の実施例および図面は特定の実施形態を表したものであり、本発明の範囲を限定するものとは見なされない。

本発明による分子による、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態の一本鎖核酸の標識化を示す、反応概略図を表す。 本特許出願において使用された分子の概略図を示す。 ＰｙＤＢ（分子１０）の分子の合成方法の反応概略図を表す。 ＰｙＤＫＢ（分子１９）の分子の合成方法の反応概略図を表す。 液体媒体中での比較における、特許出願ＷＯ−Ａ−０２/０９０３１９に記載されている第二世代［ビオ−ＥＧ３］２−ＰＤＡＭ（以下、ＢＢＰと称する）分子に対する、ＰｙＤＢおよびＰｙＤＫＢ分子の安定性を表す。 乾燥状態での比較における、第二世代ＢＢＰ分子に対する、２つの第四世代分子、ＰｙＤＢおよびＰｙＤＫＢの安定性を表す。 標識ＢＢＰおよびＰｙＤＢを各４５ｍＭの濃度で使用した際の、ＲＮＡアンプリコンの精製後の標識化の結果を示す。 ３ｍＭのＨＣｌ存在下で標識ＢＢＰおよびＰｙＤＢを各２ｍＭの濃度で使用した際の、ＲＮＡアンプリコンの未精製での標識化の結果を示す。 ２．５ｍＭの濃度で、ハイブリダイゼーションを２４時間行った際の、標識ＰｙＤＢまたはＢＢＰで標識されたＲＮＡアンプリコンの標識化の安定性を表す。 Ｋｒｅａｔｅｃｈ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）の汎用標識システム（ＵＬＳ）または本発明に従うもの、どちらかの使用した標識化技術に応じたＲＮＡアンプリコンの標識化の有効性の比較を示す。 ＨＰＬＣにより決定された、２つの第四世代の分子（ＰｙＤＢおよびＰｙＤＫＢ）に対する、２つの第三世代分子（メタニトロＤＫＢおよびパラニトロＤＫＢ）の水性溶媒中での比較溶解性を示す。

図面および明細書中で、「比較蛍光」と「ＲＦＵ」とは、同一である。

以下に示す実施例において、以下の略語を使用している。
・Ａｒ：芳香族
・ｓ：一重項
・ｂｓ：広い一重項
・ｄ：二重項
・ｄｄ：二重二重項
・ｔ：三重項
・ｑ：四重項：
・ｑｕ：五重項
・ｍ：マウンド
・Ｍ：多重項
・ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
・ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
・ＮＭＲ：核磁気共鳴
・Ｙｌｄ：収率
・Ｅｑ：当量
・ＲｆまたはＴＲ：保持時間
・ＤＭＳＯ−ｄ６：重水素ジメチルスルホキシド
・ＤＭＣＦ：ギ酸ジメチルシクロヘキシルアンモニウム
・ＣＤＣｌ_３：重水素クロロホルム
・ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
・ＤＣＭ：ジクロロメタン
・ＭｅＯＨ：メタノール
・ＡＣＮ：アセトニトリル
・ＡｃＯＥｔ：エチルアセテート
・ＭｉｌｌｉＱ ｗａｔｅｒ：超純水（ミリポア、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、フランス）
・ＤＭＡＣ：ジメチルアミノ桂皮アルデヒド
・Ｓｉ６０：シリカゲル６０ＦＬＵＫＡ（４０〜６３μｍ）
・ＵＶ：紫外線

下記（実施例１、２、３、４および９）化合物の分析および合成の一般的な条件を以下に示す。
機器：
ＨＰＬＣ条件（システム ＨＰＬＣ ＷＡＴＥＲＳ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２７９５、ダイオードアレイ検出器 ＰＤＡ９９６、ソフトウェア Ｅｍｐｏｗｅｒバージョン２、カラム ＷＡＴＥＲＳ ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８，４．６×３０ｍｍ、２．５μＭ）、流速１ｍＬ／分、３０℃（２６０ｎｍで検出）

ＨＰＬＣ塩基性法：
溶離液Ａ：ミリＱ水
溶離液Ｂ：ＡＣＮ
溶離液Ｃ：５００ｍＭアンモニア水、ｐＨ１２
即ち、２０分間で１％から６４％の直線濃度勾配のアセトニトリル（一定の５ｍＭのアンモニア水、ｐＨ＝９）。

ＨＰＬＣ中性法：
溶離液Ａ：ミリＱ水
溶離液Ｃ：ＡＣＮ
溶離液Ｄ：５００ｍＭギ酸アンモニア溶液、ｐＨ７
即ち、１０ｍＭのギ酸アンモニア溶液中、２０分間で１％から６４％の直線濃度勾配の（溶離液）Ｃ。

合成：
薄層クロマトグラフィー分析は、ＡＬＵＧＲＡＭ（登録商標）ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ ＳＩＬ Ｇ／ＵＶ_２５４４×８ｃｍ（Ｄｕｒｅｎ、ドイツ）シリカプレート上で２５４ｎｍで紫外線検出、またはビオチニル化生成物に対してはＤＭＡＣにより行った。
生成物はシリカゲル６０ＦＬＵＫＡ（４０〜６３μｍ）上クロマトグラフィーにより精製した。「フラッシュ」クロマトグラフィー（アルゴン圧下）による分離の条件は、Ｃｌａｒｋ Ｓｔｉｌｌら（Ｃｌａｒｋ Ｓｔｉｌｌ，Ｗ．；Ｋａｈｎ，Ｍ．；Ｍｉｔｒａ，Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７８，４３，２９２３−２９２５）に記載されている条件を厳密に順守する。すなわち、シリカの高さを１５ｃｍに固定し、流速が５ｃｍ／分になるように圧力をかけ、精製する生成物の量およびＲｆに基づいてカラムの直径を決める。
実施例１では、ＮＭＲスペクトルをブルカー２００ＭＨｚ分光計に記録した。化学シフト（δ）は、内部標準（ＣＤＣｌ_３：７．２４ｐｐｍ；ＤＭＳＯ−ｄ６：２．４９ｐｐｍ；Ｄ_２Ｏ：４．８０ｐｐｍ、２５℃）としての溶媒ピークに対するｐｐｍとして与えられる。スペクトルは上記略語：ｓ、ｄ、ｔ、ｑ、ｑｕ、ｍおよびＭにより記載する。結合定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）により表わす。
実施例２では、^１Ｈおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルは室温でブルカーＡＣ２００またはブルカーＤＰＸ３００分光計で行った。化学シフト（δ）は、テトラメチルシランに対するｐｐｍとして示され、ＣＨＣｌ_３（δ_Ｈ＝７．２７、δ_Ｃ＝７７．０）またはＤＭＳＯ（δ_Ｈ＝２．５２、δ_Ｃ＝４０．０）に対して標準化する。結合定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）により表現する。シグナルの形は次のように略記される：ｂｓまたはｄｄ。

マススペクトル：
マススペクトル（ＳＭ）は、２〜１０μＬ／分で石英管を通して注入することにより、ポジティブモードでの電子スプレーイオン化法によりＬＣＱイオントラップ型機器（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，米国）を使って得た。主要な溶媒としてＤＣＭおよびＭｅＯＨを使用した。

実施例１
ピリジンジアゾビオチン（ＰｙＤＢ）の合成

目的：
下記の反応概略図に従って、ジアゾメチル官能基に対してアルファであり、芳香環に認識基を有するピリジン核を含有する分子の合成の実現可能性を実証する。

手順：
→ジメチルピリジン−２，４−ジカルボキシレート（２）

ＰＣｌ_５（３９ｇ；０．１８６Ｍ；３当量）およびピリジン−２，４−ジカルボン酸（１１．５ｇ；６．２×１０^−２Ｍ）を５００ｍＬのフラスコに入れる。混合物を室温で４５分攪拌し、緑色の液を形成する。次いで、ジクロロメタン（８０ｍＬ）で希釈した後、メタノール（２０ｍＬ）を慎重に添加する。全体を６０ｇのＮａＨＣＯ_３を含有する水Ｈ_２Ｏ（３００ｍＬ）に注ぎ、水相をジクロロメタン（４×５０ｍＬ）で洗浄し、有機相を１ＭのＮａ_２ＣＯ_３（２×５０ｍＬ）で洗浄する。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：７５：２５ ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン）で精製する。

固体：ｍ＝１１．７１ｇ
収率：９６％
保存：室温

^１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：４．０３（ｓ，３Ｈ，−ＯＭｅ）；４．０９（ｓ，３Ｈ，−ＯＭｅ）；８．０７（ｄｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ_３）；８．６８（ｓ，１Ｈ，Ｈ_５）；８．９１（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ_２）
^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：５３．２８（Ｃ_８，Ｃ_１０）；１２４．４９（Ｃ_５）；１２６．２９（Ｃ_３）；１３８．６４（Ｃ_４）；１４９．０６（Ｃ_６）；１５０．９２（Ｃ_２）；１６２．４５（Ｃ_７）；１６４．９６（Ｃ_９）

→メチル２−｛Ｎ−［１３−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４，７，１０−トリオキサ−トリデシル］アミノカルボニル｝ピリジン−４−カルボキシレート（３）

トルエン（３ｍＬ）中のジエステル２（２．２５ｇ；１．１×１０^−２Ｍ）を２５ｍＬのフラスコに入れる。次いで、Ｂｏｃ−ジアミン（３．７ｇ；１．２×１０^−２Ｍ；１．１当量）を混合物に添加し、９０℃で２０時間攪拌する。トルエンを蒸発させた後、粗混合物をフラッシュクロマトグラフィー（溶離液勾配：１０，２０および３０％ジクロロメタン／アセトン）により精製する。

透明な油：ｍ＝２．９ｇ
収率：５５％
保存：室温

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：１．４２（ｓ，９Ｈ，−Ｂｏｃ）；１．７４（ｑ，２Ｈ，Ｈ_９）；１．９２（ｑ，２Ｈ，Ｈ_１６）；３．２１（ｑ，２Ｈ，Ｈ_８）；３．６１（ｍ，１６Ｈ，Ｈ_１０−Ｈ_１１−Ｈ_１２−Ｈ_１３−Ｈ_１４−Ｈ_１５−Ｈ_１７）；３．９７（ｓ，３Ｈ，−ＯＭｅ）；５．０１（ｍ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）；７．９６（ｄ，１Ｈ，Ｈ_５）；８．３５（ｓ＋ｄ，２Ｈ，Ｈ_３＋Ｈ_２）；８．６９（ｍ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）
^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：２８．６３（Ｃ_２０−Ｃ_２１−Ｃ_２２）；２９．３０（Ｃ_１６）；２９．７４（Ｃ_９）；３７．５５（Ｃ_１７）；３８．８５（Ｃ_８）；５３．０２（Ｃ_２４）；６９．６９（Ｃ_１０−Ｃ_１５−Ｃ_１１−Ｃ_１４）；７０．７８（Ｃ_１２−Ｃ_１３）；７９．９７（Ｃ_１９）；１２１．６０（Ｃ_５）；１２５．５２（Ｃ_３）；１３９．０８（Ｃ_４）；１４９．２３（Ｃ_２）；１５１．７６（Ｃ_６）；１５６．２７（Ｃ_１８）；１６３．６５（Ｃ_７）；１６５．６０（Ｃ_２３）

→４−（ヒドロキシメチル）ピリジン−２−Ｎ−［１３−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４，７，１０−トリオキサトリデシル］−カルボキサミド（４）

２５０ｍＬのフラスコ中でモノエステル（２．７３ｇ；５．４×１０^−３Ｍ）をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に溶解する。混合物を氷浴により冷却し、ＮａＢＨ_４（１．３２ｇ；３．５×１０^−２Ｍ；６．５当量）を少しずつ添加する。混合物を３０分間室温で攪拌する。

混合物をＨ_２Ｏ（１００ｍＬ）に希釈し、飽和ＮＨ_４Ｃｌで中和した後、ジクロロメタン（４×１００ｍＬ）で抽出する。有機相を合わせ、デシケーターで減圧下で一晩蒸発、乾燥させる。

透明な油：ｍ＝２．４４ｇ
収率：９５％
保存：室温

^１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：１．４２（ｓ，９Ｈ，−Ｂｏｃ）；１．７５（ｑ，２Ｈ，Ｈ_９）；１．９１（ｑ，２Ｈ，Ｈ_１６）；３．０２（ｍ，１Ｈ，ＯＨ）；３．１９（ｑ，２Ｈ，Ｈ_８）；３．５９（ｍ，１６Ｈ，Ｈ_１０−Ｈ_１１−Ｈ_１２−Ｈ_１３−Ｈ_１４−Ｈ_１５−Ｈ_１７）；４．７９（ｄ，２Ｈ，Ｈ_２３）；５．０３（ｍ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）；７．４７（ｄ，１Ｈ，Ｈ_３）；８．１５（ｓ，１Ｈ，Ｈ_５）；８．３９（ｍ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）；８．５１（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ_２）
^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：２８．７７（Ｃ_２０−Ｃ_２１−Ｃ_２２）；２９．２６（Ｃ_１６）；３０．０７（Ｃ_９）；３７．６８（Ｃ_１７）；３９．０１（Ｃ_８）；６３．７０（Ｃ_２３）；６９．４２（Ｃ_１０−Ｃ_１５）；７０．３９（Ｃ_１１−Ｃ_１４−Ｃ_１２−Ｃ_１３）；７９．９６（Ｃ_１９）；１１９．９５（Ｃ_５）；１２３．８７（Ｃ_３）；１４８．４４（Ｃ_２）；１５０．０３（Ｃ_６）；１４３．３４（Ｃ_４）；１５６．４２（Ｃ_１８）；１６４．９６（Ｃ_７）

→４−（ホルミル）ピリジン−２−Ｎ−［１３−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４，７，１０−トリオキサトリデシル］カルボキサミド（５）

（ＣＯＣｌ）_２（１．２ｍＬ、１３．７ｍＭ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液を−７０℃でアルゴン下にＤＭＳＯ（２．０ｍＬ、２８．２ｍＭ）のジクロロメタン（８ｍＬ）溶液に添加する。これを−７０℃で３０分間攪拌した後、アルコール４（１．９２ｇ、４．２ｍＭ）のジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液を滴下する。これを−７０℃で３０分間攪拌し、ＮＥｔ_３（６．５ｍＬ、４７ｍＭ）を添加する。反応混合物を０℃で３時間攪拌した後、水（７０ｍＬ）に注ぐ。水相を上記ジクロロメタンで抽出し、洗浄（ＮａＨＣＯ_３）、ＭｇＳＯ_４で乾燥、蒸発させて粘性の油を得る。Ｍｅ_２Ｓの遊離が起こるので、次亜塩素酸ナトリウム溶液を使用してこれを捕捉し、汚染された容器を洗浄しなければならない。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（遊離液：８５：１５ ＡｃＯＥｔ／アセトン）により精製する。

透明な油：ｍ＝１．４６ｇ
収率：７５％
^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：１．４２（ｓ，９Ｈ，−Ｂｏｃ）；１．７６（ｑ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ_９）；１．９５（ｑ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ_１６）；３．２２（ｑ，２Ｈ，Ｈ_８）；３．５７（ｍ，１６Ｈ，Ｈ_１０−Ｈ_１１−Ｈ_１２−Ｈ_１３−Ｈ_１４−Ｈ_１５−Ｈ_１７）；４．９８（ｍ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）；７．８５（ｄ，１Ｈ，Ｈ_３）；８．５９（ｓ，１Ｈ，Ｈ_５）；８．７７（ｄ，１Ｈ，Ｈ_２）；１０．１５（ｓ，１Ｈ，Ｈ_ａｌ）
^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：２９．５９（Ｃ_２０−Ｃ_２１−Ｃ_２２）；３０．０３（Ｃ_９−Ｃ_１６）；３８．１１（Ｃ_８−Ｃ_１７）；７０．１１（Ｃ_１０−Ｃ_１５）；７０．９９（Ｃ_１１−Ｃ_１４−Ｃ_１２−Ｃ_１３）；７９．５０（Ｃ_１９）；１２２．２７（Ｃ_５）；１２３．６８（Ｃ_３）；１４３．２２（Ｃ_４）；１４９．８０（Ｃ_２）；１５２．６１（Ｃ_６）；１５６．３５（Ｃ_１８）；１６３．６２（Ｃ_７）；１９１．３２（Ｃ_２３）

→４−（ジメトキシメチル）ピリジン−２−Ｎ−（１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデシル）カルボキサミド（６）

アルデヒド５（１．４ｇ、３．１ｍＭ、１当量）を１０ｍＬのメタノールに溶解する。ＴＭＳＣｌ（１ｍＬ、７．９ｍＭ、２．５当量）を添加し、混合物を一晩攪拌する。１Ｍの水酸化ナトリウム（４０ｍＬ）溶液を添加し、生成物をジクロロメタンで抽出する。有機相を炭酸ナトリウムの存在下で乾燥し、溶媒を真空下で蒸発させる。

Ｍ＝９９７ｍｇ
収率：８１％

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：８．５４（ｄ，１Ｈ，Ｈ_６），８．３５（ｂｒ ｓ，１Ｈ，Ｈ_８），８．２４（ｓ，１Ｈ，Ｈ_３），７．５２（ｄ，１Ｈ，Ｈ_５），５．４２（ｓ，１Ｈ，Ｈ_２３），３．７１−３．５３（ｍ，１５Ｈ，Ｈ_９＋Ｈ_{１１−１６}），３．３３（ｓ，６Ｈ，Ｈ_{２４，２５}），２．８０（ｔ，２Ｈ，Ｈ_１８），１．９１（ｑｕｉｎｔ，２Ｈ，Ｈ_１０），１．７５（ｑｕｉｎｔ，２Ｈ，Ｈ_１７）

→アセタール−ビオチン（７）

アセタール（６）（１．５４ｇ、３．９ｍＭ）を３０ｍＬのジクロロメタンに溶解する。ビオチン（１．３６ｇ、４．２ｍＭ、１．１当量）を添加し、混合物を２時間攪拌する。溶液を５０ｍＬの１Ｍ炭酸ナトリウムで３回抽出する。水相を５０ｍＬのジクロロメタンで洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を蒸発させる。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー、ＳｉＯ_２、φ＝５０ｍｍ、１５ｃｍ、溶離液：７００ｍＬの１０％メタノール／ジクロロメタン次いで１Ｌの１５％メタノール／ジクロロメタンで精製する。次いで、溶媒を蒸発させ、油性の残留物をエーテルで洗浄して白色粉末を得る。

ｍ＝１．７８ｇ
収率：７４％

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ ｄｕａｌ，ＣＤＣｌ_３）：８．５５（ｄ，１Ｈ，Ｈ_２），８．３５（ｔ，１Ｈ，Ｈ_１３），８．２６（ｓ，１Ｈ，Ｈ_５），７．５５−７．５３（ｍ，１Ｈ，Ｈ_１），６．７（ｂｒｏａｄ ｓ，１Ｈ，Ｈ_４２），６．２（ｂｒｏａｄ ｓ，１Ｈ，Ｈ_４０），５．４４（ｓ，１Ｈ，Ｈ_７），４．４−４．６（ｍ，１Ｈ，Ｈ_３８），４．２−４．４（ｍ，１Ｈ，Ｈ_３９），３．７１−３．５４（ｍ，１６Ｈ，Ｈ_１５，Ｈ_{１７−２５}，Ｈ_２７），３．３４（ｓ，６Ｈ，Ｈ_{１０−１１}），３．２−３．１（ｍ，１Ｈ，Ｈ_３５），３−２．８（ｍ，１Ｈ，Ｈ_３７），３．８−３．７（ｍ，１Ｈ，Ｈ_３７’），２．１９（ｔ，２Ｈ，Ｈ_３１），１．９２（ｑｕｉｎｔ，２Ｈ，Ｈ_１６），１．８−１．３（ｍ，８Ｈ，Ｈ_２６，Ｈ_{３２−３４}）

→アルデヒド（８）

アセタール（７）（１．７６ｇ、２．８ｍＭ）を８０：２０ 酢酸：水 溶液（２０ｍＬ）に溶解し、混合物を６０℃で２４時間アルゴン下に攪拌する。溶液を蒸発させ、油性の残留物を白色粉末が得られるまでエーテルで洗浄する。

Ｍ＝１．８３ｇ
収率：約１００％

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ ｄｕａｌ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１０．１７（ｓ，１Ｈ，Ｈ_８），８．９２（ｓ＋ｄ，２Ｈ，Ｈ_１０,２），８．４２（ｓ，１Ｈ，Ｈ_５），７．９９（ｄ，１Ｈ，Ｈ_１），７．７３（ｔ，１Ｈ，Ｈ_２５），６．４−６．３（ｓ＋ ｂｒｏａｄ ｓ，２Ｈ，Ｈ_{３９，３７}），４．３−４．１（ｍ＋ｍ，２Ｈ，Ｈ_{３５，３６}），３．５３−３．２８（ｍ，１８Ｈ，Ｈ_{１２，１４−２２，２４}），３．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ_３２），２．８０（ｄ，１Ｈ，Ｈ_３４），２．７８（ｄ，１Ｈ，Ｈ_３４’），２．２−１．００（ｍ，１２Ｈ，Ｈ_{１３，２８−３１}）

→トシルヒドラゾン（９）

アルデヒド８（１．６２ｇ、２．７９ｍＭ）のジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）溶液を１３０℃で３０分間アルゴン下で攪拌する。４−メチルベンゼンスルホンヒドラジドを添加し、混合物を１時間攪拌する。溶媒を蒸発させ、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー：ＳｉＯ_２、φ＝３０ｍｍ、１５ｃｍ、溶離液：１０％メタノール／ジクロロメタンで精製する。油性の残留物を黄色粉末が得られるまでエーテルで洗浄する。

Ｍ＝１．５７ｇ
収率：７５％

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ ｄｕａｌ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１２．０（ｂｒｏａｄ ｓ，１Ｈ，Ｈ_３９），８．８３（ｓ，１Ｈ，Ｈ_８），８．６３（ｄ，１Ｈ，Ｈ_２），８．１３（ｓ，１Ｈ，Ｈ_４１），７．９９（ｓ，１Ｈ，Ｈ_５），７．７７（ｄ，２Ｈ，Ｈ_{４６,５０}），７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｈ_１），７．４２（ｄ，２Ｈ，Ｈ_{４７,４９}），６．４１（ｓ，１Ｈ，Ｈ_３７），６．３５（ｓ，１Ｈ，Ｈ_３５），４．４−４．２（ｍ，１Ｈ，Ｈ_３４），４．０−４．２（ｍ，１Ｈ，Ｈ_３３），３．５１−３．３３（ｍ，１６Ｈ，Ｈ_{９，１１−２０，２２}），３．１−３．０（ｍ，２Ｈ，Ｈ_３２），２．８−２．７（ｍ，１Ｈ，Ｈ_３０），２．３６（ｓ，３Ｈ，Ｈ_５１），２．０３（ｔ，２Ｈ，Ｈ_１０），１．７７（ｔ，２Ｈ，Ｈ_２１），１．６−１．２（ｍ，８Ｈ，Ｈ_{２６−２９}）

→最終ジアゾ化合物（１０）

トシルヒドラゾン９（２００ｍｇ、０．２７ｍＭ）を２５ｍＬフラスコに入れる。水素化ナトリウム（油中６０％）（４２．８ｍｇ、１．０７ｍＭ、４当量）のメタノール（１０ｍＬ）溶液を添加し、混合物を室温で２４時間攪拌する。生成物を０．５ＭのＮａ_２ＣＯ_３（１０ｍＬ）およびジクロロメタン（４×１０ｍＬ）で抽出する。油性の残留物をエーテルで洗浄してオレンジ色の粉末を得る。

Ｍ＝１３５ｇ
収率：８８％

^１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ ｄｕａｌ，ＣＤＣｌ_３）：８．３１−８．２８（ｂｒ ｓ＋ｄ，２Ｈ，Ｈ_８，２），７．７３（ｄ，１Ｈ，Ｈ_５），６．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ_１），６．６２（ｔ，１Ｈ，Ｈ_２３），６．１３（ｓ，１Ｈ，Ｈ_３７），５．３２（ｓ，１Ｈ，Ｈ_３５），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｈ_３９），４．６−４．４（ｍ，１Ｈ，Ｈ_３４），４．４−４．２（ｍ，１Ｈ，Ｈ_３３），３．７−３．５（ｍ，１８Ｈ，Ｈ_{９，１１−１２，２２}），３．１３（ｍ，１Ｈ，Ｈ_３０），２．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ_３２），２．７２（ｄ，１Ｈ，Ｈ_３２’），２．２−１．３（ｍ，１２Ｈ，Ｈ_{１０，２１，２６−２９}）

結果および結論：
我々は、認識基（ビオチン）を担持するピリジン核と共役したジアゾメチル官能基を有する化合物の合成が収率良く実現可能であることを実証した。

実施例２
ピリジンジアゾケトンビオチン（ＰｙＤＫＢ）の合成
目的：
下記の反応概略図に従って、ジアゾ官能基に対してアルファであるピリジン核と、ジアゾ官能基に対してアルファ’である認識基（ビオチン）とを有する分子の合成の実現可能性を実証する。

手順：
→ブロモケトン（１２）の合成

γ−ブチロラクトン（５．０２０ｇ／４．５５ｍＬ；３２．２３ｍＭ；１．０当量）をＴＨＦ（１５ｍＬ；３．３ｖ）で希釈した後、氷浴で０℃に冷却する。水素化ナトリウム（６０％；３．０１８ｇ；７５．４２ｍＭ；２．２７当量）を５分間かけて添加した後、氷浴を３０分間取り外す。フラスコを０℃に戻した後、イソニコチン酸エチル（３．８０ｍＬ；４９．８４ｍＭ；１．５当量）のＴＨＦ（２４５ｍＬ；６４．５ｖ）溶液を１滴ずつ流し入れる。反応は室温で１８時間攪拌して行う。ＴＨＦを真空下蒸発除去した後、残留物を１００ｍＬのエチルエーテルに取り込み、期待した生成物を沈殿させ、懸濁液を濾過した後、ロータリーエバポレーターで１ｍｂａｒで２０分間乾燥し、生成物を取得する。本生成物の一部（４．７２１ｇ；２４．７ｍＭ）を４８％臭化水素酸（３８ｍＬ、すなわち６５０ｍＭ）水に取り込み、２時間で１１０℃に昇温する。反応混合物をＮａ_２ＣＯ_３でｐＨ９へ塩基性化した後、２００ｍＬの水と合わせ、２００ｍＬの酢酸エチルで２回抽出する。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥、綿濾過、ロータリーエバポレーターで蒸発させる。

ｍ＝３．０９６ｇ
収率（２工程後）：２１％
ＨＰＬＣ法：中性

→保護ブロモケトン（１３）の合成

５００ｍＬのフラスコ中で、ブロモケトン（３．０９６ｇ；１３．５７ｍＭ；１．０当量）を無水エタノール（１６５ｍＬ；８０ｍＭ）に溶解し、塩化トリメチルシリル（５１．５ｍＬ；４０７．２ｍＭ；３０．０当量）を添加後、反応混合物をアルゴン下に置き、次いで５３℃（試薬の沸点より低い温度）に１８時間加熱する。反応混合物を蒸発乾燥後、５０ｍＬの水に取り、３５％苛性ソーダ溶液でｐＨ９−１０の塩基性にした後、２００ｍＬとし、ジクロロメタン（ＤＣＭとも略記される）２×１５０ｍＬで抽出する。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥、濾過、減圧下で蒸発乾燥する。蒸発残留物を１ｍＬのＤＣＭに取り、順相Ｓｉ６０シリカゲル（ｈ＝５０ｃｍ；φ＝１５ｃｍ；溶離液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９５／５）のカラムに載せる。

ｍ＝１．５０６ｇ
収率：４０％
ＴＬＣ溶離液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９５／５
ＨＰＬＣ法：中性

^１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．４−１．７（Ｍ；２Ｈ；ｅ）；３．０−３．２５（ｍ；８Ｈ；ｆ，ｇ）；３．３０（ｔ；２Ｈ；ｄ）；７．４２（ｄ；２Ｈ；ａ）；８．６５（ｄ；２Ｈ；ｂ）

→保護アミノ化ケトン（ガブリエル反応）（１５）

ブロモケトン（１．５０６ｇ；５．４９ｍＭ；１．０当量）、フタルイミドカリウム（１．５２６ｇ；８．２４ｍＭ；１．５当量）およびＤＭＦ（５５ｍＬ；０．１Ｍ）を１００ｍＬフラスコに入れ、１５５℃で１５分間加熱する。溶媒を蒸発乾燥後、蒸発残留物を１００ｍＭの苛性ソーダ溶液２００ｍＬに取り、ＤＣＭ、２×２００ｍＬで抽出し、ジクロロメタン相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥、濾過、蒸発乾燥して化合物１４を得る。これを全部（５．４９ｍＭ；１．０当量）、水（２１．３５ｍＬ；１０９．８ｍＭ；２０当量）およびメタノール（１０９ｍＬ；５０ｍＭ）中、２５％ヒドラジンと反応させ、反応混合物を１８時間攪拌する。溶媒を除去した後、残留物を１０ｍＭの苛性ソーダ溶液２００ｍＬに取り、ＤＣＭ ３×２００ｍＬで抽出する。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥、濾過、減圧下で蒸発後、得られた油分を１ｍＬのＤＣＭに取り、順相Ｓｉ６０シリカゲル（ｈ＝１５ｃｍ；φ＝３ｃｍ；溶離液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ_３：９７．５／２．５／１）のカラムに載せる。

ｍ＝３００ｍｇ
収率：２６％
ＴＬＣ溶離液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ_３：９０／１０／１
ＨＰＬＣ法：中性

^１Ｈ ＮＭＲ（フタルイミド１４）（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．２−１．３（Ｍ；２Ｈ；ｅ）；１．８８（Ｍ；２Ｈ；ｄ）；３．０３（ｔ；６Ｈ；ｇ）；３．４４（ｄｄ；２Ｈ；ｆ）；７．４５（ｄ；２Ｈ；ａ）；７．５７−７．７１（ｍ；４Ｈ；ｉおよびｊ）；８．５２（ｄ；２Ｈ；ｂ）
^１Ｈ ＮＭＲ（アミン１５）（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．０−１．２（ｍ；４Ｈ；ｅおよびｆ）；１．８８（Ｍ；２Ｈ；ｄ）；２．５４（ｔ；２Ｈ；ｈ）；３．１５（ｔ；６Ｈ；ｇ）；７．３５（ｄ；２Ｈ；ａ）；８．５８（ｄ；２Ｈ；ｂ）

活性化ビオチン（２０）の合成

ビオチン（５ｇ、２３．１ｍＭ、１．０当量）を無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）およびピリジン（２．０７ｍＬ、２５．４ｍＭ、１．１当量）に懸濁する。５分間攪拌した後、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ−ＴＦＡ：４．６２１ｍＬ、すなわち、７．５０ｇ、２５．４ｍＭ、１．１当量）を添加する。一晩攪拌後、反応を完了させ、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させる。蒸発残留物を１００ｍＬのエチルエーテルに取り懸濁後、フリットフィルターで濾過、固形状物を最小量のエーテルで洗い流す。ここで、ＴＬＣで僅かにビオチンが観察されるが、以下において何ら影響しない。

ｍ＝７．１０６ｇ
収率：８１％
ＴＬＣ溶離液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝９０／１０

ビオチンと芳香族アミンの結合（化合物１６）

化合物１５（８０８ｍｇ、２．０ｍＭ、１．４当量）を６０℃のＤＭＦ（４．２８ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（１．６０ｍＬ、１１．４ｍＭ、８．０当量）の添加前に、５分間攪拌する。化合物２０のＤＭＦ溶液（５００ｍＭで２．８５ｍＬ、すなわち、３００ｍｇ、１．４ｍＭ、１．０当量）を一度に全てを添加する。６０分後、溶媒を減圧下に蒸発させる。それ以上の処理を行うことなく、粗反応生成物をそのまま脱保護に使用する。

質量および収率は次の段階で計算する。
ＨＰＬＣ法：中性

ビオチニル化ケトン（化合物１７）

化合物１６を６Ｍ塩酸溶液５０ｍＬに取り、室温で２時間攪拌する。溶液を蒸発させて乾燥する。残留物は塩酸塩の状態において赤色の油である。それを９０／８／２ ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＴＥＡ混合物に取り、油を脱色し、気体を蒸発させ、２ｍＬのトリエチルアミンを添加した後、混合物を蒸発乾燥して得られた沈殿物を１００ｍＬのエチルエーテルおよび１０ｍＬのＤＣＭに取り、懸濁液を濾過、固形状物を５０ｍＬのエーテルで粉砕し、２８℃で２時間真空下のオーブンに放置する。粉末を５ｍＬのＤＣＭ／ＭｅＯＨ（８８/１２）混合物に取り、２５０μＬの２Ｍ苛性ソーダ溶液を添加し、全部を溶解する。この溶液を直径＝３ｃｍ、ｈ＝１６ｃｍ、ｖ＝５ｃｍ／分のＳｉ６０シリカゲルカラムに載せ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（８８/１２）混合物で溶出する。

ｍ＝９４０ｍｇ
収率：８３％、第２工程後、かつ２．９当量の塩酸トリエチルアミンを無視する場合。
ＴＬＣ溶離液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：８５／１５
ＨＰＬＣ法：中性

^１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝１．２８（ｔ；ＴＥＡ）；１．４９（Ｍ；２Ｈ；ｋ）；１．３０−１．５０（ｍ；４Ｈ；ｊおよびｌ）；１．７３（ｑｕｉｎｔ；２Ｈ；ｅ）；２．０５（ｔ；２Ｈ；ｉ）；２．６−２．８（Ｍ；２Ｈ；ｍ）；２．９−３．２（ｍ；ＴＥＡの５Ｈ＋Ｈ；ｄ，ｆ，ｎおよびＴＥＡ）；４．０−４．３（ｍ；２Ｈ；ｏおよびｏ’）；６．３８（ｓ；１Ｈ；ｐ’）；６．４３（ｓ；１Ｈ；ｐ）；７．７８（ｄ；２Ｈ；ｂ）；７．９５（ｔ；１Ｈ；ｈ）；８．０８（ｄ；２Ｈ；ａ）；１０．３（ｍ；塩酸ＴＥＡ）

→ケトンのヒドラゾン化（１８）

ケトン１７（４００ｍｇ、５０６．５μＭ）をＤＭＦ（２．２５ｍＬ、２２４ｍＭ）、ＭｅＯＨ（１１．３ｍＬ、４４．８ｍＭ）および酢酸（５８０μＬ、１０．１３ｍＭ、２０当量）に溶解し、２４７μＬのヒドラジン一水和物（２４６μＬ、５．０６５ｍＭ、１０当量）を添加する。溶液を２時間攪拌後、蒸発乾燥する。蒸発残渣物を５ｍＬの水に取り、１５ｍＬのフラスコに移してｐＨが１０に達するまで２Ｍ苛性ソーダで塩基性化し、生成物を沈殿させ、試験管をボルテックスにより攪拌してよく混合した後、８０００ｒｐｍで遠心分離する。上清を捨て、上記操作をさらに２回繰り返してｐＨ１０の苛性ソーダ溶液の５ｍＬに取る。沈殿物（黄色粉末）を酸化工程に使用する前に室温で真空下でオーブン内で乾燥する。

ｍ＝１９０ｍｇ
収率：９３％
ＨＰＬＣ法：中性、その後塩基性

^１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝１．２−１．７（ｍ；８Ｈ；ｅ，ｊ，ｋおよびｌ）；１．７３（ｑｕｉｎｔ；２Ｈ；ｅ）；２．０６（ｔ；２Ｈ；ｉ）；２．６−２．９（Ｍ；２Ｈ；ｍ）；３．０−３．２（ｍ；３Ｈ；ｆおよびｎ）；４．１０−４．３５（ｍ；２Ｈ；ｏおよびｏ’）；６．３９（ｓ；１Ｈ；ｐ’）；６．４７（ｓ；１Ｈ；ｐ）；７．１１（ｓ；２Ｈ；ｒ）；７．５５（ｄ；２Ｈ；ｂ）；７．８７（ｔ；１Ｈ；ｈ）；８．４７（ｄ；２Ｈ；ｂ）。

→ピリジンジアゾケトン（ＰｙＤＫＢ）のビオチニル化（１９）

ヒドラジン１８（１７７．２ｍｇ、４３８μＭ、１．０当量）をＤＭＦ（２２ｍＬ、２０ｍＭ）に部分的に溶解し、０℃に冷却し、テトラメチルグアニジン（４４８μＬ、３．５６ｍＭ、８．１４当量）、３Å分子篩（７２２ｍｇ、試薬の質量の３.８倍）および酸化マンガン（２．３８７ｇ、３５．６ｍＭ、８１．４当量）を添加する。懸濁液を２０分間攪拌した後、１ｃｍ厚さのセライトプラグで濾過し、プラグを濾液が無色になるまでメタノールで洗い流す。溶液を蒸発乾燥した後、２０ｍＬのＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９０／１０）に取り、０．２５ＭのＮａ_２ＣＯ_３溶液で洗浄する。沈殿物が形成される。分析後、沈殿物および有機相を合わせ、蒸発乾燥し、１００ｍＬのＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９０／１０）混合物に溶解、１００ｍＬの０．０５ＭのＮａ_２ＣＯ_３で洗浄する。有機相を回収し、無水Ｎａ_２ＣＯ_３で乾燥、濾過、蒸発乾燥する。

ｍ＝４２．８ｍｇ
収率：２４．３％
ＨＰＬＣ法：塩基性

^１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝１．２０−１．７４（ｍ；８Ｈ；ｅ，ｊ，ｋおよびｌ）；１．７３（ｑｕｉｎｔ；２Ｈ；ｅ）；２．０７（ｔ；２Ｈ；ｉ）；２．６−２．９（Ｍ；２Ｈ；ｍ）；３．００−３．２５（ｍ；３Ｈ；ｆおよびｎ）；４．１０−４．３５（ｍ；２Ｈ；ｏおよびｏ’）；６．３７（ｓ；１Ｈ；ｐ’）；６．４４（ｓ；１Ｈ；ｐ）；６．９４（ｄ；２Ｈ；ｂ）；７．９０（ｔ；１Ｈ；ｈ）；８．３５（ｄ；２Ｈ；ｂ）

結果および結論：
我々は、アルファ位にピリジン核が共役していてアルファ’で認識基（ビオチン）に連結しているジメチル官能基を含有する化合物の合成が収率良く実現可能であることを実証した。

実施例３
室温、液体溶媒中におけるＢＢＰ（ｂｉｓ−ｂｉｏ−ＰＤＡＭ）分子に比較してのＰｙＤＢまたはＰｙＤＫＢの安定性の実証
目的：
液体溶媒中でのＰｙＤＢまたはＰｙＤＫＢ分子の安定性を第二世代分子と比較して実証することを目的とする。このために、各化合物の１２５ｍＭを室温（２２＋／−１℃）で９６／４ ＤＭＳＯ／メタノール混合物中に保存する過酷な条件下で加速安定性試験を行う。なお、これらは過酷な保存条件である。

手順：
図２に示す３つの化合物、ＰｙＤＢ、ＰｙＤＫＢおよびＢＢＰを１２５ｍＭで９６／４ ＤＭＳＯ／メタノール混合物中に溶解し、室温（２２プラスまたはマイナス１℃）で保存する。これらの溶液の２μＬをＨＰＬＣ（塩基性方法、ウォーターズＨＰＬＣシステム）に一定の間隔で注入し、クロマトグラム（ソフトウェアＥｍｐｏｗｅｒ２のＰＤＡ Ｍａｘ Ｐｌｏｔ）のピーク全体を積分して主要生成物の分解を測定する。初期化合物の純度の変化を時間の関数としてプロットし、図５に明示する。

結果と結論：
ＢＢＰは数日以内に分解される（１０日目で純度＜１０％）が、２つの第四世代分子であるＰｙＤＢおよびＰｙＤＫＢはこの期間の最後まで８０％以上が安定したままであることが明らかに示される。
ジアゾ官能基に対してアルファであるピリジル部分の存在は、電子非局在化によりジアゾ官能基を安定化し、加水分解の影響を受けにくくする。アルファ’の標識の存在は水性溶媒中での加水分解の影響を受けにくくし、この官能基をさらに大幅に安定化する。

実施例４
＋４℃で乾燥状態におけるＢＢＰ分子に比較してのＰｙＤＢの安定性の実証

目的：
ＰｙＤＢまたはＰｙＤＫＢ分子の乾燥安定性を第二世代ＢＢＰ分子と比較して実証する。

手順：
２つのＰｙＤＢ化合物およびＢＢＰを２５０ｍＭで１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）および１０％トレハロースの溶液に溶解する。溶液を５０ｎＭのアリコートで一晩凍結乾燥する。次いで乾燥生成物を＋４℃で保存する。これらのアリコートを一定の間隔でメタノールに溶解し、これらの溶液の１５μＬをＨＰＬＣ（ウォーターズ）に注入し、クロマトグラム（ソフトウェアＥｍｐｏｗｅｒのＰＤＡ Ｍａｘ Ｐｌｏｔ）のピークの全体の積分により主要生成物の分解を測定する。初期化合物の純度の変化を時間の関数としてプロットし、図６に明示する。

結果と結論：
実施例３と同様だが、より著しい程度に、ＢＢＰが凍結乾燥に耐えない（この段階で＞６０％が分解）のに対して、ＰｙＤＢまたはＰｙＤＫＢはこの工程で完全に安定したままであることが証明される。さらに、４℃で乾燥状態に一か月以上保存しても分解は非常にわずかである（２つの第四世代の標識の純度は８０％以上）。
前と同様に、ジアゾ官能基に対してアルファであるピリジル部分の存在は、電子非局在化によりジアゾ官能基を安定化し、加水分解の影響を受けにくくする。

実施例５
中間精製を伴う、ＢＢＰ分子と比較した、ＰｙＤＢでの核酸の標識化
目的：
第二世代の分子（ＢＢＰ）と比較して、ＰｙＤＢ分子による核酸の標識化の有効性を実証する。

この目的のために、増幅反応（ＮＡＳＢＡ、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓベーシックキット、ビオメリュー社製、Ｂｏｘｔｅｌ、オランダ）によって得られた、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１７４塩基配列の断片であるＲＮＡアンプリコンをジアゾ標識との反応によりビオチンで標識する。標識化反応の生成物を、アフィメトリックス社製のＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーションによって検出する（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７（１），４９−５５頁，Ａ．Ｔｒｏｅｓｃｈら，１９９９に記載のＣｕｓｔｏｍ ＤＮＡ Ｃｈｉｐ Ｃｏｍｂｏ Ｍｙｃｏ）。

手順：
チューブ内で以下を混合する：
・１８μＬの２５０ｍＭの標識溶液（９６／４ ＤＭＳＯ／メタノール）、これはＰｙＤＢまたはＢＢＰのいずれかである、
・１２μＬのＤＭＳＯ、
・１５μＬのＮＡＳＢＡ０．５×緩衝液（「ＮｕｃｌｉＳｅｎｓベーシックキットＥａｓｙＱビオメリュー」キット）、
・３５μＬの１ＭのトリスＨＣｌ、
・５μＬの０．１×ＮＡＳＢＡ（ＮＡＳＢＡ増幅反応、１０倍希釈、１７４塩基のアンプリコン）、および
・１５μＬの２０ｍＭのＨＣｌ。
溶液をボルテックスで混合し、次に６５℃で１０分間インキュベートする。

核酸の精製：
標識された核酸は、製造業者が推奨する精製プロトコルを使用して、ＱｉａＱｕｉｃｋカラム（ＰＣＲ精製キットＱｉａＱｕｉｃｋ、キアゲン社製、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）で精製した。溶出量は１００μＬである。

ＤＮＡチップ上でのハイブリダイゼーション：
精製後、標識された核酸を４００μＬのハイブリダイゼーション緩衝液に移す。サンプルを、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６ＳＲＮＡの「ＧｅｎＢａｎｋ」Ｍ２０９４０配列の解析用に設計されたＤＮＡチップにハイブリザイズさせる。このＤＮＡチップはＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７（１），４９−５５頁，１９９９に発表された文献にＡ.Ｔｒｏｅｓｃｈらによって記載されている。

ハイブリダイゼーション工程は、Ａ.Ｔｒｏｅｓｃｈらの上記刊行物に記載されているハイブリダイゼーションプロトコルおよび緩衝液を利用して、ＦＳ４５０ ｆｌｕｉｄｉｃｓ ｓｔａｔｉｏｎｓ（アフィメトリックス、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）で実施する。

ハイブリダイゼーションは、以下の条件下で使用された、標識のビオチンと相互作用する、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したストレプトアビジン（ＳＡ）との結合により明らかになる。すなわち、３００μＬの純水、３００μＬの１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７）／１ＭのＮａＣｌ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／０．００５％の消泡剤、６μＬのＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ）、６μＬのＳＡ−ＰＥ（３００μｇ／ｍＬ）。

ＤＮＡチップの読み取り：
標識化とハイブリダイゼーションの後に、ＤＮＡチップの表面に放射される蛍光の読取およびシグナル強度と相同率に関するデータの作成を、アフィメトリックスから提供される読み取りシステムおよびソフトウェア（Ｓｃａｎｎｅｒ Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ ＡｒｒａｙおよびＧＣＯＳソフトウェア）によって実施する。読取りシステムは、ｒｆｕ（「相対的蛍光単位」）で表示されるシグナルおよびバックグラウンドノイズ強度を提供する。相同率（図７、図８及び図１０における、％ＢＣまたは％Ｒｉｇｈｔ）を参照配列、この場合はマイコバクテリウム・ツベルクローシスの配列と比較して示す。
標識ＢＢＰおよびＰｙＤＢの結果を、シグナル強度（Ｍｅｄ）、バックグラウンドノイズ（ＭｅｄＢｃｋｇｄ）および相同率（％Ｒｉｇｈｔ）の中央値として図７のグラフに示す。
一般的に、９０％より高い相同率が優先的に求められる。第２には、高い特異的なシグナルと低いバックグラウンドノイズが求められる。

結果と結論：
この実施例は、標識ＰｙＤＢでは、ＢＢＰ参照分子により得られるシグナルより３倍高い蛍光シグナルが得られることを示す。
ＰｙＤＢの非常に大きな安定性を考慮すると、この標識が以前の世代の分子に比較して優れていることが実証される。

実施例６
中間精製を伴わない、ＢＢＰ分子と比較しての、ＰｙＤＢでの核酸の標識化
目的：
実施例５と同じことを実証することを目的とするが、精製による余分な標識の除去をしない、好ましくない条件下である。

手順：
１ｍＬのチューブ内で以下を混合する：
・５μＬの８ｍＭの標識溶液（ＤＭＳＯ／メタノール＝９６／４）。これはＰｙＤＢまたはＢＢＰのどちらかである、
・５μＬの０．１×ＮＡＳＢＡ（ビオメリューのＮｕｃｌｉＳｅｎｓベーシックキット）、
・５μＬの１ＭのトリスＨＣｌ、及び
・５μＬの２０ｍＭのＨＣｌ。

溶液をボルテックスで混合し、次に６５℃で１０分間インキュベートする。この標識された核酸を精製することなく、直接ハイブリダイズさせる。

ＤＮＡチップ上でのハイブリダイゼーション：
標識された核酸を、精製せずに、４８０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液に移す。サンプルを、前の実施例と同じ方法でＤＮＡチップにハイブリダイズさせる。

ＤＮＡチップの読取り：
標識ＢＢＰおよびＰｙＤＢの結果を、強度、バックグラウンドノイズおよび相同率として図８のグラフに示す。

結果と結論：
この実施例は、その構造により、標識ＰｙＤＢがＢＢＰ参照分子に比較して減少したバックグラウンドノイズを呈することを示す。特異的なハイブリダイゼーションを示す特異的なシグナルも向上し、相同率は、ＢＢＰでは比較的低いが、ＰｙＤＢ（２ｍＭ）では高くなっている。

前と同様に、前の世代に比較して、第四世代の分子の優位性が実証されている。

実施例７
ＰｙＤＢにより標識されたアンプリコンの２４時間にわたる安定性の評価
目的：
目的は、標識したＲＮＡアンプリコンがその蛍光強度を失うことなしに、ＤＮＡチップ上に２４時間までハイブリダイズできることを実証することであり、これは、ＲＮＡ−標識結合の安定性を実証する。

手順：
チューブ内で以下を混合する。
・５μＬの１０ｍＭの標識（ＰｙＤＢまたはＢＢＰ）ＤＭＳＯ／ＭｅＯＨ（９６／４）溶液、
・５μＬの０．１×ＮＡＳＢＡ（ビオメリューのＮｕｃｌｉＳｅｎｓベーシックキット）増幅産生物、
・５μＬの１ＭのトリスＨＣｌ、及び
・５μＬの水。

溶液をボルテックスで混合し、次に６５℃で１０分間インキュベートする。

核酸の精製：
標識された核酸を、製造業者が推奨する精製プロトコルを使用して、ＱｉａＱｕｉｃｋ（ＰＣＲ精製キット、キアゲン社製）カラムで精製した。溶出量は１００μＬである。

ＤＮＡチップ上でのハイブリダイゼーション：
精製後、標識された核酸を、４００μＬのハイブリダイゼーション緩衝液に移す。サンプルを、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６ＳＲＮＡの「ＧｅｎＢａｎｋ」Ｍ２０９４０配列の解析用に設計されたＤＮＡチップにハイブリザイズさせる。このＤＮＡチップはＡ．Ｔｒｏｅｓｃｈらによる刊行物、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７（１），４９−５５頁，１９９９に記載されている。
ハイブリダイゼーション工程は、８０μＬのハイブリダイゼーション混合物をチップに注入し、次いでこれをハイブリダイゼーションオーブンに４５℃で０．５時間、２時間、６．５時間または２４時間置くことによって行った。
ハイブリダイゼーションは、以下の条件下で使用された標識であるビオチンと相互作用する、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したストレプトアビジン（ＳＡ）との結合により明らかになる。すなわち、３００μＬの純水、３００μＬの１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７）／１ＭのＮａＣｌ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／０．００５％の消泡剤、６μＬのＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ）、６μＬのＳＡ−ＰＥ（３００μｇ／ｍＬ）。

ＤＮＡチップの読み取り：
標識化とハイブリダイゼーションの後に、ＤＮＡチップの表面に放射される蛍光の読取およびシグナル強度と相同率に関するデータの作成を、アフィメトリックスから提供される読み取りシステムおよびソフトウェアによって実施する。読取りシステムは、ｒｆｕ（「相対的蛍光単位」）で表示されるシグナルおよびバックグラウンドノイズ強度を提供する。相同率を参照配列、この場合はマイコバクテリウム・ツベルクローシスの配列と比較して示す。
第四世代標識ＰｙＤＢの結果を、ハイブリダイゼーション時間の関数としてのシグナル強度（Ｍｅｄ）の中央値として、図９に示す。
蛍光シグナルが安定したままであり、ハイブリダイゼーション時間に応じて上昇する傾向さえあることを示す。

結果と結論：
この実施例は、ＰｙＤＢにより標識されたアンプリコンがハイブリダイゼーションの過程において完全に安定したままであり、（長時間のハイブリダイゼーションや腫瘍学での遺伝子発現において特に有利な）２４時間の延長も可能であることを示す。図９を参照。
蛍光シグナルが時間とともに増加さえすることが観察され、それはアンプリコンの良好なハイブリダイゼーションによるものである（ハイブリダイゼーションの反応速度が遅い）。
このように、標識-核酸の結合の安定性が実証される。

実施例８
本発明に記載する分子の標識効率と市販の技術（ＵＬＳ ＲＮＡ標識キット)との比較
手順：
ＲＮＡアンプリコンは、上述のとおりＮＡＳＢＡ増幅によって調製し、ＢＢＰおよびＰｙＤＢ分子で標識する。
チューブ内で以下を混合する。
・５μＬの１×ＮＡＳＢＡ（ビオメリュー社のＮｕｃｌｉＳｅｎｓベーシックキット）、
・５μＬの２０ｍＭの標識（ＢＢＰまたはＰｙＤＢ）のＤＭＳＯ／メタノール（９６／４）溶液、
・５μＬの１ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、及び
・５μＬの水。
溶液をボルテックスで混合し、次に６５℃で１０分間インキュベートした。
Ｋｒｅａｔｅｃｈ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）の市販キット「ＵＬＳ ＲＮＡ標識キット」による標識化を、製造業者が推奨するプロトコルに従って行った。要約すると、次のものを混合する。
・２０μＬの１×ＮＡＳＢＡ（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓベーシックキット、ビオメリュー社、Ｂｏｘｔｅｌ、オランダ）、
・１μＬの標識溶液、
・３μＬの１０×緩衝液、及び
・６μＬの水。
溶液を８５℃で３０分間インキュベートした。

核酸の精製：
ＢＢＰまたはＰｙＤＢ分子により標識した核酸を、製造業者が推奨する精製プロトコルを使用して、ＱｉａＱｕｉｃｋカラム（ＰＣＲ精製キット、キアゲン社製）で精製した。溶出量は１００μＬである。
市販キット「ＵＬＳ ＲＮＡ標識キット」により標識された核酸については、Ｋｒｅａｔｅｃｈ（アムステルダム、オランダ）により推奨され、提供されている精製を使用した。最終体積は３０μＬであり、この会社が推奨するブロッキング溶液を１００μＬ添加する。

ＤＮＡチップ上でのハイブリダイゼーション：
精製後、標識された核酸を、４００μＬのハイブリダイゼーション緩衝液（ＢＢＰまたはＰｙＤＢ）または３７０μＬのＫｒｅａｔｅｃｈハイブリダイゼーション緩衝液に移す。前記核酸を、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６ＳＲＮＡの「ＧｅｎＢａｎｋ」Ｍ２０９４０配列の解析用に設計されたＤＮＡチップにハイブリダイズさせる。
このＤＮＡチップはＡ．Ｔｒｏｅｓｃｈらによる刊行物、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７（１），４９−５５頁，１９９９に記載されている。ハイブリダイゼーション工程は、Ａ．Ｔｒｏｅｓｃｈらによる上記刊行物に記載されているハイブリダイゼーションプロトコルおよび緩衝液を使用して、ｆｌｕｉｄｉｃｓ ｓｔａｔｉｏｎｓ（アフィメトリクスＦＳ４５０）で実施した。
ハイブリダイゼーションは、以下の条件下で使用された標識であるビオチンと相互作用する、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したストレプトアビジン（ＳＡ）との結合により明らかになる。すなわち、３００μＬの純水、３００μＬの１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７）／１ＭのＮａＣｌ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／０．００５％の消泡剤、６μＬのＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ）、６μＬのＳＡ−ＰＥ（３００μｇ／ｍＬ）。

ＤＮＡチップの読み取り：
標識化とハイブリダイゼーションの後に、ＤＮＡチップの表面に放射される蛍光の読取およびシグナル強度と相同率に関するデータの作成を、アフィメトリックスから提供される読み取りシステムおよびソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ ＡｒｒａｙおよびＧＣＯＳソフトウェア）によって実施する。読取りシステムは、ｒｆｕ（「相対的蛍光単位」）で表示されるシグナル（Ｍｅｄｉａｎ）およびバックグラウンドノイズ（ＭｅｄＢｇｄ）強度の中央値を提供する。相同率（％ｒｉｇｈｔ）は「ｂａｓｅ ｃａｌｌ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ」（％ＢＣ）とも称され、参照配列、この場合はマイコバクテリウム・ツベルクローシスの配列と比較して示される。
標識ＢＢＰおよびＰｙＤＢおよび競合キットの結果を、シグナル強度（Ｍｅｄ）、バックグラウンドノイズ（ＭｅｄＢｃｋｇｄ）および相同率（％Ｒｉｇｈｔまたは％ＢＣ）の中央値として、図１０に示す。

結果と結論
供給者により記載された条件に正確に従って適用した、シス−プラチン標識（ＵＬＳ ＲＮＡ標識キット）を使用する技術は、本発明によって提供される技術的解決法よりも非常に劣っている標識能力を有することがわかるが、それは、この市販キットでは、バックグラウンドノイズ（競合４×、図１０）から明確に切り離されたシグナルを得るためには４倍以上の濃度のＲＮＡを加える必要があるが、全ての場合でＢＢＰ分子により行われた標識化より１０倍弱く、ＰｙＤＢ分子により行われた標識化より１８倍弱いままであるからである。
全ての場合に、同一性率（％ＢＣ、％Ｒｉｇｈｔ）は同じままである。
従って、ヌクレオシド間結合の標識化は、他の標識化技術と比較して、非常に良好な検出感度を得ることを可能にし、これは分子の世代にかかわりがない。第四世代に関しては、これはさらにもう一度この新規例における優位性を示す。

実施例９
２つの第三世代ジアゾ標識（パラニトロＤＫＢおよびメタニトロＤＫＢ）と２つの第四世代標識（ＰｙＤＢおよびＰｙＤＫＢ）の溶解性の比較
目的：
ジアゾ標識剤のピリジン核の存在が分子の溶解性を改良することを実証することが望まれる。

手順：
標識のモルエプシロン（ε）の決定：
数ミリグラムの標識（５〜１５ｍｇ）を正確に計量し、１００ｍＭのＤＭＳＯ（完全に溶解性）で溶解する。この溶液をＭｅＯＨで１／１０、さらにＭｅＯＨで１／１００（最終希釈１／１０００）に希釈する。この溶液のＵＶスペクトルを測定して、吸光度を測定するλｍａｘを決定する。この測定により、各標識のモルεを計算することが可能になる（ランベルト・ベールの法則）。

水中への標識の溶解性の決定：
数ミリグラムの標識（５〜１５ｍｇ）を正確に計量し、１００ｍＭの水（完全に溶解性）で溶解する。この溶液をボルテックスで攪拌し、遠心分離する。上清を除き、ＭｅＯＨで１／１０または１／１００に希釈する。標識のＵＶスペクトルを測定して、分解がないことを確認する。λｍａｘで吸光度を測定し、上清中の標識濃度、すなわち、標識の水への溶解性を予め決定したモルε値を使用して算出する（図１１）。

結果と結論：
図１１からＰｙＤＢは、第三世代分子であるパラニトロＤＫＢおよびメタニトロＤＫＢより、水に３倍以上溶解することが分かる。溶解性におけるこの増加は、単にピリジン核の存在によるものである。ＰｙＤＢは第三世代の分子であるパラニトロＤＫＢおよびメタニトロＤＫＢより、９０倍以上溶解性である。溶解性におけるこの増加もまた、ほとんど二置換ピリジン核によりもたらされる。
我々はこのように、これら分子の最終溶解性に対するピリジン核の非常に大きな影響力を実証した。

ピリジン核はその塩基性度が公知の核であり、ジアゾメチル官能基の安定性を予測できるが、逆に核酸に対する反応性に乏しい。実際、ジアゾ／リン酸塩反応の機構は陽子変換に基づいている。陽子捕獲核（ピリジン）の存在は上記反応を防止できたが、この現象はピペリジンなどのより強い塩基においてのみ発現することが観察された。標識化反応は緩衝化した溶媒中、ｐＨ７で行う。
標識がアルファ’である例では、増大した立体障害の問題のためにリン酸塩との反応性の問題が予想される。ここで再度、これらの分子の効果は驚くべきものである。
さらに、リン酸塩のアルキル化の間におけるジアステレオ異性体の生成は、ハイブリダイゼーション、よって核酸の検出を邪魔する可能性を有した。これは予測可能であり、この種の標識は効果が低いと信じさせるものであった。従って、この種の分子を作成し、良好な標識化の結果を得ることは明らかなものではなかった。

Claims (20)

1. 式（Ｃ）：
   

   

   ［式中、
   ・Ｒ_１は、検出可能な標識または少なくも1つの多量体構造によって連結された少なくとも２つの検出可能な標識を表し、
   ・Ｒ_２およびＲ_３は、互いに独立であり、Ｈ、ＮＯ_２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ^２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲまたはＣＯＯＲを表し、ここで、Ｒはアルキルまたはアリールであり、
   ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合を有する直鎖を含むリンカーアームである］
   により表される標識化試薬。
2. 式（Ｄ）：
   

   

   ［式中、
   ・Ｒ_１は、検出可能な標識または少なくも1つの多量体構造によって連結された少なくとも２つの検出可能な標識を表し、
   ・Ｒ_２は、Ｈ、ＮＯ_２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ^２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲまたはＣＯＯＲを表し、ここで、Ｒはアルキルまたはアリールであり、
   ・Ｒ_４は、Ｈ、アルキル基またはアリール基を表し、
   ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合を有する直鎖を含むリンカーアームである］
   により表される標識化試薬。
3. 式（Ｅ）：
   

   

   ［式中、
   ・Ｒ_２およびＲ_３は、互いに独立であり、Ｈ、ＮＯ_２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ^２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲまたはＣＯＯＲを表し、ここで、Ｒはアルキルまたはアリールであり、
   ・ｎは、１〜１２、好ましくは１〜６の整数である］
   により表される請求項１に記載の標識化試薬。
4. 式（Ｆ）：
   

   

   ［式中、
   ・Ｒ_２は、Ｈ、ＮＯ_２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ^２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲまたはＣＯＯＲを表し、ここで、Ｒはアルキルまたはアリールであり、
   ・Ｒ_４は、Ｈ、アルキル基またはアリール基を表し、
   ・−Ｙ−Ｘは、−ＣＨ_２ＮＨ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ_２Ｏ−または−ＣＨ_２Ｓ−を表し、
   ・ｍ、ｎおよびｐは、互いに独立であり、１〜１２、好ましくは１〜６の整数である］
   により表される請求項２に記載の標識化試薬。
5. 式（Ｇ）：
   

   

   により表される、請求項１又は３に記載の標識化試薬。
6. 式（Ｈ）：
   

   

   により表される、請求項２又は４に記載の標識化試薬。
7. Ｒ_１が式（Ｉ）：
   

   

   により表されるＤ−ビオチン残基から成ることを特徴とする、請求項１または２に記載の標識化試薬。
8. ａ）芳香族カルボン酸誘導体をラクトンのエノラートに反応させて（クライゼン型反応）環状前駆体を形成し、
   ｂ）次いで、環状前駆体をハロゲン酸で開環しハロゲン化芳香族ケトンを形成し、
   ｃ）ハロゲン化芳香族ケトンのカルボニル官能基を保護基によって保護し、被保護前駆体を形成し、
   ｄ）被保護前駆体に（ガブリエル型の）アミノ化反応をさせてアミノ化前駆体を形成し、
   ｅ）アミノ化前駆体を脱保護してアミン官能基を解放させ、前記アミン官能基を検出可能な標識と反応させて、そのカルボキシル官能基を活性化し、検出可能な標識を含有する前駆体を形成し、
   ｆ）標識された前駆体にカルボニル官能基の脱保護の反応をさせて、標識されたカルボニル含有前駆体を形成し、最後に
   ｇ）カルボニル官能基をジアゾ官能基に変換して、上述のように、標識されたカルボニル含有前駆体を標識化試薬に変換する
   工程を有する請求項１、３または５のいずれか１項に記載の標識化試薬を合成する方法。
9. ａ）芳香族ジカルボン酸をエステル化してジエステルを形成し、
   ｂ）このジエステルを単一保護されたアミノ化エチレングリコール由来の化合物で位置選択的に置換し、カルボキシル官能基とアミン官能基が保護された前駆体を形成し、
   ｃ）次いで、前駆体を還元しアルコールとし、かつ酸化してアルデヒドとし、
   ｄ）工程ｃ）で合成されたアルデヒドを、アミン官能基を脱保護しながら同時にこの官能基を保護するために酸処理してアミノ化アセタールとし、
   ｅ）アミノ化アセタールを活性化された検出可能な標識のカルボキシル官能基と反応させて検出可能な標識を含有する前駆体を形成し、
   ｆ）標識された前駆体にカルボニル官能基の脱保護の反応をさせて、標識されたカルボニル含有前駆体を形成し、最後に
   ｇ）バンフォード・スティーブンス反応によりカルボニル官能基をジアゾ官能基に変換して、上述のように、標識されたカルボニル含有前駆体を標識化試薬に変換する
   工程を有する請求項２、４または６のいずれか１項に記載の標識化試薬を合成する方法。
10. 生体分子と請求項１から７のいずれか１項に記載の試薬を均一溶液中、実質的に水性緩衝液中で接触させることを有する、生体分子、特に核酸を標識する方法。
11. 請求項１０に記載の方法により取得することができる、標識された生体分子。
12. ・核酸を断片化する工程、
    ・請求項１から７のいずれか１項に記載の試薬から選択された標識化試薬を用いて、少なくとも１つの断片上に標識を結合させる工程を有する一本鎖または二本鎖核酸を標識化し、断片化する方法であって、
    前記試薬は、主として前記断片の少なくとも１つのリン酸塩上に共有結合により連結することを特徴とする方法。
13. 断片化および標識化が２工程で行われることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
14. 断片化および標識化が１工程で行われることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
15. 標識化が実質的に水性均一溶液中で行われることを特徴とする、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 断片化が酵素的、物理的または化学的手段により行われることを特徴とする、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の方法。
17. 請求項１２から１６のいずれか１項に記載の方法により取得することができる、標識された核酸。
18. 請求項１７に記載の標識された核酸を含有する、標的核酸を検出するためのキット。
19. 請求項１から７のいずれか１項に記載の試薬が結合している、固体支持体。
20. 核酸を捕獲するための方法であって、
    ・請求項１１に記載の少なくとも一つの生体分子または請求項１７に記載の核酸であって、ジアゾメチル官能基を有する該生体分子または該核酸を直接的または間接的に結合させた固体支持体を使用し、
    ・前記支持体に、遊離核酸を含有し得る生体サンプルを接触させ、
    ・少なくとも１つの核酸に分子が共有結合する前記固体支持体を洗浄する、
    工程を有する方法。

Images